priprava magnetnih zamreŽenih encimskih skupkov iz β

Diplomsko delo

PRIPRAVA MAGNETNIH ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ β-GALAKTOZIDAZE

September, 2016 Kaja Jeromel

Kaja Jeromel

Priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz β-galaktozidaze

Diplomsko delo

Maribor, 2016


Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Kaja Jeromel

Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemija

Predvideni strokovni naslov: diplomirani/a kemik/kemičarka (UN)

Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Komentor: Katja Vasić, univ. dipl. inž. kem. tehnol.

Maribor, 2016


I

Kazalo

Kazalo ........................................................................................................................................ I Izjava....................................................................................................................................... III Zahvala ................................................................................................................................... IV

Povzetek ................................................................................................................................... V Abstract ................................................................................................................................... VI Seznam tabel ......................................................................................................................... VII Seznam slik .......................................................................................................................... VIII Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................. X

1 Uvod in opredelitev problema ........................................................................................... 1

2 Teoretični del ..................................................................................................................... 2

2.1 Encim β-galaktozidaza ............................................................................................... 2 2.2 Imobilizacijske metode .............................................................................................. 2

2.2.1 Vezava na nosilec ............................................................................................... 3 2.2.2 Ujetje................................................................................................................... 3

2.2.3 Zamreženje ......................................................................................................... 3 2.3 Zamreženi encimski skupki (CLEAs) ........................................................................ 3

2.3.1 Priprava CLEAs .................................................................................................. 4

2.4 Magnetni zamreženi encimski skupki (mCLEAs) ..................................................... 4 2.5 Mrežni povezovalec glutaraldehid (GA).................................................................... 5

2.5.1 Fizikalne lastnosti glutaraldehida ....................................................................... 5 3 Eksperimentalni del ........................................................................................................... 6

3.1 Materiali in reagenti ................................................................................................... 6 3.2 Laboratorijska oprema in aparature ........................................................................... 6

3.3 Eksperimentalne metode ............................................................................................ 7 3.3.1 Postopek sinteze imobilizacije CLEAs ............................................................... 7 3.3.2 Imobilizacija β-galaktozidaze na maghemitne aminosilanske nanodelce in

priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov (mCLEAs)...................................... 9 3.3.3 Izvajanje testa aktivnosti pri različnih temperaturah ........................................ 10

3.3.4 Preverjanje stabilnosti CLEAs in mCLEAs pri izpostavljenosti različnim

temperaturam ................................................................................................................... 10 3.4 Analizne metode ...................................................................................................... 10

3.4.1 Učinkovitost imobilizacije ................................................................................ 10 3.4.2 Aktivnostni test ................................................................................................. 12

4 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 15 4.1 Ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih ........................................ 15

4.2 Vpliv resuspendiranja po obarjanju ......................................................................... 16 4.3 Rezultati 3-urnega zamreženja encima β-galaktozidaze ob dodatku 1,5% (v/v)

mrežnega povezovalca GA ................................................................................................. 17 4.4 Rezultati spiranja po zamreženju encimskih skupkov ............................................. 18 4.5 Zamreženje encima ob prisotnosti albumina iz govejega seruma (BSA) in albumina

kokošjih jajc (EA) ............................................................................................................... 20 4.6 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri sobni temperaturi na učinkovitost

imobilizacije in aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze ................................................... 21 4.7 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri 10°C na učinkovitost imobilizacije in

aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze ............................................................................. 23

4.8 Primerjava časa zamreženja (2 uri) pri sobni temperaturi in temperaturi 10°C ...... 25


II

4.9 Aktivnost CLEAs in mCLEAs pri izvajanju aktivnostnega testa pri različnih

temperaturah ........................................................................................................................ 26

4.10 Vpliv skladiščenja CLEAs in mCLEAs pri različnih temperaturah na njuno

aktivnost .............................................................................................................................. 29 5 Zaključek ......................................................................................................................... 34 6 Literatura.......................................................................................................................... 35 7 Priloge .............................................................................................................................. 36

7.1 Bradfordova umeritvena krivulja ............................................................................. 36 8 Življenjepis ...................................................................................................................... 38


III

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Science direct (http://www.sciencedirect.com/)

Gesla: Število referenc

enzyme IN immobilization 749

cross linked enzyme aggregates IN CLEAs 451

β-galactosidase IN immobilization 33

Vir: Digitalna knjižnica Univerze v Mariboru (http://dkum.uni-mb.si/Iskanje.php)

Gesla: Število referenc

Zamreženi encimski skupki 10

β-galaktozidaza 3

Skupno število pregledanih člankov: 46

Skupno število pregledanih knjig: 4

Maribor, september 2016 Kaja Jeromel


IV

Zahvala

Rada bi se zahvalila svoji mentorici red. prof. dr. Maji Leitgeb

za vso potrpežljivost in pomoč pri vodenju in usmerjanju pri

izdelavi moje diplomske naloge.

Velika zahvala gre tudi somentorici univ. dipl. inž. kem. teh.

Katji Vasić, ki mi je stala ob strani pri eksperimentalnem delu

z dobrimi nasveti in nepogrešljivo pomočjo.

Še posebej pa se zahvaljujem moji družini in vsem, ki so vsa

leta študija verjeli vame.


V


Povzetek

Namen diplomskega dela je bil pripraviti aktivne zamrežene encimske skupke (CLEAs) in

magnetne zamrežene encimske skupke (mCLEAs) iz encima β-galaktozidaze ter pri tem

doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostanek aktivnosti encima β-galaktozidaze.

Pri tem smo optimirali parametre, da smo prišli do čim boljših rezultatov. Priprava CLEAs in

mCLEAs je bila sestavljena iz postopka obarjanja in zamreženja. Pri obarjanju smo med

drugim preučevali, katera organska topila so se izkazala kot najboljši obarjalni reagenti.

Zamreženje pa smo optimirali s spreminjanjem časa in temperature.

Ugotovili smo, da so najboljši obarjalni reagenti za pripravo CLEAs etanol, aceton, 1-

propanol in 2-propanol, za pripravo mCLEAs pa etanol, 1-propanol in 2-propanol. Optimalni

pogoji za pripravo CLEAs in mCLEAs so koncentracija encima β-galaktozidaze 50 mg/ml in

2-urno zamreženje pri 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca glutaraldehida

(GA). Ugotovili smo tudi, da so CLEAs in mCLEAs pri 2-urni izpostavljenosti na 50°C še

stabilni, medtem ko pri izpostavljenosti na 70°C njihova aktivnost upade.

Ključne besede: β-galaktozidaza, zamreženi encimski skupki, mrežni povezovalec,

obarjanje, zamreženje, imobilizacija

UDK: 543.645.4(043.2)


VI

Preparation of magnetic cross-linked enzyme aggregates from β-galactosidase

Abstract

The purpose of the diploma work was to prepare cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)

as well as magnetic cross-linked enzyme aggregates (mCLEAs) from the enzyme β-

galactosidase and achieve the highest efficiency of immobilization and the remaining

activity of the enzyme β-galactosidase. With this process we optimized the parameters to

achieve the best possible results. The preparation on CLEAs and the mCLEAs consisted of

two procedures: precipitation and cross-linking. With the first we were examining which

organic solvents worked out most beneficially. We optimized the cross-linking with

variations in time and temperature.

We determined that the best precipitated reagents for the preparation of CLEAs are ethanol,

acetone, 1-propanol and 2-propanol and for the preparation of mCLEAs are ethanol 1-

propanol and 2-propanol. The most optimal conditions for the preparation of CLEAs and

mCLEAs occur with the concentration of the enzyme β-galactosidase 50 mg/ml, at a 2 hours

cross-linking at 10°C with adding 1,5% (v/v) cross-linking agent glutaraldehyde (GA). We

also realized that CLEAs and mCLEAs still remain stable when exposed to 50°C for 2 hours,

but they lose their stability at 70°C.

Key words: β-galactosidase, cross-linked enzyme aggregates, cross-linking agent,

precipitation, cross-linking, immobilisation

UDK: 543.645.4(043.2)


VII

Seznam tabel

4-1 Kvalitativna ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih ............................ 15


VIII

Seznam slik

Slika 2-1 Funkcije encima β-galaktozidaze [2]......................................................................... 2

Slika 2-2 Prikaz različnih imobilizacijskih metod [3] .............................................................. 3

Slika 3-1 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na neuspešno ..................................................... 8

Slika 3-2 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na uspešno ......................................................... 8

Slika 3-3 Prikaz CLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo

opravili vse meritve ................................................................................................................... 9

Slika 3-4 Prikaz mCLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo

opravili vse meritve ................................................................................................................. 10

Slika 3-5 Prikaz obarvanosti raztopin pri Bradfordovi metodi ............................................... 11

Slika 3-6 Nastanek β-D-galaktoze in o-nitrofenola iz o-nitrofenol- β-galaktozida (hidroliza)

[12] .......................................................................................................................................... 12

Slika 3-7 Prikaz obarvanosti pri aktivnostnem testu. Bolj kot je bila raztopina rumene barve,

višja je bila izmerjena aktivnost. ............................................................................................. 13

Slika 4-1 Prikaz učinkovitosti in preostale aktivnosti po obarjanju encima s koncentracijo

100 mg/ml v vseh obarjalnih reagentih in po resuspendiranju z 900 µl pufra PBS ............... 16

Slika 4-2 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem

zamreženju encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega

povezovalca GA ...................................................................................................................... 17

Slika 4-3 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 3-urnem

zamreženju encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega

povezovalca GA ...................................................................................................................... 18

Slika 4-4 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem

zamreženju encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca

GA in dveh spiranjih z 900 µl pufra PBS ............................................................................... 19


zamreženju encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca

GA in dveh spiranjih z 900 µl pufra PBS ............................................................................... 19

