Minisatellite polymorphisms of the SLC6A19: Susceptibility in hypertensionSo-Young Seol a, Sang-Yeop Lee a,b, Young-Dae Kim c, Eun-Ju Do a, Jeong-Ah Kwon a, Seung Il Kim d,In-Sun Chu b,*, Sun-Hee Leem a,*a Department of Biological Science, Dong-A University, 840 Hadan-2-dong, Saha-gu, Busan 604-714, Republic of Koreab Medical Genomics Research Center, KRIBB, Daejeon 305-806, Republic of Koreac Department of Internal Medicine, College of Medicine, Dong-A University, Busan 602-714, Republic of Koread Proteomics Team, Korea Basic Science Institute, Daejeon, 305-806, Republic of KoreaPolimorfismos mini satlites del SLC6A19: Susceptibilidad en la hipertensinResumenEl SLC6A19 es un homlogo humano de B0AT1 que codifica un transportador de aminocidos neutros.Examinamos la distribucin del VNTR (nmero variable de repeticiones en tndem; mini satlites) y se realizaron anlisis polimrfica de SCL6A19 aislado del ADN genmico de los controles y las familias multi generacionales.Se descubri que el SLC6A19 contena siete bloques de mini satlites, 3 de los cuales (SLC6A19-MS1, -MS4 y -MS7) mostraron polimorfismo y resultaron ser transmitidos a travs de la meiosis, siguiendo la herencia mendeliana en siete familias.Estos polimorfismos mini satlite pueden ser marcadores tiles para el mapeo de la paternidad y la huella de ADN.Adems, se realiz un estudio de casos y controles en el que se compar el ADN genmico de 400 controles y 205 casos con hipertensin esencial (tambin llamada hipertensin primaria, esta por definicin, no tiene una causa identificable).Una asociacin estadsticamente significativa fue identificada entre los raros alelos SLC6A19-MS7 y la aparicin de la hipertensin (OR, 7,87; intervalo de confianza del 95%, 0.88-70.66; yp= 0,028).Estos hallazgos sugieren que el raro alelo SLC6A19-MS7 puede ser un factor de riesgo para la hipertensin.Palabras clave La hipertensinesencial/primaria; Transportador deneurotransmisores; VNTR; Polimorfismos mini satlites; SLC6A19

