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N O C I C E P T O R E S

As células que sentem dor

T R A D U Ç Ã O

Alan Fein

iv

Conteúdo

A dor é uma sensação desagradável, primariamente tem a função protetora em contrapartida

na cronicidade não atende a sobrevivência. Esta edição eletrônica é uma introdução ao estudo

da dor, uma investigação experimental do sistema sensorial especializado, os nociceptores.

I – Nociceptores: O autor revisa o sistema nervoso periférico sensorial especializado que

fornece informações ao sistema nervoso central da lesão tecidual, os nociceptores aferentes

primários e as sensações dolorosas. Descreve as classes dos nociceptores. Analisa a função dos

nociceptores e o mecanismo de funcionamento do nociceptor. A ocorrência da hiperalgesia e a

sensibilização dos nociceptores.

II - Transdução Sensorial: Nesta seção, uma explanação dos mecanismos moleculares na

sinalização do estímulo nocivo. As alterações da permeabilidade iônica na membrana

plasmática, o potencial de repouso e o gradiente de concentração. A relação entre a estrutura

e a função dos canais de íons. Os tipos de estímulos sensoriais que ocorrem durante a lesão

tecidual.

III – Receptores de Potencial Transitório (TRP): Uma análise das propriedades dos canais do

receptor de potencial transitório. O descobrimento em TRP em fotorreceptores da Drosófila. A

classificação dos TRP nos mamíferos e as sensações de moléculas irritantes ou nocivas no

sabor e chemestesia, como a capsaicina. Os canais do TRP implicados na transdução de sinal

do nociceptor: TRPV1 e como alvo terapêutico, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPA1 e TRPM8.

IV - Mediadores Químicos: O autor examina os mediadores químicos considerados a

desempenhar um papel no nociceptor: a serotonina (5-HT), a bradicinina (BK), o trifosfato de

adenosina (ATP), as proteases e a inflamação neurogênica, o pH baixo, o ácido lisofosfatídico

(LPA) e o fator de crescimento neural (NGF). Simultaneamente evidencia os receptores e os

canais de íons considerados envolvidos na execução das ações dos mediadores químicos.

V – Canais de Íons Controlados por Voltagem (VGICs): Uma verificação do papel das correntes

da membrana na geração e na propagação dos potenciais de ação, do mesmo modo que a

liberação de neurotransmissores das terminações pré-sinápticas. As respostas e as sensações

de dor nos canais de sódio controlado por voltagem de subunidade alfa (NaV), como: NaV1.8,

NaV1.9, NaV1.7, NaV1.3, NaV1.1 e NaV1.6. Os canais de potássio (K) no efeito da morfina e o

canal de cálcio controlado por voltagem (CaV). A regulação da frequência de disparo nos canal

de cátions controlado por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN).

VI – Dor Neuropática: Uma descrição dos mecanismos básicos da dor neuropática – ou

neuropatia periférica. Modelos de lesões nervosas experimentais e dois exemplos das

síndromes de dor neuropáticas: causalgia e neuralgia do trigêmeo. Alguns exemplos da

diversidade dos tratamentos: gabapentina e pregabalina, artemin e canabinoides. O padrão de

disparo resultante de uma corrente em marca-passo. A atividade espontânea e toxina

botulínica tipo A. Dor espontânea, hiperalgesia e alodinia associadas com a desmielinização.

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Abreviações e Anacrônimos

5-hidroxitriptamina 5-HT 5-hydroxytryptamine

receptor de 5-hidroxitriptamina 2A 5-HT2A 5-hydroxytryptamine 2A receptor

receptor de 5-hidroxitriptamina 3 5-HT3 5-hydroxytryptamine 3 receptor

ácido araquidônico AA arachidonic acid

adenilato ciclase AC adenylate cyclase

anti-inflamatório não esteroidal AINE nonsteroidal anti-inflammatory drug

artemin ARTN artemin

canal de íon sensível a ácido ASIC acid-sensing ion channel

trifosfato de adenosina ATP adenosine triphosphate

receptor B1 de bradicinina B1 bradykinin receptor B1

receptor B2 de bradicinina B2 bradykinin receptor B2

bradicinina BK bradykinin

toxina botulínica tipo A BTX-A botulinum toxin type A

monofosfato de adenosina cíclico cAMP cyclic adenosine monophosphate

canal de cálcio controlados por voltagem CaV voltage gated calcium channel

canabinoides CB cannabinoids

receptor de canabinoide tipo um CB1 cannabinoid receptor type one

receptor de canabinoide tipo dois CB2 cannabinoid receptor type two

monofosfato de guanosina cíclico cGMP cyclic guanosine monophosphate

peptídeo relacionado ao gene da calcitonina CGRP calcitonin gene-related peptide

ciclooxigenase COX cyclooxygenase

diacilglicerol DAG diacylglycerol

toxina da diftérica A DTA diphtheria toxin A

enzima conversora da angiotensina ECA angiotensin converting enzyme

potencial de equilíbrio do potássio EK potassium equilibrium potential

potencial de equilíbrio do sódio ENa sodium equilibrium potential

receptor de prostanoide E EP E prostanoid receptor

potencial de reversão Erev reversal potential

quinases reguladas por sinal extracelular um e dois ERK1/2 extracellular signal-regulated kinase one and two

ácido gama-aminobutírico GABA gamma-aminobutyric acid

fator neurotrófico derivado da célula glial GDNF glial cell-derived neurotrophic factor

difosfato de guanosina GDP guanosine diphosphate

receptor acoplado à proteína G GPCR G protein-coupled receptor

gânglio da raiz dorsal GRD dorsal root ganglion

trifosfato de guanosina GTP guanosine trisphosphate

canal controlado por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização

HCN hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel

canal HCN dois HCN2 HCN channel two

canal HCN quatro HCN4 HCN channel four

ácido hidroperoxieicosatetraenoico HPETE hydroxyeicosatetraenoic acid

corrente marca-passo do HCN Ih pacemaker current of HCN

receptor do trifosfato inositol IP inositol trisphosphate receptor

trifosfato de inositol IP3 inositol trisphosphate

canal de potássio de dois poros K2P two-pore potassium channel

canal de potássio de dois poros membro dois K2P2.1 two-pore potassium channel member two

canal de potássio de dois poros membro três K2P3.1 two-pore potassium channel member three

canal de potássio de dois poros membro cinco K2P5.1 two-pore potassium channel member five

canal de potássio sensível ao ATP KATP ATP-sensitive potassium channel

canal de potássio de retificação interna Kir inwardly-rectifying potassium channel

canal de potássio controlado por voltagem KV voltage-gated potassium channel

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canal de íon controlado por ligante LGIC ligand-gated ion channel

lipoxigenase LOX lipoxygenase

ácido lisofosfatídico LPA lysophosphatidic acid

receptor do ácido lisofosfatídico um LPA1 lysophosphatidic acid receptor one

proteína quinase ativada por metogênese MAPK mitogen-activated protein kinase

N-araquidonoildopamina NADA N-arachidonoyldopamine canal de sódio controlado por voltagem NaV voltage-gated sodium channel

canal de sódio controlado por voltagem alfa I NaV1.1 sodium channel, voltage-gated, alpha I

canal de sódio controlado por voltagem alfa III NaV1.3 sodium channel, voltage-gated, alpha III

canal de sódio controlado por voltagem alfa VI NaV1.6 sodium channel, voltage-gated, alpha VI

canal de sódio controlado por voltagem alfa VII NaV1.7 sodium channel, voltage-gated, alpha VII

canal de sódio controlado por voltagem alfa VIII NaV1.8 sodium channel, voltage-gated, alpha VIII

canal de sódio controlado por voltagem alfa IX NaV1.9 sodium channel, voltage-gated, alpha IX

fator de crescimento neural NGF nerve growth factor

óxido nítrico NO nitric oxide

receptor purinérgico P2 purinergic receptor

purinoceptor do canal de íons controlado por ligante P2X ligand-gated ion channel purinoceptor

purinoceptor do canal de íons controlado por ligante dois P2X2 ligand-gated ion channel purinoceptor two

purinoceptor do canal de íons controlado por ligante três P2X3 ligand-gated ion channel purinoceptor three

purinoceptor acoplado à proteína G P2Y G protein-coupled purinoceptor

purinoceptor acoplado à proteína G um P2Y1 G protein-coupled purinoceptor one

purinoceptor acoplado à proteína G dois P2Y2 G protein-coupled purinoceptor two

receptor ativado por proteases PAR protease-activated receptor

receptor ativado por proteases um PAR1 protease-activated receptor one

receptor ativado por proteases dois PAR2 protease-activated receptor two

receptor ativado por proteases quatro PAR4 protease-activated receptor four

fosfofatidil colina PC phosphatidyl choline

prostaglandina E2 PGE2 prostaglandin E2

prostaglantina I2 PGI2 prostaglandin I2

fosfadilinositol difosfato PIP2 phosphatidylinositol bisphosphate

permeabilidade ao potássio PK potassium permeability

proteína quinase C PKC protein kinase C

proteína quinase G PKG protein kinase G

fosfolipase A2 PLA2 phospholipase A2

fosfolipase C PLC phospholipase C

fosfolipase C-beta PLC- phospholipase C-beta

fosfolipase D PLD phospholipase D

permeabilidade ao sódio PNa sodium permeability

ácido graxo poli-insaturado PUFA polyunsaturated fatty acid

receptor da tirosina quinase RTK receptor tyrosine kinase

substância P SP substance P

receptor sulfonilureia SUR sulfonylurea receptor

receptor da tirosina quinase neurotrófica tipo um TRK1 neurotrophic tyrosine kinase receptor type one

receptor de potencial transitório TRP transient receptor potential

receptor de potencial transitório da anquirina um TRPA1 transient receptor potential ankyrin one

receptor de potencial transitório da melatatina oito TRPM8 transient receptor potential melastatin eight

receptor de potencial transitório da vaniloide um TRPV1 transient receptor potential vanilloid one

receptor de potencial transitório da vaniloide dois TRPV2 transient receptor potential vanilloid two

receptor de potencial transitório da vaniloide três TRPV3 transient receptor potential vanilloid three

receptor de potencial transitório da vaniloide quatro TRPV4 transient receptor potential vanilloid four

tetrodotoxina TTX tetrodotoxin

resistente a tetrodotoxina TTX-R tetrodotoxin-resistent

sensível a tetrodotoxina TTX-S tetrodotoxin-sensitive

canal de íon controlado por voltagem VGIC voltage-gated ion channel

potencial de membrana VM membrane potential

1

I – Nociceptores

A dor é uma sensação desagradável, a qual é um componente essencial do sistema de defesa

do organismo. Fornece um rápido aviso ao sistema nervoso para iniciar uma resposta motora e

minimizar o prejuízo físico. A falta da capacidade de experimentar a dor – como na rara

condição de insensibilidade congênita a dor, com anidrose1 – pode causar sérios problemas

graves à saúde, tais como: automutilação, autoamputação e cicatrizes nas córneas.

Até o século XX, houve um debate acalorado e vigoroso sobre a natureza da dor. Um lado

deteve que o estímulo sensorial, qual normalmente ativa os órgãos do sentido, tal como tato,

iria iniciar a dor através dos mesmos órgãos, se o estímulo fosse suficientemente forte. Outro

lado que existia uma classe especializada separada de órgãos do sentido específicos à dor.

No final do século passado, o debate foi definido e demonstrado conclusivamente que existem

órgãos sensoriais especializados, os quais sinalizam a dor.

Dor e Nocicepção

A palavra “dor”, na língua portuguesa*, vem do latim: dolore, que significa sofrimento; e “pain”

na língua inglesa, do grego: poiné, pena.

Os fisiologistas distinguem entre dor e nocicepção, onde a nocicepção se refere aos sinais que

chegam ao sistema nervoso central (SNC) resultante da ativação dos receptores sensoriais

especializados, chamados nociceptores, que fornecem informações sobre a lesão tecidual.

Consequentemente a dor uma experiência emocional desagradável que geralmente

acompanha a nocicepção.

O foco dessa edição eletrônica são os nociceptores, os receptores sensoriais especializados que

fornecem informações sobre a lesão tecidual.

Neurônios sensoriais

Historicamente, para aprender alguma coisa sobre o estímulo que ativa um grande número de

nociceptores, nas fibras nervosas selecionadas aleatoriamente, foram tipicamente estudadas

as que inervam a pele. Os grandes nervos periféricos, em animais, são na realidade uma

combinação composta de feixes, por milhares de fibras nervosas individuais, delimitadas por

uma bainha de tecido conectivo frouxo. A velocidade de condução com que as fibras nervosas

individuais, no feixe, transmitem os potenciais de ação para e do sistema nervoso, podem

variar mais do que 100 vezes, tornando interessante saber a velocidade de condução, nas

fibras, que transportam o sinal dos nociceptores ao cérebro.

* Nota do tradutor

2

A atividade elétrica em uma fibra individual, no feixe nervoso, pode ser isolada e verificada,

usando uma variedade de métodos, um dos quais é mostrado na Figura 1.1. Nesse exemplo

citado, um eletrodo intracelular foi usado para espetar o corpo celular de um neurônio

sensorial, no gânglio da raiz dorsal (GRD) e dessa maneira registrar sua atividade elétrica. O

GRD é composto por vários corpos celulares dos neurônios sensoriais e está localizada lateral a

medula espinhal da coluna vertebral. Estes neurônios sensoriais têm axônios que projetam aos

tecidos periféricos, como a pele e são responsáveis por nossas sensações em nosso corpo. O

gânglio trigeminal é análogo ao GRD da medula espinhal e responsável pelas sensações na

face. A velocidade de condução, no neurônio espetado, foi medida usando um pulso de

voltagem breve, aplicado ao eletrodo estimulante extracelular, para evocar o potencial de

ação na fibra nervosa composta do feixe nervoso. Sabendo, a distância entre o eletrodo

estimulante e o local do eletrodo de registro, o tempo que leva o potencial de ação para

alcançar o local do eletrodo de registro após aplicação do pulso de voltagem, a velocidade de

condução facilmente pode ser calculada.

Fig. 1.1 – Calor intenso do fogo ativa os terminais dos nociceptores. Os potenciais de ação são propagados ao longo dos axônios dos nociceptores a medula espinhal e um eletrodo intracelular, espetado no corpo celular que se encontra no gânglio da raiz dorsal, monitora a atividade de um dos nociceptores. O terminal central de uma fibra de coloração positiva para planta lectina, isolectina B4 (IB4

+) é mostrada que termina na lâmina II, e que uma fibra (IB4

-) é mostrada que

termina na lâmina I. Os eletrodos estimulantes extracelulares estão conectados a um estimulador de pulso “não mostrado” e são usados para iniciar os potenciais de ação em fibra nervosa.

3

Muitos neurônios – sensoriais – aferentes isolados desta forma respondem a estimulação

mecânica ou térmica de baixa intensidade, ou seja, o estímulo que em indivíduos evoca uma

sensação não dolorosa ou inócua. Além disso, estas fibras apresentam toda uma faixa de

velocidades de condução expostas através do nervo. Alguns dos neurônios registrados desta

forma são diferenciados por limiar relativamente elevado de ativação, por exemplo, só pode

ser ativado por estímulos intensos – mecânico, térmico ou irritante químico – que são

potencialmente prejudiciais aos tecidos. Estes neurônios de limiar alto são considerados os

nociceptores aferentes primários.

Nociceptores Aferentes Primários

Todos nós, provavelmente, experimentamos que a dor pode ser provocada por estímulo

térmico, mecânico e químico, o qual produz ferimento tecidual. Várias possibilidades podem

explicar como estes diferentes estímulos resultariam na sensação de dor.

Uma possibilidade é que os nociceptores individuais são sensíveis a todos esses estímulos

diferentes. A outra é que existem vários tipos diferentes de nociceptores e cada um serem

sensíveis a um estímulo específico. Como veremos abaixo, revela-se que ambas as

possibilidades são encontradas na natureza: alguns nociceptores são sensíveis a um estímulo

específico enquanto outros são sensíveis a vários tipos de estímulos.

A fibra nervosa, axônio, em um nervo combinado incluem os nervos aferentes e eferentes,

motores e autonômicos. A velocidade que uma fibra nervosa individual conduz os potenciais

de ação está relacionada com o diâmetro da fibra. Nas fibras mielinizadas maiores, a

velocidade de condução, em metros por segundo, é aproximadamente seis vezes o diâmetro

do axônio, determinado em mícron (veja a Figura 1.2).

Fig. 1.2 – Diâmetros dos axônios e velocidades de condução no nervo periférico.

Os diâmetros dos axônios são apresentados em micrometros (m) e as velocidades de condução são dadas em metros por segundo (m/s). As fibras designadas por C são amielinizadas e as fibras A têm uma camada de mielina.

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O histograma de distribuição das velocidades de condução tem quatro picos: as fibras

condutoras mais lentas são amielinizadas e designadas por C, enquanto as fibras mielinizadas

condutoras mais rápidas são designadas por A, A e A.

A opinião amplamente difundida, apresentada na maioria dos livros atuais, são apenas as

fibras nervosas de diâmetros menores e mais lentas, as fibras C e A, que transportam os

sinais aferentes dos nociceptores e são sentidas como dor. As evidências disponíveis, as quais

foram revisadas minuciosamente2, 3, sugerem que uma fração substancial dos nociceptores das

fibras A podem conduzir na faixa de velocidade da condução A. Consequentemente, para

permitir esta possibilidade, a denominação utilizada nesse texto é que o sinal dos nociceptores

seja carregado pelas fibras C amielinizadas e fibras A mielinizadas condutoras na faixa da

velocidade de condução A-. Isto deve ser mantido em mente, que o inverso não é verdade,

nem todas as fibras C e A- são nociceptores. Estas fibras também carregam os sinais dos

estímulos não nocivos ou inócuos; como mecânico, calor e frio.

Devido à diferença na velocidade de condução entre as fibras C e A-, o sinal das fibras A-

chegam à medula espinhal antes das fibras C. Isto levanta a possibilidade que o estímulo

doloroso evoca duas sensações de dor sucessivas e possivelmente distintas.

Sensações dolorosas

A evidência que sustenta o aspecto em que os sinais das fibras C e A- são sensações de dor

distintas, provém de condições experimentais, estimulação elétrica e bloqueio de nervo, onde

as atividades das fibras A e C são estudadas isoladas. Quando é feita a estimulação nas fibras A

é descrita como causando uma sensação de dor acentuada em picada e que nas fibras C uma

sensação fraca em queimação dolorida.

Geralmente, afirma-se que para o estímulo doloroso existe uma resposta subjetiva bifásica: a

dor em picada de latência curta é seguida por uma segunda dor de latência longa em

queimação e de qualidade menos suportável. No entanto, a evidência para duas sensações de

dor sucessivas é muito menos atraente do que as duas sensações de dor distintas. No artigo

original mostrando que os sinais das fibras C e A- são sensações de dor distintas. Afirmou-se

que tal resposta subjetiva bifásica um estímulo doloroso transitório é ausente frequentemente

em indivíduos normais4.

A incapacidade de muitos indivíduos normais, em experimentar a primeira e a segunda dor a

um estímulo, na superfície da pele, não deve ser tomada para sugerir que estes dois tipos de

dor são artefatos, nas condições experimentais, em que foram observadas. Pelo contrário,

quando são ativados simultaneamente, em condições normais, são difíceis de ser identificada

cada uma pelo observador.

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Classes de Nociceptores

Quatro classes de nociceptores foram descritos: mecânicos, térmicos, polimodais e silenciosos.

Os nociceptores mecânicos respondem a pressão intensa enquanto os nociceptores térmicos

respondem às temperaturas extremas, quentes (> 45°C) ou frias (< 5°C) e possuem fibras A

mielinizadas, que conduzem impulsos na velocidade de 3 m/s a 40 m/s. Coletivamente, esses

dois tipos de nociceptores A- são chamados de nociceptores mecano-térmico.

Os nociceptores polimodais respondem aos estímulos nocivos; mecânicos, térmicos e

químicos, possuem pequenas fibras C amielinizadas que conduzem impulsos na velocidade

menor de 3 m/s. Lembre-se que as pequenas fibras A- mielinizadas carregam entrada

nociceptiva responsável pela dor acentuada em picada e as pequenas fibras C amielinizadas

carregam entrada nociceptiva responsável pela dor fraca em queimação.

Os nociceptores silenciosos são ativados por estímulos químicos, mediadores inflamatórios,

respondem a estímulos mecânicos e térmicos somente depois de serem ativados. Estes

nociceptores também possuem pequenas fibras C amielinizadas que conduzem impulsos na

velocidade menor de 3 m/s.

Os nociceptores, que respondem as temperaturas nocivas, podem ser divididos em:

unimodais, que são ativados por um estímulo térmico exclusivo; e os polimodais, que

detectam estímulos dolorosos químicos, mecânicos e térmicos.

Função dos Nociceptores

A função básica dos nociceptores é de transmitir informações aos neurônios de ordem

superior sobre a lesão tissular. Os receptores individuais podem ser considerados como uma

“caixa-preta” de engenharia, que transforma a lesão tissular em um sinal apropriado para as

células nervosas sucessivas. A função principal de um nociceptor pode ser completamente

descrita se sua conexão de entrada/saída está determinada. A entrada, naturalmente se refere

à lesão tecidual. Qual a saída?

Um dos conceitos centrais da neurobiologia considera que os neurônios se comunicam uns

com outros via sinapses. Mais comumente são encontradas as sinapses de liberação química,

conhecida como transmissores sinápticos. Com a liberação desses transmissores que a célula é

capaz de se comunicar com seus vizinhos pós-sinápticos.

Devido aos nociceptores serem neurônios com sinapses químicas, sua saída é codificado na

liberação dos seus neurotransmissores: a relação de entrada/saída é simplesmente uma

conversão da lesão tecidual em liberação do transmissor.

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Transmissor sináptico

A medição direta da liberação do transmissor sináptico, em condições fisiológicas, é muito

difícil e não pode ser efetuada para qualquer nociceptor. Assim, parece que uma derivação da

relação de entrada/saída está além do alcance.

No entanto, outra propriedade neural quase universal é de assistência: a liberação de

transmissor é controlada diretamente pelo potencial de membrana sináptica. Portanto, com a

variação do registro do potencial de membrana na sinapse, a saída do nociceptor pode ser

indiretamente presumida. Infelizmente, na maioria dos casos, tecnicamente é difícil, se não

impossível o registro intracelularmente de um terminal sináptico. As maiorias dos registros

eletrofisiológicos são realizadas em outras regiões da célula, porque estas regiões estão mais

acessíveis. Atividade elétrica, nos nociceptores, como na maioria dos neurônios está associada

à propagação do potencial de ação, que ocorre na escala de tempo em milissegundos. Esta

propagação dos potenciais de ação ao terminal sináptico e assim regulam a liberação de

transmissor.

Duas técnicas de registro são normalmente usadas para registrar os potenciais de ação do

nociceptor: eletrodos extracelulares registram sua ocorrência em algum lugar ao longo do

axônio do nociceptor ou são registrados intracelularmente no corpo celular do nociceptores,

conforme ilustrado na Figura 1.1. Assim, transdução sensorial dos nociceptores é medida

normalmente como a conversão da lesão tecidual em disparo padronizado dos potenciais de

ação.

Transdução sensorial

Durante o século passado, estabeleceu-se a estrutura básica de transdução sensorial as

diferentes sensações, em muitas espécies de vertebrados e invertebrados.

A célula sensorial típica mostra ter uma região especializada, onde o receptor molecular

sensorial detecta o estímulo, o qual aos nociceptores é a lesão tecidual. O estímulo sensorial

provoca uma alteração conformacional no receptor molecular, que dispara o processo de

transdução, que traz uma mudança do potencial de membrana na célula receptora. A

alteração resultante do potencial de membrana, chamado potencial de receptor.

No neurônio sensorial típico, a parte da célula onde a transdução sensorial ocorre, muitas

vezes, é distante do terminal sináptico. Portanto, o potencial de receptor precisa ser

convertido em uma série de propagação dos potenciais de ação, o qual por sua vez carrega o

sinal ao longo do axônio à sinapse. Os nociceptores não estimulados, normalmente, disparam

poucos ou nenhum potencial de ação e a sua resposta a lesão tecidual é um aumento da taxa

de disparo da propagação dos potenciais de ação junto ao axônio das células.

