5.- polimorfismos
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polimorfismosTRANSCRIPT
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Polimorfismo de ADN
Podemos agrupar los tipos de polimorfismos del ADN en dos
categorías:
- polimorfismo de secuencia
- polimorfismo de tamaño
El polimorfismo genético hace referencia a la existencia en una población de múltiples alelos de un gen. Un polimorfismo es una variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una población. Los polimorfismos son siempre mutaciones que se presentan con una frecuencia superior al 1%
Polimorfismos de tamaño:
Se trata de secuencias de ADN distribuidas en miles de loci por
todo el genoma que se repite en un numero variable de veces.
VNTRs (variable number of tamdem repeats): aquellos que
poseen repeticiones en numero variable, arregladas en serie y
sin interrupción a lo largo del cromosoma.
Teniendo en cuenta la alta variabilidad de estos sistemas
Jeffreys sostuvo que la probabilidad de encontrar dos individuos
con el mismo perfil multilocus de ADN, en el planeta era casi
nula por lo que se denomino al sistema el “DNA fingerprinting” o
huellas de ADN y lo propuso como una marca individual que
podría ser utilizado con fines de identificación de personas.
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VNTR significa "número variable de repeticiones en tándem" (Variable Number of Tandem Repeats)
Una repetición en tándem es una secuencia corta de ADN que se repite consecutivamente en un locus cromosómico específico. Se encuentran repartidas por todo el genoma humano. Para muchas de las repeticiones en tándem, el número de unidades repetidas varía entre individuos. Un ejemplo de VNTR en humanos es una secuencia de ADN de 17 pb que se repite entre 70 y 450 veces en el genoma. El número total de pares de bases en ese locus puede así variar entre 1190 y 7650.
- los microsatélites, que presentan una unidad de repetición pequeña (1 a 8 nucleótidos), que en 76% de los casos son A, AC, AAAN y AG. Son altamente polimórficos, es decir, presentan un gran número de alelos. Algunos de ellos parecen estar directamente implicados en la etiología de algunas enfermedades (este sería el caso de las expansiones de trinucleótidos),
- los minisatélites, presentan unidades de repetición mayores (de 10 a 100 nucleótidos). Son menos polimórficos (presentan menos alelos) y también menos abundantes.
STR (short tandem repeat)
amplificación de secuencias con pequeñas repeticiones en tandem (2 a 4 n)
Se detectan por Southern blot y PCR
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Detección del polimorfismo
Polimorfismo de longitud de los fragmentos de DNA (RFLP)
son variaciones en la secuencia de DNA que afectan a la secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción. Se detectan por Southern blot y PCR
Polimorfismo del número de repeticiones de secuencias en tandem (VNTR) son variaciones en la secuencia de DNA que afectan al número de repeticiones de una secuencia. Corresponden normalmente a los minisatélites y microsatélites. Se detectan principalmente por PCR. Muy polimórfico.
Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) son variaciones en la secuencia de DNA de un par de bases.
Aplicaciones de los polimorfismos
Marcadores en el mapeo de genes Diagnóstico presintomático y prenatal de enfermedades hereditarias Pruebas de paternidad Medicina forense
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Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
RFLP
RFLP Los RFLP son marcadores genéticos del ADN
La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense y en pruebas de
paternidad.
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1.Extracción de ADN 2.Amplificación con un par de primers específicos a la región flanqueante al sitio de restricción polimorfico 3.Digestión con la Enzima de Restricción apropiada 4.Separación de los fragmentos por electroforesis, teñido con Gel Red 5.Análisis de los resultados
Detección por PCR:
Separación electroforética de ácidos nucleicos
Los fragmentos grandes de ADN quedan retenidos en su migración al pasar con mayor dificultad a través del poro. Los fragmentos más pequeños alcanzan el extremo final del gel, pasando con facilidad a través de los poros
RECORDAR:
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Cuál sería el perfil electroforético para: Homocigoto normal Heterocigoto Homocigoto enfermo
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Sonda dirigida a extremo 5`de fragmento de 1.2 kb
Cuál sería el perfil detectado por Southern para: Homocigoto normal Heterocigoto Homocigoto enfermo
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RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción ejemplo: en el alelo 2, el sitio rojo ha mutado, y el fragmento "a" obtenido por restricción desaparece, forma parte de un segmento más grande de ADN, el fragmento "b".