El SLC6 (familia transportadora del soluto 6), familia de protenas actan como transportadores especficos para los neurotransmisores, aminocidos, y osmolitos. Toda la familia de protenas SLC6 se puede dividir en los siguientes cuatro subgrupos: GABA (cido -aminobutrico), monoaminas, AA (aminocidos) y Hurfanos. Miembros de la familia SLC6 son conocidos por jugar un papel importante en una serie de condiciones patolgicas, y varios miembros de la familia SLC6 son potenciales objetivos de drogas que estn siendo continuados actualmente por la industria farmacutica[2],[5],[11][27].El grupo de hurfanos de la familia SLC6 incluye SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19 y SLC6A20. El SLC6A forma un clster de filognesis con SLC6A19 y SLC6A20[11].Adems, SLC6A18 estaba presente en la parte secuenciada de una biblioteca en un proyecto de secuenciacin del ADNc a gran escala y anotado automticamente como Xtrp2[22].Los patrones de expresin de SLC6A18 y SLC6A19 se han encontrado cantidades abundantes en el cerebro anterior[11]y el rin.Adems, se ha informado de que el gen murinoXT2, que es homlogo al gen SLC6A18 humano, se asocia con hipertensin[23].Adems, el SLC6A19 en humanos y de ratones recientemente demostr ser capaz de transportar los aminocidos neutros[16].Por otra parte, se sabe que mutaciones en el gen SLC6A19 puede causar la enfermedad renal conocida como trastorno de Hartnup, que es un trastorno metablico hereditario que involucra el transporte de ciertos aminocidos (por ejemplo, triptfano e histidina) en el intestino delgado y los riones. Una comparacin de las regiones sintticas del genoma del ratn y del humano revel la presencia de dos genes transportadores hurfanos en el cromosoma humano 5p15, que posteriormente fueron clasificados como SLC6A18 y SLC6A19 por la organizacin del genoma humano[11].Se observ una unin relativamente fuerte entre la hipertensin humana y la regin 5p15[24]y[28].Esta regin codifica los genes de la B Xtrp (SLC6A18) y0AT1 (SLC6A19), que son homlogas a la zona del cromosoma de ratn 13. Estos transportadores SLC6A18 y SLC6A19 son altamente expresados en el rin[11].Adems, la interrupcin del gen XT2causa la hipertensin[23].Tomados juntos, estos resultados indican que los transportadores de la familia hurfanos pueden causar hipertensin en los seres humanos.Recientemente hemos llevado a cabo un estudio en el que se inform de la distribucin de VNTRs de SCL6A18[29].Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la distribucin global de estos mini satlites, lo que indica que estos polimorfismos no son responsables de la susceptibilidad de la hipertensin esencial (EH) en la poblacin coreana.El SLC6A18 y SLC6A19 se encuentran cerca de los telmeros en los brazos p del cromosoma 5. Los mini satlites humanos son secuencias altamente variables TR (repeticiones en tndem) que se encuentran principalmente en las regiones sub-telomericas del cromosoma[12][25], que es donde se localizanhTERT, sck1 / SLI, MUC2y SLC6A18[13],[17],[18][29].Algunos alelos minisatlites estn asociados con trastornos humanos y con la expresin diferencial de los genes cercanos[1],[3],[10],[19][21], y las variantes de VNTR se asocian con un alto riesgo de una variedad de enfermedades[13][15].Por lo tanto, analizamos siete nuevos mini satlites de toda la regin SLC6A19 para determinar si haba alguna importancia funcional putativa a la variacin allica en estos mini satlites con respecto a la susceptibilidad para la hipertensin esencial.Para determinar el genotipo de los polimorfismos de SLC6A19, se analizaron 400 muestras de ADN genmico obtenido de la sangre de individuos normales, as como a partir de muestras obtenidas a partir de siete familias multi generacionales.Adems, se investig la posible asociacin de SLC6A19 con hipertensin en los coreanos.Materiales y mtodosLos resultados de anlisis que provienen de la base de datos para el tndem repiten la regin de SLC6A19.Todas las regiones de secuencias de ADN analizados en este estudio se basan en secuencias genmicas del SLC6A19 (longitud en 1-101,999 pb,Fig.1)y se han reunido por la UCSC (> hg18_dna rango = CHR5: 1.250.001-1352000) y el NCBI (> ref | NC_000005.8 | NC_000005: 1.250.001-1352000 Homo sapiens cromosoma 5, conjunto de referencia; la secuencia completa).

El software buscador de repeticin del Tandem se utiliz para detectar VNTR y otras regiones repetidas.Unidades de repeticin entre 10 y 100 pb de longitud que anot > 300 en el algoritmo del programa se seleccionaron para su posterior anlisis.

Fig.1.Mini satlites en SLC6A18.(A) Estructura de la regin genmica en torno a SLC6A19.Se prev que 19 exones (cajas negras) codifican a SLC6A19.Las posiciones aproximadas de mini satlites identificados por el Programa de Buscador de repeticiones en tndem[4]se indican mediante asteriscos y nmeros (MS1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7).(B) Las secuencias representan siete unidades de repeticin mini satlite.