Estas conclusões estão resumidas na Figura 1.3.

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Fig. 1.3 – Desenho esquemático do nociceptor.

O desenho mostra as quatro regiões da célula mais significativas de um nociceptor idealizado: a região de transdução sensorial, o axônio, o corpo celular e o terminal sináptico. O estímulo e a alteração resultante do potencial de membrana – potencial de receptor.

Funcionamento do Nociceptor

Em paralelo, com as regiões anatômicas do nociceptor, um esquema funcional capaz de

descrever o mecanismo de funcionamento do nociceptor, como na Figura 1.4.

Fig. 1.4 – Esquema funcional do nociceptor.

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O corpo celular, o axônio e o terminal pré-sináptico dos nociceptores devem funcionar mais ou

menos, como agem em outras células. As setas partindo do corpo celular, para outras regiões

do nociceptor se destinam a indicar que o corpo celular é necessário para manter as outras

regiões da célula, sem a qual a célula eventualmente morreria. O axônio conduz o potencial de

ação ao terminal pré-sináptico, onde é liberado o transmissor ou os neurotransmissores. A

liberação do transmissor no terminal sináptico está sujeita a modulação por agentes liberados

por outros neurônios e células possivelmente gliais.

O estímulo que causa ferimento tecidual pode ativar, direta ou indiretamente, a região de

transdução sensorial dos nociceptores. Por exemplo, um nociceptor pode conter receptor

molecular sensível ao calor na membrana plasmática, que responde diretamente a um

estímulo de calor prejudicial, ou contrariamente a lesão tecidual com o estímulo pode resultar

na produção de um fator que por sua vez ativa o nociceptor. Uma terceira possibilidade é que,

devido ao ferimento tecidual torne-se inflamado e um fator extrínseco, que ativa o nociceptor,

entre na região machucada.

A caixa de eventos perirreceptor permite a produção, durante o ferimento tecidual, de fatores

que podem ativar ou modular o nociceptor. Os intensos estímulos nocivos frequentemente

conduzem a um aumento na resposta a estímulos dolorosos subsequentes “controle”. Após os

estímulos nocivos é a transdução da resposta, em potencial de receptor, deve ser

transformada ou codificada em uma série de potenciais de ação, os quais transportam o sinal

de transmissão ao terminal pré-sináptico.

Terminações nervosas livres

A opinião predominante atual é que as terminações nervosas livres das fibras Aδ-β e fibras C

constituem a região sensorial dos nociceptores. Não existem estruturas especializadas

associadas às terminações nervosas, tal como existem para outros receptores sensoriais, como

mecanorreceptores. Muitos outros receptores sensoriais podem ser isolados funcionalmente

intactos e o estudo isolado de fotorreceptores, receptores auditivos, receptores olfatórios,

etc., nos dizem muito sobre seus mecanismos de funcionamento.

Idealmente para estudar as vias envolvidas no processo de transdução nos nociceptores, uma

preparação de nociceptores isolados é necessária. As terminações nervosas livres dos

nociceptores são extremamente finas e são incorporadas em uma matriz de tecido, a qual se

fosse para ser dissecadas, para isolar os nociceptores, seria a liberação de muitas moléculas

que o terminal nervoso do nociceptor se destina a detectar. Esta falta de acessibilidade, não é

possível estudar diretamente o maquinário da transdução do nociceptor tanto em um estado

não estimulado e em seu meio ambiente natural.

Deve ter em mente que nem todas as terminações nervosas livres representam a região de

transdução sensorial dos nociceptores. As terminações nervosas livres são também

responsáveis pela detecção de temperatura, estímulos mecânicos, como pressão, e

informações sobre o tato.

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Corpos celulares dos nociceptores

Por não ser possível isolar as terminações nervosas sensoriais dos nociceptores em estado não

estimulado, os estudos sobre os nociceptores isolados são frequentemente efetuados nos

corpos celulares dos nociceptores.

Por exemplo, os corpos celulares neuronais nos gânglios das raízes dorsais são isolados por

tratamento enzimático e são cultivados antes da utilização. As terminações sensoriais são

completamente removidas durante o processo de isolamento e são esperados e suposto que

as propriedades desses terminais sejam recriadas nos corpos celulares cultivados. Enquanto o

gânglio original continha mais do que somente nociceptores, apenas uma fração dos corpos

celulares cultivados será realmente dos nociceptores. Esta preparação dos corpos celulares

cultivados é usada frequentemente para investigação experimental da base celular e

molecular na detecção dos estímulos dolorosos.

As incertezas e as pressuposições associadas com esses procedimentos tornam imprescindível

que as conclusões devem ser verificadas com muito cuidado e demonstrado para se parecer

com o que realmente ocorre in vivo.

Taxa de disparo dos potenciais de ação

Como mencionado acima, os nociceptores não estimulados normalmente disparam poucos ou

nenhum potenciais de ação, além disso: sua resposta à lesão tecidual é um aumento na taxa

de disparo dos potenciais de ação.

Uma vez que tem uma despolarização da membrana para causar um aumento na taxa de

disparo, esta conclusão implica que o potencial de receptor nos nociceptores é uma

despolarização de membrana, como mostra na Figura 1.3.

Assim, o maquinário de transdução, por necessidade, ter que de algum modo comporta ou

transportadores nos canais de íons que podem despolarizar a membrana plasmática na região

de transdução. A região de codificação (consulte a Figura 1.4) por sua vez converte a

despolarização da membrana em um aumento da taxa de disparo dos potenciais de ação.

Hiperalgesia

As propriedades dos nociceptores, considerados até agora, foram elucidadas principalmente a

partir dos estudos de tecido não ferido.

No entanto, os estímulos nocivos intensos resultando em lesão tecidual frequentemente

conduzem a um aumento na resposta a estímulos dolorosos subsequentes, chamado

hiperalgesia, isto é, uma sensibilidade excessiva ou sensibilidade à dor.

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A hiperalgesia compreende: a hiperalgesia primária, uma sensibilidade aumentada na área

ferida predominantemente devido à sensibilização do nociceptor periférico; a hiperalgesia

secundária, uma sensibilidade aumentada circundante a área não ferida, centralmente

mediada. Aquelas que nos ferimos, pode provavelmente lembrar, ter experimentado esta

hipersensibilidade a dor no local do ferimento e da região circundante. Por exemplo, a

inflamação devido à dor de garganta pode ser tão ruim que o mero ato de engolir é doloroso.

Sensibilização

Nenhuma descrição das propriedades dos nociceptores seria completa, sem uma consideração

a sensibilização dos nociceptor resultante do ferimento tecidual.

A sensibilização é um desvio à esquerda, isto é, em direção à intensidade inferior, na curva de

estímulo/resposta, que diz respeito à magnitude da resposta neural a intensidade de estímulo.

Como mostra na Figura 1.5, a sensibilização do nociceptor é caracterizada por diminuição do

limiar e aumento a magnitude da resposta aos estímulos de supralimiar.

Lembre-se de que alguns, mas não todos os nociceptores apresentam sensibilização.

Respostas individuais aos estímulos térmicos, obtidos antes da superfície da pele ser aquecida.

Respostas sensibilizadas, obtidas a partir da mesma área, depois do ferimento da queimadura.

Fig. 1.5 – Sensibilização do nociceptor térmico.

A sensibilização do nociceptor térmico ao estímulo, em uma área da pele aquecida à temperatura indicada.

11

II – Transdução Sensorial

Na tentativa de compreender a transdução sensorial no nociceptor, evidenciou ser instrutivo

considerar os mecanismos moleculares utilizados na sinalização em outra parte do sistema

nervoso. Os mecanismos utilizados por outros sentidos, bem como aqueles usados na

transmissão sináptica, revelaram ser mais útil.

Numerosos estudos demonstraram que o potencial de receptor sensorial e o potencial

sináptico são o resultado das alterações da permeabilidade iônica na membrana plasmática.

Isto é, o resultado de íons fluindo através das proteínas em membranas íntegras, chamados

canais de íons. Antes de considerar como a abertura e o fechamento dos canais de íons são

regulados durante a transdução do sinal no nociceptor, importante é compreender as forças

que causam o fluxo de íons por destes canais.

Basicamente, existem dois tipos de forças que impulsionam a circulação iônica nas membranas

celulares. Existe o campo elétrico através da membrana celular, o qual é manifestado como

um potencial elétrico através da membrana e existe gradiente de concentração para cada

espécie iônica.

Potencial de Repouso

A maioria dos corpos celulares, incluindo os neurônios, mantém no seu citoplasma um

potencial negativo com referência a parte externa da célula. Para uma célula que está em

estado de repouso, não estimulada, os pesquisadores usam normalmente o termo potencial

de repouso referente a este potencial negativo através da membrana plasmática celular.

Basicamente, o potencial de repouso depende da concentração de íons entre os dois lados da

membrana plasmática e da permeabilidade de repouso da célula para esses íons.

Negligenciando a pequena contribuição de outros íons, mas não sem importância, focamos

nossa atenção aos íons sódio e potássio.

Se a membrana fosse permeável exclusivamente ao íon potássio (K+), o potencial de

membrana (VM) seria dado por:

VM = EK = RT

ln [K+]e

zF [K+]i Onde:

EK é o potencial de equilíbrio do potássio;

[K]e é a concentração extracelular do potássio;

[K]i é a concentração intracelular do potássio;

R é a constante universal dos gases;

T é a temperatura absoluta (escala de Kelvin, 37°C = 310°K);

F é a constante de Faraday (carga em um mol de cátions monovalentes);

z é a valência do íon;

ln é o logaritmo natural.

12

Da mesma maneira, exclusivamente ao íon sódio (Na+), o VM seria:

VM = ENa = RT

ln [Na+]e

F [Na+]i Onde:

ENa é o potencial de equilíbrio do sódio;

[Na]e é a concentração extracelular do sódio;

[Na]i é a concentração intracelular do sódio.

Em muitas células incluindo os neurônios, a [Na]e é muito superior a [Na]i e a [K]i é muito maior

do que a [K]e, como mostra na Figura 2.1.

Fig. 2.1 – Concentrações de íons no extracelular e intracelular.

Diagrama simplificado mostra as concentrações, em milimol (mM), desiguais de íons; sódio (Na+),

potássio (K+) e cloro (Cl

-) nos dois lados da membrana, fora e dentro, de uma célula típica e os potenciais

de equilíbrio do sódio (ENa) e potássio (EK), em milivolt (mV).

Normalmente, em repouso, as membranas biológicas e particularmente as neuronais são

permeáveis ao Na+ e K+ portanto seu potencial de repouso está situado entre o ENa e o EK, a

proximidade de qualquer um destes potenciais de equilíbrio depende da permeabilidade

relativa ao Na+ e K+. Em uma célula típica, o potencial de membrana (VM) deve estar entre o

potencial de equilíbrio do sódio aproximadamente sessenta e cinco milivolts positivos e o

potencial de equilíbrio do potássio aproximadamente oitenta e cinco milivolts negativos, como

mostra a Figura 2.1.

As células são normalmente muito mais permeáveis ao K+, em repouso, do que ao Na+;

portanto, o potencial de repouso é sempre negativo no interior e pode variar ao redor de

trinta milivolts negativos até oitenta milivolts negativos, dependendo do grau de

permeabilidade ao Na+.

Toda vez que o potencial de membrana estiver situado entre o ENa e o EK, o Na+ tenderá a vazar

para dentro e o K+ a vazar para fora da célula. A não ser que a célula compense a constante

perda de K+ e ganho de Na+, o gradiente de concentração iônica irá parar gradualmente de

funcionar, o potencial de equilíbrio do sódio e o potencial de equilíbrio do potássio diminuirão

em direção a zero e o potencial de membrana irá desaparecer.

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Gradiente de Concentração

As células possuem enzimas dependentes metabolicamente, chamadas bombas, as quais

compensam o vazamento passivo, por bombeamento de K+ para dentro e Na+ para fora da

célula. Esta molécula, Na+/K+ ATPase, é uma bomba de Na+/K+, que utiliza trifosfato de

adenosina (ATP) para catalisar o movimento de três Na+ para fora por dois K+ para dentro da

célula.

Existe uma rede de extrusão de uma carga positiva para fora da célula a cada ciclo da bomba,

assim a bomba é eletrogênica. É consenso geral, que a bomba não participa diretamente na

geração dos sinais elétricos, mas tem seu efeito principal em manter gradiente de

concentração iônico para o Na+ e K+ através da membrana celular.

Também, foram encontrados íons de cálcio (Ca2+) a desempenhar um papel importante na

transmissão sináptica e na transdução sensorial, as células têm bombas e trocadores de Ca+2,

as quais mantêm Ca2+ no interior, numa concentração muito inferior do que no exterior da

célula.

Canais de Íons

A biologia molecular fornece-nos uma compreensão básica da relação entre a estrutura e a

função dos canais de íons em geral. As proteínas do canal têm sequencia de aminoácidos que

se estendem através dos lipídios da membrana plasmática, bilateralmente, do interior ao

exterior da célula. Contêm uma região especializada, chamada de região de poro (P), que

formam um canal ou poro, o qual fornece uma via através do quais íons – Na+, K+, Ca2+ e Cl- –

podem passar pela membrana.

A característica relevante dos canais de íons, os quais sustentam o potencial de receptor e o

potencial sináptico, que são submetidos a uma transição de um estado fechado para aberto,

isto é regulado ou controlado por mudanças no canal, a qual resulta do estímulo sensorial ou

do transmissor sináptico, como mostra a Figura 2.2.

Fig. 2.2 – Região de poro do canal.

A transição da região de poro do canal na membrana de um estado fechado para aberto, por mudanças no canal, a qual resulta do estímulo sensorial ou do transmissor sináptico.

14

Fig. 2.3 – Mecanismos de comporta dos canais de íons.

Em A – ligação de um agonista extracelular na comporta e abertura do canal. B – ligação de um segundo mensageiro intracelular na comporta e abertura do canal. C – movimento de carga no canal de proteína devido à despolarização da membrana na comporta e abertura do canal.

Os dois mecanismos, bem compreendidos, utilizados na comporta desses canais são

mostrados na Figura 2.3 – A – B. Para transmissão sináptica, o transmissor sináptico – ou seja, o

ligante – liga-se aos sítios extracelulares do canal de íons da membrana pós-sináptica e as

comportas se abrem (Figura 2.3 – A), esses canais de íons controlados por ligantes (LGICs),

algumas vezes, são também chamados de canais ionotrópicos. Para muitos estímulos

sensoriais, um segundo mensageiro intracelular é gerado pelo processo de transdução

sensorial na comporta com abertura do canal (Figura 2.3 – B). Para efeitos de simplicidade, os

canais são mostrados com dois sítios de ligação externa (Figura 2.3 – A) e com dois sítios de

ligação interna (Figura 2.3 – B), embora a natureza dos canais tenha frequentemente mais de

dois sítios de ligação.

15

Fig. 2.4 – Ilustração da estrutura dos canais de íons.

A ilustração esquemática da estrutura dos canais com domínio de poro, onde: A – um único domínio de poro e B – dois domínios de poro.

Estrutura molecular dos canais

Os canais não são normalmente da propriedade de uma única molécula de proteína, mas são

os resultados da ligação não covalente de várias subunidades de lado oposto uns aos outros

para formar a região do poro. Os canais podem ser homomérico, na qual todas as subunidades

são idênticas; ou heteromérico, isto é ter subunidades não idênticas com propriedades

diferentes.

A região de poro pode ser seletiva ao Na+, K+, Ca2+ e Cl-. Porém, alguns canais são encontrados

a permitir que os três cátions – Na+, K+ e Ca2+ – passem por sua região de poro, esses canais de

cátions são chamados controlados por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN).

A maioria dos canais de íons tem três, quatro ou cinco subunidades, organizados em simetria

circular, formando um único poro aquoso na interseção axial (veja a Figura 2.4 – A, como

exemplo de quatro subunidades). Além disso, a figura mostra que cada subunidade tem

apenas um domínio de poro único. Em contrapartida, conforme mostra a Figura 2.4 – B, o canal

de vazamento do K+ é composto de dois domínios no poro, chamado de canal de potássio de

dois poros (K2P).

Os canais K2P são essenciais à função neuromuscular, porque são responsáveis pelas células,

sendo mais permeáveis ao K+, em repouso, que ao Na+, normalmente estabiliza o potencial de

membrana celular, com baixa voltagem de hiperpolarização ao limiar do disparo dos nervos e

músculos. Nesses canais, como mostra na Figura 2.4 – B, cada subunidade tem dois domínios de

poros, organizado em tandem.

16

Exceto para os casos onde a ligação do ligante ao LGICs realmente diminui a permeabilidade

do canal e diminui a condutância de membrana, o transmissor abre normalmente o canal,

permitindo que os íons fluam, aumentando assim a condutância da membrana celular aos

íons. A resposta ao ligante desativa quando o ligante desassocia e difunde para fora, o canal

muda, em seguida, volta à sua conformação fechada.

Expressão dos canais

Surpreendentemente, a biologia molecular revelou uma multiplicidade de genes para os canais

ionotrópicos, os quais parecem ter funções idênticas essencialmente.

Por exemplo, o canal nicotínico da acetilcolina encontrado nos neurônios que normalmente

tem cinco subunidades – pentamérica, composto por apenas dois tipos de subunidades, dois

alfas () e três betas (). Acontece que existem pelo menos oito genes que codificam a

subunidade e quatro que codificam a . Assim, existe um grande número de diferentes

combinações possíveis das subunidades e , em um animal, cuja função não é

compreendida. A suposição tácita é que esses genes diferentes evoluíram porque atende a

diferentes funções. As duas possibilidades óbvias são que possuem diferentes afinidades a

acetilcolina e, portanto, abrem em concentrações diferentes ou têm propriedades de

permeabilidade iônicas ligeiramente diferentes.

Tipos de receptores

Ao contrário dos receptores ionotrópicos, onde o receptor e o canal são a mesma molécula, o

receptor metabotrópico, a molécula receptora da comporta é indiretamente do canal, o

receptor é uma molécula separada do canal de íon, a qual sustenta o potencial do receptor.

Os receptores metabotrópicos podem ser classificados em dois tipos:

Receptores acoplados à proteína G (GPCRs)

Receptores da tirosina quinase (RTKs)

A família dos GPCRs está acoplada a uma molécula efetora, via uma proteína de ligação

nucleotídeo guanosina, uma proteína G, daí seu nome. Ativação do componente efetor

normalmente requer a participação de várias outras proteínas, além da proteína G.

Usualmente a molécula efetora é uma enzima que produz um segundo mensageiro difusível,

por exemplo, monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), monofosfato de guanosina cíclico

(cGMP), ácido araquidônico (AA), diacilglicerol (DAG) ou um polifosfato inositol.

Os segundo mensageiros podem agir diretamente na comporta do canal de íon (veja a Figura

2.3 – B) ou pode disparar uma cascata bioquímica. Por exemplo, o segundo mensageiro pode

mobilizar Ca2+ das lojas intracelulares e o Ca2+ intracelular elevado pode agir diretamente na

comporta do canal de íon. Outra possibilidade é que o segundo mensageiro ative as proteínas

quinases específicas – proteínas de transferência do fosfato – que fosforilando o canal de íon

ou outras proteínas celulares – assim, alterando suas atividades – e iniciando ou modulando o

17

potencial de receptor. Em alguns casos, a proteína G do segundo mensageiro pode atuar

diretamente no canal de íon.

Os RTKs podem agir na comporta do canal de íon direta ou indiretamente, via fosforilação, isto

é a transferência de um grupo fosfato ao canal ou a outras proteínas celulares.

Os canais encontrados na região de codificação e no axônio (consulte a Figura 1.4), os quais

convertem o potencial de receptor em uma série de propagação dos potenciais de ação são

controlados por despolarização da membrana (veja a Figura 2.3 – C) – os canais de íons

controlados por voltagem (VGICs). Os canais de sódio controlados por voltagem (NaV) e os

canais de potássio controlados por voltagem (KV) desempenham um papel importante na

geração e a propagação dos potenciais de ação. Os canais de cálcio controlados por voltagem

(CaV) desempenham um importante papel na terminação pré-sináptica, onde funcionam na

liberação do transmissor sináptico.

Estímulos Sensoriais

Antes de examinar, os mecanismos moleculares subjacentes à transdução de sinal do

nociceptor, são úteis considerar brevemente os tipos de estímulos, os quais ocorrem no tecido

durante a lesão. Com ênfase aos estímulos que razoavelmente podem estar envolvidos na

transdução de sinal.

Em primeiro lugar, existem os estímulos próprios, tais como: deformação mecânica no tecido e

aumento ou diminuição da temperatura no tecido. Esses estímulos podem regular diretamente

os canais de íons (veja a Figura 2.2) na membrana plasmática do nociceptor, dando assim

origem ao potencial do receptor. Em seguida, existem as alterações locais no meio extracelular

resultante da liberação ou a exposição de moléculas do tecido machucado. Ou seja, moléculas

que normalmente são encontradas no interior das células ou na membrana celular podem

agora ser encontradas em ou expostas no espaço extracelular, onde podem ligar aos

receptores no plasma do nociceptor. Finalmente, existem moléculas que entram na região

machucada, como parte da resposta inflamatória do organismo ao ferimento, onde se podem

ligar aos receptores na membrana plasmática do nociceptor.

Quaisquer umas destas três possibilidades razoáveis podem participar na transdução de sinal

do nociceptor. Idealmente, seria identificar o papel específico na transdução de sinal do

nociceptor de todas as substâncias que aparecem no tecido machucado durante os estímulos

dolorosos. No entanto, como assinalado na Seção – I, não é possível isolar as terminações

nervosas sensoriais dos nociceptores, em um estado não estimulado e estudar como

respondem a estímulos dolorosos. Em vez disso, como vimos somos forçados a usar métodos

indiretos. Por exemplo, os corpos celulares neuronais de um GDR são frequentemente

utilizados após serem isolados e cultivados.

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III – TRP

A família dos canais de cátions do receptor de potencial transitório (TRP) é de interesse porque

vários de seus membros foram implicados na transdução de sinal do nociceptor. Procurando

limitar as considerações dos canais do TRP ao seu papel a nocicepção resultou em uma análise

superficial de todas as suas propriedades conhecidas.

TRP em fotorreceptores da Drosófila

O mutante trp foi originalmente isolado em fotorreceptores da Drosófila, no qual a resposta

luminosa – potencial de receptor – decaiu a linha de base durante a iluminação prolongada

(veja a Figura 3.1), daí o nome receptor de potencial transitório.

Foi encontrado um gene para codificar o canal de Ca2+ seletivo responsável pelo componente

principal da resposta luminosa. Outros dois membros da família TRP das proteínas – TRPL e

TRP – foram posteriormente encontrados aos fotorreceptores da Drosófila, que

supostamente são responsáveis pela resposta luminosa residual no mutante trp.

A cascata da fototransdução na Drosófila é iniciada quando a luz ataca a rodopsina (Rho), a

qual leva a estimulação de uma proteína G heterotrimérica que ativa a fosfolipase C (PLC).

Revela-se que a ativação do canal, o qual leva ao influxo de cátions no fotorreceptor é

mediado, in vivo, pelo diacilglicerol (DAG) ou seus metabolitos, os ácidos graxos poli-

insaturados (PUFAs).

Usando a terminologia discutida na Seção – II, a família do TRP na Drosófila são os canais de

íons controlados por segundo mensageiro ativado descendente do GPCR da Rho.

Fig. 3.1 – Resposta luminosa no fotorreceptor da Drosófila.

A comparação de tempo no mutante trp, à resposta luminosa decaiu a linha de base durante o estímulo luminoso; enquanto no tipo selvagem, o fotorreceptor apresenta uma despolarização mantida durante o estímulo.

19

TRP nos mamíferos

Baseados na homologia foram identificados numerosos membros da família do TRP, em

vertebrados. Nos mamíferos, os membros dessa família foram classificados em seis

subfamílias:

TRPC - canônico;

TRPV - vaniloide;

TRPA - anquirina;

TRPM - melastatina;

TRPP - policistina;

TRPML - mucolipina.