Slika 4-6 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs ob dodatku BSA

in EA v razmerju 3:1in pri uporabi koncentracije encima β-galaktozidaze 50 mg/ml in 100

mg/ml ...................................................................................................................................... 20

Slika 4-7 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 in 3-urnem

zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi

(T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ................................................ 21

Slika 4-8 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 in 3-urnem

zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi

(T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ................................................ 22


zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob

dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ..................................................................... 23

Slika 4-10 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 in 3-

urnem zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C

ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ................................................................ 24


IX

Slika 4-11 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 -urnem

zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C in sobni

temperaturi (T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ............................ 25

Slika 4-12 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 -urnem


temperaturi (T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA ............................ 26

Slika 4-13 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima

β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v)

mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C .................................................. 27



mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C .................................................. 27

Slika 4-15 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem


dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C v primerjavi

z aktivnostim testom opisanim v poglavju 3.4.2. ................................................................... 28



dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C v primerjavi

z aktivnostnim testom opisanim v poglavju 3.4.2. ................................................................. 29



mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri ...................................................... 30



mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri ...................................................... 31



dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri v primerjavi z

neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs ....................................................................................... 32



dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri v primerjavi z

neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs ....................................................................................... 32

Slika 7-1 Prva Bradfordova umeritvena krivulja .................................................................... 36

Slika 7-2 Druga Bradfordova umeritvena krivulja ................................................................. 36

Slika 7-3 Tretja Bradfordova umeritvena krivulja.................................................................. 37

Slika 7-4 Četrta Bradfordova umeritvena krivulja ................................................................. 37


X

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli c množinska koncentracija (mol/l)

M molarnost (mol/l)

V prostornina (ml, μl)

A absorbanca (nm)

Grški simboli

masna koncentracija (mg/ml)

φ prostorninski delež (% (v/v))

Kratice

BSA albumin iz govejega seruma

CLEAs zamreženi encimski skupki

EA albumin iz kokošjih jajc

GA glutaraldehid

mCLEAs magnetni zamreženi encimski skupki

NaBH3CN natrijev-cianoborov hidrid

NH2 amino skupina

PBS fosforni pufer

PEHA pentaetilenheksamin

pH vrednost pH


1

1 Uvod in opredelitev problema

Encimi so naravni katalizatorji, ki so biokompatibilni, biorazgradljivi in pridobljeni iz

obnovljivih virov. Industrijsko uporabo encimov pogosto ovira pomanjkanje dolgoročne

stabilnosti in težka ponovna uporaba encima. Te pomanjkljivosti lahko odpravimo z

imobilizacijo encima. Imobiliziran encim je encim, ki je vezan na inertno, netopno snov.

Prednost imobiliziranih encimov je, da se lahko ponovno uporabijo in da se pri imobilizaciji

stabilizirajo. Imobiliziran encim lahko zagotavlja večjo odpornost na spremembe pogojev,

kot so pH ali temperatura. Pomembni so za komercialne namene, saj imajo številne prednosti

v samih stroških in procesu reakcije. [3][35][11]

Diplomsko delo zajema predvsem področje imobilizacije in zamreženja encima β-

galaktozidaze.

Ukvarjali smo se z imobilizacijo β-galaktozidaze brez nosilca, pri kateri nastanejo zamreženi

encimski skupki (CLEAs). Prednost CLEAs je, da v enem koraku izvedemo čiščenje in

vezavo encima. Dodajanje organskih topil vodni raztopini proteinov vodi do njihovega

obarjanja, naslednja faza za pripravo CLEAs pa je zamreženje v obliki encimskih skupkov.

Za zamreženje uporabimo mrežni povezovalec. Največkrat je to glutaraldehid (GA), zaradi

ugodne cene in enostavne uporabe. Pomembno je, da uporabimo optimalno količino le-tega,

saj lahko drugače pride do deaktivacije encima. Po zamreženju CLEAs ločimo s

centrifugiranjem in dobimo zamrežene skupke encimov. [1][8]

Prednosti CLEAs so, da jih lahko pripravimo iz neobdelanih encimov, nimamo stroškov z

nosilci, čiščenje in vezavo encima opravimo v enem koraku, njihovo skladiščenje je

enostavno, imajo visoko katalitsko produktivnost, enostavno jih je ločiti in tudi ponovno jih

lahko uporabimo. [15]

Glavni namen diplomskega dela je bila priprava aktivnih zamreženih encimskih skupkov in

magnetnih zamreženih encimskih skupkov iz encima β-galaktozidaze in sočasna

optimizacija parametrov, da bi dosegli čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostanek

aktivnosti encima. Iskali smo tudi najbolj primerne obarjalne reagente. Diplomsko delo

obsega opis vseh uporabljenih eksperimentalnih in analiznih metod, nekaj teoretičnih

dejstev, na koncu pa so predstavljeni in interpretirani še doseženi rezultati.


2

2 Teoretični del

2.1 Encim β-galaktozidaza Ima tri encimske aktivnosti. Cepi lahko disaharidno laktozo, da se tvorita glukoza in

galaktoza, ki nadalje vstopata v proces glikolize in se uporabita kot vir energije. Katalizira

lahko transgalaktozilizo laktoze do alolaktoze ali pa lahko cepi alolaktozo v monosaharide.

Uporablja se v genetiki, molekularni biologiji in drugih znanostih. V molekularni biologiji se

običajno uporablja kot reporterski označevalec (marker) za spremljanje genske ekspresije.

Uporablja pa se tudi za blaženje simptomov laktozne intolerance. [3][11]

Slika 2-1 Funkcije encima β-galaktozidaze [2]

2.2 Imobilizacijske metode Imobilizacija encima je ponavadi zahteva za uporabo encima kot industrijskega

biokatalizatorja. Imobilizacijske tehnike so bile v zadnjem času zelo močno orodje za

izboljšanje skoraj vseh lastnosti encima, npr. stabilnost, aktivnost in selektivnost. [6]

Metode imobilizacije encimov lahko razdelimo v tri kategorije: vezava na nosilec, ujetje in

zamreženje.


3

Slika 2-2 Prikaz različnih imobilizacijskih metod [3]

2.2.1 Vezava na nosilec

Vezava na nosilec je lahko fizikalna (npr. hidrofobne in van der Waalsove interakcije),

ionska ali kovalentna. Fizikalna vezava pri strogih industrijskih pogojih visoke koncentracije

reaktanta in produkta ter pri veliki ionski moči je običajno preveč šibka, da bi encim obdržali

na nosilcu. Ionska vezava je večinoma močnejša. S kovalentno vezavo imobiliziramo le

nizke koncentracije encimov, kar pa preprečuje uhajanje encima s površine nosilca.

Tipični nosilci za imobilizacijo encimov so sintetične smole, biopolimeri ter anorganske

trdne snovi, kot so npr. silicijev dioksid (angl. "silica") SiO2 ali zeoliti. [3]

2.2.2 Ujetje

Pri tej metodi gre za ujetje encima v zamrežen polimer. Običajno so vključene organske in

anorganske matrice polimera, kot so poliakrilamidni in silikatni sol-gel. Encim se lahko

deaktivira ali pa se izgubi. [3]

2.2.3 Zamreženje

Zamreženje je navzkrižno povezovanje encimskih agregatov ali kristalov. Tehnika

zamreženja proteina preko reakcije, npr. glutaraldehida z reaktivno NH2 skupino na površini

proteina, je bila odkrita več kot 40 let nazaj. Kljub temu zamreženi encimi kažejo nizko

ohranitev dejavnosti, slabo ponovljivost in majhno mehansko stabilnost. Zaradi svoje

želatinaste strukture je z njimi tudi težko ravnati. [3]

Vezava na nosilec je postala najbolj razširjena encimska imobilizacijska metoda.

2.3 Zamreženi encimski skupki (CLEAs)

Znano je, da dodajanje soli, vodotopnih organskih topil ali neionskih polimerov k vodnim

raztopinam proteinov vodi do njihovega obarjanja v skupke, ki so povezani z nekovalentnimi

vezmi, brez motnje njihove terciarne strukture torej brez denaturacije.

Navzkrižno povezovanje oz. zamreženje teh skupkov jih naredi trajno netopne, medtem ko

agregati vzdržujejo svojo superstrukturo. Zato se pojavi njihova katalitična aktivnost. To je

privedlo do razvoja nove skupine imobiliziranih encimov: CLEAs. Odkar se obarjanje

uporablja za čiščenje encimov, metoda s CLEAs v bistvu združuje čiščenje in imobilizacijo v

eno skupno operacijo, ki ne zahteva zelo čistega encima. [1]


4

Če encim izkazuje omejeno termično stabilnost in nizko toleranco na organska topila, je

idealen kandidat za stabilizacijo z imobilizacijo.

CLEAs imajo številne prednosti v smislu industrijskih aplikacij. Ni potrebe za zelo čisti

encim. Lahko jih pripravimo iz zelo nedodelanih oz. surovih encimskih pripravkov. Kažejo

visoko katalitsko produktivnost in preprosto okrevanje in recikliranje. Na splošno imajo

izboljšano skladiščenje in operativno stabilnost glede na denaturacijo s toploto, organskimi

topili in avtolizo. So tudi stabilni proti izpiranju v vodnem mediju. Še ena lastnost CLEAs

je, da je odlična metoda za stabilizacijo kvartarnih struktur multimernih encimov.

Pomembna lastnost je tudi njihova velikost delčkov (angl. "particle size"), ki je ponavadi v

območju 5 nm do 50 nm. Zelo lahko jih ločimo s filtracijo, še boljše pa s centrifugiranjem.

