S. Boulardii uygulamalarının H. Pylori’nin mide ve duedonal epitelyumda oluşturduğu

enfeksiyonların eradikasyonundaki rolünün in vitro hücre kültürü yöntemleri ile

belirlenmesi

Serhan Sakarya, Necati Günay

Adnan Menderes Üniversitesi

Genel bilgi • H. pylori ilk 1982 yılında tanımlanmış, gastirik ve peptik

ülser için etyolojik, maligniteler için önemli bir risk faktörüdür.

• Gelişmekte olan ülkelerde %70-90 , gelişmiş ülke %25-50 oranında prevalans göstermektedir.

• Gastirik epitele aderansında fukosialiye, sialiye veya sulfatlı oligosakkaritler, glikolipidler, glikoproteinler, müsin ve lipid benzeri moleküller rol oynamaktadır.

• Halen aderansda rol oynayan 2 reseptör tanımlanmıştır; – Kan gurup antijenlerine bağlanan adhesin (BabA) H-1 ve Lewis b

Kan grubundaki fukosialiye oligosakkaritlere bağlanır.

– Sialiye Lewis X antijen bağlanan adhesin (2-3) sialik asit yapısındaki oligosakkaritlere bağlanır, kronik inflame mide epitelinde oluştuğu için kronik enfeksiyonlarda önemlidir.

• H. Pylori tedavisinin gelişen direnç ve yan etkiler alternatif tedavi gereksinimini ortaya çıkartmıştır.

• Probiyotiklerin birçok GIS patojenine etkinlikleri, alternatif tedavide kullanımı üzerine çalışmalar yapılmasına neden olmuştur. – L. acidophilus 4356 ve LB, L. johnsonii La1, L casei

393, L. lactis BH5, L. reuteri TM 105, W. confuse, B. subtilis gibi probiyotik bakterilerin laktik ve asetik asit ve hidrojen peroksit gibi salgıları ile H. Pylori’yi in vitro koşullarda öldürmektedir.

– L. Johnsonii La1, L. salivarius, L. acidophilus, W. confuse ve L. reuteri, H. pylori’nin gastrik hücre aderansını in vitro olarak kompetetif inhibisyona uğratmaktadır.

– Ayrıca mukozal bariyer ve immünolojik mekanizmalar ile de H. pylori infeksiyonlarını engellemektedir.

Amaç • Bakteri cinsi probiyotiklerin in vitro

etkinliklerine karşın in vivo başarılarının yeterli olmaması.

• Bir maya probiyotik olan S. boulardii’nin; – Mide ve ince barsaktaki pH ve enzimler gibi

çevresel koşullardan etkilenmememsi

– Klinik çalışmalarda eradikasyonda etkili olması

– Tedavi yan etkilerini azaltması

S. boulardii’nin in vitro hücre kültürü yöntemler ile H. pylori canlılığı ve epitele aderansı üzerine etkileri ve mekanizmasını araştırmak

Metod Materyal • Kimyasallar

Clostridium perfringens’den ekstrakte edilmiş Neuraminidase tip V Sambucus Nigra (SNA) , Maackie amurensis (MAA) ve Archis hypogea (PNA) lektin, calcein AM (CaAM)

• Hücre dizini ve mikroorganizmalar:

HuTo-70 duodenal ve AGS mide hücre dizini (ATCC Manassas, VA, USA), Lactobacillus acidophilus (ATCC 11975), Lactobacillus reuteri (DSM 17938) ve Helicobacter pylori (NCTC 11637) Refik Saydam Hıfzısıha Merkezi, Sccharomyces boluardii (Biocodex – Fransa)

•Koloni sayımı, fluoresan mikroskobi, florometrik teknikler kullanılarak probiyotiklerin H.pylori’nin, canlılığı ve epitele aderansı üzerine etkisi ve S. Boulardii’nin hücre yüzey sialik asit üzerine etkisi test edildi.

Sonuçlar

Probiyotik mikroorganizmaların H. Pylori canlılığı üzerine etkinliği

S boluardii, L acidophilus ve L. Reuteri sıvı besiyerinde üretilerek, bakterilerin 107, 106, 105, 104, 103 ve süpernatantlarının 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 dilüsyonları eş zamanlı olarak, zımbalanarak kuyucuklar oluşturulmuş %7 at kanlı BHI agara ekilmiş olan 107 /ml H pylori ile birlikte ekilerek 350C mikroaerofilik jar içinde 24 s inkübe edildi. İnkübasyon sonrası zonları ölçüldü.