Os canais do TRP, em mamíferos, são permeáveis aos cátions e têm seis domínios

transmembranas ladeados por regiões terminal-C e -N intracelular. As quatro subunidades são

consideradas para reunir como homo e/ou heterotetrâmeros na formação dos canais

funcionais. Embora, os canais do TRP podem ser de fraca voltagem dependente, falta o sensor

de voltagem dos canais controlados por voltagem (consulte a Figura 2.3 – C).

Sabor e chemestesia

A sensação de gosto – gustação – é a capacidade de sentir o sabor das substâncias, tal como

nos alimentos. As sensações do gosto incluem: doce, salgado, azedo, amargo e umami*.

Umami é o sabor que ocorre quando os alimentos são consumidos com aminoácido glutamato.

Em contraste com a sensação de gosto, o nervo trigêmeo transmite informações sobre

moléculas nocivas e irritantes que entram em contacto com a boca.

As sensações chemestéticas são definidas como aqueles que ocorrem em qualquer lugar no

corpo quando produtos químicos ativam os receptores por outras sensações. Desse modo, as

sensações transmitidas ao cérebro, quando moléculas nocivas ativam fibras de dor no nervo

trigêmeo e são descritas como sensações chemestéticas. A queimação da pimenta malagueta

e o esfriamento do enxaguatório de mentol são exemplos de chemestesias.

Capsaicina

A capsaicina (8-metil-N-vanili1-6-nonenamida) ingrediente pungente ou quente da pimenta

malagueta, a qual dá a sensação de queimação ou picante, foi isolada pela primeira vez no

século XIX. O interesse nos efeitos sensoriais da capsaicina tem uma longa história. Cristovão

Colombo descreve ter comido pimenta malagueta com nativos no novo mundo, há mais de

quinhentos anos. Wilbur Scoville desenvolveu um teste e uma escala, em 1912, para medir o

picante ou o calor da pimenta malagueta. A escala de Scoville ainda está em uso.

* Significa saboroso, na língua japonesa.

20

Os efeitos da capsaicina são melhores entendidos, em termos de suas ações excitatórias e

dessensibilizantes nos nociceptores polimodais. Os estudos eletrofisiológicos revelam que a

capsaicina despolariza os neurônios do GRD (consulte a Figura 1.1). Diminui sua resistência à

entrada de uma forma dependente da concentração, sugerindo que o efeito excitatório

específico da capsaicina nos neurônios nociceptivos envolve um aumento na permeabilidade

da membrana aos íons, tais como Na+ e/ou Ca2+. Estudos subsequentes mostraram que a via

de permeabilidade iônica discrimina mal entre os cátions, com os bivalentes sendo

relativamente mais permeáveis aos monovalentes.

A descoberta da resiniferatoxina – um análogo ultrapotente da capsaicina que imita as ações

celulares e de um antagonista potente – capsazepina – sugeriram fortemente a existência de

um receptor de capsaicina específico.

TRPV1

O canal de cátion do receptor de potencial transitório, da subfamília vaniloide (TRPV), membro

um (TRPV1) é o receptor da capsaicina. Foi clonado usando um ensaio de influxo do Ca2+ em

células não neuronais, transfectada com ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA)

construído a partir do ácido ribonucleico (RNA) do GRD5. A análise eletrofisiológica provou que

o receptor clonado era semelhante ao receptor da capsaicina natural dos neurônios sensoriais,

de várias maneiras. As correntes evocadas da capsaicina foram reversíveis na remoção do

ligante e as concentrações inferiores nas respostas máximas evocadas da resiniferatoxina, a

qual persiste após a remoção do ligante. As curvas de ativação para a corrente capsaicina nos

canais naturais e no receptor clonado revelaram coeficientes de dois – equação de Hill –

sugerindo a existência de mais de um sitio de ligação da capsaicina.

Os canais do TRPV1 não são ativados somente pela capsaicina, mas também por prótons com

pH abaixo de 6.5 e por temperaturas elevadas, confirmando os estudos anteriores mostrando

que as correntes evocadas pelo calor, pH baixo e capsaicina são comumente encontradas no

mesmo neurônio sensorial. Interessantemente, o canal do TRPV1 é o único membro da

subfamília vaniloide que é ativado pela capsaicina: o nocaute* do TRPV1, em humanos e

camundongos, resulta em insensibilidade a capsaicina6, 7. Analisaremos, os efeitos do pH baixo

no canal do TRPV1 junto com seu efeito em outros canais de íons, em seção posterior.

Estudos anteriores mostraram que as correntes evocadas pelo calor e pela capsaicina são

encontradas comumente no mesmo neurônio sensorial. Isto levantou a possibilidade de que o

canal do TRPV1 era um detector de temperatura, o que habilita os nociceptores térmicos a

responder a uma faixa de temperaturas quentes. Então se fosse assim, em animais no qual o

TRPV1 foi nocauteado, esperaria um déficit na responda para aquelas temperaturas quentes

que ativam o TRPV1. Paradoxalmente, nos camundongos em que o canal do TRPV1 foi

nocauteado, os déficits exibidos na resposta a temperaturas quente, acima de 50°C,

considerando que o canal do TRPV1 é ativado nas temperaturas igual ou superior a 42°C.

* Nocaute: técnica genética que consiste em desabilitar a expressão de um gene específico num organismo.

21

Embora, estes animais foram prejudicados na detecção do calor doloroso, é claro que

normalmente usam um mecanismo alternativo, diferente do canal de cátions do TRPV1, para

detectar calor nocivo a temperaturas inferiores a 50°C ou têm um mecanismo de auxilio.

Lembre-se que os estímulos nocivos intensos resultando na lesão tecidual, frequentemente

conduzirem a um aumento na resposta a estímulos dolorosos subsequentes, referido como

hiperalgesia, em que a hiperalgesia primária é devido à sensibilização do nociceptor periférico

ou a hipersensibilidade. Interessantemente, os camundongos de nocaute do TRPV1 exibiram

pouca hipersensibilidade térmica no local da inflamação tecidual do que os camundongos do

tipo selvagem expostos à hipersensibilidade normal. Retornaremos a esta conclusão em seção

posterior quando consideramos os mecanismos de hiperalgesia.

Todos nós, provavelmente, estamos familiarizados com a dor em queimação, produzida pela

aplicação de tinturas alcoólicas, tal como a tintura de iodo, em feridas na pele. A sensação de

queimação levanta a possibilidade de que o etanol pode ativar o canal de cátions do TRPV1.

Para testar essa ideia, o efeito do etanol nos neurônios isolados do gânglio trigeminal ou GRD,

como também nas células HEK293 para expressar o TRPV1, foi investigado8. Verificou-se que o

etanol ativa o TRPV1 e potencializa as respostas a capsaicina e outros ativadores do TRPV1;

apoiando a noção de que o álcool provoca uma sensação de queimação, ativando o TRPV1.

As incertezas e os pressupostos associados à utilização isolada e os cultivados dos neurônios

do gânglio trigeminal e do GRD, como também células preparadas a expressar o canal de

cátions do TRPV1, tornam essencial que essas conclusões sejam verificadas cuidadosamente e

mostrando a refletir o que acontece in vivo.

TRPV1 como alvo terapêutico

Em contraste com a hiperalgesia – sensibilidade excessiva ou sensibilidade à dor – após

intensos estímulos nocivos, a exposição à capsaicina pode resultar em dessensibilização

subsequente.

Considerando que a dessensibilização comparativamente as doses baixas podem ser específica

a capsaicina e seus congêneres, as doses altas estão associadas a uma perda da capacidade de

resposta a outros estímulos mecânicos nocivos – limiar alto, químicos e calor. Esta

dessensibilização cruzada aos estímulos nocivos pela capsaicina sugere o seu o uso ou um

análogo como um analgésico. Evidentemente o objetivo final, ainda não alcançado, é

encontrar um análogo a capsaicina que induz a analgesia, sem primeiro causar dor.

A dessensibilização pela capsaicina está bem documentada, como o grau depende da

concentração, com que frequência é aplicada e por quanto tempo. A dessensibilização

induzida pela capsaicina foi observada tanto por atividade de registro nos neurônios do GRD

(consulte a Figura 1.1), assim como pelo monitoramento da reação comportamental – a dor.

Com doses baixas, aplicada em intervalos de tempo adequados, a dessensibilização não

necessariamente acontece de maneira que a excitação dolorosa possa ser reproduzida com

cada aplicação de capsaicina. Com doses altas ou exposição prolongada, a dessensibilização

22

decorre em aplicações consecutivas de capsaicina e se torna menos eficaz ou deixar de

produzir qualquer efeito.

Recentemente, um método novo para a produção de analgesia, usando a capsaicina em

combinação com um anestésico local impermeável a membrana (QX-314) foi descrito9. QX-314

é um bloqueador carregado positivamente dos canais de sódio controlados por voltagem

(NaV), que inibe os potenciais de ação quando aplicado intracelularmente, mas o bloqueio

falha quando aplicado extracelularmente. A ideia era introduzir QX-314 intracelularmente aos

neurônios sensíveis à dor através do canal de cátions do TRPV1 aberto, evitando assim os

efeitos motores e táteis que ocorrem com aplicação extracelular do anestésico local, como na

lidocaína. Todos nós provavelmente experimentamos a inibição do controle motor e da

sensação tátil com o uso do anestésico local durante procedimentos odontológicos. Uma

limitação do tratamento da combinação é o mesmo com o uso da capsaicina por si só, isto é a

própria capsaicina provoca uma sensação dolorosa, com a combinação era esperado o efeito

durante o uso do QX-314.

A inibição do canal de cátions do TRPV1 parece ser uma abordagem simples para produção de

analgesia. Entretanto, a situação não é que simples; após a identificação do canal do TRPV1 em

nociceptores, uma variedade dos tipos de célula, incluindo: os queratinócitos, as células

pancreáticas, as células endoteliais, os linfócitos, os macrófagos e as células de diferentes

regiões do cérebro, mostraram também a expressar o TRPV1. Sua presença, em todos esses

tipos de células e em diferentes partes do corpo, sugere que o TRPV1 é estimulado

normalmente por um ligante endógeno – endovaniloide – e não por estimulação térmica.

Neste contexto é importante salientar, a qual existe evidências acumuladas sugerindo, que

ativação do TRPV1 por seu ligante endógeno é essencial para a manutenção da temperatura

corporal interna. A capsaicina, além de causar a sensação de queimação, provoca também

hipotermia, em uma variedade de animais e a introdução dos antagonistas do canal de cátions

do TRPV1 levam a hipertermia; em ratos, camundongos e macacos. Uma sugestão resultante

destes estudos é que os canais do TRPV1, na função da regulação de temperatura corporal,

são ativados tonicamente via um ligante endógeno. Porque os antagonistas do canal de

cátions do TRPV1 causam hipertermia é improvável que podem ser desenvolvidos para

utilização sistêmica, como agente autônomo ao tratamento da dor.

Uma possibilidade que deve ser considerada é que um endovaniloide produzido durante a

lesão tecidual e assim faz uma mediação na ativação do nociceptor. Por exemplo, o suposto

endovaniloide de N-araquidonoildopamina (NADA) foi identificado como uma molécula

endógena no sistema nervoso, em mamífero, que ocorre em vários núcleos do cérebro e do

GRD. Foi originalmente estudado porque ativa os receptores canabinoide e verificou-se

subsequentemente a ativar potencialmente o canal de cátions do TRPV1. Como seria esperado

para um ligante endógeno do canal do TRPV1 apurou-se que o NADA aumenta a frequência de

disparo do potencial de ação dos neurônios nociceptivos espinhal e melhora da resposta aos

estímulos térmicos. É necessário mais trabalho para determinar se o NADA ou outro

endovaniloide é de fato o ativador normal dos canais do TRPV1.

23

TRPV2

O canal de cátion do receptor de potencial transitório, da subfamília vaniloide, membro dois

(TRPV2) está intimamente relacionado com o receptor da capsaicina – TRPV1 – com o qual

compartilha 49% de identidade na sequencia. Entretanto o canal do TRPV1 é ativado pela

capsaicina e responde a temperaturas acima de 43°C, considerando que o canal do TRPV2 não

responde a capsaicina e responde às temperaturas igual ou superior a 52°C. O canal do TRPV2

é expresso em uma variedade de tecidos, incluindo várias regiões do cérebro, medula espinhal

e gânglio sensorial. Sua expressão nos tecidos que nunca são expostos a temperaturas tão

elevadas, como a 52°C, sugere que o canal de cátions do TRPV2 é normalmente ativado por

outros estímulos que não o calor nocivo nessas regiões do corpo.

No entanto, o canal do TRPV2 com base em sua similaridade com do TRPV1 e sua capacidade

de detectar estímulos de calor elevado igual ou superior a 52°C, parece ser um candidato

provável para detecção de sensações de calor nocivo, em nociceptores. Em estudo utilizando

uma preparação ex vivo de medula espinal, de gânglios da raiz dorsal da região torácica e

lombar superior, de nervos cutâneos dorsais e de pele dorsolateral do tronco de um lado, o

papel do canal de cátions do TRPV2 na sensação térmica nociva foi avaliado. Na preparação ex

vivo em que as terminações sensoriais do nociceptor permaneceram conectadas ao corpo

celular do GRD. Os nociceptores, em preparação ex vivo, seriam esperados a ter propriedades

mais próximas das células in vivo em relação às células isoladas do GRD, pelo tratamento

enzimático e cultivadas antes da sua utilização (consulte Seção – I). Usando a preparação ex

vivo, em animais para os quais o canal do TRPV1 foi nocauteado, mostra que uma maior

população de nociceptores, na qual o canal do TRPV2 não foi expresso conforme determinado

pela coloração imuno-histológico, responde normalmente ao calor nocivo de 31°C a 52°C.

Este estudo mostra que existe uma população de nociceptores que, em condições normais,

não exigem a presença do canal de cátions do TRPV1 funcional ou do TRPV2 para detectar

calor nocivo. Até que um camundongo em que o TRPV2 nocauteado tenha sido relatado, o

papel do canal de cátions do TRPV2 na sensação de calor nocivo permanecerá indeterminado.

TRPV3

A cânfora é um composto natural que atualmente utilizado como ingrediente ativo, em gel

anticoceira, pelo mercado. Foi demonstrado a aumentar a intensidade das sensações cutâneas

produzidos durante o aquecimento da pele, consistente com a ativação do canal de cátion do

receptor de potencial transitório, da subfamília vaniloide, membro três (TRPV3).

O canal do TRPV3 está intimamente relacionado com do TRPV1 e do TRPV2, com os quais

compartilha 43% e 41% de sequencia na identidade, respectivamente. O canal de cátions do

TRPV3 possui um limiar único: é ativado a temperaturas inócuas com limiar de ativação em

torno de 33°C a 35°C e apresenta respostas crescentes em temperaturas nocivas mais altas.

Conforme relatado, os camundongos de nocaute do TRPV1 e do TRPV3 exibem déficits

comportamentais em resposta a temperaturas ao calor igual ou superior a 50°C. Esta

24

constatação sugere que o TRPV3 e o TRPV1 têm funções sobrepostas na sensação de calor

nocivo. No entanto, em contraste os camundongos de nocaute do TRPV1, o déficit em

hiperalgesia ao calor não foi observado em camundongos de nocaute do TRPV3.

TRPV4

O canal de cátion do receptor de potencial transitório, da subfamília vaniloide, membro quatro

(TRPV4) é um canal de cátion não seletivo permeável ao Ca2+ que compartilha 40% a

identidade de aminoácidos com o canal do TRPV1. Exibe propriedades de comporta

excepcionais sendo ativado por soluções hipotônicas, como certos derivados do éster de forbol

e por temperaturas inócuas, na faixa de 27°C a 34°C.

A ativação por soluções hipotônicas sugere que serve como um sensor para osmolaridade e/ou

do estiramento mecânico associados com o edema celular. Além disso, o TRPV4 é ativado por

um processo envolvendo o citocromo P450 de formação dependente da epoxigenase dos

ácidos epoxieicosatrienoico: concentrações submicromolar do ácido 5',6'-epoxieicosatrienoico

ativa o TRPV4. Estes resultados indicam que o TRPV4 pode ser ativado por uma variedade de

estímulos físicos e químicos, os quais podem ou não compartilhar um mecanismo comum.

Os camundongos de nocaute do TRPV4 exibem várias anormalidades nas funções fisiológicas

que são equiparáveis com o conhecido das propriedades de comporta no canal. Também,

apresentavam anormalidades na regulação osmótica e uma acentuada redução à sensibilidade

a pressão da cauda. Se o canal de cátions do TRPV4 desempenha um papel na hiperalgesia

térmica é controverso. Um estudo10 concluiu que os camundongos de nocaute do TRPV4

apresentam uma hiperalgesia reduzida de 35°C a 45°C, mas não de 50°C enquanto outro

grupo11 diferente não conseguiu encontrar um papel ao canal do TRPV4 na hiperalgesia

térmica. Além disso, o primeiro estudo falhou em conseguir encontrar alterações no

comportamento térmico agudo em camundongos de nocaute do TRPV4, considerando que o

último estudo encontrou latências de retirada por mais tempo durante o aquecimento agudo

da cauda de 45°C a 46°C, sugerindo algum papel ao canal do TRPV4 na nocicepção ao calor.

Consideraremos o papel do canal do TRPV4 na detecção de estímulos mecânicos nocivos, na

Seção – IV, quando considerarmos o papel da ativação do receptor ativado por protease dois

(PAR2) na hiperalgesia mecânica.

Em resumo, os canais de cátions do TRPV analisados por estudos de nocaute genético (veja a

Tabela 3.1), o TRPV1 e o TRPV3 mostraram desempenhar um papel na nocicepção térmica. O

TRPV1 é necessário na hiperalgesia térmica, enquanto o TRPV3 é dispensável nesta função. Até

mais estudos serem realizados, o papel do TRPV4 continuará a ser controverso.

Tab. 3.1 – Os efeitos nos camundongos de nocaute do TRPV.

Canais Déficits na resposta de temperaturas nocivas Déficits na hiperalgesia

TRPV1 > 50°C Pouca térmica TRPV2 Não relatado Não relatado TRPV3 > 50°C Não observado TRPV4 Controverso Controverso

25

Estas conclusões tornam claro que os combinados de nocaute desses canais (TRPV1/TRPV3,

TRPV3/TRPV4 e TRPV1/TRPV3/TRPV4) são desejáveis, se quisermos entender mais plenamente

o papel dos canais do TRPV na nocicepção. Um mutante de nocaute do TRPV2 não foi

divulgado e seu papel na sensação de calor nocivo continua a ser avaliado.

TRPA1

Os canais de cátions do receptor de potencial transitório, da subfamília anquirina, membro um

(TRPA1) são expressos heterologos e ativados por compostos irritantes como: sementes de

mostarda, wasabi*, raiz-forte, óleo de gaultéria, canela, alho, emissões do escapamento de

veículos e gás lacrimogêneo; os quais despertam uma sensação dolorosa em queimação ou em

picada.

O canal do TRPA1 é expresso em neurônios do GRD e no ouvido interno; no entanto, o TRPA1

não é essencial aparentemente à detecção inicial do som pelas células ciliadas. O papel do

TRPA1 como sensor de frio nocivo foi controverso; os camundongos de TRPA1 quando

expressados em células CHO são ativados a temperaturas perto de 17°C, o que está próximo

do limiar do frio nocivo a seres humanos12 – 15°C. A controvérsia resultou quando ortologos,

rato e humano, do TRPA1 expressos em qualquer uma linha de célula do rim embrionária

humana (HEK293) ou ovócitos de Xenopus não foram ativados pelo frio13. Posteriormente,

outro grupo14 não conseguiu obter ativação pelo frio em camundongos de TRPA1 expressos

heterologos nas células HEK293. Ainda um quarto estudo15 concluiu que os camundongos de

TRPA1 expressados em células HEK293 são um canal ativado pelo frio, que apoia as conclusões

anteriores que o TRPA1 responde ao frio nocivo. A controvérsia também foi estendida a

camundongos de nocaute do TRPA1. As respostas nociceptivas comportamentais ao contato

com uma superfície fria ou ao esfriamento evocado pela evaporação da acetona foram

avaliadas por dois grupos diferentes16, 17; com procedente conclusão de uma falta de

envolvimento do TRPA1 na detecção aguda ao frio e o outro concluindo uma reduzida

sensibilidade ao esfriamento. Estas conclusões contraditórias, sobre a ativação ao frio no canal

do TRPA1, parecem ter sido resolvidas pelo trabalho subsequente.

Um estudo18, em camundongos, no quais todos os neurônios sensoriais expressando o canal

de sódio ativado por voltagem de subunidade alfa do tipo VIII (NaV1.8, veja na Seção – V)

resistente ao tetrodotoxina (TTX-R) foram eliminados, mostrando resistência ao frio nocivo,

avaliados usando uma placa fria a 0°C. Esta conclusão foi semelhante ao que foi observado em

camundongos de nocaute do TRPA1 utilizando uma placa fria a 0°C. Significativamente, os

camundongos de nocaute do NaV1.8 também apresentaram uma redução significativa na

expressão do TRPA1 em neurônios do GRD e a falta de uma resposta nociceptiva ao TRPA1

mediado ao formol (veja a Seção – V). Além disso, um estudo19 posterior forneceu uma

explicação plausível às discrepâncias nos trabalhos anteriores descritos acima e concluiu que o

TRPA1 atua como um sensor ao frio, in vitro e in vivo.

* Rabanete japonês

26

Em contraste ao debate sobre o papel do canal de TRPA1 como um sensor de frio nocivo, o

papel na excitação do nociceptor evocado pela bradicinina (BK) e hipersensibilidade a dor, não

foi controverso. A BK é um peptídeo contendo nove resíduos de aminoácidos – nonopeptídeo,

que é liberado em tecidos inflamados onde induz a dor e a hipersensibilidade mecânica e

térmica. As injeções de BK, em camundongos de nocaute do TRPA1, foram muito menos

dolorosas e mostraram pouca ou nenhuma prova de hipersensibilidade térmica ou mecânica.

Ambas as consequências são esperadas se o canal de TRPA1 faz uma mediação às ações da BK.

Veremos mais profundamente os efeitos da BK no TRPA1, junto com seu efeito sobre TRPV1 e

outros canais de cátions na Seção – V.

TRPM8

A capacidade do canal de cátion do receptor de potencial transitório, da subfamília

melastatina, membro oito (TRPM8) recombinante em ser ativado pelo frio, é amplamente

aceito. O canal do TRPM8 é ativado por agentes de esfriamento, como mentol ou

temperaturas abaixo de 26°C. Além disso, três estudos independentes utilizando os

camundongos de nocaute do TRPM8 indicam que o TRPM8 está envolvido na sensação de frio

nocivo.

A dor induzida, pelo esfriamento de evaporação na pata, foi medida com observação das

respostas de lambida e encolhimento da pata estimulada, em camundongos normais e de

nocaute do TRPM8: os camundongos de nocaute manifestam comportamento

significativamente reduzido em comparação com os normais20. Um resultado semelhante foi

encontrado por outro grupo21 que, além disso, constataram: “*…+ injeção de icilina, um

composto sintético que ativa a TRPM8, em muito menor grau o TRPA1, na pata traseira dos

camundongos de tipo selvagem causa a indução rápida retirada da pata traseira, quando o

camundongo é colocado sobre uma placa fria de 1°C. Este comportamento é completamente

removido, em camundongos de nocaute do TRPM8, sugerindo que a ativação do TRPM8 pode

obter como uma reposta nociceptiva”. O terceiro grupo22 também encontrou uma resposta

nociceptiva reduzida ao esfriamento por evaporação na pata, em camundongo de nocaute do

TRPM8. Além disso, estes pesquisadores também verificaram que após o ferimento causado

pela constrição da ligadura do nervo ciático, em camundongos normais, os quais apresentaram

uma maior sensibilidade à acetona, com lambida prolongada e agitação da pata. Enquanto os

camundongos de nocaute do TRPM8 exibiram aumento não significativo na resposta ao

esfriamento pela evaporação na pata. Estes dados indicam claramente que o canal de TRPM8

está envolvido na sensação de frio nocivo.

Os camundongos de nocaute do TRPM8 mantém um número neurônios sensíveis ao frio,

indicando que o TRPM8 não é receptor ativado só pelo frio. A combinação de nocaute dos

TRPA1 e TRPM8 poderia ajudar a explicar o papel relativo do TRPA1 e do TRPM8 na detecção

do frio nocivo.