Imajo nizke pridelovalne stroške, saj ne potrebujemo dragih nosilcev. [3]

2.3.1 Priprava CLEAs

Priprava zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) je postopek brez uporabe nosilca, saj

združujemo encime v 3D strukturo. Razdeljena je na več korakov. Prvi korak je obarjanje, ki

je lahko uspešno ali pa ga ocenimo za neuspešno. Če dobimo belo oz. motno suspenzijo, to

pomeni, da smo encim oborili uspešno. Obarjanje moramo izvajati počasi in sicer tako, da k

obarjalnemu reagentu po kapljicah dodajamo raztopino encima. Drugi del postopka priprave

CLEAs pa je zamreženje encimskih skupkov. Dodamo mrežni povezovalec oz. zamreževalo

in nato vse skupaj točno določen čas zamrežujemo. Dobimo suspenzijo, ki vsebuje CLEAs

in preostali prosti encim. Ta pristop je najbolj preprost in natančen način za določanje

aktivnosti CLEAs. Zelo pomemben je čas zamreženja, saj ravno ta določa čas

izpostavljenosti encima obarjalnemu reagentu. Prav tako je pomembno, katero zamreževalo

(angl. "cross-linker") uporabimo. Čas, potreben za popolno zamreženje, je odvisen tudi od

temperature. Nasplošno naj bi veljalo zamreženje pri sobni temperaturi, ki naj bi trajalo 3

ure, vendar z optimizacijo vseh parametrov (koncentracija mrežnega povezovalca,

temperatura zamreženja, čas zamreženja ...) lahko dosežemo boljše rezultate. [8]

2.4 Magnetni zamreženi encimski skupki (mCLEAs) Magnetni zamreženi encimski skupki so pripravljeni z adicijo funkcionaliziranih amino

magnetnih nanodelcev kot dodatek v encimsko raztopino. Iz te raztopine s pomočjo

obarjanja pridobimo agregate oz. skupke, ki se potem zamrežijo skupaj z nanodelci.

Nanodelci imajo zaradi svoje velikosti veliko površinsko območje, zato jih lahko prevlečemo

z velikim številom amino skupin. Poleg tega zaradi magnetnih lastnosti magnetnih

nanodelcev dobimo mCLEAs, ki jo lahko zlahka nadzorujemo in ločimo od reakcijske zmesi

že samo z uporabo magnetnega polja. S tem se lahko izognemo centrifugiranju in filtraciji.

[7]


5

2.5 Mrežni povezovalec glutaraldehid (GA)

Med številnimi razpoložljivimi zamreževalnimi sredstvi je glutaraldehid nedvomno daleč

najbolj uporabno sredstvo na različnih področjih kot so mikroskopija, encimska tehnologija,

biomedicina in farmacevtske znanosti. Je linearni dialdehid (C5H8O2) s 5 ogljikovimi atomi.

Je brezbarvna, oljnata tekočina, ki je topna v vseh razmerjih v vodi in alkoholih kot tudi v

organskih topilih. Je zelo uporaben zaradi svoje tržne dostopnosti in nizkih stroškov, poleg

tega pa ima tudi visoko reaktivnost. Hitro reagira z aminsko skupino in je učinkovitejši od

drugih aldehidov pri tvorjenju termično in kemično stabilne vezi.

Glutaraldehid je pogosto uporabljen kot blago zamreževalno sredstvo pri imobilizaciji

encimov, saj reakcija v vodni raztopini pufra tako poteče pod pogoji blizu fiziološke pH,

ionske trdnosti in temperature.

V literaturi sta največkrat omenjeni dve metodi z uporabo glutaraldehida: tvorba

tridimenzionalne mreže kot posledica intermolekularnega zamreženja in vezava na netopni

nosilec (npr. najlon, zamreženi proteini, kot sta želatina ali goveji serum albumin (BSA),

polimeri z amino skupino, …) .

Koncentracijo encima in glutaraldehida moramo skrbno nadzorovati, da preko zamreženja

dobimo v vodi netopne derivate encimov. Paziti moramo, da izberemo takšne pogoje, da se

intermolekularno zamrežujejo molekule encimov in ne prihaja do intramolekularnega

zamreženja, ki ga ponavadi povzročijo nizke koncentracije encima in glutaraldehida. Znano

je, da količina uporabljenega zamreževala vpliva na stopnjo oziroma obseg zamreženja.

Encimska aktivnost je obratno sorazmerna koncentraciji uporabljenega glutaraldehida, saj

lahko obsežno zamreženje povzroči izkrivljanje oziroma popačenje strukture encima.

Uspeh glutaraldehida kot zamreževala je posledica njegove večkomponentne narave, kjer je

prisotnih več oblik v ravnotežju raztopine reagenta pri določenem pH. [5]

2.5.1 Fizikalne lastnosti glutaraldehida

Glutaraldehid se pojavlja kot prozorna oziroma brezbarvna tekočina z gostoto 1,06 g/ml.

Njegovo tališče je pri -14°C, vrelišče pa pri 187°C. Topen je v vodi, etanolu, ocetni kislini,

kloroformu, etru in drugih organskih topilih. Nevarni so njegovi hlapi, ki dražijo nos, oči in

kožo. Glutaraldehid ni vnetljiv, uporablja se predvsem kot razkužilo in zamreževalno

sredstvo. [13]


6

3 Eksperimentalni del

3.1 Materiali in reagenti Uporabili smo naslednje kemikalije:

Encim β-galaktozidaza iz Aspergillus oryzae, Sigma

2-nitrofenol β-D-galaktopiranozid, Sigma

BSA – albumin iz govejega seruma, Sigma-Aldrich

EA-albumin iz kokošjih jajc, Sigma-Aldrich

Na2CO3 – natrijev karbonat, brezvodni, Kemika Zagreb

Glutaraldehid, Sigma-Aldrich

C2H3NaO2- natrijev acetat, brezvodni, Kemika Zagreb

PEHA – pentaetilenheksamin, Aldrich

NaBH3CN- natrijev cianoborov hidrid, Merck

Coomassie Brilliant Blue G 250, Merck

Aceton, Carlo Erba reagents

Etanol, Sigma Aldrich

1-propanol, Merck

2-propanol, Sigma-Aldrich

n-heksan, Merck

metanol, Carlo Erba reagents

1-butanol, Merck

Acetonitril, Sigma-Aldrich

Amonijev sulfat, Fluka Chemika

Dietil eter, Sigma-Aldrich

3.2 Laboratorijska oprema in aparature

Steklene čaše (30 ml, 50 ml, 100 ml)

Steklene bučke (100 ml)

Steklena palčka

Spatula

Grelnik

Magnet

Centrifugirke (50 ml)

Mikrocentrifugirke (1,5 ml, 2ml)

Stojalo za (mikro) centrifugirke

Pipete (0,1 ml, 1 ml, 5 ml)

Termometer


7

pH-meter, Hanna Instruments, Madžarska

Vorteks, Mikro+Polo, Slovenija

Tehtnica, Sartorius, Nemčija

Stresalnik, Heidolph Unimax 1010, Nemčija

Centrifuga, Eppendorf Centrifuge 5804R, Nemčija

UV-VIS spektrofotometer, Varian Cary 50 Probe

Magnetno mešalo, Rotamix Slovenija

Sušilnik (Binder, Nemčija)

3.3 Eksperimentalne metode

3.3.1 Postopek sinteze imobilizacije CLEAs

Postopek za pripravo zamreženih encimskih skupkov (angl. "cross-linked enzyme

aggregates") je sestavljen iz dveh stopenj:

obarjanja in

zamreženja

3.3.1.1 Obarjanje encima β-galaktozidaze

Izbrali smo nekaj organskih topil, ki naj bi bili potencialni dobri obarjalni reagenti. Pri

obarjanju je bil volumski delež obarjalnega reagenta 90% (v/v) in volumski delež encima

10% (v/v). V centrifugirko smo odpipetirali 900 μl obarjalnega reagenta in mu kasneje

počasi po kapljicah dodali 100 μl raztopine encima. Vse skupaj smo obarjali 40 minut ob

konstantnem stresanju in na koncu raztopino centrifugirali 5 minut pri 11 000 rpm/minuto.

Po končanem centrifugiranju smo odpipetirali supernatant, izmerili koncentracijo proteinov

po Bradfordovi metodi in izmerili aktivnost encima. Glede na rezultate smo določili, kateri

obarjalni reagenti so najboljši, preostale pa izločili.

Kot obarjalne reagente smo preizkusili naslednja organska topila:

Aceton

Etanol

1-propanol

2-propanol

n-heksan

metanol

1-butanol

Acetonitril

Amonijev sulfat (0.1M, 0.2M, 0.5M, 1M, 2M, 2.5M, 3M)

Dietil eter


8

Slika 3-1 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na neuspešno

Slika 3-2 Prikaz obarjanja, ki smo ga ocenili na uspešno

3.3.1.2 Zamreženje encima β-galaktozidaze v encimske skupke (CLEAs)

Zamrežene encimske skupke dobimo s postopkom obarjanja, opisanega v poglavju 3.3.1.1 in

s postopkom zamreženja encima.

Za zamreženje smo sprva uporabili različne kombinacije encima in stabilizacijskih proteinov

BSA ter EA.

obarjali smo encim (100 mg/ml ali 50 mg/ml): 100 μl encima smo počasi po

kapljicah dodajali v raztopino obarjalnega reagenta in mešali 40 minut

BSA+PEHA: v mikrocentrifugirko smo odpipetirali 100 μl encima, 100 μl BSA

(goveji serum albumin) in 200 μl PEHA (pentaetilenheksamin) ter mešali 40 minut.

BSA+EA: v razmerju 3:1 smo zmešali 300 μl BSA (30 mg/ml) in 100 μl EA (50

mg/ml). 100 μl te mešanice smo zmešali s 100 μl encima (100 mg/ml ali 50 mg/ml)

in dodali 200 μl PEHA ter mešanico mešali 20 minut. Sledilo je obarjanje s 100 μl

mešanice in nadaljnjo mešanje 40 minut.