Todos los primeros utilizados en este trabajo fueron diseados utilizando software Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)[26].Los siguientes cebadores se construyeron sobre la base de la secuencia de ensamblado por el UCSC: MS1, F-GGGTGCTGCAGGATTTGGGTA & R-TCAGGCCCAGCATTCGTATATGT;MS2, F-CCTGGGCCAGCCACTGACTC & R-CGAGCACAGCGCAGATTGGA;MS3, F-GCAGAGCCCACACCCTCTCG & R-GGGGACAGCTAGGCAGGATGG;MS4, F-GCTGCACTGGGCAGGTGAGA & R-TGGCTGGGATGGGCTACTCC;MS5, F-TGTGTGCATGCATGGGGTGT & R-CGTGCACATGAACACAGGCACA;MS6, F- GCAGCCTGTGAGGCCCTGTC & R-ATATGGGGGCGGGGCATGT;MS7, F-CATGGCAATGGTGCCACCTG & R-TGAGGAATGTCCCCAGGCAGA.Preparacin de ADN genmico a partir de linfocitos de sangre perifrica.Se analizaron los individuos no relacinados sanos para evaluar el grado de polimorfismo mini satlite en SLC6A19.Adems, se realiz un estudio de casos y controles en los que el ADN obtenido a partir de 400 controles sanos se compar con el ADN obtenido de 205 individuos con hipertensin esencial(Tabla1).Los pacientes fueron clasificados como hipertensos cuando tenan una presin arterial sistlica (PAS) de> 140 mmHg o una presin arterial diastlica (PAD) de> 90 mmHg.Adems, las personas que estaban tomando actualmente la medicacin para la hipertensin tambin fueron clasificadas como hipertensas.Por el contrario, los controles normotensos tenan una SBP de menos de 130 mmHg y una DBP de menos de 85 mmHg.El rango de edades y el sexo de los controles normotensos e hipertensos se muestran en laTabla 1.Adems, las muestras que se obtuvieron de siete grupos familiares multigeneracionales.;cinco familias de dos de generaciones y dos familias de tres generaciones.Todas las muestras se obtuvieron de dos hospitales diferentes en dos ciudades diferentes (Dong-A Hospital Universitario [# IRB-06.10.02 y IRB-07-10-7; Busan, Corea] y Chungbuk Hospital Universitario Nacional [# IRB-2006 -1; Cheongju, Corea]).Para los experimentos de PCR, el ADN genmico se aisl a partir de leucocitos perifricos que fueron tomadas de 400 litros de sangre entera usando el Blood y Cell Culture DNA Mini Kit (Qiagen, CA).

Fig.2.La frecuencia allica y los patrones electroforticos de SLC6A19 mini satlites.Los patrones allicos de cada mini satlite se muestran en la parte superior (patrones electroforticos) de cada panel (A-G).La frecuencia allica, el tamao de los productos PCR y nmero de repeticiones se indican en la parte inferior de cada panel.Los mini satlites se amplificaron por PCR apartir del ADN genmico de muestras de control usando cebadores de diagnstico (Materiales y Mtodos).Se analizaron tres patrones polimrficos de diferentes genotipos con 6 alelos para MS1 (a), 2 alelos para MS4 (D) y 5 alelos para MS7 (G).Se encontr que las otras cuatro regiones minisatlite (B, C, E, y F) son monomrficos.Los marcadores de tamao (M) se dan en pares de bases (pb o 100 marcadores de tamao 1 kb).Patrones de haplotipos se numeran de acuerdo a cada minisatlite.Hmuestra la heterocigosidad de cada minisatlite en los controles.

Anlisis de polimorfismos en los minisatlites SCL6A19.Los cebadores utilizados para analizar los polimorfismos genticos se disearon basndose en la secuencia genmica SLC6A19.El ADN del genoma humano aislado de la sangre completa se amplific utilizando estos cebadores de PCR bajo condiciones estndar[29].Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel (1 V / cm) en 1 TAE amortiguador a travs de un gel de agarosa al 1.0-2.0% en funcin de sus tamaos esperados.Los anlisis estadsticos.En general, el grado de polimorfismo de un rango de 0 a 1 se incrementa con el nmero de alelos.Para evaluar la probabilidad de que dos alelos escogidos al azar sean diferente (heterocigoto) en un locus dado, se utiliz la siguiente frmula:

Dondexi2es la frecuencia de los alelos del alelo iTH en cada locus minisatlite[8].Los anlisis de regresin se realizaron para determinar las posibilidades ratio (OR) de la asociacin entre los grupos de control y de casos.La OR se estim utilizando el logaritmo natural y su error estndar.En su caso, se utiliz una prueba de ji cuadrado con un grado de libertad para evaluar las diferencias entre los grupos.Las diferencias significativas se determinaron utilizando un intervalo de confianza (IC) del 95%.Todas las pruebas fueron de dos caras, conp