27

IV – Mediadores Químicos

Em longo prazo, uma das metas de investigação da dor é identificar os mediadores químicos,

liberados dos tecidos feridos ou doentes, que são responsáveis pela ativação e sensibilização

dos nociceptores.

Os mediadores químicos interagem com canais de íons na membrana plasmática do nociceptor

utilizando os mecanismos de sinalização, como os usados em outra parte do sistema nervoso.

Esses mediadores podem agir quer diretamente nos canais de íons controlados por ligante

(LGICs) – receptores ionotrópicos – ou indiretamente por – receptores metabotrópicos – via os

receptores acoplados à proteína G (GPCRs) ou os receptores da tirosina quinase (RTKs), reveja

a Seção – II.

Os pesquisadores em dor distinguem dois aspectos da sensibilização: alodinia – dor resultante

do estímulo normalmente inócuo; e hiperalgesia – uma resposta realçada ao estímulo

normalmente não doloroso.

Serotonina

Em seres humanos, a injeção de serotonina (5-hidroxitriptamina – 5HT) produz dor e

hiperalgesia. A origem da 5-HT humana são as plaquetas que são conhecidas por desempenhar

um papel importante na inflamação, in vivo.

Em suporte a essa ideia é a constatação de que a injeção cutânea de plaquetas provoca dor

aguda e hiperalgesia23. De maneira diferente das terminações nervosas dos neurônios

contendo 5-HT, as plaquetas não sintetizam 5-HT e pelo contrário dependem de absorção do

plasma. De maneira interessante, a proteína responsável pela absorção da 5-HT na plaqueta

humana é idêntica ao transportador da 5-HT no cérebro. Os inibidores seletivos da recaptação

de serotonina usados no tratamento da depressão reduzem significativamente à concentração

da 5-HT nas plaquetas, em pacientes deprimidos24. Uma suposição razoavelmente pode ser

que, nestes pacientes, exista uma redução significativa de liberação da 5-HT das plaquetas, no

tecido lesado ou inflamado, resultando em redução na dor induzida pela 5-HT.

A família dos receptores da 5-HT nos mamíferos é ampla, agrupados em sete tipos – 5-HT1 a

5HT7 – consistindo de 14 subtipos de receptores diferentes. Embora a 5-HT conhecida em

desempenhar um papel importante na nocicepção, existe apenas uma avaliação limitada dos

subtipos do receptor da 5-HT envolvidos neste processo e ainda interagem entre si e com

outros mediadores químicos da nocicepção.

Receptor 5-HT2A

A injeção intraplantar de 5-HT ou -metil-5-HT – um agonista do receptor da

5-hidroxitriptamina do tipo dois e subtipo A (5-HT2A), em ratos reduz significativamente a

28

latência de retirada da pata à estimulação ao calor radiante. Além disso, o pré-tratamento25

com cetanserina – um antagonista do receptor 5-HT2A – atenua a resposta comportamental

após a injeção da 5-HT. Estes resultados sugerem que o receptor 5-HT2A está envolvido na

hiperalgesia induzida pela 5-HT no ferimento agudo ou na inflamação. Estas conclusões foram

ampliadas, mostrando que a inibição do receptor 5-HT2A, em ratos: por injeção local –

intraplantar – de sarpogrelata bloqueia a hiperalgesia primária térmica26. A injeção sistêmica

de sarpogrelata27 bloqueia a hiperalgesia térmica induzida por adjuvante de Freund completo

(CFA). A injeção local de cetanserina produziu inibição dose dependente da hiperalgesia

evocada pela carragenana28. Juntos estes resultados sugerem que a 5-HT tem um papel

principal na hiperalgesia resultante do ferimento tecidual por ativação dos receptores 5-HT2A

nos terminais nervosos do nociceptor.

O receptor 5-HT2A é um GPCR e sua ativação leva a despolarização do potencial de membrana

em repouso dos neurônios do GRD isolados agudamente de ratos. Nas células exibindo uma

resposta mediada pelo receptor 5-HT2A, a 5-HT e a -metil-5-HT despolarizam o potencial de

membrana em repouso e diminui a permeabilidade da membrana (reveja a Seção – II), medido

eletricamente como um aumento da inclinação na relação da voltagem de corrente da

membrana (veja adiante). Nas células agudamente isoladas que revelaram uma despolarização

mediada pelo receptor 5-HT2A e o potencial de reversão (Erev) a despolarização era linearmente

relacionada ao logaritmo da concentração de potássio [K+] extracelular, indicando que a

despolarização resultou de uma diminuição permeabilidade ao potássio (PK) em repouso29.

Potencial de receptor

A fim de entender os diferentes mecanismos pelos quais os canais de íons despolarizam a

membrana plasmática – potencial de receptor – consideremos uma situação idealizada:

Fig. 4.1 – Despolarização do potencial de receptor.

A mesma despolarização do potencial de receptor pode ser gerada por um aumento da permeabilidade ao sódio (PNa) ou uma diminuição da permeabilidade ao potássio (PK).

29

As duas situações ilustradas na Figura 4.1 são para uma célula que tem permeabilidade de

repouso ao íon sódio (Na+) e ao potássio (K+) e os seus respectivos potenciais de equilíbrio ao

sódio (ENA) e ao potássio (EK). A despolarização da membrana resulta do aumento da razão a

permeabilidade ao sódio (PNa) em relação a permeabilidade ao potássio (PK), ou seja a

permeabilidade ao aumento do Na+ em relação ao K+. Idealmente, isso pode acontecer

quando: a PNa aumenta e a PK permanece a mesma, conforme lado esquerdo da ilustração,

maior permeabilidade provoca uma redução na inclinação da resistência; ou quando, a PNa

permanece a mesma e a PK diminui, menor permeabilidade provoca um aumento na inclinação

da resistência, como no lado direito.

Canais K2P

Os canais de potássio de dois poros (K2P) (reveja a Figura 2.4 – B) são considerados responsáveis

pela PK em repouso nas células. Portanto, parece razoável especular que a diminuição da PK

resulta do fechamento dos canais K2P nas células do GRD avaliadas.

Em um sistema de expressão heterólogo30, tem se mostrado os efeitos excitatórios de um

GPCR ocorre via inibição de alguns canais de K2P. O canal K2P2.1 (TREK-1) é amplamente

colocalizado com o canal de TRPV1 tornando um candidato a um dos canais responsáveis pela

PK em repouso dos nociceptores. Além disso, quando o canal K2P2.1 é nocauteado, os animais

são mais sensíveis aos estímulos mecânicos de limiar baixo e exibem um aumento na

hiperalgesia mecânica e térmica em condições de inflamação31.

Seria interessante determinar se o canal K2P2.1 ou algum outro canal K2P está envolvido na

resposta mediada por 5-HT2A. Se o fechamento dos canais de K+ podem causar dor como estas

conclusões indicam, em seguida, outra conclusão a tirar este trabalho é que a abertura dos

canais de K+ em nociceptores é, potencialmente, um mecanismo importante na

antinocicepção. Voltaremos a esta ideia, quando considerarmos o papel dos canais de K+ na

antinocicepção induzida por agonistas do receptor de opioide.

Receptores 5-HT3

Em contraste com todos os outros receptores da serotonina que são GPCRs, o receptor da

5-hidroxitriptamina do tipo três (5-HT3) é um LGIC constituído de cinco monômeros, formando

uma região central de poro (consulte a Figura 2.4 – A). Foram identificados cinco subunidades,

os subtipos 5-HT3A a 5-HT3E, os receptores funcionais 5-HT3A homomérico e os 5-HT3A/B

heteromérico verificaram ser expressos em neurônios. Exibindo uma resposta ao receptor

5-HT3 em neurônio do GRD, a 5-HT e 2-metil-5HT produziram uma despolarização com

diminuição da resistência de entrada. Além disso, o Erev para a resposta da despolarização ficou

menos negativo quando a [K+] extracelular foi elevada a 10 mM e a despolarização foi

convertida a hiperpolarização em uma solução de Na+ livre, indicando que a resposta do

receptor 5-HT3 resultou de um aumento da permeabilidade ao Na+ e K+.

30

Os estudos em camundongos de nocaute do 5-HT3A levam os autores à interpretação que os

receptores 5-HT3 não estão envolvidos na dor aguda, mas são necessários na dor persistente.

Usando o teste de formalina (veja adiante) descobriram que a primeira fase no

comportamento de dor não difere entre os camundongos do tipo selvagem e do mutante. Em

contraste, a segunda fase no comportamento de dor foi significativamente reduzida em

animais mutantes, indicando que os receptores 5-HT3 são importantes à dor persistente32.

Além disso, observou também uma redução significativa no comportamento da segunda fase

do teste de formalina após a administração intratecal – espaço subaracnoide – de um

antagonista de receptor 5-HT3, sugerindo que os receptores 5-HT3 são afetados na medula

espinhal.

Teste de formalina

O teste de formalina é amplamente usado para avaliar os efeitos dos compostos analgésicos

em animais de laboratório. Os estímulos nocivos em camundongos é uma injeção de solução

diluída de formalina debaixo da pele na superfície dorsal da pata traseira. A resposta é a

quantidade de tempo que os animais passam lamber a pata injetada. Existem dois períodos

distintos de lambida, uma fase precoce dura os primeiros 5 minutos e uma fase tardia dura de

20 a 30 minutos após a injeção. Em geral acreditasse que a fase precoce é devido a um efeito

direto nos nociceptores.

Bradicinina

Em seres humanos, a injeção intradérmica de bradicinina (BK) dose dependente produz dor e

hiperalgesia de calor, indicando que a BK tanto excita como sensibiliza os nociceptores33. A BK

é um polipeptídeo formado no sangue; provoca contração do músculo liso não vascular,

potente vasodilator de alguns vasos sanguíneos, aumenta a permeabilidade vascular e o mais

importante ao nosso propósito está envolvida no mecanismo de dor.

A inflamação local seguinte à lesão tecidual aciona a liberação de BK (nonapeptídeo

H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH), produzida pela calicreína mediada clivagem

enzimática de cininogenênio no local do ferimento ou inflamação tecidual. As calicreínas são

proteases de serina que liberam as cininas – BK e calidina – dos cininogênios – cininogênio de

alto peso molecular e de baixo peso molecular. A calicreína dos tecidos humanos libera

preferencialmente a calidina (decapeptídeo Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH) dos

cininogênios. A pré-calicreína é a precursora da calicreína e só pode ativar as cininas depois de

ativadas durante o ferimento ou inflamação tecidual.

Uma vez formada a BK é degradada por duas enzimas: a carboxipeptidase-N, conhecida

também como cininase-I; e a enzima conversora de angiotensina (ECA), também chamada

cininase-II. A cininase-I transforma BK e calidina em seus metabolitos ativos, des-Arg9-BK

e Lis-des-Arg9-BK, ou seja, BK e calidina sem seus resíduos de arginina no terminal-C. A ECA

remove o dipeptídeo do terminal-C da BK ou Lis-BK, que conduz à sua desativação.

31

Os inibidores da ECA conduzem a um aumento de BK devido à diminuição da degradação e

também uma diminuição da angiotensina – um vasoconstrictor – que são utilizados no

tratamento da hipertensão arterial. Sugeriu-se que alguns efeitos da redução da pressão da

arterial dos inibidores da ECA podem ser devido a seus efeitos sobre a BK.

Receptores B1 e B2

As ações da BK são mediadas por meio de dois GPCRs – o receptor B1 de bradicinina (B1) e o

receptor B2 de bradicinina (B2). A BK ativa os receptores B2 enquanto os receptores B1

apresentam maior afinidade a des-Arg9-BK, ou seja, o receptor B1 é seletivo ao metabólito da

cinina, sem o resíduo de arginina no terminal-C.

Os receptores B2 são constitutivamente expressos em neurônios do GRD e acredita-se que seja

o subtipo do receptor da bradicinina funcional predominante nos tecidos não traumatizados.

Por outro lado, os receptores B1 não são normalmente expressos constitutivamente de

extensão significativa, mas são de forma ascendente durante a inflamação crônica. Como o

receptor B1 não está presente em tecidos não inflamados é um alvo atraente ao

desenvolvimento de antagonistas, como poderiam ser esperados a causar poucos efeitos

indesejados.

Uma vez que o receptor B2 é um GPCR, tem de haver um canal de íon que seja ativado

descendentemente no B2. Além disso, dado que a ativação do receptor B2 provoca hiperalgesia

térmica e que os camundongos de nocaute do TRPV1 apresentam pouca hipersensibilidade

térmica no local da inflamação tecidual, é plausível que o TRPV1 pode ser o canal de íons que

age descendente sobre a BK.

Em dois estudos de camundongos de nocaute do TRPV1, a BK obteve disparos do potencial de

ação em fibras C, em ambos os casos não houve nenhuma diferença na resposta inicial aos

camundongos de nocaute em comparação aos camundongos normais. Em um dos estudos a

resposta aos camundongos de nocaute foi menos persistente do que aos camundongos

normais34, enquanto no outro não houve nenhuma diferença significativa35. Estas conclusões

sugerem que o canal do TRPV1 contribui, mas não é necessária ao receptor B2 mediada

excitação do nociceptor.

Por outro lado, a injeção de BK intraplantar produziu hipersensibilidade térmica substancial em

camundongos de tipo selvagem, mas não em camundongos de nocaute do TRPV1,

demonstrando que o canal do TRPV1 é necessário, in vivo, ao desenvolvimento da

hipersensibilidade térmica induzida pela BK36.

Modelos moleculares

A ativação da maioria das células pela bradicinina (BK) é mediada pela fosfolipase C (PLC) e/ou

fosfolipase A2 (PLA2), por conseguinte estas são as vias bioquímicas que provavelmente

medeiam entre o receptor B2 e o canal do TRPV1 (veja a Figura 4.2 – A – B).

32

BK – bradicinina; B2 – receptor B2 de bradicinina; G – proteína G e subunidades alfa, beta e gama;

PLC-– fosfolipase C-beta; PIP2 – fosfatidilinositol difosfato; IP3 – inositol trifosfato; DAG – diacilglicerol;

PKC – proteína quinase C épsilon; P – fosforilação; TRPV1 – canal do receptor de potencial transitório da vaniloide um.

BK – bradicinina; B2 – receptor B2 de bradicinina dois; G – proteína G subunidade? ; PLA2 – fosfolipase A2;

AA – ácido araquidônico; COX – ciclooxigenase; AINE – anti-inflamatório não esteroidal; PGI2 – prostaglandina I2; IP – receptor fosfato de inositol; PGE2 – prostaglandina E2; EP – receptor de prostanoide E;

Gs – proteína G estimulante; AC – adenilato ciclase; ATP - trifosfato de adenosina; cAMP – monofosfato de adenosina cíclico; PKA – proteína quinase A; P – fosforilação; TRPV1 – canal do receptor de potencial transitório da vaniloide um,

LOX – lipoxigenase; 12-HPETE – ácido hidroperoxieicosatetraenoico.

BK – bradicinina; B2 – receptor B2 de bradicinina; G – proteína G e subunidades alfa, beta e gama;

PLA2 – fosfolipase A2; AA – ácido araquidônico; COX – ciclooxigenase; AINE – anti-inflamatório não esteroidal; PGE2 – prostaglandina E2; EP – receptor de prostanoide E; Gs – proteína G estimulante; AC – adenilato ciclase;

ATP – trifosfato de adenosina; cAMP – monofosfato de adenosina cíclico; PKA – proteína quinase A; P – fosforilação;

PLC- – fosfolipase C-beta; PIP2 – fosfatidilinositol difosfato; DAG – diacilglicerol; IP3 – inositol trifosfato; Ca2+ – íon cálcio; RE – retículo endoplasmático; TRPA1 – canal de cátions do receptor de potencial transitório da anquirina um.

Fig. 4.2 – Modelos esquemáticos implicados na modulação da bradicinina.

O esquema mostra a vias bioquímicas que são implicadas na modulação da bradicinina (BK) ao receptor

B2 de bradicinina (B2), via: A – PLC- ao TRPV1; B – PLA2 ao TRPV1; C – PLA2 e PLC- ao TRPA1.

33

A grande parte das evidências que suportam esse modelo vem das experiências usando os

corpos celulares neuronais do GRD ou dos sistemas de expressão heterólogos. É importante

ter em mente que as incertezas e as suposições associadas com esses procedimentos tornarem

essenciais e as conclusões devem ser verificadas com muito cuidado e demonstradas se

assemelham ao que ocorre realmente, in vivo.

B2 – via PLC- TRPV1

O receptor B2 é acoplado à enzima fosfolipase C-beta (PLC-) via proteína de ligação

nucleotídeo guanosina Gq/11 (veja a Figura 4.2 – A).

Os heterotriméricos das proteínas G; alfa, beta e gama (G) da família Gq/11 estimulados

pela PLC- via membros da família Gq/11 (Gq, G11, G14 e G15/16). As diferentes

subunidades, cinco e de doze , foram descritas permitindo inúmeras possibilidades de

coexpressão às subunidades , e . A composição exata da subunidade a acoplada Gq/11 ao

receptor B2 é desconhecida e indicada na ilustração como Gq/11.

A ligação da BK ao receptor B2 leva a ativação do Gq/11, via troca do trifosfato de guanosina

(GTP) por difosfato de guanosina (GDP) no sitio da ligação do nucleotídeo e a dissociação das

subunidades . Em transformar Gq/11 ativada ligada com GTP ativa a enzima PLC- que

hidrolisa PIP2 (fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato) a forma IP3 (inositol 1,4,5-trisfosfato) e DAG

(diacilglicerol). A subunidade Gq/11 é uma GTPase intrínseca, hidrolisando o fosfato terminal

da GTP para restaurar a GDP no sitio da ligação nucleotídeo levando a reassociação de Gq/11

com a subunidades assim retornando Gq/11 ao estado inativo.

A evidência disponível até sugere dois mecanismos possíveis pela qual a hidrólise modula a

atividade do PIP2 ao canal do TRPV1: quer por fosforilação do TRPV1 por ativação da proteína

quinase C (PKC) via DAG e/ou por depleção do PIP2 que normalmente atua a inibir o TRPV1.

Resumidamente, a evidência dos neurônios isolados do GRD e das células HEK293 expressando

o canal do TRPV1 e o receptor B2 demonstra que a estimulação com BK, ou ativação da PKC,

reduz o limiar da temperatura por ativação das correntes do TRPV137, 38. Além disso, a inibição

da proteína quinase C épsilon (PKCresulta em uma diminuição de 70% na sensibilização do

canal TRPV1 por BK39. Esta constatação não exclui um papel a outras isoformas da PKC em

desempenhar um papel na sensibilização do canal do TRPV1 por BK. Já que a PKC

normalmente ativada pela DAG é razoável supor que este é o mecanismo de ativação da

PKCem nociceptores.

No outro mecanismo, um estudo36 usando sistemas de expressão heterólogos, ficou

demonstrado que a diminuição em nível do PIP2 na membrana plasmática imita os efeitos da

potencialização da BK no canal do TRPV1. O papel do PIP2 na regulação do TRPV1 pode ser

mais complicado do que mostrado na ilustração: a evidência sugere um modelo no qual o PIP2

tem um efeito inibitório e ativador sobre o TRPV140. Uma ativação e o efeito inibitório

concomitante é o resultado de uma dependência da distribuição normal de atividade do canal

34

de TRPV1 sobre níveis do PIP2. Se níveis do PIP2 em repouso é elevado, que está à direita do

pico da curva de resposta da dose normal, uma diminuição moderada nos níveis dos PIP2

resultará em maior atividade do TRPV1, considerando que ainda diminua os níveis do PIP2 à

esquerda do pico resultará na inibição do canal. A exposição dos nociceptores contendo o

canal do TRPV1 a doses elevadas de capsaicina está associada com uma perda da capacidade

de resposta a capsaicina, bem como a outros estímulos nocivos mecânicos, químicos e calor

(reveja a Seção – III). Foi sugerido que doses elevadas de capsaicina ativa ao máximo o canal de

cátion do TRPV1, causando um grande influxo de Ca2+ que ativa PLC, assim a depleção do PIP2,

causando uma inibição profunda do canal do TRPV1, o qual é responsável pela perda da

capacidade de resposta a capsaicina e a outros estímulos.

B2 – via PLA2 TRPV1

A evidência cumulativa do número dos tipos de células demonstrou que os GPCRs podem

acoplar a PLA2, no entanto qual proteína G é usada para acoplar o receptor B2 a PLA2 no

nociceptores não tenha ainda sido determinada, por isso a interrogação assinalada entre B2 e

PLA2 (veja a Figura 4.2 – B).

A PLA2 ativada cataliticamente hidrolisa os fosfolipídios liberando o ácido araquidônico (AA).

As duas vias importantes do metabolismo do AA são as vias da ciclooxigenase (COX) e da

lipoxigenase (LOX). A via da COX forma compostos intermediários que em seguida são

convertidos em compostos ativos biologicamente, os quais incluem as prostaglandinas –

prostaglandina E2 (PGE2) e prostaglandina I2 (PGI2) – enquanto a via da 12-LOX produz o ácido

12-hidroperoxieicosatetraenoico (12-HPETE). Assim, os mediadores dos lipídios – PGE2, PGI2 e

12-HPETE – são conjeturados a serem produzidos em nociceptor em resposta a BK.

Apesar de estarmos considerando o papel da PGE2, PGI2 e 12-HPETE na mediação dos efeitos

da BK, devem ser mantido em mente que estes mediadores dos lipídios não têm de ser

produzidos no nociceptor onde agem. Também pode ser produzida por outras células

próximas durante o ferimento tecidual – não necessariamente em resposta a bradicinina – e

então difundem ao nociceptor; isto é conhecido como: sinalização paracrina.

12-HPETE

Primeiro, considere as evidências que apoiam a via do AA LOX 12-HPETE. Os

experimentos com neurônios do GRD cultivados e fibras nervosas cutâneas na preparação de

nervo-pele, in vitro, demonstraram que a BK agindo através do receptor B2, excita terminações

nervosas sensoriais ativando o canal do TRPV1 via a produção de metabólitos da LOX do AA41.

Além de a BK estimular diretamente na produção de 12-HPETE, que foi mostrado em um

sistema de expressão para ativar diretamente o canal do TRPV142.

Não é claro até que ponto esta via normalmente contribui ao receptor B2 mediada excitação

do nociceptor dada à evidência, discutida acima, os camundongos de nocaute do TRPV1, que

ativação do canal do TRPV1 não é necessária à ativação do nociceptor pela BK34, 35.

35

PGE2

É preciso considerar que a PGE2 por si só provoca dor e hiperalgesia térmica. A injeção

intraplantar de PGE2, em pata traseira de camundongos, dose dependente produz de curta

duração o comportamento de lamber a pata – nociceptivo – quando comparado com os

animais de controle43. Além disso, houve uma redução na latência da retirada de pata –

hiperalgesia térmica – após a injeção de PGE2 intraplantar, que foi significativamente reduzida

em camundongos de nocaute do canal TRPV144. Além do mais, usando uma preparação de

nervo-pele isolada, hiperalgesia térmica induzida pela BK foi mostra a ser mediada por

ativação da COX45.

A diversidade das ações da PGE2 é supostamente resultante da sua interação com uma família

dos GPCRs, os receptores de prostanoide E (EP), designados EP1 a EP4, os quais são encontrados

em neurônios do GRD46. A identidade do receptor ou dos receptores EP que acopla a PGE2 a

hiperalgesia térmica é ainda controverso. A ativação dos receptores EP pela PGE2 pode

estimular a PKA, PKC e proteínas quinases ativada por mitógeno (MAPKs).

Em células transfectadas com o canal do TRPV1, as correntes ativadas de calor foram muito

potencializadas pela ativação da PKA e a potenciação foi muito reduzida em células

transfectadas com TRPV1 mutantes tendo mutações em locais de fosforilação da PKA47. Além

disso, a interrupção da proteína ancorada PKA, em camundongos de AKAP150, declinou a

diminuição na latência da retirada de pata, os estímulos térmicos induzidos pela injeção de

PGE2 intraplantar, mas não afeta sensibilidade térmica em condições basais48. Estes resultados

sugerem que a hiperalgesia térmica induzida pela PGE2 é em parte mediada pela PKA. O EP

está acoplado a PKA via a proteína G estimulante (GS) que ativa a enzima adenilato ciclase (AC).