9

Obarjanje smo preizkušali z različnimi obarjalnimi reagenti: aceton, etanol, 1-propanol, 2-

propanol, 1-butanol, n-heksan, metanol, acetonitril, dietil eter in amonijev sulfat. Pripravili

smo raztopino encima (100 ali 50 mg/ml). 100 μl te raztopine smo obarjali v 900 μl

obarjalnega reagenta. Raztopino smo mešali 40 minut. Nato je nastopila stopnja zamreženja.

Dodali smo mrežni povezovalec glutaraldehid (1,0 % (v/v) ali 1,5 % (v/v)) in mešali še 2 ali

3 ure. Mešali smo pri sobni temperaturi ali pri 10°C. Po pretečenem času smo dodali še 100

μl 100 mM NaBH3CN ter stresali še dodatnih 40 minut. Po končanem zamreženju smo

raztopino centrifugirali 5 minut na 11 000 rpm/min. Odpipetirali smo supernatant, v katerem

smo izmerili koncentracijo proteinov po Bradfordovi metodi, peletek pa smo uporabili za

aktivnostni test. V primeru, da se nam oborina po prvem centrifugiranju ni dobro posedla,

smo ponovno centrifugirali in nato odvzeli supernatant, v katerem smo nadalje opravili

meritve.

Slika 3-3 Prikaz CLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo opravili vse

meritve

Testirali smo tudi rezultate po dveh spiranjih. Prvo spiranje je sledilo po obarjanju,

zamreženju in centrifugiranju. Ko smo odvzeli supernatant, smo dodali 900 μl pufra PBS in

ponovno centrifugirali 3 minute na 11 000 rpm/min. Po prvem spiranju smo prav tako

odvzeli supernatant za merjenje koncentracije proteinov, na peletku pa smo naredili

aktivnostni test.

Isti postopek je bil za vzorce po dveh spiranjih, kjer smo vzorce ponovno sprali z 900 μl PBS

in meritve opravili po identičnem postopku kot pri prvem spiranju.

3.3.2 Imobilizacija β-galaktozidaze na maghemitne aminosilanske nanodelce in priprava magnetnih zamreženih encimskih skupkov (mCLEAs)

Pripravili smo si mešanico encima z aminosilanskimi delci: 5 mg aminosilanskih nanodelcev

smo dodali 100 μl encima (50 g/ml) in 300 μl pufra PBS.

Mešanico smo stresali 40 minut. Po stresanju smo 100 μl mešanice obarjali v 900 μl

obarjalnega reagenta. Sledil je enak postopek kot pri pripravi zamreženih encimskih

skupkov. Opisan je v poglavju 3.3.1.2


10

Slika 3-4 Prikaz mCLEAs po centrifugiranju ter odvzemu supernatanta, na katerih smo opravili vse

meritve

3.3.3 Izvajanje testa aktivnosti pri različnih temperaturah

Regente za aktivnostni test smo pripravili po klasičnem postopku, vendar smo vzorce med

testom za 10 minut izpostavili na 50°C in 70°C. Tako smo ugotavljali spremembe aktivnosti.

3.3.4 Preverjanje stabilnosti CLEAs in mCLEAs pri izpostavljenosti različnim temperaturam

CLEAs in mCLEAs smo pripravili po že znanem in v prejšnjih poglavjih opisanem postopku

pri optimalnih pogojih (2 uri zamreženja pri 10°C in ob dodatku 1,5% (v/v) glutaraldehida).

Kasneje smo vzorce izpostavili za 2 uri temperaturam 50°C in 70°C ter na koncu izmerili

preostalo aktivnost encima imobilizirane β-galaktozidaze.

3.4 Analizne metode

3.4.1 Učinkovitost imobilizacije

3.4.1.1 Bradfordova metoda za določevanje skupnih proteinov

Pripravili smo Bradfordov reagent po naslednjem postopku: v 50 ml 95% etanola in v 100

ml 85% (v/v) fosforne kisline (H3PO4) smo raztopili 100 mg Coomassie Brilliant Blue ter

razredčili z Milli-Q vodo do oznake 1 L.


11

Kasneje smo pripravili umeritveno krivuljo: za pripravo smo uporabili protein albumin v

koncentracijskem območju od 0 do 1 mg/L. Natehtali smo 10 mg albumina in mu dodali 1

ml Milli-Q vode. 10 mg/ml smo razredčili po naslednjem postopku:

samo Milli-Q voda (Blank)->0,0 mg/ml

20 µl albumina (10mg/ml) + 980 µl Milli-Q vode -> 0,2 mg/ml





Vzorec za določanje smo pripravili tako, da smo v mikrocentrifugirko odpipetirali 1 ml

Bradfordovega reagenta in mu dodali 20 µl vzorca. Mikrocentrifugirko smo zvorteksirali in

inkubirali 15 minut na sobni temperaturi. Absorbanco smo merili pri 595 nm, za slepi vzorec

pa smo namesto vzorca vzeli 20 µl Milli-Q vode.

Bolj kot je bila raztopina obarvana modro, več je bilo prisotnega prostega encima v vzorcu.

Slika 3-5 Prikaz obarvanosti raztopin pri Bradfordovi metodi


12

3.4.1.2 Izračun učinkovitosti imobilizacije

Po Bradfordovi metodi za določanje proteinov smo iz dobljenih podatkov izračunali

učinkovitost imobilizacije, ki nam pove, koliko encima se je uspelo vezati na površino

magnetnih nanodelcev.

Enačba za izračun učinkovitosti imobilizacije:

100)(

(%)

i

si

c

cc

(3.1)

Kjer so:

ρ koncentracija imobiliziranega encima (mgencim/gnosilec)

ci koncentracija prostega encima (mg/ml)

cs koncentracija encima v spiranjih (mg/ml)

Vvzorec volumen vzorca (ml)

mn masa nosilca (magnetnih nanodelcev) (g)

3.4.2 Aktivnostni test

Aktivnost encima β-galaktozidaze smo določali po naslednjem principu:

Slika 3-6 Nastanek β-D-galaktoze in o-nitrofenola iz o-nitrofenol- β-galaktozida (hidroliza) [12]

Pri aktivnostnem testu β-galaktozidaze smo morali upoštevati naslednje pogoje: T=37°C,

pH=6.0, A405nm


13

Potrebovali smo 4 različne reagente.

- Reagent A smo pripravili iz 100 mM natrijevega acetatnega pufra, ki smo ga raztopili

v 100 ml deionizirane vode. Raztopino smo pri 37°C umerili na pH 6.0 z 1M HCl.

- Reagent B smo pripravili iz 2,0 mM o-nitrofenol β-D-galaktopiranozida z 0,01%

(v/v) BSA (goveji serum albumin) v 100 ml reagenta A. Tudi to smo po potrebi

umerili na pH 6.0 pri 30°C.

- Reagent C pa smo pripravili iz 1000 mM natrijevega karbonata, ki smo ga raztopili v

100 ml deionizirane vode.

- Reagent D je predstavljal raztopino encima β-galaktozidaze ali pelet, na katerem smo

testirali aktivnost.

Aktivnostni test smo izvajali tako, da smo s pomočjo mililitrske pipete dozirali reagente.

Najprej smo dodali 500 µl reagenta B, kasneje dodali 300 µl deionizirane vode, premešali in

inkubirali na 37°C ter na koncu dodali 200 µl našega vzorca, ki ga je skoraj vedno

predstavljal pelet (CLEAs ali mCLEAs), oziroma reagent D. Vzporedno smo po enakem

postopku izvajali slepo probo (blank), pri kateri smo namesto reagenta D dodali 200 µl

deionizirane vode. Mešali smo natanko 10 minut in po tem času dodali 4 ml reagenta C.

Vzorce smo centrifugirali na 11 000 rpm 5 minut in nato izmerili absorbanco pri 405 nm.

Bolj kot je bila raztopina rumene barve, višja je bila izmerjena aktivnost vzorca.

Slika 3-7 Prikaz obarvanosti pri aktivnostnem testu. Bolj kot je bila raztopina rumene barve, višja je

bila izmerjena aktivnost.


14

3.4.2.1 Izračun preostale aktivnosti

Aktivnost encima smo izračunali po naslednji enačbi:

2,06,410

5)(/

dfAAencimamlU sv (3.2)

Pri čemer so:

5 celotni volumen vzorca (ml)

10 čas testa (min)

4,6 milimolarni koeficient ekstinkcije o-nitrofenila pri 405 nm

df razredčitveni faktor

0,2 volumen porabljenega encima (ml)

As absorbanca slepe probe

Av absorbanca vzorca

Preostala aktivnost je tako:

100(%) encimačistegaaktivnost

CLEAaktivnostA (3.3)


15

4 Rezultati in diskusija

4.1 Ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih

Obarjanje je potekalo tako, da smo 100 µl encima (γ =100 mg/ml) po kapljicah obarjali v

900 µl obarjalnega reagenta. Obarjanje smo ocenili kot uspešno v primeru nastanka bele

oborine. V primeru tvorbe dveh faz pa smo obarjanje ocenili za neuspešno. Motno oz. belo

oborino smo dobili v primeru etanola, acetona, 1-propanola, 2-propanola, acetonitrila in

metanola. V primeru n-heksana, dietil etra, 1-butanola in amonijevega sulfata (0.1M, 0.2M,

0.5M, 1M, 2M, 2.5M, 3M) pa smo dobili dve fazi in obarjanje ocenili kot neuspešno ter ta

organska topila enostavno izločili. Če je bilo obarjanje uspešno, je sledilo centrifugiranje, pri

katerem se je oborina dobro ločila od supernatanta.

Rezultate prikazuje tabela 4-1.