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Análisis por hibridización con sondas de RFLP
- se trata con enzimas de restricción específicas - los fragmentos de restricción se separan mediante
electroforesis en geles de agarosa - las bandas son transferidas por Southern Blot - se hibridan con una sonda que permite determinar la longitud
y la separación de los fragmentos Suponiendo que este sitio de restricción se encuentra en un
cromosoma específico lo va a cortar formando dos fragmentos de ADN. Si una persona tiene una mutación en el sitio reconocido por la enzima no va a poder cortar y solo habrá un fragmento.
Si una persona tiene una mutación en el sitio reconocido por la enzima no va a poder cortar y solo habrá un fragmento
La técnica de Southern Blot
1. Cortar DNA con ER 2. Separar los fragmentos por electroforesis en geles de agarosa 3. Transferir los fragmentos a una membrana de nitrocelulosa 4. Hibridar los fragmentos con una sonda marcada 5. Detectar los fragmentos por el marcaje de la sonda
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Polimorfismos del tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP)
Esta secuencia de ADN polimórfica presenta dos alelos
Los distintos fragmentos obtenidos tras el corte con la enzima de restricción pueden ser separados mediante electroforesis en geles de agarosa y posteriormente detectados utilizando una sonda especifica de la secuencia polimórfica.
La sonda utilizada debe reconocer la secuencia donde se encuentra el sitio de
restricción
SNPs
Resultado del análisis electroforético:
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Aplicaciones
- El análisis de la variación de RFLP en genomas ha sido una herramienta fundamental en el mapeo genómico y el análisis de enfermedades genéticas
- El análisis RFLP fue también la base de las modernas técnicas de análisis de huellas genéticas (Genetic Fingerprinting) útiles en la identificación de muestras recuperadas de la escena de un crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la biodiversidad en poblaciones
- Cuando un RFLP normalmente se asocia con una enfermedad de origen genético, la presencia o ausencia de éste puede usarse a modo de consejo sobre el riesgo de desarrollar o transmitir la enfermedad.
- Algunas personas serán homocigotos y presentarán una única banda, otros ( ej, todos los miembros de la familia mostrados abajo) serán heterocigotos y presentarán una banda distinta por cada alelo.
RFLP
Southern blot 1. Cortar DNA con ER 2. Separar los fragmentos por
electroforesis 3-4. Transferir los fragmentos a una
membrana 5. Hibridar los fragmentos con una sonda marcada 6. Detectar los fragmentos por el marcaje de la sonda
genotipos
+ ER
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VNTR
El número variable de repeticiones en tándem (Variable Number of Tandem Repeats) o VNTR (minisatélites) son repeticiones de secuencias de 9 a 100
pares de bases que se utilizan como marcador molecular. El número de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000.
Variaciones de la longitud del alelo VNTR en seis individuos
pb 2000 1400 800 400
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• La detección de los VNTR se puede realizar por hibridación del ADN o por técnicas de PCR
• En el primer caso, el ADN genómico es digerido con enzimas de restricción que reconocen sitios adyacentes a la región repetida.
• La diferencia básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada.
• En la técnica de VNTR las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma son detectados simultáneamente, mientras que en los RFLP, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma, por lo que se detectan uno o pocos loci cada vez. De esta manera, en el autorradiograma no se obtiene un patrón simple de bandas como en el caso de los RFLP, sino un perfil complejo de bandas múltiples.