A enzima AC catalisa a conversão de trifosfato de adenosina (ATP) em monofosfato de

adenosina cíclico (cAMP) que, por sua vez ativa PKA.

Em um estudo separado49, a hiperalgesia térmica induzida por injeção intraplantar de PGE2 não

foi afetado com nocaute da PKCε.

PGI2

Em contraste com a família dos receptores EP para a PGE2, existe apenas um único receptor

fosfato de inositol (IP) para PGI2.

Usando o ensaio de contorção abdominal induzido pelo ácido acético, onde uma injeção

intraperitonealmente da solução de ácido acético diluída provoca a resposta de sequencia de

contrações abdominais em camundongo de tipo selvagem, os camundongos de nocaute do IP

mostraram uma resposta de contorção consideravelmente reduzida em comparação com os

camundongos de tipo selvagem50.

Além do mais, a hiperalgesia térmica induzida pela injeção de PGI2 intraplantar foi

significativamente diminuída em camundongos de nocaute do TRPV1 e os camundongos de

36

nocaute do IP, indicando que a PGI2 sensibiliza o canal do TRPV1 via receptores IP. Além disso,

a potenciação induzida pela PGI2 nos neurônios do GRD de ativação da capsaicina no TRPV1 foi

suprimida por um inibidor da PLC e também por um inibidor da PKC sugerindo o

envolvimento de um via dependente de PLC e PKC43. Na figura 4.2, uma linha pontilhada

partindo do PI – na ilustração B – para Gq/11α – da ilustração A – indica isso.

Canal do TRPV1 e do TRPA1

É importante verificar se o modelo descreve o real, in vivo, do acoplamento entre o receptor B2

e o canal do TRPV1. O mecanismo de nocicepção induzido pela BK – lamber a pata – foi

testado, pela injeção de BK em pata de camundongos na presença de diferentes inibidores de

enzimas. Os inibidores seletivos da PLC, PKC, PLA2 ou LOX diminuíram acentuadamente a

nocicepção causado por BK, mas não da capsaicina51. Até agora estas conclusões são coerentes

com o modelo apresentado na Figura 4.2 – A – B.

O TRPV1 não é o único canal de cátions do TRP que desempenha um papel na ativação e

sensibilização dos nociceptores pela BK, o TRPA1 também foi implicado. Em camundongos de

nocaute do TRPA1, as respostas induzidas pela BK em neurônios do GRD foram reduzidas

significativamente, mas não ausentes e comparáveis em camundongos de nocaute do TRPV152.

Em estudo comportamental, em camundongos, verificou-se que após injeção subcutânea BK

intraplantar, os camundongos do tipo selvagem passaram quase três vezes mais tempo a

cuidar da pata afetada que os camundongos de nocaute do TRPA153. Estes resultados sugerem

que a ativação do TRPA1 desempenha um papel na dor aguda causada por BK.

Em atenção a hipersensibilidade a dor, não há evidências da hipersensibilidade térmica

induzida pela BK com injeção intraplantar em camundongos de nocaute do TRPA151. Assim

TRPV1 e TRPA1 são necessários ao desenvolvimento da hiperalgesia térmica induzida pela BK.

Estudos de colocalização, utilizando anticorpos para o TRPA1 e o TRPV1 revelaram que todos

os neurônios com TRPA1 positivos também expressam o TRPV154, indicando que as vias

bioquímicas, mostradas na Figura 4.2 – A – B, são utilizadas na modulação do canal do TRPA1.

B2 – via PLA2 – PLC- TRPA1

Embora a evidência experimental não seja tão extensa quanto ao canal de cátions do TRPV1,

podemos sugerir que, em certa medida, as mesmas vias que modulam o canal do TRPV1

também afetam o TRPA1 (veja Figura 4.2 – C).

Usando um sistema de expressão heterólogo e neurônios do GRD, a via tanto o PLC como a

PKA foram mostrados a transportar correntes potencializadas ao canal do TRPA155. Portanto,

as vias para ativação do PLC e da PKA são as mesmas (veja Figura 4.2 – A – B). No entanto, o

inibidor da PKC não preveniu a potenciação pela BK dos transportes de correntes pelo TRPA1 e

o ativador da PKC não potencializou a resposta do TRPA1. Estas conclusões indicam que a

37

ativação PKC não contribui para a sensibilização do canal do TRPA1, que é diferente do

mecanismo para sensibilização do TRPV1; por isso, a PCK não está presente na ilustração.

O Ca2+ intracelular é um importante mensageiro intracelular e a liberação do Ca2+ das lojas

intracelulares – retículo endoplasmático (RE) – foi mostrado a ativar diretamente o TRPA156, 57.

Assim, o IP3 induziu a via de liberação do Ca2+. Estudos complementares serão necessários para

elucidar a natureza exata da interação funcional entre TRPV1 e TRPA1. Uma possibilidade é

que o TRPV1 e o TRPA1 combinem para formar canais hetero e multiméricos.

A ação analgésica dos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), como a aspirina, é produzida

por meio de sua inibição da COX, a enzima que produz as prostaglandinas. Baseado no modelo

molecular, podemos concluir que um dos locais de ação do AINE é a ativação da COX pela BK

nos nociceptores (veja a Figure 4.2 – B – C).

Trifosfato de Adenosina

O trifosfato de adenosina (ATP) é uma importante fonte de energia intracelular, onde é

produzido durante a respiração celular e consumido por muitos processos celulares. As

experiências em seres humanos têm mostrado que a libertação do ATP na pele provoca dor de

forma dose dependente58.

Já que o ATP é impermeável à membrana, os receptores do ATP localizado na membrana

plasmática do nociceptor são necessários para detectar a liberação do ATP das células

machucadas no espaço extracelular. O ATP dirige-se a dois tipos de receptores distintos da

família de receptores purinérgicos (P2): ativa o purinoceptor do canal de íons controlado por

ligante (P2X) e o purinoceptor acoplado à proteína G (P2Y). Atualmente, foram identificados

sete diferentes subtipos do receptor P2X e oito subtipos do P2Y.

Receptores P2X

Normalmente, o purinoceptor do canal de íons controlado por ligante dois (P2X2) e o três

(P2X3) são expressos por pequenos neurônios sensoriais do GRD. Os resultados experimentais

sugerem que as correntes induzidas pelo ATP em neurônios do GRD são mediadas por

receptores homoméricos P2X3 e heteroméricos P2X2/P2X3.

Em camundongos de nocaute do P2X3 houve uma perda significativa de aproximadamente

90% dos neurônios do GRD responsivos ao ATP59. Uma pequena resposta residual sustentada

ao ATP foi vista em alguns neurônios do GRD em camundongo de nocaute duplo do P2X2/P2X3

indicando a presença de baixos níveis de outras subunidades de receptores P2X ou P2Y em

alguns neurônios60.

A fase precoce no comportamento da dor induzida pela formalina foi significativamente

reduzida em camundongos de nocaute do P2X3, embora as respostas a outros estímulos

nocivos fossem normais58, 61. Por outro lado, a fase precoce no comportamento da dor

38

induzida pela formalina não foi atenuada em camundongos de nocaute do P2X259. Estas

conclusões trazidas, in vivo, juntamente com os resultados, in vitro, discutidas acima

sustentam a noção de que o canal ionotrópico P2X3 sinaliza a dor aguda do tecido machucado.

A-317491 é um antagonista não nucleotídeo que tem alta afinidade e seletividade ao bloqueio

dos canais P2X3 e P2X2/P2X3, foi encontrada a produzir uma similar redução de dor induzida

pela formalina como foi produzida nos camundongos de nocaute62. Além disso, como nos

camundongos de nocaute as respostas aos estímulos mecânico e térmico nocivos estavam

normais. Tomadas em conjunto, os resultados in vitro, as conclusões nos camundongos de

nocaute e aqueles com A-317491 forneceram forte evidência que os canais contendo P2X3

contribuam a nocicepção.

Canal do TRPA1

Curiosamente, os camundongos de nocaute do TRPA1 apresenta uma redução significativa em

todas as fases do comportamento da dor induzida pela formalina incluindo a fase precoce63. A

atenuação da fase precoce do comportamento da dor induzida pela formalina em

camundongos de nocaute do TRPA1 é muito maior do que em camundongos de nocaute do

P2X3. No momento não é claro que tipo de relacionamento e se existir entre o canal P2X3 e do

TRPA1.

O formaldeído, ingrediente ativo da formalina, é um fixador covalente de ligações cruzadas às

proteínas na forma não específica. Estas ligações cruzadas levam a uma variedade de efeitos,

incluindo a lesão tecidual geral. A consideração foi que a lesão tecidual libera o ATP das células

e a liberação do ATP ativa os receptores P2X3. Em contraste, a conclusão com o canal do TRPA1

indica que há um efeito direto da formalina no TRPA1 ao invés de um efeito indireto através da

lesão tecidual inespecífica62.

Os canais do TRPA1 são ativados por uma variedade de compostos irritantes; o mecanismo de

ativação da formalina é provável que seja semelhante a estes compostos, que são o conceito

da modificação covalente induzida do TRPA1 (reveja a Seção – III).

Receptores P2Y

Os neurônios do GRD expressam também o purinoceptor acoplado à proteína G um (P2Y1) e o

dois (P2Y2) e foram implicados na potenciação da dor.

A injeção de ATP extracelular tem mostrado a induzir hiperalgesia térmica em camundongos. A

hiperalgesia térmica64 foi perdida em camundongos de nocaute do TRPV1 e preservada em

camundongos de nocaute do P2Y1 enquanto em camundongos de nocaute do P2Y2 não

apresentaram hiperalgesia térmica significativa65. Além disso, camundongos de nocaute do

P2Y2 mostram déficits na sensação de calor nocivo – mas não ao frio – em comparação com os

camundongos de tipo selvagem.

39

Canal do TRPV1

A próxima pergunta óbvia é como ativação do receptor P2Y2 leva à hipersensibilidade térmica,

a qual foi perdida nos camundongos de nocaute do TRPV1. Uma explicação simples seria que a

ativação do receptor P2Y2 faz com que o canal do TRPV1 seja modificado de modo que sua

sensibilidade térmica é aumentada.

ATP – trifosfato de adenosina; P2Y2 – purinoceptor acoplado à proteína G dois; GTP – trifosfato de guanosina;

GDP – difosfato de guanosina; Gq/11proteína G – subunidade subunidades e ;

PLC-– fosfolipase C beta; PIP2 – fosfatidilinositol difosfato; IP3 – inositol trifosfato;

DAG – diacilglicerol; PKC – proteína quinase C épsilon; P – fosforilação; TRPV1 – canal do receptor de potencial transitório da vaniloide um.

Fig. 4.3 - Ativação do P2Y2 pelo ATP causa hipersensibilidade térmica.

Dois mecanismos possíveis: por fosforilação do canal do TRPV1 ou a liberação da inibição por PIP2.

A melhor evidência disponível sugere que o purinoceptor acoplado à proteína G dois (P2Y2) é

acoplado à enzima PLC- via proteína de ligação nucleotídeo guanosina Gq/11. Dois

mecanismos possíveis que a hidrólise do PIP2 modula a atividade do canal do TRPV1: a

modulação do TRPV1 ocorre pela fosforilação através da ativação da PKC- via DAG ou pela

depleção do PIP2, que normalmente atua a inibir o canal do TRPV1 (veja Figura 4.3).

Proteases

As proteases na circulação, que geradas durante o ferimento tecidual, foram mostradas a

ativar uma família dos GPCRs, os receptores ativados por proteases (PARs). Estes receptores

desempenham um papel na hemostasia, inflamação e dor.

As proteases clivam o domínio extracelular do terminal-N dos PARs para expor aos ligantes

amarrados, os quais ligam e ativam os receptores clivados (veja a Figura 4.5). Quatro PARs

foram identificados, PAR1 a PAR4, por clonagem molecular. Destes, o PAR1 e o PAR2 estão

presentes em neurônios do GRD e mostraram a desempenhar um papel na inflamação

neurogênica, ou seja, os sintomas inflamatórios que resultar da libertação de substâncias dos

terminais do nervo primário sensorial (veja a seguir).

40

O PAR2 é ativado pelas proteases serina de triptase e tripsina. Apesar de a tripsina ser capaz

de ativar o PAR2, a tripsina propriamente dita não está presente na maioria dos tecidos, desse

modo provavelmente não é uma enzima endógena que ativa o PAR2. Contrariamente, a

triptase é libertada durante a degranulação dos mastócitos em seres humanos e capaz de

clivar o PAR2, em células normalmente expressando PAR2 ou em células transfectada com o

receptor. Portanto, a triptase é uma candidata provável a enzima que ativa o PAR2 (veja Figura

4.5). A trombina parece ser a mais provável agonista a ativar o PAR1 neuronal.

Inflamação neurogênica

Há mais de um século foi documentado que a estimulação antidrômica – condução dos

potenciais de ação em sentido oposto ao normal – nas fibras aferentes sensoriais resulta em

eritema – vermelhidão da pele. A conclusão de que a ativação periférica dos neurônios

aferentes sensoriais é capaz de produzir manifestação de uma resposta inflamatória conhecida

como inflamação neurogênica.

Fig. 4.4 – Esquema do processo de inflamação neurogênica.

Um estímulo nocivo causa a despolarização do terminal de um nociceptor, assim iniciando a propagação dos potenciais de ação no axônio. As setas mostram a direção da propagação. A propagação dos potenciais de ação ao longo do axônio no sentido da medula espinhal e também invade os processos de ramificações terminais próximas – arborização – do nociceptor.

A destruição dos neurônios sensíveis a capsaicina diminui extremamente a inflamação

neurogênica produzida pela estimulação antidrômica das fibras aferentes sensoriais,

implicando os nociceptores sensíveis a capsaicina na inflamação neurogênica. O resultado do

estímulo nocivo na geração de uma série de potenciais de ação em nociceptores, que são

41

conduzidos por seus axônios à medula espinhal e após o processamento pelo cérebro, uma

sensação de dor ocorre (como descrito na Seção – I). Por outro lado, os potenciais de ação vão

invadir retrogradamente os processos de ramificações terminais – arborização – do nociceptor

(veja a Figura 4.4).

A despolarização resultante no terminal causa a liberação dos neuropeptídios – substância P

(SP) e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) – que por sua vez atuam em células

alvo na periferia, como os mastócitos e o músculo liso vascular produzindo a inflamação, a

qual é caracterizada pela vermelhidão, calor e inchaço66, 67.

Em geral o CGRP não induz a hiperalgesia de calor nos nociceptores, porém adequadamente

escolhido nas linhagens de camundongos, o CGRP induz a hiperalgesia de calor68. Portanto,

dependendo da linhagem do camundongo, a inflamação neurogênica pode causar

hiperalgesia. Presumivelmente, há uma variabilidade semelhante na capacidade do CGRP a

induzir hiperalgesia de calor em nociceptores dos seres humanos.

PAR2

O receptor ativado por proteases dois (PAR2) é ativado pelas proteases serina triptase e

tripsina, adicionalmente um peptídeo sintético curto, SLIGRL (SLIGRL-NH2 – Ser-Leu-Ile-Gly-

Arg-Leu-amida), com base na sequencia do ligante amarrado foi mostrado a ativar o receptor e

assim imitar os efeitos das proteases (veja a Figura 4.5). A Injeção de SLIGRL na pata do rato foi

mostrada induzir a inflamação neurogênica, a qual depende da liberação do CGRP e da SP69.

Algumas pesquisas têm tentado excluir a possibilidade que o comportamento nociceptivo e os

efeitos hiperalgésicos da ativação do PAR2 podem ser secundários à resposta inflamatória

neurogênica. A Injeção intraplantar de SLIGRL, em doses subinflamatória, foi encontrada a

induzir hiperalgesia térmica, morder e comportamento de lamber – nociceptivo.

Canal do TRPV1

O canal do TRPV1 é necessário a hiperalgesia resultante dos estímulos nocivos intensos, o qual

resulta em lesão tecidual (reveja a Seção – III) e ao desenvolvimento da hipersensibilidade

térmica induzida pela BK. Da mesma forma, verificou-se que a hiperalgesia induzida no PAR2

resulta da sensibilização do canal do TRPV170, mas foi abolido pela capsazepina – um

antagonista do receptor da capsaicina – apesar de inibir a hiperalgesia térmica não inibiu a

nocicepção71 – tempo gastado em lamber e morder a pata injetada – induzida no PAR2.

Outras pesquisas, em neurônios do GRD e em células HEK293 transfectadas, indicaram que o

PAR2 ativa PKCε e PKA em neurônios do GRD e assim sensibiliza o canal de TRPV172. Esta

conclusão tem semelhança com a sensibilização do canal de TRPV1 pela BK ativando a via PKC

e PKA (consulte a Figura 4.2).

42

Apesar de a capsazepina ter inibido a hiperalgesia térmica induzida no PAR2, não inibiu a dor

imediata, o que implica na existência de outra via que excita o nociceptor. Uma pesquisa73 de

inervação de neurônios nociceptivos do cólon em camundongos, a superinfusão de SLIGRL por

3 minutos, causou uma despolarização sustentada que estava associada a uma maior

resistência de entrada, que durou até 60 minutos e foi bloqueada por: calfostina – um inibidor

da PKC e PD98059 – inibidor de quinases reguladas por sinal extracelular um e dois (ERK1/2). A

despolarização da membrana e o aumento na resistência de entrada após a ativação do PAR2

provavelmente resulta do fechamento da abertura dos canais de K+ no potencial de membrana

em repouso.

Canais K2P

Os canais de potássio de dois poros (K2P) são considerados ser responsáveis à permeabilidade

ao K+ em repouso nas células, portanto são provavelmente os canais de K+ que são fechados

após a ativação do PAR2.

O canal K2P2.1 (TREK-1) é expresso em nociceptores e animais de nocaute do K2P2.1 são

hipersensíveis aos estímulos mecânicos31. Talvez o K2P2.1 ou algum outro canal K2P está

envolvido na despolarização mediada por PAR2. Além de bloquear a permeabilidade do K+ em

repouso, o SLIGRL suprime acentuadamente – 55% – as correntes do potássio retificador

tardio72. A despolarização da membrana abre o canal retificador tardio, que tende a trazer o

potencial de membrana de volta ao potencial de repouso, portanto a supressão do retificador

tardio seria esperada a melhorar e prolongar a despolarização da membrana causada por

outros canais de íons.

A injeção intraplantar, em rato, de uma dose subinflamatória de 10 g de SLIGRL induz a uma

hiperalgesia térmica e mecânica prolongada74 enquanto a injeção de uma dose muito inferior

produzido apenas hiperalgesia térmica75. Posteriormente, foi “conjeturado que a hiperalgesia

mecânica mediada por PAR2 requer sensibilização do TRPV4” 76. Descobriram que hiperalgesia

mecânica mediada por PAR2 não foi observada em camundongos de nocaute do TRPV4. Além

disso, a injeção intraplantar de agonista do TRPV4 – 4-forbol 12,13-didecanoato (4-PDD)

produzido hiperalgesia mecânica em camundongos normais77 que não foi observada em

camundongos de nocaute do TRPV475. Por último, descobriram que “antagonistas da PLC- e

da PKA, PKC e PKD inibiram a sensibilização induzida por PAR2 da corrente e sinais de Ca2+ no

TRPV4”.

Numa tentativa de resumir os diferentes mecanismos descritos acima, pela qual a ativação do

PAR2 é conceituada a causar dor e a hiperalgesia térmica e mecânica, veja a Figura 4.5.

PAR1

Da mesma maneira que o PAR2 é ativado por um peptídeo sintético curto, o receptor ativado

por proteases um (PAR1) pode ser ativado seletivamente por um peptídeo agonista, TFLLR

43

(TFLLR-NH2 – Thr-Phe-Leu-Leu-Arg-amida), correspondente ao ligante amarrado ao receptor

PAR1.

A injeção intraplantar de TFLLR, em dose subinflamatória, aumenta o limiar e a latência da

retirada da pata aos estímulos mecânico e térmico78. A evidência disponível de outros sistemas

sugere que o PAR1 é acoplado negativamente a adenilato ciclase (AC) via proteína G inibitória

(Gi), assim inibindo a ativação da PKA. Deste modo, analgesia induzida no PAR1 possivelmente

pode ser explicada pela inibição do AC (veja a Figura 4.5).

SLIGRL – SLIGRL-NH2 – Ser-Leu-Ile-Gly-Arg-Leu-amida; Triptase;

PAR2 – receptor ativado por proteases dois; ERK ½ – quinases reguladas por sinal extracelular um e dois; K2P2.1(?) – canal de potássio de dois poros; P – fosforilação;

PKA – proteína quinase A; PKC – proteína quinase C; PKD – proteína quinase D; TFLLR – TFLLR-NH2 – Thr-Phe-Leu-Leu-Arg-amida; Trombina;

PAR1 – receptor ativado por proteases um; Gs – proteína G estimulação; Gi – proteína G inibitória; AC – adenilato ciclase; ATP – trifosfato de adenosina; cAMP – monofosfato de adenosina cíclico;

TRPV1 – canal de cátions do receptor de potencial transitório da vaniloide um; Capsaicina;

TRPV4 – canal do receptor transitório vaniloide quatro; 4-PDD – 4-forbol didecanoato 12,13-didecanoato.

Fig. 4.5 – Mecanismos de ativação e inibição do nociceptor pelo PAR1 e PAR2.

PAR4

Adicionalmente, foi identificado o receptor ativado por proteases quatro (PAR4) como outro

importante receptor na analgesia79.

A injeção intraplantar de um peptídeo sintético curto, GYPGKF (GYPGKF-NH2 – Gly-Tyr-Pro-Gly-

Lys-Phe-amida), com base na sequencia do ligante amarrado ao PAR4, aumentou limiar

nociceptivo a resposta ao estímulo nocivo térmico e mecânico. Além disso, coinjeção de

GYPGKF com carragenina reduziu significativamente a resultante da hiperalgesia e alodinia.

44

pH Baixo

A injeção de soluções ácidas – pH 5.0 a 6.0 – causa dor em queimação intensa80 e uma

diminuição substancial do pH – 6.6 a 7.4 – no líquido sinovial pode ser encontrada nas

articulações inflamadas81.

Não há consenso sobre a identidade do receptor molecular específico que é ativado por um pH

baixo, em nociceptores.

Canal do TRPV1

Uma diminuição no pH extracelular tem dois efeitos no canal de cátions do TRPV1: primeiro, os

prótons extracelulares abaixam o limiar de ativação do TRPV1 pela capsaicina e pelo calor;

segundo, abaixa acidificação – pH 6.0 – abre diretamente o canal.

É improvável que o canal do TRPV1 seja o único sensor para prótons extracelulares porque as

fibras nervosas individuais na pele do rato, as quais disparam os potenciais de ação em

resposta a prótons, não são sempre disparadas em resposta a capsaicina.

Além disso, a resposta a prótons foi reduzida, mas não eliminada82, nos neurônios do GRD dos

camundongos de nocaute do TRPV1.

ASICs

A descoberta e subsequente clonagem dos canais de íons sensíveis a ácido (ASICs) tornaram-se

os candidatos ao sensor de prótons extracelulares. Normalmente, uma fração significativa dos

neurônios do GRD de ratos exibem correntes transitórias semelhante ao ASIC em resposta a

prótons – pH 5.0 – em contraste a camundongos transgênicos expressando uma forma

negativa dominante do ASIC3, nenhum dos neurônios exibiu correntes transitórias semelhante

ao ASIC83. Surpreendentemente, em testes comportamentais de camundongos transgênicos

verificou-se ser mais sensíveis a um número de modalidades da dor que os camundongos de

tipo selvagem, tornando-se improvável que sejam transdutores diretos aos estímulos

nociceptivos.

A sensibilidade aos prótons nos neurônios do GRD, em seres humanos, foi examinada pela

acidificação rápida do fluido extracelular de pH 7.35 a 6.00 causando uma despolarização

prolongada do potencial de membrana em todas as 40 células testadas84.

Surpreendentemente, a despolarização da membrana foi associada a uma diminuição na

condutância de membrana em 27 das 40 células testadas, em vez do aumento na condutância

que seria esperado com a ativação do TRPV1 ou do ASICs (consulte a Figura 4.1). Subsequentes

experimentos de substituição dos íons indicaram que a diminuição na condutância após a

acidificação era devido a uma diminuição da permeabilidade ao K+ de fundo85.

