Diagnóstico de Leptospirosis por la Reacción en Cadena de la Polimerasa

(PCR)

Dra. Elthy Galarza R.Dra. Elthy Galarza R.

“PCR”(Polymerase Chain Reaction)

Kary B. Mullis 1989.

Premio Nobel de Química en 1993.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Fundamento de la PCR

Técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Amplificar secuencias específicas de ADN in vitro

Definición de caso de Leptospirosis en humanos

(OMS/CDS/ISR/99.2 /A27 Leptospirosis)

Definición de caso de Leptospirosis en humanos

(OMS/CDS/ISR/99.2 /A27 Leptospirosis)

• Clínica

• Epidemiología

• Diagnóstico Microbiológico

Leptospirosis en HumanosLeptospirosis en Humanos

Inmune y Lepstospiruria LeptospiremiaFases de la

Enfermedad

IgM

IgG

Concentración de

Anticuerpos

Leptospira en: Sangre

LCR

Orina(reservorios)

Orina (convalecientes)

Fiebre

UveítisEstado ConvalecienteEstado Agudo

Años

MesesSemana 4Semana 3Semana 2Semana 1Período de incubación

2 a 20 días

Inmune y Lepstospiruria LeptospiremiaFases de la

Enfermedad

IgM

IgG

Concentración de

Anticuerpos

Leptospira en: Sangre

LCR

Orina(reservorios)

Orina (convalecientes)

Fiebre

UveítisEstado ConvalecienteEstado Agudo

Años

MesesSemana 4Semana 3Semana 2Semana 1Período de incubación

2 a 20 días

Inmune y Lepstospiruria LeptospiremiaFases de la

Enfermedad

IgM

IgG

Concentración de

Anticuerpos

Leptospira en: Sangre

LCR

Orina(reservorios)

Orina (convalecientes)

ManifestacionesClínicas Diversas- Forma leve o anictérica (90%)

UveítisEstado ConvalecienteEstado Agudo

Años

MesesSemana 4Semana 3Semana 2Semana 1Período de incubación

2 a 20 días

Métodos del Laboratorio de MicrobiologíaMétodos del Laboratorio de Microbiología

CultivoInoculación en animalesExamen directo en campo oscuro ?Impregnación argénticaInmunofluorescencia Directa Inmunoperoxidasa

Métodos Bacteriológicos

Microaglutinación de serogruposELISAHAPesquisa

Métodos Serológicos

Hibridación de ácidos nucleicosReacción en cadena de la polimerasa

Métodos Biología Molecular

Diagnóstico del agente etiológicoDiagnóstico del agente etiológico

Muestra clínica(sangre - orina – LCR – órganos -

tejido)

Frasco pequeño con medio de cultivo para leptospiras, sellado con tapón de goma y retapa metálica.

Incubar a temperatura entre 28oC – 30oC

(como mínimo 7 días)

Observación microscópica semanal

(Si no hay crecimiento a los 6 meses eliminarlo)

Inocular en medio de cultivo para leptospira

empleando tubos con tapas de rosca

Clasificación

Cultivo en medios selectivos

semanas - meses

Identificación días - semanas

Diagnóstico directo de L. interrogans

Diagnóstico directo de L. interrogans

Cultivo en medios selectivos Técnica de la PCR

semanas - meses

Identificación días - semanas

Horas

Identificación minutos

Amplificación del ADN Amplificación del ADN Por la PCR Por la PCR

PCR-Tiempo Real PCR-Tiempo Real PCR-Convencional PCR-Convencional

Diagnóstico molecular Diagnóstico molecular

PCR

Amplificación del ADN !!!!!!

Pasos • Desnaturalización• Acoplamiento• Extensión

Técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Reactivos de la mezcla• ADN muestra• Cebadores (primer)• dNTP (dCTP, dGTP, dATP, dTTP)• Enzima Taq polimerasa• Solución de MgCl2• Buffer para PCR

• PCR - Simple

• PCR - REA

• PCR - Múltiple

• Nested - PCR

• AP- PCR

• Real Time - PCR (PCR en tiempo real)

•

PCR:

• Regiones Universales (U)• Regiones Semiconservadas (S)• Regiones Variables (V)

ARN r 16S COMO MOLECULA DIANA

• Molécula evolutivamente muy

estable.

• Alto número de copias por célula

( 104

ribosomas/células).

• Especificidad puede ser manipulada.

*

• Secuencias disponibles en Base de

Datos.

• Métodos de secuenciación

normalizados.

*

• Regiones Universales (U): Las secuencias son esencialmente

las mismas para todos los microorganismos.

• Regiones Semiconservadas (S): las secuencias son muy

similares entre los microorganismos estrechamente

relacionados

(Ej. Bacterias que pertenecen al mismo género)

• Regiones Variables (V) : Las secuencias varían entre especies

diferentes de bacterias y entre subespecies.

Regiones del ARN r 16 S

Amplificación del ADN

por el Método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Amplificación del ADN

por el Método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Muestras de orina y Clasificación de cepas Electroforesis en gel de agarosa al 2%

ARN ribosomal 16S

Primer 1

Primer 2¨

PCR - REA

Sitio de corte

L. interrogans L. biflexa

PCR - REA

PCR - Múltiple

Se utilizan 2 juegos de cebadores

812 pb

418 pb280 pb

78 pb

PCR-Múltiple con 2 juegos de cebadores

PCR-Múltiple con 4 juegos de cebadores

PCR

PCR Tiempo RealMezcla de reacción

• ADN muestraADN muestra• Juego de Cebadores Juego de Cebadores • dNTPdNTP• Buffer para PCR Buffer para PCR • MgClMgCl22

• Taq Taq polimerasapolimerasa• Agua Agua

• Sonda marcada Sonda marcada

• Sustancia intercalante al ADN de doble cadena Sustancia intercalante al ADN de doble cadena

PCR en Tiempo Real

Fragmento de ADN pequeño:

1321 ggatcatttg gattagtaag aagccaaaat gacaacttaa atatttcaag tgttacaaag1381 aattctagtg atgataatct caagtatctc aatgctgttg agaaatacct tgatggtcag

1441 caaaactttg caatcagaag gtatgataac aacggtagag ctttatatga tattaactta1501 gcaaaaatgg aaaacccctc aacggtgcaa aggggtttaa atggcgagcc tatctttgat

1561 ccttttaaag gctttggttt aactggtaat gcccctactg attggaatga gatcaaaggt

• Cebadores 1 y 2Cebadores 1 y 2• dNTPdNTP• Buffer 10X Buffer 10X TaqTaqManMan• MgClMgCl22• Agua Agua • Sonda marcada Sonda marcada • Ampli Ampli TaqTaq Gold (actividad nucleasa 5´- 3´) Gold (actividad nucleasa 5´- 3´)

Mezcla de Reacción

¨quencher¨ - TAMARA: 6-carboxytetramethylrhodamine

5´ oligonucleótido 3´

¨reporter¨ - FAM: 6-carboxyfluorescein

- TET: tetrachloro-6-carboxyfluorescein- JOE: 2,7,-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein

- HEX: hexachloro-6-carboxyfluorescein

extremo 5´ con un ¨reporter¨ (sustancia fluorescente)

extremo 3´ con un ¨quencher¨ (sustancia bloqueadora)

Reporter actttgcaatcagaaggt Quencher

Sonda

GRACIAS !!!!