Probiyotiklerin HuTo-70 hücrelerine H.pylori aderansı üzerine etkisi

0.0×10 -00

5.0×10 04

1.0×10 05

1.5×10 05

HP HP+SB

*p=0.032

Bacte

ria (

CF

U)

A

B

0.0×10 -00

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07HP HP+SB

*p=0.029

Bacte

ria (

CF

U)

Kantitatif: HuTo 70 ve AGS hücreleri 24 kuyucuklu hücre kültürü plaklarına uygun besiyerleri ile ekilerek (0,5X105

hücre/cm2) plağı kaplayana kadar inkübe edildi. Mikroorganizma suspansiyonları 107 CFU olacak şekilde hazırlandıktan sonra gruplara göre birlikte veya tek tek hücre üzerine eklenerek 2.5 saat inkübe edilip 3 kez antibiyotikli PBS ile yıkanarak probiyotik mikroorganizmalar öldürüldü. Hücreler parçalama solüsyonu ile parçalandı. Solüsyon dilüe edilerek %7 BHİ agara ekilip inkübasyon sonunda koloni sayımı yapıldı.

C

S. boulardii’nin HuTo-70 hücrelerine H. pylori aderansı üzerine etkisi

0.0×10 -00

2.5×10 04

5.0×10 04

7.5×10 04 HP SB+HP

Bacte

ria (

CF

U)

0.0×10 -00

1.0×10 06

2.0×10 06 HP SB+HP

Bacte

ria (

CF

U)

A

B

Probiyotiklerin AGS hücrelerine H.pylori aderansı üzerine etkisi

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

*p<0.01

cont NANase SB

Abso

lute

flu

ore

scence

unit

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

*

*p<0.01

p<0.05

Abso

lute

flu

ore

scence

unit

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

*

*p<0.001

p<0.05

Abso

lute

flu

ore

scence

unit

A

B

C

Fluoresan mikroskopi Fluorometri

TR-SNA lektin; (2-6) galactose, (2-6)GalNAc ve -galactose bağlı sialik asitler

TR-MAA lektin; (2-3) galactose bağlı sialik asitler

TR-PNA lektin; Sialik asit uzaklaştırıldıkdan sonra subterminal -galactose

S. boulardii nin HuTo-70 hücre yüzey sialik asid kompozüsyonu üzerine etkisi

Cont NANase

SB Yüzeye bağlanan lektin

B

Cont

SB

NANase

Yüzeye bağlanan laktin

A

Yüzeye bağlanan lektin

Cont NANasa

SB

C

0.0

0.1

0.2

0.3

*p<0.05

cont NANase S.B

Absolu

te flu

ore

scence U

nit

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Absolu

te flu

ore

scence U

nit

0.00

0.25

0.50

0.75

*

Figure 11: Fluorometric values of SNA (A), MAA (B) and PNA (C) prior to treatment of HuTo cells with NANase, S. boulardii and media alone. *, signi?cantly decreased/increased compared to the media alone at P <0.05

p<0.05

Absolu

te flu

ore

scence U

nit

A

B

C

Fluoresan mikroskopi Fluorometri

TR-SNA lektin; (2-6) galactose, (2-6)GalNAc ve -galactose bağlı sialik asitler

TR-MAA lektin; (2-3) galactose bağlı sialik asitler

TR-PNA lektin; Sialik asit uzaklaştırıldıkdan sonra subterminal -galactose

S. boulardii nin AGS hücre yüzey sialik asid kompozüsyonu üzerine etkisi

Cont

SB

NANase

Yüzeye lektin bağlanma

A

Yüzeye lektin bağlanma

Cont

SB

NANase B

Cont

SB

NANase

Yüzey lektin bağlanma

C

Yorum I • S. Boulardii;

– İnce barsak epiteli; • H. Pylori’nin epitele aderansını azaltmaktadır

• İnce barsak epitelinde MAA lectin bağlanmasını ↓, PNA lectin bağlanmasını ↑ ve SNA lectin üzerinde etksiz = (2-3) galaktoza bağlı sialik asitler üzerine etkil Nöraminidaz aktivitesi.

– Mide epiteli; • H. Pylori’nin epitele aderansını etkilememekte

• Hiçbir lektinin bağlanmasını etkilememkte + NANase MAA lektin bağlanmasını etkilememekte= Mide epitelin yüzeyinde yapısal olarak (2-3) galaktoza bağlı sialik asit bulunmamaktadır.

Sonuç II • Mide ve duedonum epitelinin yüzey sialik

asit kompozüsyonun farklı olduğu, • S. Boulardii’nin (2-3) galaktoza bağlı

sialik asitler üzerine etkil Nöraminidaz aktivitesinin olduğunu,

• Yüzey sialik asitler üzerine etkileyerek H. Pylori aderansı üzerine etkili olduğunu,

Gösteren ilk çalışmadır • SabA reseptörüne bağlanan (2-3) sialik

asit yapı kronik mid ülserinde oluşan inflamasyonda ortaya çıktığından, S. Boulardii’nin inflame mide epitelinde H. Pylori aderansında etkili olarak eredikasyonda etkili olabilir.

Teşekkür ederim