• En la técnica de PCR se utilizan partidores que flanqueen los VNTR
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DNA fingerprinting
Analisis VNTR
Sitio de restricción
Sitio de restricción
Repeticiones en tandem (Tandem Repeats)
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En esta figura, sólo se ilustran tres variantes diferentes (alelos) para el locus VNTR, pero es habitual en los loci VNTR humanos encontrar 50 o más alelos distintos.
Para tres alelos diferentes, designados A, B y C, son posibles seis perfiles distintos de ADN.
Los genotipos posibles son AA, BB, CC, AB, BC y AC,
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•Corte con ER
•Southern
Cuando se comparan los perfiles de un solo locus VNTR para individuos no relacionados entre sí, habitualmente son diferentes. No obstante, es posible que dos personas tengan el mismo perfil en uno o dos loci por casualidad. Sin embargo, la probabilidad de que dos personas tengan el mismo perfil de ADN en 4, 5 o 6 loci VNTR diferentes es extremadamente baja. Cuando se usan los perfiles de ADN con fines medico-legales, se analizan de 4 a 6 o mas loci VNTR diferentes.
La identificación con ADN o “huella genética” se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que poseen la característica de ser altamente variables o polimórficos entre los mismos
Además de ser muy polimórfico, el ADN que se utiliza para la identificación en Genética Forense es un ADN no codificante o no expresivo, por lo que no revela características fenotípicas de los individuos;
Huella Genética
Sir Alec Jeffreys
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La huella genética (fingerprint) es una técnica que se utiliza para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN. La técnica se basa en que dos seres humanos tienen una gran parte de su secuencia de ADN en común y para distinguir a dos individuos se puede explotar la repetición de secuencias altamente variables llamadas VNTR. Dos seres humanos no relacionados será poco probable que tengan el mismo número de mini o microsatélites en un determinado locus. La técnica de PCR se utiliza para obtener suficiente ADN que permita detectar el número de repeticiones en varios loci. La huella genética se utiliza en la medicina forense para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen también en la identificación de los restos humanos y en las pruebas de paternidad.
Los microsatélites muestran una mayor variación que el resto del genoma ya que en ellos se encuentran unas secuencias en distinta repetición y con diferente grado de recombinación
VNTRs, or minisatellites contain repeating clusters of 10-100 nucleotides that are variable between individuals, and may produce different restriction fragments. Even though one band (B2) is shared between 2 individuals in this RFLP analysis of many VNTR markers (this example shows just 2 markers) can serve as a DNA fingerprint to identify individuals. Relatively large sample of DNA (10,000 cells) is required for VNTR analysis, so this technoloqie is more useful in paternity testing than in criminal cases.
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•El ADN de cada persona proviene, mitad de su padre y
mitad de su madre.
•Cada persona tiene dos alelos para cada locus (Marcador), uno
en la región D5S818 del cromosoma de la madre y otro en
esa misma región pero del cromosoma del padre.
La información genética proviene la mitad del padre y la otra mitad de la madre. Los caracteres se expresan en las nuevas generaciones según el Principio de Segregación
Conceptos de:
•Alelo, dominancia y recesividad
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Secuencias hipervariables de microsatélites llamadas VNTR (variable number
of tandem repeat) sirven para determinar paternidad.
CIENCIA FORENSE y PATERNIDAD
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Quién es el padre? Construya el perfil de la madre
B es hijo
CIENCIA FORENSE y PATERNIDAD
Marker
Suspect A
Semen (clothing)
Suspect B
Marker
Vaginal swab
Victim Control DNA
Marker
No DNA
Quién es el violador?
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Aplicaciones de los polimorfismos en la Medicina forense
identificación de individuos
Se analizan diferentes VNTR o STR, lo que da un perfil de bandas para cada individuo Cada alelo tiene una frecuencia La frecuencia del perfil será el producto de dichas frecuencias
DEFINICION DE GENETICA FORENSE
Rama de la genética humana aplicada a la solución de problemas sociales y legales, cuyos objetivos son: Identificación genotípica de los individuos, que se basa en la estructura genética individual única y no repetida de cada persona.