45

Canais KP2

Na medida em que, os canais de potássio de dois poros (K2P) são considerados ser responsáveis

à permeabilidade ao K+, em repouso nas células, é possível que um canal de KP2 sensível ao

ácido está envolvido.

Dois canais de KP2 – K2P3.1 (TASK-1) e K2P5.1 (TASK-2) – e um canal de potássio de retificação

interna – Kir2.3, que são bloqueados por prótons, foram identificadas em neurônios GRD84. Os

canais de Kir não são retificadores perfeitos; podem passar algumas correntes para fora na

faixa de voltagem acima do potencial de repouso, portanto sua inibição seria esperada a

melhorar e prolongar a despolarização da membrana causada por outros canais de íons.

Os efeitos dos prótons acima considerados podem envolver o efeito direto em vários canais de

íons diferentes acima expostos – TRPV1, ASICs, K2P3.1, K2P5.1, Kir2.3. No entanto é possível que

os efeitos dos prótons sejam mediados por uma molécula receptora, a qual é separada

realmente do canal de íon que está sendo modulado. Recentemente, GPCRs sensíveis a próton

foram identificados86 e posteriormente mostrados estar presente nos neurônios do GRD de

pequenos diâmetros responsáveis pela nocicepção87.

Usando um sistema de expressão ovócito Xenopus, a acidose externa foi mostrada modular

negativa profundamente atividade do canal K2P2.1 (TREK-1) em seres humanos88. Os autores

foram capazes de distinguir um componente rápido e lento na diminuição das correntes do

canal do K2P2.1 resultante da exposição ao baixo pH externo. O componente rápido resultou de

protonação dos resíduos extracelulares no K2P2.1. Enquanto o componente lento, da

dessensibilização do K2P2.1, foi mediado por um GPCR sensível ao próton, a qual pareceu ativar

a PLC. Existe um número de vias em que a ativação da PLC poderia potencialmente modular a

atividade do canal do K2P2.1 (consulte a Figura 4.2).

O artigo original85 descrevendo GPCR sensível ao próton mostra que o receptor foi inativo em

pH 7.8 e totalmente ativado em pH 6.8. Desde modo, tornar apenas fraco para moderado à

acidificação extracelular para ativar totalmente o GPCR sensível ao próton, tornando os

receptores ideais a detecção da acidificação extracelular.

Ácido Lisofosfatídico

O ácido lisofosfatídico (LPA), o simples glicerolfosfolipídio (1-acil-sn-glicerol-3-fosfato) tem um

mol de ácidos graxos por mol de lipídio: onde o ácido graxo pode ser saturado ou insaturado,

dependendo do tecido.

O LPA é rapidamente produzido e liberado das plaquetas ativadas e mais abundante no soro –

1 a 5 M – do que no plasma. Onde plasma é a parte líquida do sangue que é separada das

células do sangue e soro é o fluido restante após agitação do plasma para precipitar um

coágulo.

46

Até agora foram identificados sete GPCRs – LPA1 a LPA7 – específicos. As vias, as quais podem

dar origem à produção do LPA, são ilustradas na Figura 4.6. Em camundongos, a injeção

intraplantar de LPA provoca respostas doloridas89.

PC – fosfatildil colina; PLD – fosfolipase D; PLA2 – fosfolipase A2;

PIP2 – fosfadilinositol bifosfato; PLC – fosfolipase C; DAG – diacilglicerol; IP3 – inositol trifosfato.

Fig. 4.6 – Vias de produção do ácido lisofosfatídico.

Canal K2P

Subsequentemente, os efeitos do LPA nos canais do K2P2.1 (TREK-1) foram investigados87

através de um sistema de expressão ovócito Xenopus. Numa concentração fisiológica de 1 M,

o LPA diminuiu drasticamente as correntes do K2P2.1; o efeito persistente por minutos e foi

reversível ao ser lavado. O pré-tratamento com U73122 – um inibidor da PLC – bloqueou

completamente a diminuição induzida pelo LPA nas correntes do K2P2.1. Além disso,

experiências indicaram que a PLC foi provavelmente ativada por receptores LPA endógenos

Xenopus.

Correntes NaV

Os efeitos do LPA nas correntes de sódio controlado por voltagem (NaV) em neurônios do GRD

de ratos também foram investigados90. O LPA suprimiu as correntes do sódio sensível ao

tetrodotoxina (TTX-S) quando aumentadas as correntes do sódio insensível a TTX (discutidos

na Seção – V).

47

Fator de Crescimento Neural

O fator de crescimento neural (NGF) é um fator trófico que promove a sobrevivência dos

nociceptores durante o desenvolvimento.

Para nosso propósito, as conclusões importantes são que o receptor de alta afinidade ao NGF –

receptor da tirosina quinase neurotrófica tipo um (TRK1) ou receptor da tirosina quinase tipo A

(trkA) – é expressado em nociceptores de animais adultos e que o nível do NGF está elevado

na pele inflamada.

Receptor TRK1

Usando uma molécula de fusão sintética (TRK1-IgG) para sequestrar o NGF verificou que a

administração de TRK1-IgG juntamente com carragenina bloqueou a hiperalgesia resultante da

inflamação induzida pela carragenina91. Além disso, o receptor TRK1 medeia a hiperalgesia

causada pelo NGF porque o NGF ainda pode induzir hiperalgesia térmica em camundongos em

que a baixa afinidade ao receptor neutrofina p75 é nocauteado92. Estes resultados sugerem

fortemente que o NGF está envolvido na regulação da sensibilidade à dor em animais adultos.

Além disso, a hiperalgesia térmica da pata traseira desenvolveu em minutos da injeção de NGF

intraplantar indicando que a transcrição do gene não estava envolvida93.

Canal do TRPV1

A fim de examinar os efeitos diretos do NGF nos nociceptores em experiências de animais

adultos foram realizadas em dissociação de neurônios do GRD em cultura. Observou-se uma

melhoria rápida da corrente induzida pela capsaicina com aplicação do NGF em esses

neurônios do GRD isolados94, 95. Estes resultados indicam claramente que um dos alvos do NGF

é o canal do TRPV1.

Experimentos subsequentes, usando neurônios do GRD e sistemas de expressão, para tentar

elucidar as vias de sinalização envolvidas na sensibilização pelo NGF deram até agora

resultados conflitantes.

Resumo

Nesta seção foram sucintamente revistas as evidências aos mediadores químicos considerados

a desempenhar um papel no nociceptor. No diagrama da Figura 4.7, os canais de íons e os

receptores – receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e receptor da tirosina quinase (RTK) –

considerados envolvidos na execução das ações dos mediadores químicos.

48

GPCRs Receptores Acoplados à Proteína G Mediadores Químicos 5-HT2A Receptor da serotonina do tipo dois subtipo A 5-HT Serotonina B2 Receptor B2 de bradicinina BK Bradicinina EP Receptor de prostanoide E PGE2 Prostaglandina E IP Receptor fosfato de inositol PGI2 Prostaglandina I2 P2Y2 Purinoceptor acoplado à proteína G dois ATP Trifosfato de adenosina PAR2 Receptor ativado por proteases dois Triptase pH Baixo H+ Próton LPA1 Receptor do ácido lisofosfatídico um LPA Ácido lisofosfatídico RTK Receptor da Tirosina Quinase Mediador Químico TRK1 Receptor da tirosina quinase neurotrófica tipo um NGF Fator de crescimento neural LGICs Canais de Íons Controlados por Ligantes Mediadores Químicos 5-HT3 Receptor da serotonina do tipo três 5-HT Serotonina P2X3 Purinoceptore de íons controlado por ligante, três. ATP Trifosfato de adenosina P2X2/P2X3 Purinoceptores heteroméricos ATP Trifosfato de adenosina VGICs Canais controlados por Voltagem TRPV1 Receptor de potencial transitório vaniloide um TRPV4 Receptor de potencial transitório vaniloide quatro TRPA1 Receptor de potencial transitório anquirina um K2P Canais de potássio de dois poros

Fig. 4.7 – Os canais e receptores envolvidos na transdução de sinal do nociceptor.

49

Finalmente na Tabela 4.1, para cada mediador químico foi listado o GPCRs, os canais de íons e

as vias do segundo mensageiros considerados desempenhar o papel.

Tabela 4.1 – Mecanismos envolvidos na transdução de sinal do nociceptor.

Mediador Químico

Dor Aguda

Hiper- algesia

GPCRs

Canais de Íons Vias do Segundo Mensageiro Ionotrópicos Metabotrópicos

5-HT Sim Sim 5-HT2A K2P2.1(?)

5-HT3A

BK Sim Sim B2

TRPV1

PLC-β DAG PKCε PIP2

PLA2 COX PGE2 PKA

LOX 12-HPETE

TRPA1 PLC-β

PIP2

IP3 Ca2+

PLA2 COX PGE2 PKA

12-HPETE Sim ---- TRPV1

PGE2 Sim Sim EP(?) TRPV1

PKA TRPA1

PGI2 Sim Sim IP TRPV1 PLC PKC

ATP Sim Sim

P2Y2 TRPV1 PLC-β DAG PKCε

PIP2

P2X3

P2X2 /P2X3 TRPA1

Proteases Sim Sim PAR2

TRPV1 PKA

PKC

TRPV4

PKA

PKC

PKD

K2P2.1(?) PKC

ERK ½

pH Sim Sim H

+

K2P2.1(?) PLC

TRPV1

ASIC

LPA Sim ---- LPA1 K2P2.1(?) PLC

NGF ---- Sim TRPV1 (?)

50

V – VGICs

Depois que ocorre a transdução do estímulo nocivo em um potencial de receptor, a resposta

deve ser transformada ou codificada em uma série de potenciais de ação, os quais carregam o

sinal ao terminal sináptico que culmina na liberação do neurotransmissor – ou seja, a

informação é transmitida a medula espinhal.

É durante este processo que os canais de íons controlados por voltagem (VGICs): o canal de

sódio controlado por voltagem (NaV), canal de potássio controlado por voltagem (KV), canal de

cálcio controlado por voltagem (CaV) e o canal de cátions controlado por nucleotídeo cíclico

ativado por hiperpolarização (HCN) dão sua contribuição.

Na medida em que os VGICs estão enriquecidos nos nociceptores em comparação com outras

regiões do sistema nervoso e do organismo, servem como metas ao desenvolvimento de

fármacos analgésicos ou anestésicos.

NaV

Os canais de sódio controlados por voltagem de subunidade alfa (NaV) são essenciais para

codificar o potencial do receptor em uma série de potenciais de ação e conduzi-los ao longo do

axônio.

Os canais de NaV são compostos de uma subunidade alfa () na formação de poro e pelo

menos uma subunidade beta () auxiliar. As subunidades são multifuncionais: modulam a

comporta do canal, regulam o nível de expressão do canal e a função como as moléculas de

aderência celular interagem com a matriz extracelular e o citoesqueleto. A família da

subunidade formadora de poros tem nove tipos conhecidos, nomeados de NaV1.1 a NaV1.9;

nem todos estão presentes nos neurônios do GRD.

Os neurônios diferem na forma dos seus potenciais de ação e também na taxa e regularidade

no qual disparam os potenciais de ação. De modo geral, os nociceptores disparam os

potenciais de ação tendo uma duração mais longa – vários milissegundos – e uma taxa

relativamente lenta normalmente em um intervalo menor do que 10 por segundo.

Um modo de distinguir as duas classes gerais dos canais de NaV com base na sua sensibilidade

a tetrodotoxina (TTX), uma neurotoxina potente “toxina do baiacu” que bloqueia os potenciais

de ação nos nervos por ligação aos poros da subunidade . Nem todas as subunidades são

sensíveis a TTX; por conseguinte, podemos distinguir entre os canais sensíveis (TTX-S) e os

resistentes (TTX-R). Os neurônios sensoriais nociceptivos são mostrados a expressar os canais

de NaV TTX-R e TTX-S. Os canais de sódio controlados por voltagem TTX-S – NaV1.1, NaV1.3,

NaV1.6 e NaV1.7 – e os TTX-R – NaV1.8 e NaV1.9 – estão implicados no funcionamento do

nociceptores em estados normais e patológicos.

51

A caracterização da contribuição especifica dos canais de NaV ao funcionamento dos neurônios

do GRD é limitada pela falta de bloqueadores dos canais seletivos. A geração de camundongos

de nocaute dos canais de NaV específicos oferece uma solução alternativa para esse problema

e estes animais podem ser caracterizados comportamentalmente. Além disso, as gravações

eletrofisiológicas podem ser feitas nesses animais para caracterizar ainda mais a contribuição

dos canais específicos à detecção de estímulos dolorosos.

Os canais de sódio controlados por voltagem TTX-R – NaV1.8 e NaV1.9 – são expressos

predominantemente em pequenos neurônios do GRD, que incluem células nociceptivas e são

sugeridos a desempenhar um papel importante nos mecanismos da dor. Adicionalmente a

expressão preferencial do NaV1.8 e do NaV1.9 em pequenos neurônios do GRD sugere que

estes canais são bons alvos ao tratamento farmacológico de dor.

NaV1.8

O canal de sódio controlado por voltagem de subunidade alfa do tipo VIII (NaV1.8) é expresso

principalmente em aferentes nociceptivos de pequeno diâmetro e os camundongos de

nocaute do NaV1.8 apresentam um aumento pronunciado no limiar a estímulos mecânicos

nocivos96, 97. Os camundongos em que a toxina diftérica A (DTA) foi usada para matar os

neurônios expressando o NaV1.8 também mostraram um aumento pronunciado no limiar aos

estímulos mecânicos nocivos98.

Interessantemente, nestes estudos, as respostas ao calor nocivo eram semelhantes aos

camundongos normais e o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória foi atrasado. Estas

conclusões podem ser explicadas se os canais de NaV1.8 foram especificamente localizados em

nociceptores mecanossensitivos e determinou sua excitabilidade.

Neste contexto, os canais de sódio TTX-R são mostrados estar presente em densidades

suficientemente elevadas nos terminais periféricos dos nociceptores a ser o determinante da

sua excitabilidade99. Alternativamente, o nocaute do NaV1.8 pode interromper o aparelho

mecanossensitivo localizado no terminal nociceptor. Além disso, estudos sobre o papel exato

do canal de NaV1.8 na nocicepção mecanossensitivo e o desenvolvimento de bloqueadores dos

canais de NaV1.8 altamente específicos ajudaria a esclarecer a situação.

Para complementar, o aumento do limiar a estímulos mecânicos nocivos, os camundongos de

nocaute do canal de NaV1.8 também exibiram uma perda da sensibilidade a estímulos ao frio

nocivo97,100. A perda da sensibilidade ao frio nocivo provavelmente ocorre porque o canal de

NaV1.8 parece ser o único dos canais de NaV que permanece funcional em temperaturas muito

baixas. Adicionalmente ao frio, as correntes muito inferiores eram necessárias para disparar o

canal de NaV1.8 gerando os potenciais de ação do que a 30°C nos terminais do nociceptor

tratados com TTX100.

52

Canais de K2P

A diminuição do limiar para desencadear potenciais de ação a temperaturas reduzidas

provavelmente resulta de um aumento na resistência de entrada da membrana devido ao

fechamento dos canais de potássio de dois poros (K2P)101, 102. O fechamento dos canais de K2P

será a despolarização da membrana e, além disso, também vai aumentar a resistência de

entrada membrana, assim menos corrente para o interior iniciando por estímulos nocivos

serão necessária para desencadear o potencial de ação (consulte a Figura 4.1).

Canais do TRP

Em relação aos canais de receptor de potencial transitório (TRP) considerados a serem

sensores ao frio, os camundongos de DTA98 apresentam uma expressão reduzida do sensor ao

frio – TRPA1 – e apresenta uma quase completa supressão da segunda fase da resposta a

formalina, que foi atribuída ativação do canal do TRPA1103. Por outro lado, a expressão do

sensor ao frio, o TRPM8 parece ser normal em camundongos de DTA.

Baseado nesses resultados pode-se fazer um modelo preliminar à transdução ao frio nocivo no

nociceptores mecano-frio em camundongos (conforme ilustrado na Figura 5.1). A exposição a

uma temperatura fria nociva, em torno de 0°C, resulta na ativação do canal do TRPA1 e a

inibição dos canais de K2P, a resultante despolarização excita o canal de NaV1.8 e os potenciais

de ação se propagam a medula espinhal. O aparelho mecanossentivo que é contra a corrente

do NaV1.8 é uma proposta de simplicidade.

TRPA1 – canal do receptor de potencial transitório da anquirina um; K2P – canal de potássio de dois poros;

NaV1.8 – canal de sódio controlado por voltagem alfa VIII.

Fig. 5.1 – Modelo da exposição do nociceptor ao frio.

Uma exposição do nociceptor mecano-frio a temperatura fria, em torno de 0°C, abre os canais do TRPA1 e fecha os canais de K2P, que por sua vez ativar os canais de NaV1.8 e desse modo excitando o nociceptor.

53

NaV1.9

A maior parte dos neurônios do GRD que expressam o canal de NaV1.8 também expressam104

o canal de sódio controlado por voltagem de subunidade alfa do tipo IX (NaV1.9), embora um

número muito pequeno de células do GRD expressam também não só os canais de NaV1.8 ou

NaV1.9.

Em camundongos no qual o canal de NaV1.9 foi nocauteado, a resposta comportamental ao

estímulo nocivo – mecânico, calor e frio – não foram diferentes do que nos camundongos de

tipo selvagem. Adicionalmente, as experiências usando uma preparação de nervo e pele

indicam que os limiares de dor mecânica e térmica foram os mesmos nos camundongos de

nocaute do canal de NaV1.9 e nos de tipo selvagem105. Em contraste, a hipersensibilidade

resultante da inflamação periférica produzida pela injeção intraplantar do adjuvante de Freund

completo (CFA) é substancialmente reduzida nos camundongos de nocaute106, como é a

hipersensibilidade resultante da injeção intraplantar de formalina ou carragenina105.

O limiar do estímulo doloroso tem demonstrado ser reduzido por múltiplos mediadores

inflamatórios – como PGE2, BK, ATP e 5-HT – agindo através de múltiplas vias de sinalização

intracelulares – por exemplo, PLC-, PKA e PKC. Na Seção – IV foram apresentadas evidências

que estas vias intracelulares são alvos dos canais do TRPV1, TRPA1, TRPV4 e K2P para produzir a

hipersensibilidade.

As evidências apresentadas acima sugerem que o canal de NaV1.9 também pode ser um alvo

para esses mediadores inflamatórios e via de sinalização intracelulares. Neste contexto, a

hipersensibilidade térmica resultante da injeção intraplantar de PGE2 foi significativamente

reduzida em camundongos de nocaute do canal de NaV1.9 comparados aos de tipo

selvagem105, 106. Não existe ainda nenhum consenso sobre a via de sinalização intracelular que

tem como alvo o canal de NaV1.9. Porque os mediadores inflamatórios – PGE2, BK, ATP e 5HT –

mencionado acima, agem através dos GPCRs, a hipótese de que a ativação da proteína G era

necessária para regular o canal de NaV1.9 foi testada107. Descobriram que a amplitude de uma

corrente de sódio TTX-R, atribuída ao canal de NaV1.9, gravado de pequenos neurônios do GRD

tendo menos de 25m de diâmetro, foi aumentada mais de 3 vezes por 500m de GTP--S

intracelular – um análogo do GTP não hidrolisável. Presumivelmente, GTP--S está

funcionando por ligação a uma proteína G e mantendo a proteína G ao qual está ligado no

estado ativo porque o GTP--S é resistente à hidrólise do GDP.

Um estudo108 mais recente mostrou que a natureza da corrente de sódio TTX-R de regulação

positiva foi realmente no canal de NaV1.9. Para reiterar, embora estas conclusões indiquem o

envolvimento de uma proteína G, não apontam a via de sinalização intracelular que é ativada

pela proteína G. Uma possibilidade é que ativada a proteína G, com ligação do GTP--S,

trabalham por interagindo diretamente com o canal de NaV1.9.

54

NaV1.7

Em 2006, foi relatado que um grupo de indivíduos em três famílias que exibiram uma

incapacidade congênita de sentir dor e eram de outra maneira aparentemente normal109. A

perda da capacidade de sentir dor foi mostrada como resultado de mutação desproposito no

gene SCN9A, que codifica subunidade do canal de NaV1.7 TTX-S que são expressados em

níveis elevados nos neurônios do GRD nociceptivos.

Antes dessa descoberta em seres humanos, os camundongos de nocaute do canal de NaV1.7

foram encontrados mortos logo após o nascimento, portanto o canal de NaV1.7 teve que ser

excluído em um subconjunto de neurônios, portanto produzindo informações menos úteis do

que as descobertas de nocaute global do canal de NaV1.7 em seres humanos110. Obviamente, o

canal de sódio controlado por voltagem de subunidade alfa do tipo VII (NaV1.7) é um alvo

excelente para o desenvolvimento de novos analgésicos ao tratamento de dor.

Existe agora também evidência que as mutações pontuais no SCN9A podem resultar em

aumento nas sensações de dor. Os pacientes com neuropatia dolorosa herdada –

eritromelalgia herdada, às vezes chamada eritermalgia – com episódios de experiência da dor

em queimação crônica severa, vermelhidão da pele e inchaço da face, de orelhas e

extremidades. Os pacientes com eritermalgia primária111 têm mutações em SCN9A, o qual

codifica a subunidade do canal de NaV1.7.

As propriedades eletrofisiológica foram estudas em canal de NaV1.7 mutantes e tendem as

mesmas mutações encontradas em pacientes com eritermalgia112. Os canais mutantes

exibiram hiperexcitabilidade provocada por uma mudança de hiperpolarização na ativação e

por uma lentidão na desativação e inativação.

NaV1.3

A dor neuropática – ou neuralgia – algumas vezes desenvolve após o ferimento ou doença que

lesa um nervo. Uma variedade de alterações ocorre tanto em nociceptores e também no

sistema nervoso central após a lesão do nervo, entre essas alterações hiperexcitabilidade dos

neurônios do GRD é bem documentado após o ferimento dos axônios periféricos do GRD.

Foi proposto que a hiperexcitabilidade dos neurônios do GRD podem contribuir para dor

neuropática113 e que a regulação positiva do canal de sódio controlado por voltagem de

subunidade alfa do tipo III (NaV1.3) contribui para a hiperexcitabilidade anormal da ferida dos

neurônios do GRD114.

O canal de NaV1.3 é um canal de sódio TTX-S expresso em neurônios em todo o sistema

nervoso embrionário que é substancialmente de regulação negativa em animais adultos. No

entanto, níveis normais no comportamento da dor neuropática desenvolve em camundongos

de nocaute do canal de NaV1.3 sugerindo que a expressão do canal de NaV1.3 não é necessária

ao desenvolvimento da dor neuropática115.

55

NaV1.1 e NaV1.6

Embora o canal de sódio controlado por voltagem de subunidade alfa do tipo I (NaV1.1) e do

tipo VI (NaV1.6) serem expressos em nociceptores suas funções específicas, se houver, na

nocicepção e na sensação de dor, não são ainda claras.

K

Na Seção – IV, consideramos um número de situações nos quais os mediadores químicos

parecem excitar – despolarizar – os nociceptores por bloquear a permeabilidade aos canais de

potássio (K).

Canais de K2P

Verificou-se que os membros da subfamília dos canais de potássio de dois poros – K2P2.1

(TREK-1), K2P10.1 (TREK-2) e K2P4.1 (TRAAK) – são ativados por estímulos mecânicos e térmicos.

Além disso, estes canais são colocalizados com os canais de cátions do receptor de potencial

transitório – TRPV1, TRPV2 e TRPM8 – em neurônios do gânglio trigeminal116.

A atividade dos canais – K2P2.1, K2P10.1 e K2P4.1 – são muito baixas, em torno de 24°C, e

tornam-se muito ativos a 37°C. Adicionalmente117 a extensão da membrana aumenta a

atividade dos canais a 37°C. A atividade dos três canais continua a aumentar até 42°C, a

temperatura máxima para a quais medições precisas poderiam ser feita em sistemas de

expressão usados.