4-1 Kvalitativna ocena obarjanja encima v različnih obarjalnih reagentih

Obarjalni reagent Opažanja

etanol bela oborina

aceton bela oborina

1-propanol bela oborina

2-propanol bela oborina

n-heksan 2 fazi

acetonitril bela oborina

1-butanol 2 fazi

metanol bela oborina

dietil eter 2 fazi

amonijev sulfat (0.1M, 0.2M, 0.5M, 1M, 2M, 2.5M in

3M)

2 fazi


16

4.2 Vpliv resuspendiranja po obarjanju

Po obarjanju smo testirali še aktivnost resuspendiranega encima. Resuspendiranje smo

izvedli tako, da smo po obarjanju vzorec centrifugirali ter odvzeli supernatant. Nato smo na

peletek dodali 900 µl pufra PBS ter izmerili aktivnost po istem postopku.

Slika 4-1 prikazuje primerjavo dobljenih rezultatov po samem obarjanju in po obarjanju ter

dodatnem resuspendiranju.

Pri obarjanju smo dosegli dobre rezultate, saj je aktivnost encima na peletku pri vseh vzorcih

znašala čez 100% in tudi učinkovitost imobilizacije je bila pri vseh obarjalnih reagentih nad

90%. Najvišjo preostalo aktivnost encima smo s 104,05% dosegli v primeru uporabe etanola

kot obarjalnega reagenta, najnižjo pa z 100,80% v primeru uporabe 2-propanola. Najvišja

učinkovitost imobilizacije je znašala 98,88% in sicer pri obarjanju z 1-propanolom, najnižja

pa je bila pri uporabi obarjalnega reagenta acetona in je znašala 93,77%.

Po uspešnem obarjanju je sledilo merjenje aktivnosti in učinkovitosti imobilizacije pri

resuspendiranem encimu. Najvišjo aktivnost zasledimo v primeru uporabe acetona kot

obarjalnega reagenta in sicer 86,03%. Sledi preostala aktivnost pri uporabi etanola in 1-

propanola s približno 85,50%, najslabšo aktivnost, ki znaša 81,07%, pa zasledimo pri

uporabi 2-propanola kot obarjalnega reagenta. Sklepamo, da se je preostanek encima

deaktiviral. Učinkovitosti imobilizacije so pri vseh obarjalnih reagentih zelo dobre, saj vse

znašajo več kot 99%.

Slika 4-1 Prikaz učinkovitosti in preostale aktivnosti po obarjanju encima s koncentracijo 100 mg/ml

v vseh obarjalnih reagentih in po resuspendiranju z 900 µl pufra PBS

0

20

40

60

80

100

120

10

30

50

70

90

110

130

150

170

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Učinkovitost po obarjanju [%]

Učinkovitost po resuspendiranju [%]

Aktivnost CLEAs po obarjanju [%]

Aktivnost CLEAs po resuspendiranju [%]


17

4.3 Rezultati 3-urnega zamreženja encima β-galaktozidaze ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Postopek zamreženja je trajal 3 ure ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca

glutaraldehida (GA). Preizkusili smo zamreženje encima s koncentracijo 50 mg/ml in

100 mg/ml.

Iz slike 4-2 lahko razberemo, da so se aktivnosti pri koncentraciji encima 100 mg/ml

nahajale med 80% in 90%. Najvišjo aktivnost smo dosegli v primeru uporabe acetona kot

obarjalnega reagenta z 89,37%, najnižjo pa v primeru uporabe etanola z 84,11%. Pri

koncentraciji encima 50 mg/ml so bile vse aktivnosti visoke in sicer okoli 100%. Najnižjo

aktivnost zaznamo v primeru uporabe etanola, pri katerem je le-ta znašala 94,71%. Najvišjo

aktivnost encima pa smo dosegli v primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta in sicer

103,62%.

Po dobljenih rezultatih smo sklepali, da je optimalna koncentracija encima β-galaktozidaze

za nadaljevanje 50 mg/ml, saj so se pri vseh vzorcih pokazale višje preostale aktivnosti

CLEAs kot pri koncentraciji 100 mg/ml.

Slika 4-2 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem zamreženju

encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Pri pripravi mCLEAs smo uporabljali encim s koncentracijo 50 mg/ml. Prav tako kot pri

CLEAs, smo zamreževali 3 ure ob dodatku 1,5% (v/v) GA.

Slika 4-3 prikazuje učinkovitost imobilizacije in aktivnost na peletku po zamreženju

mCLEAs. Tako aktivnost kot učinkovitost imobilizacije sta bili v primeru uporabe acetona

kot obarjalnega reagenta najnižji. Učinkovitost imobilizacije je znašala 98,94%, preostala

aktivnost pa 75,12%. Sklepamo, da je preostanek encima pri uporabi acetona kot obarjalnega

reagenta deaktiviral. V primeru uporabe obarjalnih reagentov etanola, 1-propanola in 2-

propanola pa smo dosegli odlične rezultate.

0

20

40

60

80

100

120

10

30

50

70

90

110

130

150 P

reo

stal

a ak

tivn

ost

[%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Učinkovitost imobilizacije [%] (encim 100 mg/mL)


Aktivnost CLEAs [%] (encim 100 mg/mL)



18

Učinkovitost imobilizacije je v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov znašala 100%,

aktivnost pa je bila v primeru uporabe vseh treh obarjalnih reagentov nad 130%. Najvišja

aktivnost je bila v primeru uporabe 2-propanola in sicer 139,01%. V primeru, ko je

izmerjena aktivnost v primerjavi s prostim encimom zelo visoka, sklepamo, da je prišlo do

hiperaktivacije. Ta pojav naj bi bil posledica konformacijskih sprememb v proteinu v obliki

skupkov.

Slika 4-3 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 3-urnem zamreženju

encima s koncentracijama 50 in 100 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

4.4 Rezultati spiranja po zamreženju encimskih skupkov

Ker smo želeli odstraniti nezamrežen encim, smo po zamreženju supernatant odpipetirali in

mu dodali 900 µl pufra PBS, ponovno odpipetirali supernatant in peletku ponovno dodali

900 µl pufra PBS. S tem smo vzorec dvakrat sprali in nato spranemu peletku izmerili

aktivnost.

Na sliki 4-4 in 4-5 so prikazani rezultati za CLEAs in mCLEAs.

0

20

40

60

80

100

120

140

10

30

50

70

90

110

130

150

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Učinkovitost imobilizacije [%]

Aktivnost mCLEAs [%]


19

Slika 4-4 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 3-urnem zamreženju

encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA in dveh spiranjih

z 900 µl pufra PBS

Na sliki 4-4 lahko vidimo, da so po dveh spiranjih rezultati pri uporabi vseh obarjalnih

reagentov približno enaki. Pri uporabi vseh obarjalnih reagentov je bila učinkovitost

imobilizacije med 98% in 99%. Najvišjo aktivnost smo dobili v primeru uporabe etanola kot

obarjalnega reagenta, znašala je 94,72%, najnižjo pa v primeru uporabe acetona, in sicer

91,13%.


zamreženju encima s koncentracijo 50 mg/ml ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA in

dveh spiranjih z 900 µl pufra PBS

0

20

40

60

80

100

120

0

20

40

60

80

100

120

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]


Aktivnost CLEAs [%]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0

20

40

60

80

100

120

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%]


Aktivnost mCLEAs [%]


20

Slika 4-5 prikazuje učinkovitost imobilizacije in aktivnost encima po zamreženju in dveh

spiranjih mCLEAs. Aktivnosti so bile v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov zelo

visoke, znašale so od 129,57% do 133,99%. Najvišjo aktivnost, 133,99%, smo dosegli v

primeru uporabe 2-propanola, sledile so aktivnosti v primeru uporabe obarjalnih reagentov

etanola, acetona in na koncu 1-propanola z aktivnostjo 129,57%. Učinkovitosti imobilizacije

so bile v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov visoke, nad 99%.

Pri CLEAs in mCLEAs smo dobili po dveh spiranjih zelo dobre rezultate. Aktivnost je v

primerjavi z rezultati, izmerjenimi takoj po zamreženju, za nekaj odstotkov padla, ampak še

vedno ostala zelo visoka.

4.5 Zamreženje encima ob prisotnosti albumina iz govejega seruma (BSA) in albumina kokošjih jajc (EA)

Preučevali smo vpliv dodatka stabilizacijskih proteinov in sicer albumina iz govejega seruma

(BSA) in albumina kokošjih jajc (EA) na preostalo aktivnost imobiliziranega encima.

Uporabili smo kombinacijo teh dveh stabilizacijskih proteinov, v razmerju 3:1. Tudi tukaj

smo preverjali aktivnost za koncentracijo encima 50 mg/ml in 100 mg/ml. Pri obeh smo

dodali 1,0% mrežnega povezovalca GA in zamreževali 3 ure.

Slika 4-6 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs ob dodatku BSA in EA v

razmerju 3:1in pri uporabi koncentracije encima β-galaktozidaze 50 mg/ml in 100 mg/ml

Iz slike 4-6 hitro razberemo, da so aktivnosti ob dodatku BSA in EA v razmerju 3:1 precej

upadle. V primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta opazimo znatno znižanje

aktivnosti pri obeh koncentracijah. Pri koncentraciji encima 50 mg/ml je aktivnost upadla na

1,73%, medtem ko je pri koncentraciji encima 100 mg/ml upadla na 10,87%. V primeru

uporabe etanola kot obarjalnega reagenta je pri koncentraciji encima 50 mg/ml aktivnost

upadla na 0,46%, pri koncentraciji 100 mg/ml pa je bila malo višja in je znašala 78,63%.

0

20

40

60

80

100

120

10

30

50

70

90

110

130

150

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]






21

V primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega reagenta je aktivnost pri koncentraciji

encima 50 mg/ml upadla na 25,75%, pri koncentraciji encima 100 mg/ml pa na 33,85%.

Najboljše, a vseeno ne tako zelo dobre rezultate, smo dobili v primeru uporabe 1-propanola.