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•La información genética proviene la mitad del padre y la otra mitad de la madre Los caracteres se expresan en las nuevas generaciones según el Principio de Segregación
•Conceptos de: Alelo, dominancia y recesividad
Análisis del cromosoma Y Se han creado cebadores específicos para regiones del cromosoma Y que amplifican secuencias solo heredadas por parte paterna. Por ello, este tipo de análisis sólo sirve para comparar familiares por parte del padre y varones.
Análisis mitocondrial Se usa en muestras muy degradadas, ya que el DNA mitocondrial posee más copias que el nuclear. Se amplifican las regiones HV1 y HV2 y se comparan siempre con familiares por parte materna ya que las mitocondrias son herencia exclusiva de la madre. Los científicos forenses amplían la región HV1 y HV2 del ADNmt y luego cada región es secuenciada en un único nucleótido y se compara las diferencias con la referencia.
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•GENOTIPO •El ADN de cada persona
proviene, mitad de su padre y mitad de su madre.
•Cada persona tiene dos alelos para cada locus
(Marcador), uno en la región D5S818 del cromosoma de la madre y otro en esa misma región pero del cromosoma
del padre.
El FBI ha sido un líder en el desarrollo de tecnología de tipificación de ADN para su uso en la identificación de autores de delitos violentos. En 1997, el FBI anunció la selección de 13 loci STR que formarían el núcleo central de la base de datos nacional de los EE.UU., llamada CODIS. Todos los STR del CODIS son secuencias repetitivas tetraméricas. Todos los laboratorios forenses o criminalísticos que usan el sistema CODIS pueden contribuir a una base de datos nacional. Los analistas de ADN pueden también buscar coincidencias entre el perfil de ADN de pruebas obtenidas en la escena de un crimen y los perfiles de ADN ya disponibles en la base de datos.
El sistema CODIS (Combined DNA Index System)
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SISTEMA O LOCUS UNIDAD REPETIDA LOCALIZACIÓN
CROMOSÓMICA
FGA (TTTC) n 4q28
TPOX (AATG) n 2p23-pter
ACPP (AAAT) n 3q21-qter
F13B AAAT Iq31-q32.1
CSF1PO (AGAT) n 5q 33.3-q34
F13A1 (AAAT) n 6p24-p25
LPL (AAA) n 8p22
THO1 (AATG) n 11p 15.5
D16S539 AGAT 16q24-qter
D3S1744 AGTT 3q24
VWA (AGAT) n 12q 13.3-q13.2
D12S1090 (TAAT) n 12q 12
FPS (AAAT) n 15q25-ter
MICROSATÉLITES MÁS UTILIZADOS COMO
MARCADORES GENÉTICOS
Chromosomal locations of the 13 VNTR loci in the CODIS panel
CODIS (Combines DNA Information System).
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The designations D3, vWA and FGA represent three different chromosomal locations (STRs) under analysis
Análisis del cromosoma Y Se han creado cebadores específicos para regiones del cromosoma Y que amplifican secuencias solo heredadas por parte paterna. Por ello, este tipo de análisis sólo sirve para comparar familiares por parte del padre y varones.
Análisis mitocondrial Se usa en muestras muy degradadas, ya que el DNA mitocondrial posee más copias que el nuclear. Se amplifican las regiones HV1 y HV2 y se comparan siempre con familiares por parte materna ya que las mitocondrias son herencia exclusiva de la madre. Los científicos forenses amplían la región HV1 y HV2 del ADNmt y luego cada región es secuenciada en un único nucleótido y se compara las diferencias con la referencia. Hay un fragmento en este genoma de 400pb altamente polimórfico
En el tejido óseo, los dientes y el pelo se encuentran a menudo unas cantidades de ADN nuclear tan pequeñas que no se puede obtener un perfil de STR.