O canal do TRPV1 é ativado a temperaturas acima de 42°C (reveja a Seção – III). Supondo-se

que a atividade destes canais de K2P continua a aumentar acima de 42°C, então sua ativação

em nociceptores tende a neutralizar excitação aumentando a permeabilidade da membrana

ao K+. Consequentemente, foi sugerido que estímulos dolorosos mecânicos e térmicos em

nociceptores seriam esperados a ativar os membros da subfamília dos canais de K2P – K2P2.1,

K2P10.1 e K2P4.1 – assim o "ajuste" ou contrariando a excitação118, 119. Ou seja, a ativação de um

nociceptor por estímulos nocivos mecânicos ou térmicos é um equilíbrio entre a

despolarização causada pela ativação de um dos canais de íons excitatório sensorial mecano

ou termo e a hiperpolarização causada pela ativação de um membro da família do canal K2P.

Morfina

A morfina alivia a dor – o principal ingrediente ativo no ópio tem sido conhecido por séculos. O

efeito analgésico da morfina é principalmente atribuído à ativação dos receptores opioides no

sistema nervoso central (SNC). No entanto, a morfina atua no SNC e no sistema nervoso

periférico (SNP) causando analgesia. Para o nosso propósito, estamos interessados somente na

sua ação em nociceptores.

56

Uma variedade de experiências sugeriu a existência de pelo menos três tipos de receptores

opioides: mu (), delta () e kappa (). Os efeitos analgésicos da morfina são drasticamente

reduzidos em camundongos com falta do receptor opioide sugerindo que os receptores

primariamente medeiam analgesia120.

Além disso, estudos comportamentais em rato, os efeitos analgésicos da morfina administrada

perifericamente também parecem ser mediado pelo receptor , mas não são facilmente

detectáveis no tecido normal; os efeitos são apenas aparentes durante hiperalgesia quando os

receptores estão sensibilizados121.

Utilizando uma preparação de pele-nervo de rato foram comparados os efeitos da morfina

sobre as propriedades da resposta dos nociceptores únicos inervando a pele normal e a

inflamada122. A morfina não teve nenhum efeito significativo sobre a resposta dos

nociceptores aos estímulos mecânicos ou térmicos na pele normal. No entanto, os

nociceptores inervando a pele inflamada apresentam limiares mais baixos aos estímulos

mecânicos nocivos e as respostas aos estímulos nocivos mecânicos e térmicos foram elevados

e administração de morfina perifericamente inibiu a atividade dos nociceptores cutâneos nas

condições de inflamação. Estes resultados indicam que a morfina agiu sobre os receptores

opioides localizados na região de transdução sensorial do nociceptor (consulte a Figura 1.3) e

medeia analgesia durante a inflamação local.

Sabe-se há algum tempo que altos níveis de glicose no sangue antagonizam a analgesia da

morfina e sugeriu-se que o efeito pode ser devido a níveis elevados do ATP intracelular123.

Canais de Kir

Subsequentemente foi demonstrado que a glibenclamida – um hipoglicemiante oral –

bloqueador dos canais de potássio sensível ao ATP (KATP), antagoniza analgesia da morfina

induzida em camundongos124, sugerindo que a morfina atua ativando os canais de KATP.

Os canais de KATP são um tipo do canal de potássio – composto por quatro subunidades

regulatórias do receptor sulfonilureia (SUR) e quatro poros sensíveis ao ATP – formando as

subunidades do canal de potássio de retificação interna (Kir). Os canais de KATP atuam como

sensores metabólicos e quando os níveis do ATP intracelular são elevados, os canais são

fechados.

Em neurônios do GRD de ratos sensíveis a capsaicina, o diazóxido – um relaxante da

musculatura lisa – agonista do canal de KATP, reverte à sensibilização produzida pela PGE2,

indicando que a ativação do canal de KATP pode reverter à excitabilidade realçada nos

neurônios do GRD125.

57

Os receptores opioides são GPCRs, o que levanta a questão de qual via o segundo mensageiro

intracelular medeia à via de ação da morfina ao canal de KATP. Foi sugerido que a morfina126, 127

ativa canal de KATP através da via do óxido nítrico (NO) – monofosfato guanosina cíclica (cGMP)

– proteína quinase G (PKG). O fechamento canais de potássio de dois poros (K2P), além de

despolarizarem a membrana, também aumentará a resistência de entrada membrana; assim

menos corrente exógena será necessária para desencadear o potencial de ação.

Outra forma de aumentar a eficácia das correntes internas iniciada por estímulos nocivos no

disparo potenciais de ação é inibir a despolarização ativada por canais de potássio controlado

por voltagem (KV). Nos neurônios do GRD de ratos, a PGE2 e o estável análogo do PGI2 –

carbaPGI2 – suprimiram o tipo sustentado da corrente externa de potássio controlado por

voltagem128.

Cav

Os receptores opioides também foram localizados no terminal sináptico dos neurônios do

GRD na medula espinhal129, 130. Adicionalmente, a morfina aplicada na medula espinhal reduziu

a liberação da substância P (SP) evocada pela estimulação do nervo ciático131. Além disso, os

opioides foram encontrados a suprimir na transmissão sináptica excitatória, mas não a

inibitória em neurônios da medula espinhal de ratos adultos132. Juntas estas constatações

implicam que os opioides desempenham um papel na regulação da liberação do transmissor

dos nociceptores terminais.

Dois mecanismos diferentes poderiam contribuir para a inibição pré-sináptica da liberação do

transmissor pelo opioide: Em primeiro lugar, como discutido acima, a morfina poderia ativar os

canais de KATP no terminal, deste modo a hiperpolarização do terminal pré-sináptico e a

diminuição da resistência na entrada do terminal. Isto reduziria a capacidade de invadir

potenciais de ação à despolarização do terminal e ativar os canais de Ca+, que por sua vez

reduz o influxo de Ca+ resultante e a consequente a liberação do transmissor. Em segundo

lugar, os opioides poderiam inibir diretamente os canais de cálcio controlados por voltagem

(CaV) no terminal sináptico.

Usando ovócitos Xenopus expressando os canais de Ca+ neuronal e os receptores opioides, a

ativação do receptor da morfina com uma encefalina sintética – DAMGO – resultou em uma

inibição rápida das correntes de cálcio133. Os receptores opioides μ dos neurônios do GRD em

ratos são acoplados negativamente a três tipos de canais de Ca+ de alto limiar são

considerados a desempenhar um papel na transmissão sináptica134. Foi sugerido que os

receptores opioides inibem os canais de Ca+ por meio de uma ação direta da proteína G no

canal de Ca+ e não através da via de um segundo mensageiro135.

Em conclusão, a evidência disponível é consistente com os opioides inibindo a liberação de

transmissor por ativação dos canais KATP e/ou inibindo os canais de Ca+ no terminal sináptico.

58

HCN

As correntes da membrana resultante de ativação dos canais controlado por nucleotídeo cíclico

ativado por hiperpolarização (HCN) foram primeiramente descritas em neurônios do GRD

isolados há mais de 25 anos136.

Não era até os últimos anos conhecido, qual o possível papel dos canais HCN na dor

neuropática periférica, tornou-se aparente137. Aqui vamos considerar as propriedades gerais

dos canais HCN, seu papel na regulação da frequência de disparo em alguns neurônios do GRD

e também aquelas propriedades que irão se revelar útil para compreender seu possível papel

na dor neuropática periférica – ou neuralgia periférica (na Seção – VI).

Os canais HCN são ativados por degraus de voltagem da hiperpolarização para potenciais mais

negativo que -50 mV a -60 mV, o qual é próximo dos potenciais de repouso da maioria das

células. Estas correntes do HCN (Ih) foram originalmente denominadas de If para “estranho” e Iq

para “esquisito” porque ao contrário da maioria dos canais controlados por voltagem foram

ativados por hiperpolarização ao invés da despolarização.

Fig. 5.2 – Ativação e desativação da corrente do HCN

Sob as condições: A – grampo de voltagem – a Ih é ativada por um degrau de voltagem de -40 mV a -100 mV e inativada quando a voltagem retorna a -40 mV; B – grampo de corrente – um pulso de corrente da hiperpolarização ativa Ih causando a despolarização “envergamento” durante a hiperpolarização da membrana.

59

Na Figura 5.2 – A, um degrau de voltagem da hiperpolarização ativa uma corrente interna

lentamente em desenvolvimento – Ih – a amplitude da qual aumenta com o aumento da

hiperpolarização (não mostrado). Se a magnitude da Ih é função do potencial de membrana –

relação da corrente pela voltagem (I/V) – é evidente que há uma região de retificação interna

“anormal”. Por retificação interna entende-se que as correntes – cargas positivas – passam

pelos canais mais facilmente para dentro da célula – direção interna – e mal na direção

externa. Quando descoberta pela primeira vez a retificação interna foi chamada de retificação

anômala para distingui-la da mais comumente encontradas correntes de retificação externa.

Os canais HCN não são os únicos canais de retificação interna; lembre-se que os canais de KATP

têm a subunidade, o canal de potássio de retificação interna (Kir). Os canais da Ih são

permeáveis aos Na+ e K+ enquanto os canais de Kir são permeáveis a K+.

Por um lado, ativação do canal de Kir tenderá a inibir o disparo dos potenciais de ação, pois o

potencial de membrana vai deslocar em direção ao EK (≈ -85 mV). Em contraste, a ativação dos

canais HCN tenderá excitar o nociceptor: dependendo da proporção de permeabilidade PK/PNa

do potencial de membrana deslocará a um valor entre EK e ENa, o qual despolarizará a

membrana em sentido do limiar de disparo dos potenciais de ação.

Na Figura 5.2 – B, a Ih é uma corrente interna ativada por hiperpolarização além do potencial de

repouso, qual é manifesta como um “envergamento” da despolarização do potencial de

membrana durante a corrente de hiperpolarização. Desde que a Ih não inative com uma

determinada voltagem, uma sustentada corrente interna do Ih irá desempenhar um papel na

determinante no potencial de repouso e na resistência de entrada. Porque a rede de corrente

da membrana com o potencial de repouso é zero, a corrente interna do Ih deve ser equilibrada

por uma corrente externa. Esta corrente pode ser contribuída por uma corrente de K+ em

repouso transportado por canais de K2P.

A participação da Ih em determinar o potencial de repouso tem a consequência que pode

desempenhar um papel na determinação excitabilidade do neurônio. Quando a Ih está

presente em uma célula com o canal de NaV com baixo limiar e uma quantidade adequada de

canais de K2P há o potencial para o disparo rítmico de potenciais de ação. Em um potencial de

repouso permissivo após a hiperpolarização seguindo um potencial de ação pode ser suficiente

para ativar a Ih que pode ser suficiente para despolarizar a membrana de volta ao limiar do

potencial de ação138. É este potencial ao disparo rítmico que é considerado a desempenhar um

papel na dor neuropática – ou neuralgia periférica (veja na Seção – VI).

HCN2 – HCN4

Uma família de quatro genes em mamíferos codifica as subunidades dos canais controlados

por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização – HCN1 a HCN4 – responsáveis pela

corrente – Ih. Cada subunidade do canal HCN é composta de seis segmentos transmembrana,

com um sensor de voltagem e uma região formadora de poro (P). Uma importante

60

característica dos canais HCN é seu domínio de ligação do nucleotídeo cíclico, que sustenta sua

regulação por cAMP e não requer a fosforilação da proteína.

O HCN2 e HCN4 são fortemente modulados por aumento das concentrações de cAMP, com a

voltagem de ativação deslocada para potenciais mais positivos, perto de 10 mV a 20 mV,

enquanto canais HCN1 e HCN3 são relativamente insensíveis ao cAMP. Consequentemente,

com aumento do cAMP, um degrau de voltagem da hiperpolarização ativa HCN2 e HCN4 mais

completamente.

A PGE2 e PAR2 ativa a PKA por um aumento do cAMP (reveja a Seção – IV). Isto levanta a

possibilidade de que esses mediadores químicos podem sensibilizar os nociceptores

deslocando a voltagem de ativação dos canais HCN2 ou HCN4 por um aumento no cAMP. Esta

possibilidade foi testada139 em neurônios do GRD usando uma variedade de técnicas –

incluindo o ZD7288 – um bloqueador potente da Ih – não seletivo entre HCN1 a HCN4. Estes

autores descobriram que havia uma população de neurônios do GRD, com corpos celulares de

diâmetro menores, que tinha uma Ih sensível ao cAMP. Além disso, encontraram para estes

neurônios nociceptivos pequenos que aumenta os níveis de cAMP deslocando a curva de

ativação de voltagem da Ih para mais potenciais de despolarização e causando uma

despolarização estável do potencial de membrana em repouso, que foi bloqueado por ZD7288.

Estas constatações sugerem que modulação da Ih através de um aumento do cAMP

desempenha um papel importante na sensibilização do nociceptor causada pela PGE2.

61

VI – Dor Neuropática

A capacidade de experiência da dor tem uma função protetora: adverte-nos contra a lesão

existente ou iminente ao corpo e evoca as respostas que minimizam a lesão (reveja Seção – I).

Isto é, a dor aguda ou nociceptiva é um mecanismo de proteção necessário; em contrapartida,

a dor crônica não atende a sobrevivência evidente ou funcionamento útil.

Entre diferentes tipos de dor crônica é a dor neuropática periférica – ou neuralgia periférica –

a característica essencial da qual é a dor resultante de um ferimento ou uma lesão do

nociceptor. A dor neuropática é frequentemente intensa, implacável e resistente ao alívio por

terapias disponíveis.

A dor crônica sem qualquer evidência de uma lesão ou um machucado no nociceptor, como a

enxaqueca, não é considerada dor neuropática. O ferimento pode ser em qualquer parte do

nociceptor e pode ser o resultado de qualquer um de uma série de insultos possíveis ao

nociceptor. Embora o insulto na dor neuropática periférica seja o nociceptor primário, as

alterações subjacentes à síndrome de dor neuropática podem incluir alterações ao sistema

nervoso periférico (SNP), a medula espinhal e ao sistema nervoso central (SNC).

Nesta seção, vamos focar-nos sobre as alterações que ocorrem no SNP.

Mecanismos Básicos

Os sintomas da dor neuropática periférica podem incluir a dor persistente ou paroxística, em

queimação, pontada, coceira ou formigamento, a qual é independente de qualquer estímulo

óbvio. Também podem existir anormalmente as sensações exaltadas, como alodinia – dor

resultante de um estímulo normalmente inócuo – e hiperalgesia – uma resposta realçada a um

estímulo normalmente doloroso.

Intuitivamente, poderíamos pensar que quando um nervo aferente é ferido, iria falhar a

transmissão de informações a medula espinhal. Isto é, se poderia sensatamente esperar uma

perda das sensações, ao invés de uma sensação aumentada ou persistente. Isso é o que

acontece quando uma linha de telefone é cortada; não pode fazer ou receber chamadas

telefônicas. Na medida em que pode existir alguma perda de sensibilidade associada à dor

neuropática periférica, analogia da linha de telefone é verdadeira. No entanto, a resposta

realçada e a presença de dor na ausência de um estímulo, implicam que há algo

fundamentalmente diferente entre um axônio neuronal machucado e um cabo de telefone

cortado.

A questão torna-se quais os tipos de alterações ocorrem quando um nervo é machucado que

possa dar origem à dor neuropática?

62

Funcionalmente as raízes nervosas espinhais são classicamente divididas em raízes dorsais

para transmissão sensorial e raízes ventrais para transmissão motora. As raízes ventrais são

consideradas compostas de axônios dos neurônios motores mielinizados. No entanto, nos

seres humanos e outros mamíferos, na ordem de um terço de todos os axônios das raízes

ventrais são amielinizadas, têm seus corpos celulares em GRD e são predominantemente

nociceptivas (veja a Figura 6.1).

Fig. 6.1 – Gânglio da raiz dorsal mostra os corpos celulares dos nociceptores.

Na cor vermelha, o axônio entra na medula espinhal através da raiz dorsal; e na cor azul, o axônio entra através da raiz ventral. O nervo formado pelas duas raízes é mostrado secionado distalmente.

Isso provavelmente explica porque a rizotomia dorsal, um processo na qual a raiz do nervo

espinhal entre o GRD e a medula espinhal é interrompido, às vezes não proporciona alívio à

dor crônica. Além disso, esses tipos de lesões onde às raízes dorsais tiveram prejuízos não

foram considerados a causar dor neuropática nos seres humanos. Portanto, pode-se dizer que

nem todas as lesões nos nociceptores resultam em dor neuropática.

Modelos de lesões nervosas

Os modelos de lesões nervosas em animais são usados para estudar a dor neuropática (veja a

Figura 6.1). Quando um feixe nervoso é cortado distalmente ao GRD, o coto proximal que é a

porção ainda conectada ao corpo celular fechado, sob o broto de fibras nervosas de condições

mais favoráveis, irá regenerar e processar as conexões periféricas adequadas. No entanto, se a

regeneração está bloqueada de alguma forma, como na amputação, o broto pode formar uma

massa emaranhada – neuroma. A porção do axônio, no feixe nervoso cortado, separada do

núcleo celular nervoso degenera em um processo chamado degeneração Walleriana, também

conhecida como degeneração anterógrada – ocorrendo na direção normal ou externa. Quando

63

apenas uma fração das fibras nervosas em um feixe nervoso é machucada e submetida à

degeneração Walleriana, os axônios intactos restantes vão ser expostos aos produtos dos

axônios degenerados e também aos agentes liberados do tecido circundante que está

respondendo aos axônios degenerados.

Em animais, onde um neuroma experimental é realizado por uma secção de axônio – axotomia

do nervo ciático – a atividade espontânea anormal pode ser gravada das raízes dorsais e nas

fibras nervosas acima do neuroma. A descarga espontânea é também ectópica: originando em

um lugar anormal, ao invés da localização normal do termino do nervo periférico. A atividade

espontânea pode estar relacionada ao desenvolvimento de dor persistente ou paroxística que

ocorre com a dor neuropática.

Após axotomia do nervo ciático, um grande número de genes é regulado positivamente ou

negativamente em neurônios do GRD140, 141. Estas mudanças na expressão dos genes

provavelmente levam a um aumento na excitabilidade dos neurônios do GRD, a qual é a

explicação mais simples da atividade espontânea anormal.

Um prognóstico seria que uma regulação positiva dos canais de sódio controlados por

voltagem (NaV) e de cálcio controlados por voltagem (CaV) e uma regulação negativa dos canais

de potássio controlados por voltagem, os quais se opõem aos canais excitatórios, podem ser

responsáveis pela excitabilidade aumentada dos neurônios do GRD após lesão de nervos

periféricos. Foi sugerido que a regulação do canal de NaV1.3 contribui para a

hiperexcitabilidade anormal (reveja a Seção – V) e atividade espontânea dos neurônios feridos

do GRD142. No entanto, um nível normal do comportamento da dor neuropática desenvolve

em camundongos de nocaute do canal de NaV1.3 sugerindo que a expressão aumentada do

canal de NaV1.3 não é necessária ao desenvolvimento de dor neuropática143.

Os efeitos da axotomia do nervo ciático nas correntes dos canais de cálcio, de potássio e de

controlado por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN) foram estudados em

neurônios do GRD isolado de ratos, das raízes – L4 e L5 – que dão origem ao nervo ciático144.

As correntes transportadas pelos três tipos de canais foram reduzidas em neurônios do GRD

após a axotomia do ciático, sugerindo que os aumentos na excitabilidade neuronal estão

associados com a diminuição nas correntes do canal de potássio.

Um dos problemas no estudo de dor neuropática experimentalmente e do tratamento clínico

é que podem ser causadas por várias neuropatias; consequentemente, os sintomas e os

tratamentos podem depender da causa particular e qual nervo ou nervos estão envolvidos.O

ferimento mecânico do nervo pode resultar da compressão aguda ou crônica do nervo ou mais

severamente por corte parcial ou total de um nervo. Alguns modelos de ferimentos mecânicos

em nervos foram desenvolvidos e se revelaram úteis no estudo experimental de dor

neuropática, em roedores (veja Figura 6.2). O nervo ciático pode ser parcialmente ligado ou

uma constrição crônica pode ser colocada em torno do ciático. Também podem ser cortados

os nervos provenientes do ciático. Estes procedimentos têm em comum que algumas das

fibras nervosas da inervação do pé permanecem intactas e permitem testes de hiperalgesia e

de alodinia.

64

Fig. 6.2 – Modelos de ferimentos mecânicos na inervação do ciático.

É importante ter em mente que a alodinia e a hiperalgesia podem ocorrer no nociceptor e/ou

mais centralmente e, por conseguinte é necessário determinar se a hipersensibilidade em um

estado de dor neuropática induzida pela lesão do nervo está no todo ou em parte resulta de

alterações nas propriedades dos nociceptores.

Em ratos com ligação unilateral dos nervos espinhais lombares L5/L6, a qual produziu alodinia

e hipersensibilidade na perna ipsilateral, as gravações foram realizadas em única fibra distal a

ligação dos nervos de inervação da perna145. Os limiares das respostas aos estímulos

mecânicos eram mais baixos e a amplitude das respostas aos estímulos mecânicos supralimiar

foi maior nas fibras C e A nesses animais do que em animais sham operados. Somente as

fibras C eram sensíveis aos estímulos de calor e seus limiares mais baixos, em animais com

ligação do nervo que nos animais sham operados. Estes resultados indicam que os

seguimentos do ferimento nervoso dos nociceptores da inervação na pele se tornam

sensibilizados aos estímulos mecânicos e térmicos, proporcionando elementos de evidência

que a sensibilização do nociceptor pode contribuir para a dor neuropática.

65

O trauma mecânico não é a única maneira de que um nervo pode ser ferido. O ferimento

também pode ocorrer como resultado de uma doença metabólica – diabetes mellitus, uma

infecção – neuralgia pós-herpética, doenças autoimunes ou um trauma de nervo induzido

quimicamente. Complicando mais a situação é que cerca de um terço das neuropatias

periféricas é considerado ser idiopática – isto é resultando de uma causa obscura ou

desconhecida. Ainda, quando a dor crônica com alodinia, pode ocorrer na maioria dos tipos de

neuropatia, é muito improvável que uma única alteração molecular irá uniformemente

caracterizar os estados de dor neuropática.

Dois exemplos das síndromes de dor neuropática:

Causalgia

O termo causalgia foi utilizado pela primeira vez pelo médico civil de guerra Silas Weir

Mitchell, em 1864, para descrever a dor em queimação intensa e marcada sensibilidade às

vibrações ou ao toque na distribuição de um nervo periférico ferido, após ferimentos militares.

Entre 1930 a 1940, a causalgia foi associada com o sistema nervoso simpático e geralmente é

aceito que a dor está associada à função eferente simpática, classificada como: dor por

manutenção simpática.

Em condições normais, a atividade nas fibras simpáticas pós-ganglionares não produz dor, nem

é capaz de ativar os nociceptores; no entanto, após o ferimento dos nociceptores no nervo

ferido podem tornar-se excitados com a epinefrina e a estimulação do tronco simpático.

Todavia não é claro se existe um efeito direto simpático sobre o nociceptor ou se o efeito é

indireto.

Neuralgia do trigêmeo

A neuralgia do trigêmeo, também chamado de tic douloureux, é uma condição de dor crônica

caracterizada por ataques repentinos – paroxismo – de dor facial nas áreas de distribuição do

nervo trigêmeo: mandíbula, dentes, gengiva, lábios, bochechas e menos frequente em torno

dos olhos e fronte.

Estes episódios de dor podem ser disparados por um leve toque em torno da boca ou da face,

ou ainda falar ou comer. Pode ser causado por irritação ou estimulação do nervo trigêmeo por

uma pressão do vaso sanguíneo sobre a saída do tronco cerebral. Em alguns casos, está o

associado com esclerose múltipla ou tumor.

A primeira opção de tratamento de escolha para neuralgia do trigêmeo é medicação:

anticonvulsivantes, como carbamazepina, são geralmente eficazes. Aqueles pacientes

impossibilitados a tolerar os efeitos colaterais dos medicamentos ou que se tornam resistentes

à medicação, a cirurgia é a próxima opção.