Aktivnost je upadla na 55,79% pri koncentraciji encima 50 mg/ml, pri koncentraciji encima

100 mg/ml pa je znašala 80,13%. Učinkovitosti imobilizacije so prav tako upadle. Pri

koncentraciji encima 50 mg/ml je bila najvišja učinkovitost imobilizacije dosežena v primeru

uporabe acetona kot obarjalnega reagenta (96,63%), najnižja pa v primeru uporabe

obarjalnega reagenta etanola (73,98%). Pri koncentraciji encima 100 mg/ml pa so bile

učinkovitosti imobilizacije malo višje. Najvišjo smo dosegli v primeru uporabe acetona

(98,09%), najnižjo pa v primeru uporabe obarjalnega reagenta etanola (87,84%).

4.6 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri sobni temperaturi na učinkovitost imobilizacije in aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze

Pri sobni temperaturi smo CLEAs in mCLEAs ob dodatku 1,5% (v/v) zamreževali 2 uri in 3

ure.


zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi (T=25°C) ob

dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Iz slike 4-7 razberemo, da smo pri 2-urnem zamreženju najvišjo aktivnost dosegli v primeru

uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta. Sledijo aktivnosti v primeru uporabe etanola

in acetona kot obarjalnega reagenta, najslabšo aktivnost (97,78%) pa smo dosegli v primeru

uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola. Učinkovitosti imobilizacije so bile v primeru

uporabe vseh obarjalnih reagentov odlične, saj so vse znašale nad 99%. Pri 3-urnem

zamreženju smo najvišjo aktivnost prav tako dosegli v primeru uporabe 1-propanola

(95,07%), sledita aktivnosti pri uporabi obarjalnega reagenta 2-propanola z 94,69% in

acetona z 91,95%. Najnižjo aktivnost pa imamo v primeru uporabe obarjalnega reagenta

etanola, in sicer 90,17%. Učinkovitost imobilizacije je bila najnižja pri uporabi etanola kot

obarjalnega reagenta (97,24%), pri uporabi ostalih obarjalnih reagentov pa je bila nad 98%.

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

10

30

50

70

90

110

130

150

encim etanol aceton 1-propanol 2-propanol

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

] Učinkovitost imobilizacije [%] (3h zamreženja)

Učinkovitost imobilizacije [%] (2h zamreženja)

Aktivnost CLEAs [%] (3h zamreženja)



22


zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri sobni temperaturi (T=25°C) ob

dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Na sliki 4-8 so prikazani rezultati po 2-urnem in 3-urnem zamreženju mCLEAs. Najvišjo

aktivnost smo dosegli pri 3-urnem zamreženju v primeru 1-propanola (103,28%), najnižjo pa

v primeru 2-propanola (97,78%). Pri 2-urnem zamreženju smo dosegli aktivnosti okoli

100%, razen v primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta, pri katerem je aktivnost

znašala 39,67%. Ponovno smo sklepali, da je preostanek encima v primeru uporabe

obarjalnega reagenta acetona deaktiviral.

Pri CLEAs in mCLEAs vidimo, da je učinkovitost imobilizacije tako pri 2. urah in 3. urah

približno enaka. Aktivnost pri CLEAs je za nekaj odstotkov boljša pri 2-urnem zamreženju,

medtem ko je aktivnost pri mCLEAs pri 2-urnem in pri 3-urnem zamreženju približno enaka.

Glede na rezultate sklepamo, da je optimalen čas zamreženja β-galaktozidaze v (magnetne)

zamrežene encimske skupke 2 uri.

0

20

40

60

80

100

120

10

30

50

70

90

110

130

150

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]



Aktivnost mCLEAs [%] (3h zamreženja)



23

4.7 Vpliv časa stresanja ob dodatku GA pri 10°C na učinkovitost imobilizacije in aktivnost imobilizirane β-galaktozidaze

Pri 10°C smo CLEAs in mCLEAs ob dodatku 1,5% (v/v) zamreževali 2 uri in 3 ure.


zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku

1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Zamreženje CLEAs pri 10°C nam prikazuje slika 4-9. Pri 2-urnem zamreženju smo najvišjo

aktivnost zaznali v primeru 1-propanola, le-ta je znašala 117,98%, najnižjo pa smo zaznali v

primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega reagenta (98,58%). Učinkovitosti imobilizacije

so bile v vseh primerih nad 99%, najboljša je bila pri uporabi etanola, pri katerem smo

dosegli 100% učinkovitost.

Pri 3-urnem zamreženju pa smo najvišjo aktivnost dobili v primeru 1-propanola in 2-

propanola, obe sta znašali okoli 111%, sledila je aktivnost, ki smo jo dosegli v primeru

uporabe etanola kot obarjalnega reagenta, najnižjo pa smo izmerili v primeru uporabe

acetona in sicer 96,86%. Učinkovitost imobilizacije je bila pri 3-urnem zamreženju za nekaj

odstotkov nižja kot pri 2-urnem zamreženju. Najnižja, v primeru uporabe acetona, je znašala

88,44%, najvišja, v primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega reagenta, pa 99,34%.

0

20

40

60

80

100

120

140

10

30

50

70

90

110

130

150

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]






24


zamreženju encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku

1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Zamreženje mCLEAs pri 10°C nam prikazuje slika 4-10. Pri 2-urnem zamreženju najbolj

izstopa uporaba obarjalnega reagenta acetona, pri katerem je aktivnost znašala 0,00%. V

supernatantu po Bradfordovi metodi nismo zasledili preostankov proteina, zato sklepamo, da

se je encim ustrezno zamrežil. Glede na rezultate in preostalo aktivnost v primeru uporabe

acetona kot obarjalnega reagenta sklepamo, da je prišlo do koagulacije oziroma zakrnjenja

encima, kar prinaša za posledico deaktivacijo encima. Koagulacija je ireverzibilen proces.

Pri uporabi obarjalnega reagenta, v našem primeru acetona, se encim izobori v manj ugodno

konformacijo, kar povzroči veliko izgubo aktivnosti in koagulacijo encima. Pri ostalih

obarjalnih reagentih so aktivnosti visoke. Najvišjo aktivnost smo dosegli pri uporabi 2-

propanola (108,82%), sledi aktivnost v primeru uporabe etanola z 106,88% in na koncu še

aktivnost v primeru uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta z 103,84%. Učinkovitosti

imobilizacije so visoke, skoraj 100% tako pri uporabi 2-propanola, 1-propanola in etanola, v

primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta pa je znašala 94,08%.

Pri 3-urnem zamreženju smo zaznali najslabšo aktivnost prav tako v primeru uporabe

obarjalnega reagenta acetona, znašala je 31,74%. Tudi tukaj sklepamo, da je prišlo do

deaktivacije. V primeru uporabe ostalih obarjalnih reagentov so bili rezultati boljši. Najvišjo

aktivnost smo dosegli v primeru 1-propanola in sicer 109,70%. Z 109,04% mu je sledila

aktivnost v primeru uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola, v primeru uporabe

obarjalnega reagenta etanola pa je znašala preostala aktivnost 92,88%. Učinkovitosti

imobilizacije so bile visoke, nad 99%, razen v primeru uporabe acetona kot obarjalnega

reagenta je učinkovitost znašala 98,36%.

0

20

40

60

80

100

120

10

30

50

70

90

110

130

150

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]






25

Kot pri zamreženju pri sobni temperaturi (poglavje 4.6), nam zamreženje pri 10°C povzroči

približno enako učinkovitost imobilizacije tako pri 2. urah in 3. urah zamreženja. Tudi tukaj

je aktivnost pri večini primerov boljša pri 2-urnem zamreženju.

Glede na rezultate predvidevamo, da je ob dodatku GA pri 10°C optimalno 2-urno

zamreženje (magnetnih) zamreženih encimskih skupkov β-galaktozidaze.

4.8 Primerjava časa zamreženja (2 uri) pri sobni temperaturi in temperaturi 10°C

Glede na poglavje 4.6 in 4.7, smo se odločili, da primerjamo, pri kateri temperaturi sta

najboljši učinkovitost imobilizacije in preostala aktivnost.

Slika 4-11 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti CLEAs po 2 -urnem zamreženju

encima β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C in sobni temperaturi

(T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Slika 4-11 za CLEAs nam prikazuje, da je aktivnost na peletku za kar nekaj odstotkov višja

pri 10°C. V primeru etanola je aktivnost pri 2-urnem zamreženju na sobni temperaturi

znašala 102,04%, pri 10°C pa 109,30% V primeru acetona kot obarjalnega reagenta je

aktivnost na sobni temperaturi znašala 100,86% medtem ko je pri 10°C 108,56%. Prav tako

je pri uporabi 1-propanola bila boljša aktivnost pri 10°C (117,98%) in ne pri sobni

temperaturi (103,28%). Tudi v primeru uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola je

aktivnost na 10°C, ki je znašala 98,58%, bila višja kot pri sobni temperaturi, pri kateri je

aktivnost znašala 97,78%. Učinkovitost imobilizacije je bila v primeru uporabe vseh

obarjalnih reagentov, tako pri 2-urnem kot pri 3-urnem zamreženju, nad 99%, v primeru

uporabe etanola pa je v obeh primerih zamreženja znašala 100%.

Glede na rezultate sklepamo, da je optimalno zamreženje pri 2h in 10°C.

-10

10

30

50

70

90

110

130

10

30

50

70

90

110

130

150

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Učinkovitost imobilizacije [%] (sobna temperatura)

Učinkovitost imobilizacije [%] (10°C)

Aktivnost CLEAs [%] (sobna temperatura)

Aktivnost CLEAs [%] (10°C)


26

Slika 4-12 Prikaz učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti mCLEAs po 2 -urnem


temperaturi (T=25°C) ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega povezovalca GA

Na sliki 4-12 takoj razberemo, da je aktivnost v primeru uporabe acetona v obeh primerih

zelo nizka. Kot je opisano že v poglavju 4.7, je razlog za tako nizko aktivnost deaktivacija

oziroma koagulacija (zakrknjenje) encima. V primeru uporabe etanola kot obarjalnega

reagenta je pri 2-urnem zamreženju pri sobni temperaturi aktivnost znašala 99,92%, pri 10°C

pa 106,88%. Tudi v primeru uporabe 1-propanola je bila višja aktivnost pri 10°C (103,84%)

v primerjavi z aktivnostjo pri sobni temperaturi (98,33%). Enako velja za obarjalni reagent

2-propanol, pri katerem je aktivnost pri 10°C znašala 108,82%, pri sobni temperaturi pa

99,53%.