66

Alguns exemplos da diversidade dos tratamentos para dor neuropática:

Gabapentina

O fármaco antiepiléptico gabapentina foi inicialmente sintetizada para imitar a estrutura

química do neurotransmissor ácido gama-aminobutírico (GABA). No entanto, atualmente a

gabapentina não é considerada a atuar no mesmo receptor do cérebro como GABA. O uso

como um analgésico para dor neuropática resultou do relato de casos clínicos do seu efeito

analgésico em pacientes com histórias bem documentadas de dor neuropática.

Pregabalina

A pregabalina foi projetada como um sucessor mais potente da gabapentina e igualmente foi

considerada a ser útil ao tratamento de dor neuropática.

Uma proteína de ligação de alta afinidade à [3H]gabapentina foi subsequentemente isolada e

em seguida identificada como a subunidade 2-1 do canal de cálcio controlado por voltagem

(CaV)146. A expressão da subunidade 2-1 foi aumentada 17 vezes no GRD ipsilateral as lesões

nervosas, mas não no GRD contralateral147. A maior expressão da subunidade 2-1 foi

encontrada para preceder o aparecimento da alodinia em animais experimentais e diminuem

enquanto os animais foram recuperados. Estes resultados implicam que a regulação positiva

da subunidade 2-1 em nociceptores pode potencialmente desempenhar um papel no

desenvolvimento da dor neuropática após lesão do nervo.

Se os efeitos analgésicos da gabapentina e da pregabalina resultam de sua ligação com a

subunidade 2-1 do canal de CaV e se a ligação de certo modo pode ser bloqueada ou

eliminada, o efeito analgésico deve ser extremamente decrescente. Acontece que a

substituição da alanina por arginina na posição 217 da molécula 2-1 previne a ligação da

gabapentina e da pregabalina. Utilizando técnicas de gene alvos, camundongos mutantes

foram produzidos tendo alanina148 na posição 217 da molécula 2-1. Os camundongos

mutantes exibiram respostas normais à dor, no entanto o efeito analgésico da pregabalina

durante a fase tardia da dor induzida pela formalina ou alodinia após ligadura de constrição

crônica do nervo ciático foi perdida, demonstrando assim conclusivamente que as ações

analgésicas da pregabalina são mediadas pela subunidade 2-1 dos canais de CaV. Deve ter

em mente que a mutação na subunidade 2-1 diminuiu extremamente a ligação da

pregablina por todo o sistema nervoso e não apenas no GRD ipsilateral da lesão do nervo.

No estudo mostrando que o aumento da expressão da subunidade 2-1 precedida do ataque

de alodinia após o ferimento do nervo, o ferimento foi produzido por ligação dos nervos

espinhais lombares L5/L6 num ponto distal ao seu GRD e proximal a sua união para formar o

nervo ciático147. Em estudo subsequente, três tipos de ferimentos mecânicos nervosos foram

utilizados para determinar se a regulação positiva da subunidade 2-1 no GRD correlaciona

com a alodinia induzida149. Além disso, a ligação de L5/L6 conforme descrito acima, foram

67

transecionados no mesmo local e, em terceiro, o nervo ciático de um lado foi constrito por

uma série de ligaduras em torno do nervo. Em todas as três situações, houve um aumento

significativo na expressão da subunidade 2-1 no GRD e uma correspondente alodinia tátil,

que foi inibida por gabapentina.

Estes autores também estudaram animais exibindo alodinia tátil resultante da neuropatia

diabética e neuropatia tóxica induzida por vincristina – um agente utilizado na quimioterapia

do câncer que funciona por inibição da congregação de microtúbulo e seu principal efeito

colateral é neuropatia periférica. Nesses animais, não houve nenhuma alteração significativa

na expressão da subunidade 2-1 no GRD, sugerindo que o nível da subunidade 2-1 no

GRD não é o fator determinante a alodinia tátil durante todos estados de dor neuropática.

Interessantemente, em animais com neuropatia diabética existia uma alodinia tátil que foi

inibida pela gabapentina, sugerindo o envolvimento da subunidade 2-1 em locais além do

GRD. Apesar da gabapentina e pregabalina agirem pela subunidade 2-1 do canal de CaV e a

expressão desta subunidade é de regulação positiva no GRD, não existe ainda nenhuma

evidência convincente de que seu local de ação, como um analgésico para a dor neuropática é

no nociceptor e não na medula espinhal ou no sistema nervoso central (SNC).

Artemin

As terapias atuais ao tratamento de dor neuropática têm sido descritas como insuficiente, uma

vez que em muitos casos são apenas benefícios limitados e têm uma alta incidência de efeitos

indesejáveis.

Na busca contínua de novas terapias, artemin (ARTN) um dos membros da família do fator

neurotrófico derivado da célula glial (GDNF), foi considerado. Sinaliza através do coreceptor

alfa três da família do GDNF (GFR3), os complexos com o receptor RET “rearranjado durante

a transfecção” da tirosina quinase. A expressão do GFR3 em adultos está em grande parte

restrita a células do GRD de pequeno diâmetro, os quais têm axônios amielinizados muitos dos

quais são nociceptores.

Os efeitos do ARTN administrado subcutâneo na hipersensibilidade térmica e tátil, como

resultado de ligação do nervo espinhal, em ratos foram examinados. Foi verificada que a

administração sistêmica intermitente de ARTN produziu uma reversão dependente da dose na

hipersensibilidade térmica e tátil induzida da ligação do nervo, a qual foi restabelecida após a

cessação da administrarão de ARTN150. Em estudo subsequente os efeitos do ARTN após

ferimento nervoso foram especificamente estudados em fibras C porque a expressão do

receptor GFR3 é encontrada predominantemente em neurônios do GRD de pequeno

diâmetro tendo axônios amielinizados151. Mostraram que ARTN protegeu contra o ferimento

induzindo alterações nas propriedades histoquímica e eletrofisiológica das fibras C.

68

Canabinoides

A maconha foi amplamente utilizada para fins medicinais, incluindo a analgesia, nos Estados

Unidos, antes de ser classificada como uma droga do Anexo I, sujeito a lei das substâncias

controladas, a qual é classificada como uma droga com alto risco de abuso e não aceito de uso

médico. No entanto, a passagem do referendo por diversos estados permitiu o uso da

maconha para fins medicinais.

Estudos em animais têm indicado que os canabinoides (CB) produzem efeitos analgésicos em

sítio periférico, bem como espinhal e supraespinhal. No entanto, o uso de CB como analgésicos

em seres humanos é prejudicado por seu potencial de efeitos adversos, tais como alucinações,

euforia ou disforia, em pacientes que usam. O que é necessário é uma agonista do CB que

produz analgesia, mas ter efeitos adversos mínimos.

Receptores CB1 e CB2

Os efeitos dos CB são mediados por ligação a dois GPCRs, o receptor canabinoide tipo um (CB1)

e o tipo dois (CB2), que inibem a adenilato ciclase (AC) levando a diminuição dos níveis do

monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) na maioria dos tecidos e células.

Receptor CB1

A fim de determinar a extensão dos receptores CB1 localizados nos nociceptores em que

medida contribuiu para analgesia na dor neuropática e inflamatória, o CB1 foi deletado dos

nociceptores no SNP de camundongos, preservando a sua expressão no SNC152. Estes autores

usando um modelo de dor neuropática em que lesionam dois dos três ramos terminais do

nervo ciático – o nervo tibial e o fibular comum, deixando intacto o nervo sural remanescente.

Analisaram os efeitos analgésicos da administração sistêmica do agonista do receptor

canabinoide – WIN 55,212-2 – sobre a latência da resposta aos estímulos térmicos e o limiar

mecânico em animais após a lesão do nervo. A resposta da latência ao WIN 55,212-2 foi

significativamente aumentada aos estímulos térmicos e aumentou o limiar mecânico, no

entanto, os efeitos foram significativamente mais fracos em camundongos de nocaute.

Concluíram que os receptores CB1 expressos em nociceptores medeiam uma parte significativa

da produção da analgesia induzida pelo CB na dor neuropática. Chegaram à mesma conclusão

para a analgesia produzida por WIN 55,212-2 durante a dor inflamatória. Estas conclusões

argumentam fortemente ao desenvolvimento de analgésicos de ação periférica com base em

CB sintéticos que não cruzem a barreira hematoencefálica.

Finalmente, vale a pena considerar como os agonistas do CB1 que inibem a AC, levam a

diminuição dos níveis do cAMP, podem causar analgesia na dor inflamatória e neuropática

(veja a Figura 6.3).

Primeiro, considere os mediadores inflamatórios (discutidos na Seção – IV) que ativam a enzima

AC pela proteína G estimuladora (GS). Os ativadores da enzima AC são a prostaglandina E2

69

(PGE2) e do receptor ativado por proteases dois (PAR2). A enzima AC ativada catalisa a

conversão trifosfato de adenosina (ATP) em cAMP que por sua vez modula a atividade de

quatro canais – HCN, TRPV1, TRPV4 e TRPA1. A atividade dos canais de cátions do TRPV1,

TRPV4 e TRPA1 são modulados por fosforilação (P) da proteína quinase A (PKA) ativada pelo

cAMP. Por outro lado, os canais de cátions HCN têm um domínio de ligação do cAMP, o qual

regula o canal e não requer a fosforilação da proteína. PAR1 e CB1 inibem a AC pela proteína G

inibitória (Gi) e assim tendem a inibir a ativação do nociceptor pelos mediadores inflamatórios

– PG2 e do PAR2, dessa forma inibem a dor inflamatória.

CB – canabinoides; CB1 – receptor canabinoide tipo um; Gi – proteína G inibitória;

AC – adenilato ciclase; ATP – trifosfato de adenosina; cAMP – monofosfato de adenosina cíclico; PGE2 – prostaglandina E2; EP – receptor de prostanoide E; Gs – proteína G estimuladora; PAR2 – receptor ativado por proteases dois; PAR1 – receptor ativado por proteases um;

HCN2 – canal controlado por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização dois; HCN4 – canal controlado por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização quatro;

PKA – proteína quinase A; P – fosforilação; TRPV1 – canal do receptor de potencial transitório vaniloide um;

TRPV4 – canal do receptor de potencial transitório vaniloide quatro; TRPA1 – canal do receptor de potencial transitório da anquirina um;

Fig. 6.3 – Regulação da função do nociceptor pelo cAMP e a PKA.

O PAR2 e a PG2 ativam AC via Gs, assim levam ao aumento na concentração do cAMP e a ativação da PKA. Em contraste, PAR1 e CB1 inibem AC via Gi assim, levando a uma diminuição na concentração do cAMP e uma diminuição na atividade de PKA.

De que maneira, então os agonistas do CB1 podem causar analgesia na dor neuropática?

Um mecanismo possível é pelos canais HCN que foram implicados na dor neuropática, veja a

seguir.

70

Correntes em Marca-passo

O procedimento de colocação de uma ligadura em torno de um nervo espinhal para produzir

uma neuropatia foi originalmente desenvolvido para ter um modelo animal para dor

neuropática em que houvesse a dor crônica com alodinia e hiperalgesia153.

Usando esse modelo foi mostrado que as fibras A parecem mediarem a alodinia mecânica e a

hipersensibilidade enquanto as fibras C a hiperalgesia térmica154. Um mecanismo que pode dar

origem a dor crônica ao estado de dor neuropática é a presença de atividade espontânea, que

poderia ativar e/ou sensibilizar os neurônios espinhais e deste modo contribuir a dor, bem

como alodinia e hiperalgesia. Como mencionado acima, nos animais em que um neuroma

experimental é realizado por cortar o nervo ciático, os níveis elevados de atividade neuronal

ectópica espontânea podem ser gravados.

A fim de determinar o tipo das fibras que contribuem a atividade espontânea durante a dor

neuropática que existe a dor crônica com alodinia e hiperalgesia, um experimento simples foi

executado155. As ligaduras foram colocadas em torno do nervo ciático e as gravações de

diferentes tempos pós-procedimento da fibra nervosa foram feitas das raízes lombares, as

quais contribuem ao nervo ciático (veja a Figura 6.4).

Fig. 6.4 – Sistema experimental de disparo espontâneo.

Um sistema experimental utilizado para determinar o tipo das fibras nervosas de disparo espontaneamente durante a dor neuropática.

Os eletrodos estimulantes foram colocados distal e proximal do local de ligação. A velocidade

de condução da atividade espontaneamente e os axônios silenciosos podem ser determinados

usando os eletrodos estimulantes proximais. Os eletrodos estimulantes distais foram utilizados

para determinar quais as fibras conduziram através do local de ligação. As descargas

espontâneas foram observadas em 35% das A – 55 fibras, 89% das quais não conduzem

através do local de ligação, 15% das A – 20 fibras, 65% das quais não conduzem através do

local de ligação e apenas 3% das C – 2 fibras, as quais conduzem através do local de ligação.

71

Um experimento156 subsequente determinava que a atividade espontânea pudesse algumas

vezes originar perto ou no local da ligação além do GRD. Estes resultados indicam que após o

trauma mecânico, varias fibras A e A e algumas fibras C dos nervos feridos tornam-se

espontaneamente ativas e a atividade espontânea pode originar no GRD, perto ou no local do

ferimento. Além do mais, algumas das fibras com atividade espontânea ainda inervava a região

afetada pelo nervo machucado.

Muitas das atividades espontâneas das fibras A e A descritas acima exibiram um padrão de

disparo rítmico regular sugerindo fortemente a possibilidade que o padrão de disparo resulta

de uma corrente em marca-passo subjacente. As correntes em marca-passo (Ih) carregadas por

canais HCN são encontradas em neurônios do GRD (discutido na Seção – V). Em ratos157, nos

quais os nervos espinhais L5 e L6 estavam ligados, a alodinia tátil resultante foi suprimida

dependentemente da dose por ZD7288 – um fármaco originalmente considerado ser um

bloqueador específico de Ih, não seletivo entre HCN1 e HCN4. Por outro lado, o ZD7288

diminuiu as descargas espontâneas das fibras A e A. Finalmente, o ferimento nervoso

aumentou as correntes em marca-passo nos grandes neurônios do GRD e o potencial de

membrana em repouso desses neurônios foi significativamente mais positivo do que nos

controles. Estes resultados sugerem que um aumento Ih desempenha um papel na alodinia

tátil da dor neuropática. Além disso, estas conclusões apoiam a ideia que as descargas

espontâneas em neurônios do GRD desempenham um papel causal na dor neuropática.

Em desacordo com as conclusões do comportamento e eletrofisiológico descrito acima; o

ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) do canal HCN e a proteína foram reduzidas em

neurônios do GRD do mesmo lado da ligação. Em um estudo158 subsequente, a acumulação

axonal abundante da proteína do canal HCN foi encontrada nos locais de ferimento

juntamente com uma ligeira diminuição dos corpos celulares neuronais no GRD. Estes

resultados sugerem que acumulação de canais HCN no local do ferimento axonal ocasionam os

disparos ectópicos espontâneos dos potenciais de ação, que contribuem a alodinia mecânica

da dor neuropática.

As conclusões ligando Ih a indução da alodinia tátil da dor neuropática depende da

especificidade do ZD7288 para Ih, a qual foi chamada em questão com a descoberta dos efeitos

não específicos do ZD7288. Ficamos a aguardar resultados futuros antes de concluir que Ih

desempenha um papel causal no início da alodinia tátil em dor neuropática.

O papel do HCN1 na dor neuropática foi investigado159 por ligação do nervo ciático em

camundongos de nocaute do HCN1. Depois da ligação do nervo, a hiperalgesia mecânica e

alodinia ao frio estiveram presentes em animais de controle e nos camundongos de nocaute

do HCN1, a hiperalgesia mecânica foi semelhante, mas houve uma diminuição significativa da

alodinia ao frio em mais de 50% nos camundongos de nocaute. Estes resultados sugerem um

papel causal para HCN1 na indução da alodinia ao frio na dor neuropática.

72

Atividade Espontânea

Foi mencionado anteriormente que após ferimento do nervo, os nociceptores inervando a pele

tornam-se sensibilizados a estímulos mecânicos e térmicos. Desse modo fornece a evidência,

que a sensibilização do nociceptor pode contribuir ao estado de dor neuropática. Desde que a

alodinia e a hiperalgesia podem resultar de alterações que ocorrem centralmente, pode ser

que a atividade espontânea leva a hiperalgesia mediada centralmente.

Tem sido demonstrado que a estimulação elétrica das fibras C nos seres humanos pode levar a

hiperalgesia, indicando que a atividade elétrica em fibras C é suficiente para produzir

hiperalgesia mediada centralmente160. Apesar da atividade espontânea contínua pode logo ser

suficiente para produzir a hiperalgesia mecânica, não é necessária; a gangliectomia de L5 no

qual os aferentes são removidos resultou em hiperalgesia mecânica comparável a ligação do

nervo espinhal161.

Foi estudada a possibilidade da qual a dor espontânea contínua na dor neuropática é causada

por disparo espontâneo dos neurônios nociceptivos, em ratos. O comportamento de elevação

espontânea da pata como um resultado da lesão do nervo foi usado como um indicador da dor

espontânea162. Uma correlação foi verificada entre a elevação da pata espontânea e a taxa de

disparo de nociceptores C depois do ferimento e o tratamento adjuvante de Freund completo,

uma conclusão consistente com a possibilidade de uma relação causal entre os dois163.

Embora possam existir situações em que a dor neuropática crônica é o resultado do disparo

espontâneo dos aferentes nociceptivos, isso não deve ser tomado para sugerir o inverso que

todos os casos de dor neuropática contínua resultam do disparo espontâneo dos nociceptores.

No entanto, o que acontece com atividade espontânea dos aferentes A acima descrito,

poderia o disparo espontânea de esses neurônios ser a causa da dor crônica, bem como

alodinia e hiperalgesia secundaria?

Uma fração substancial dos nociceptores da fibra A (reveja a Seção – I) parecem a conduzir na

faixa de velocidade da condução A164, 165. Desse modo, o disparo espontâneo das fibras A

pode muito bem ser a causa da dor contínua, bem como alodinia e hiperalgesia secundária. Na

atualidade, esta questão permanece sem resposta.

Em resumo, locais múltiplos são alterados depois do ferimento nervoso. As anormalidades

podem ocorrer em nociceptores feridos e não feridos inervando a região afetada. Esses efeitos

incluem atividade espontânea, bem como alodinia e hiperalgesia. Os efeitos centrais

especificamente a sensibilização após o ferimento nervoso pode também ocorrer, embora

seus mecanismos não sejam considerados aqui.

73

Toxina Botulínica Tipo A

A toxina botulínica tipo A (BTX-A) liga-se ao terminal do nervo pré-sináptico onde está

incorporada na célula e, em seguida, interfere com encaixe da vesícula, desde modo a inibição

da liberação de acetilcolina (Ach) e da contração muscular. Isso tem feito da BTX-A útil ao

tratamento das doenças médicas decorrentes da contração muscular excessiva, que são

algumas vezes dolorosas.

No entanto, a dissociação entre o relaxamento muscular e a analgesia por vezes foi observada

clinicamente; sugerindo que a BTX-A poderá ter um efeito analgésico independente do seu

efeito de relaxamento muscular.

O uso da BTX-A como um agente analgésico foi testado, em ratos, no qual a ligação do nervo

ciático foi realizada para induzir a dor neuropática. Uma única dose atóxica ipsilateral

intraplantar da BTX-A injetada, 5 ou 12 dias após a ligação do nervo ciático foi capaz de reduzir

significativamente alodinia mecânica pelo menos três semanas166. Estas conclusões apoiam

fortemente a sugestão que a BTX-A tem efeito analgésico independentes do seu efeito de

relaxamento muscular.

Estudo duplo-cego placebo controlado para a utilização da BTX-A ao tratar a dor neuropática

foram efetuados em pacientes com dor pós-traumática/pós-operatória ou neuralgia pós-

herpética167 e outro grupo com neuropatia diabética dolorosa168. Em ambos os casos, a BTX-A

reduziu significativamente a dor neuropática por período de duração até três meses.

Desmielinização

A dor neuropática – ou seja, dor espontânea, hiperalgesia e alodinia – são também associadas

com neuropatias desmielinizantes periféricas em seres humanos, tais como doença de

Charcot-Marie-Tooth – amiotrofia fibular – e síndrome de Guillain-Barré – polirradiculoneurite

aguda.

O ferimento traumático do nervo, tal como a que resulta da colocação de uma ligadura ao

redor de um nervo também levará a desmielinização do nervo ferido. Consequentemente, é

razoável considerar ou não, a desmielinização pode contribuir ao desenvolvimento do estado

de dor neuropática.

A contribuição possível da desmielinização ao desenvolvimento de dor neuropática foi

estudada usando o agente desmielinizante – lisolecitina (lisofosfatidilcolina) – aplicado aos

nervos periféricos169. Estes autores encontraram que a aplicação tópica de lisolecitina causa

desmielinização focal, sem quaisquer indicações morfológicas ou imunológicas da perda

axonal. Funcionalmente, encontraram a ocorrência de baixa frequência espontâneas dos

potenciais de ação, sem significativa alodinia ou hiperalgesia periférica, mas com alodinia

mecânica e hiperalgesia térmica central. Estes resultados sugerem que a desmielinização, e

lesão não axonal, das fibras A aferentes induzem a dor neuropática central.

74

Praticamente ao mesmo tempo em que o trabalho com a lisolecitina, acima descrito estava

sendo realizado, outro grupo independente estava investigando o papel do ácido

lisofosfatídico (LPA) na dor neuropática170. Estes autores encontraram que a injeção intratecal

de LPA induziu a alodinia comportamental e hiperalgesia com desmielinização na raiz dorsal

semelhante ao encontrado para animais após a ligadura nervo. Tenha em mente que o espaço

intratecal envolve a medula espinhal e o gânglio de raiz dorsal. Além disso, descobriram que os

camundongos que faltam um dos receptores do ácido lisofosfatídico – o LPA1, não

desenvolveram alodinia comportamental, hiperalgesia e desmielinização após o ferimento do

nervo. Concluíram que a sinalização mediada pelo receptor LPA é crucial ao início da dor

neuropática.

Para esclarecer a situação no que se refere à lisolecitina e ao LPA, o mesmo grupo analisou171

os efeitos da lisolecitina em camundongos de nocaute do LPA1. Descobriram que ao contrário

dos camundongos normais, aqueles sem o receptor LPA1 não evoluíram com alodinia

comportamental e hiperalgesia após a injeção intratecal de lisolecitina. Concluíram que a

lisolecitina é convertida em LPA, que em seguida ativa o receptor LPA1 para iniciar a dor

neuropática. Este trabalho foi estendido pela injeção de LPA ao gânglio trigeminal de ratos172.

A injeção de LPA em um gânglio trigeminal induziu alodinia mecânica ipsilateral e contralateral

ao local da injeção e hiperalgesia mecânica foi observada apenas ipsilateral ao local da injeção.

O impulso para estudar o papel do LPA, na dor neuropática, foi na conclusão anterior pelo

mesmo grupo170, que a injeção intratecal da toxina botulínica C3 (BTX-C3), antes do ferimento

do nervo periférico inibiu o desenvolvimento da hiperalgesia, em camundongos173.

O BTX-C3 inibe via RhoA/Rho quinase (ROCK) por ribosilação do ADP de RhoA, e o RhoA é

ativado pela sinalização do LPA através170 da proteína G – G12/13. Além disso, mostraram

que a indução da alodinia mecânica e hiperalgesia térmica pela injeção intratecal do LPA era

inibida dependentemente da dose por BTX-C3 e também por Y-27632 – um inibidor reversível

do ROCK. Um eventual papel para a via RhoA/Rho quinase em neurônios feridos foi indicado

pela constatação que mRNA do Rho neuronal e a proporção de neurônios do GRD de L5 que

expressam RhoA sobe depois da axotomia distal174.

Como mencionado acima, a BTX-A também considerada a inibir a dor neuropática; além disso,

foi mostrado funcionar nos seres humanos. A BTX-A inibe a liberação de acetilcolina das

sinapses colinérgicas periféricas por clivagem proteolítica da proteína SNAP-25 que é essencial

para a liberação do transmissor. No entanto, tem sido demonstrado que a BTX-A também alvo

de RhoB para degradação por proteasoma175. RhoB como RhoA é ativado por sinalização do

LPA através do GPCR. Estas conclusões fortemente apontam para a via de LPA – proteína G –

Rho/Rho quinase como um alvo terapêutico potencial ao tratamento de dor neuropática.

75

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