Iz dobljenih rezultatov lahko sklepamo, da za mCLEAs ostanejo optimalni obarjalni reagenti

etanol, 1-propanol in 2-propanol (glede na rezultate poglavja 4.6 in 4.7).

Za CLEAs in mCLEAs velja, da so najboljši rezultati ob 2-urnem zamreženju pri 10°C.

4.9 Aktivnost CLEAs in mCLEAs pri izvajanju aktivnostnega testa pri različnih temperaturah

Preverjali smo, kako se spremeni aktivnost CLEAs in mCLEAs po zamreženju, če

aktivnostni test opravimo pri temperaturi 50°C in pri 70°C.

0

20

40

60

80

100

120

10

30

50

70

90

110

130

150

Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Učinkovitost imobilizacije [%] (sobna temperatura)

Učinkovitost imobilizacije [%] (10°C)

Aktivnost mCLEAs[%] (sobna temperatura)

Aktivnost mCLEAs [%] (10°C)


27

Slika 4-13 Prikaz izmerjene aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima β-

galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega

povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C

Kot lahko razberemo iz slike 4-13, je aktivnostni test pri 50°C pokazal aktivnosti v primeru

uporabe vseh obarjalnih reagentov nad 100%. Pri CLEAs smo najvišjo aktivnost dosegli v

primeru uporabe obarjalnega reagenta acetona, in sicer 117,29%, najnižjo pa v primeru

uporabe 1-propanola, in sicer 102,69%. Pri mCLEAs pa je bila najvišja aktivnost v primeru

uporabe 2-propanol (105,21%), najnižja pa v primeru uporabe etanola kot obarjalnega

reagenta (102,62%).



povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C

0

20

40

60

80

100

120


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Aktivnost na peletku [%] (CLEA)

Aktivnost na peletku [%] (mCLEA)

10

30

50

70

90

110


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Aktivnost na peletku [%] (CLEA)

Aktivnost na peletku [%] (mCLEA)


28

Tudi pri aktivnostnem testu pri 70°C (slika 4-14) so se aktivnosti ohranile in znašale okoli

100%. Pri CLEAs je bila najvišja aktivnost v primeru uporabe 1-propanola (103,38%),

najnižjo pa v primeru uporabe etanola kot obarjalnega reagenta (98,29%). Prav tako kot pri

CLEAs je tudi pri mCLEAs bila najvišja aktivnost v primeru uporabe 2-propanola z

100,38%, takoj mu sledi aktivnost v primeru uporabe 1-propanola z 100,32% in etanola kot

obarjalnega reagenta z 97,94% kot najnižjo aktivnostjo.

Lažje interpretiramo rezultate, če jih primerjamo z aktivnostjo, izmerjeno pri aktivnostnem

testu, ki je opisan v poglavju 3.4.2. Aktivnost prostega encima, izmerjenega pri testu na

50°C oz. 70°C, primerjamo z aktivnostjo, izmerjeno pri aktivnostnem testu po predpisanih

pogojih. Aktivnost CLEAs oz. mCLEAs pri aktivnostnem testu na 50 oz. 70°C pa prav tako

primerjamo z aktivnostjo CLEAs oz. mCLEAs, izmerjeno pri aktivnostnem testu opisanem v

poglavju 3.4.2.

Slika 4-15 Prikaz izmerjene preostale aktivnosti CLEAs in mCLEAs po 2-urnem zamreženju encima

β-galaktozidaze s koncentracijo 50 mg/ml pri temperaturi 10°C ob dodatku 1,5% (v/v) mrežnega

povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 50°C v primerjavi z aktivnostim testom opisanim v

poglavju 3.4.2.

Kot vidimo iz slike 4-15, je aktivnostni test pri 50°C prinesel dobre rezultate. Preostala

aktivnost encima glede na encim izmerjen pri predpisanih pogojih v poglavju 3.4.2 je

znašala 92,56%. Najvišjo preostalo aktivnost pri CLEAs smo dosegli v primeru uporabe

acetona kot obarjalnega reagenta, ko se je ohranila 100%, sledila mu je aktivnost v primeru

uporabe 2-propanola z 94,95%, etanola z 88,24% in 1-propanola kot obarjalnega reagenta z

80,57%. Pri CLEAs je aktivnost izmerjena pri aktivnostnem testu na 50°C malo manjša v

primerjavi z aktivnostnim testom pri predpisanih pogojih v poglavju 3.4.2. Najvišjo

preostalo aktivnost mCLEAs pa smo v primerjavi z aktivnostnim testom pri predpisanih

pogojih dosegli v primeru uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta. Ohranila se je

122,99% aktivnost, sledila mu je aktivnost v primeru uporabe 2-propanola z 118,63% in

etanola kot obarjalnega reagenta z 117,82%. mCLEAs pa so se rezultati v primerjavi z

rezultati izmerjenimi po predpisanih pogojih, opisanih v poglavju 3.4.2, izboljšali.

0

20

40

60

80

100

120

140


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Preostala aktivnost encima [%] Preostala aktivnost CLEA [%] Preostala aktivnost mCLEA [%]


29



povezovalca GA pri aktivnostnem testu na 70°C v primerjavi z aktivnostnim testom opisanim v

poglavju 3.4.2.

Aktivnostni test na 70°C (slika 4-16) je prav tako prinesel precej dobre rezultate. A v

primerjavi z aktivnostnim testom opravljenim pri pogojih opisanih v poglavju 3.4.2 in pri

aktivnostnem testu na 50°C, je tukaj preostala aktivnost že malo upadla. Preostala aktivnost

prostega encima pri aktivnostnem testu na 70°C je v primerjavi z aktivnostnim testom pri

pogojih iz poglavja 3.4.2 78%. Pri CLEAs smo najvišjo preostalo aktivnost dosegli v

primeru uporabe 2-propanola z 78,47%, sledi aktivnost izmerjena v primeru uporabe acetona

z 73,64%, etanola z 70,14% in 1-propanola kot obarjalnega reagenta z 68,34%. Pri mCLEAs

pa je najvišja aktivnost bila v primeru uporabe 1-propanola kot obarjalnega reagenta, in sicer

86,91%, v primeru uporabe etanola in 2-propanola pa se je v primerjavi s pogoji opisanimi v

poglavju 3.4.2 ohranila približno 82% preostala aktivnost.

4.10 Vpliv skladiščenja CLEAs in mCLEAs pri različnih temperaturah na njuno aktivnost

CLEAs in mCLEAs smo v sprva skladiščili (peletek inkubirali) na 50°C. Preverjali smo

stabilnost CLEAs in mCLEAs.

Slika 4-17 prikazuje rezultate, ki smo jih dosegli z zamreževanjem ob dodatku 1,5% (v/v)

GA 2 uri pri 10°C, za kar smo v prejšnjih poglavjih ugotovili, da so optimalni pogoji, tako za

CLEAs kot tudi mCLEAs. Nato smo supernatant odcentrifugirali ter CLEAs in mCLEAs

izpostavili 50°C za 2 uri. Kasneje smo izmerili aktivnost po že znanem postopku. Pri CLEAs

smo uporabili vse 4 optimalne obarjalne reagente, pri mCLEAs pa smo, kot je opisano v

poglavju 4.7, izločili aceton in uporabili etanol, 1-propanol in 2-propanol.

0

20

40

60

80

100


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Preostala aktivnost encima [%]

Preostala aktivnost CLEA [%]

Preostala aktivnost mCLEA [%]


30



povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri

Slika 4-17 prikazuje izmerjeno aktivnost po 2-urnem inkubiranju peletka na 50°C. Pri

CLEAs je bila najvišja aktivnost v primeru uporabe acetona kot obarjalnega reagenta in sicer

je znašala 119,88%, najnižja pa v primeru uporabe 1-propanola z 96,31%. Pri mCLEAs pa je

aktivnost že upadla. Aktivnost je še posebej v primeru uporabe etanola zelo upadla, na

9,04%, kar pomeni, da mCLEAs v primeru uporabe obarjalnega reagenta etanola pri 50°C

niso več stabilni. Vzrok je visoka temperatura, ki mCLEAs deaktivira. Tudi v primeru

uporabe 1-propanola je aktivnost upadla na 55,22%. Najvišjo aktivnost pri mCLEAs smo

dosegli v primeru obarjalnega reagenta 2-propanola, kjer je znašala 95,76%. Torej mCLEAs

so pri inkubiranju na 50°C dobro stabilni le v primeru uporabe 2-propanola kot obarjalnega

reagenta.

Rezultati so pri CLEAs dobri, saj znaša aktivnost v primeru uporabe vseh obarjalnih

reagentov nad 96%, torej se je aktivnost po 2 urah inkubiranja na 50°C zelo ohranila. Glede

na te rezultate smo se odločili, da preizkusimo, kakšno aktivnost bodo CLEAs in mCLEAs

ohranili po 2 urah inkubiranja na 70°C.

Postopek je bil enak kot pri inkubiranju na 50°C.

0

20

40

60

80

100

120

140


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Aktivnost na peletku (CLEA)

Aktivnost na peletku (mCLEA)


31



povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri

Pri rezultatih iz slike 4-18 se takoj razbere, da se aktivnost ni ohranila in tako lahko trdimo,

da CLEAs in mCLEAs niso stabilni pri temperaturi 70°C. Pri uporabi vseh obarjalnih

reagentov vidimo, da je aktivnost zelo nizka. Najvišjo aktivnost smo dosegli pri CLEAs v

primeru uporabe 2-propanola, ta je znašala 14,94%, pri mCLEAs pa v primeru uporabe

etanola kot obarjalnega reagenta, kjer je znašala 2,40%. Sklepamo, da je vzrok za

deaktivacijo previsoka temperatura.

Za lažjo primerjavo smo izračunali preostalo aktivnost. Preostalo aktivnost za inkubiran

prosti encim smo izračunali glede na prosti encim, ki ga nismo inkubirali. Za inkubirano

CLEAs in mCLEAs pa smo preostalo aktivnost prav tako izračunali glede na neinkubirano

CLEAs in mCLEAs.

Rezultati so prikazani na sliki 4-19 in 4-20.

0

20

40

60

80

100

120


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]

Aktivnost na peletku (CLEA) Aktivnost na peletku (mCLEA)


32



povezovalca GA po inkubiranju na 50°C 2 uri v primerjavi z neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs

Kot vidimo, je aktivnost inkubiranega prostega encima v primerjavi z aktivnostjo

neinkubiranega prostega encima za 12 odstotkov nižja. Pri inkubiranju CLEAs se je

aktivnost ohranila v primeru uporabe vseh obarjalnih reagentov. Najvišja preostala aktivnost,

glede na aktivnost neinkubirane CLEAs, je bila v primeru uporabe acetona in je znašala

96,76%, najnižja pa je bila v primeru uporabe etanola kot obarjalnega reagenta (80,35%). Pri

mCLEAs pa se aktivnost, razen v primeru uporabe obarjalnega reagenta 2-propanola

(101,07%), ni ohranila. Pri uporabi etanola kot obarjalnega reagenta je padla za kar 90%, pri

uporabi 1-propanola pa se je znižala za 35%.



povezovalca GA po inkubiranju na 70°C 2 uri v primerjavi z neinkubiranimi CLEAs in mCLEAs

0

20

40

60

80

100

120


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]




0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00


Pre

ost

ala

akti

vno

st [

%]





33

Ker se je aktivnost pri CLEAs pri inkubiranju na 50°C ohranila, smo preverili še, kako je pri

inkubiranju na 70°C. Inkubiranemu prostemu encimu se je aktivnost dobro ohranila

(97,36%), CLEA in mCLEA pa sta popolnoma deaktivirali v vseh obarjalnih reagentih. Tako

pri CLEAs kot mCLEAs je aktivnost, v primerjavi z aktivnostjo neinkubirane CLEAs in

mCLEAs, padla za več kot 90%, razen pri CLEAs v primeru uporabe 2-propanola kot

obarjalnega reagenta za 85%. To pomeni, da CLEAs in mCLEAs na temperaturi 70°C niso

več stabilni.


34

5 Zaključek

V diplomskem delu smo preučevali pripravo zamreženih (magnetnih) encimskih skupkov

(CLEAs oz. mCLEAs) β-galaktozidaze in določali aktivnost encima po imobilizaciji.

Preizkušali smo različna organska topila kot obarjalne reagente ter preverjali, pri katerih je

aktivnost po zamreženju najvišja. Višja aktivnost pomeni boljši obarjalni reagent. Preizkušali

smo tudi, kakšna je aktivnost po spiranju s pufrom PBS, kako se skupki odzivajo pri

različnih testih aktivnosti, do katere temperature so stabilni in ohranijo svojo aktivnost.

Uspešno smo sintetizirali tako magnetne kot nemagnetne zamrežene encimske skupke.

Zamreženi encimski skupki oz. CLEAs so vsebovali encim β-galaktozidazo in glutaraldehid,

kot mrežni povezovalec. Za obarjanje smo ugotovili, da so najbolj optimalni obarjalni

reagenti organska topila etanol, aceton, 1-propanol in 2-propanol. Magnetni zamreženi

encimski skupki oz. mCLEAs pa so vsebovali encim β-galaktozidazo, aminosilanske

nanodelce, pufer PBS in mrežni povezovalec glutaraldehid. Za optimalno obarjanje pa smo

uporabili etanol, 1-propanol in 2-propanol.

Ugotovili smo, da je za pripravo CLEAs in mCLEAs optimalna koncentracija encima za

obarjanje 50 mg/ml in da je optimalna koncentracija mrežnega povezovalca GA 1,5% (v/v).

S spreminjanjem časa zamreževanja smo ugotovili, da je optimalen čas stresanja oz.

zamreženja po dodatku mrežnega povezovalca glutaraldehida (GA) 2 uri. Raziskovali smo

tudi vpliv temperature zamreženja in ugotovili, da dobimo boljše rezultate ob zamreženju na

10°C kot pri sobni temperaturi.

V našem delu smo raziskovali termično stabilnost zamreženih encimskih skupkov ter s tem

vpliv temperature na njihovo aktivnost. Ugotovili smo, da so CLEAs pri temperaturi do

50°C do neke mere še stabilni in ohranjajo svojo aktivnost, pri temperaturi 70°C pa

aktivnosti ne ohranijo in niso stabilni. mCLEAs pa deaktivirajo že pri izpostavljenosti na

50°C in svoje aktivnosti pri tej temperaturi kot tudi pri 70°C ne ohranijo.


35

6 Literatura

[1] R.A. Sheldon. Cross-linked enzyme aggregates (CLEAs): stable and recyclable

biocatalysts. Biochemical Society Transactions, 35 (6), 2007.

[2] D.H. Juers, B.W. Matthews, R.E. Huber. LacZ β-galactosidase: Structure and function

of an enzyme of historical and molecular biological importance. The Protein Society.

www.proteinscience.org, 2012.

[3] R.A. Sheldon, S. van Pelt. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why,what and how.

Chem Soc Rev. 42 (6223), 2013.

[4] L. Cao, F. van Rantwijk, R.A. Sheldon. Cross-Linked Enzyme Aggregates: A Simple

and Effective Method for the Immobilization of Penicillin Acylase. Organic letters,

Vol 2, No. 10 (1361-1364), 2000.

[5] I. Migneault, C. Dratguenave, M.J. Bertrand, K.C. Waldron. Glutaraldehyde: behavior

in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.

BioTechniques, 37 (790-802), 2004.

[6] C. Mateo, J.M. Palomo, G. Fernandez-Lorente, J.M. Guisan, R. Fernandez-Lafuente.

Improvements of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization

techniques. Enzyme and Microbial Technology, 40 (1451-1463), 2007.

[7] S. Talekr, V. Ghodake, T. Ghotage, P. Rathod, P. Deshmukh, S. Nedar, M. Mulla, M.

Ladole. Novel magnetic cross-linked enzyme aggregates (magnetic CLEAs) of alpha

amylase. Boiresource Technology, 123 (542-547), 2012.

[8] R. Schoevaart, M.W. Wolbers, M. Gulubovic, M. Ottens, A.P.G. Kieboom, F. van

Rantwijk, L.A.M van der Wielen, R.A. Sheldon. Preparation, Optimization, and

Structures of Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs). Biotechnology and

Bioengineering. 2004.

[9] P. Lopez-Serrano, L. Cao, F, van Rantwijk, R.A. Sheldon. Cross-linked enzyme

aggregates with enhanced activity: application to lipases. Biotechnology Letters, 24

(1379-1383), 2002.

[10] Jose M. Guisan. Immobilization of Enzymes and Cells. Second edition. New Jersey:

Humana Press, 2006.

[11] https://en.wikipedia.org/wiki/Immobilized_enzyme (dostop dne 1.7.2016)

[12] http://microbeonline.com/onpg-test-%CE%B2-galactosidase-principle-procedure-

results/ (dostop dne 25.7.2016)

[13] https://en.wikipedia.org/wiki/Glutaraldehyde (dostop dne 6.8.2016)

[14] Roger A. Sheldon. Cross-Linked Enzyme Aggregates as Industrial Biocatalysts.

Organic Process Research & Development, 15 (212-223), 2011.

[15] Roger A. Sheldon. Characteristic features and biotechnological applications of cross-

linked enzyme aggregates (CLEAs). Appl Microbiol Biotechnol, 92 (467-477), 2011.

[16] F. Šulek, D.P. Fernandez, Ž. Knez, M. Habulin, R.A. Sheldon. Immobilization of

horseradish peroxidase as crosslinked enzyme aggregates (CLEAs). Process

Biochemistry, 46 (765-769), 2011.

https://en.wikipedia.org/wiki/Immobilized_enzyme

http://microbeonline.com/onpg-test-%CE%B2-galactosidase-principle-procedure-results/

http://microbeonline.com/onpg-test-%CE%B2-galactosidase-principle-procedure-results/

https://en.wikipedia.org/wiki/Glutaraldehyde


36

7 Priloge

7.1 Bradfordova umeritvena krivulja

Na spodnjih slikah so prikazane Bradfordove umeritvene krivulje.

Slika 7-1 Prva Bradfordova umeritvena krivulja

Slika 7-2 Druga Bradfordova umeritvena krivulja

y = 0,6805x R² = 0,9989

-0,1000

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

abso

rban

ca p

ri 5

95

nm

koncentracija BSA [mg/mL]

Umeritvena krivulja

y = 0,7331x R² = 0,9937

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

abso

rban

ca p

ri 5

95

nm


Umeritvena krivulja


37

Slika 7-3 Tretja Bradfordova umeritvena krivulja

Slika 7-4 Četrta Bradfordova umeritvena krivulja

y = 0,7703x R² = 0,9952

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

abso

rban

ca p

ri 5

95

nm


Umeritvena krivulja

y = 0,608x R² = 0,9979

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

abso

rban

ca p

ri 5

95

nm


Umeritvena krivulja


38

8 Življenjepis

priprava magnetnih zamreŽenih encimskih skupkov iz β

Documents