U A d - 2

JNOMRRE: MONICA MONTERO LOMELI

/ C $ S

MATRICULA: 80222780

CARRERA: BIOLOGIA

Lk. /AREA DE CONCENTRACION: BIOLOGIA EXPERIMENTAL

TRIMESTRE: DECIMO SEGUNDO

HORAS SEMANA: VEINTE

LUGAR DONDE SE LLEVARA A CABO: UNIVERSIDAD AUTONOMA I1ETROPOLITANA- IZT4PALAPA

FECHA DE INICIO: 24 DE OCTUBRE DE 1983

'FECHA DE TERMINACION: 4 DE JUNIO DE 1%

/- NOMBRE DEL TUTOR INTERNO PUES0 Y ADSCRIPCION: DRA. GRACIELA BEATY PARODI

PROFESORA TITULAR B. TIEMPO COMPLElO.

/ TITULO: POLARIDAD DE LAS CELULAS EPITELIALES: DESTINO DE UNA PROTEINA RASOLATERAL

' EQiUVOCADAMENTE' INSERTADA EN LA MEMBRANA APICAL DE LAS CELULAS NICK

1. TITULO: POLARIDAD DE CELULAS EPITELIALES: DESTINO DE UNA MEMBRANA r I L., BASOLATERAL "EQUIVOCADAMENTE" INSERTADA EN LA !lEMBRAN,A API -

CAL DE LAS CELULAS MOCK I

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' ' L..

! . , ':j r . i.

I ,- ,I' _ j " ' mr ' 2. NOMBRE DEL ALUMNO: MONICA MONTERO LOME,LI

- --iI

r. 3. No. DE MATRICULA: 80222780 {.,, !+ 1 .:

c r L I

4. INTRODUCCION.

En l o s 0rganismo.s s u p e r i o r e s e l intercambio de mater ia con e l medin ex-

' t e r r o r s e r e a l i z a a nivel de sus membranas e p i t e l i a l e s . Estas son te . j idos

cuya función e s , no só lo s e r cont inente de l o s l í q u i d o s que se producen

en l o s organismos vivos ( o r i n a , b i l i s , sanf l re , humor acuosao, l,áorimas, su-

dor, l i q u i d o cefa lor raquideo , s a l i v a , l eche , j u g o pancreá t ico , e t c . ) , s i n o

. .

además, y fundamentalmente, r e g u l a r l a composición de esos l i q u i d o s . Es de-.

c i r , que l a s c é l u l a s además de c o n t r o l a r su composición c i top lasmát ica median-

t e bombas, a c a r r e a d o r e s , cana les , e t c . , como l o ' h a c e cualouiei . otra c é l u l a

del organismo, regulan también l a composición del compartimiento que 1 imitan

puesto que e s t o s l í q u i d o s t ienen una composición d i s t i l - t a 'a l a d.1 iredio i n -

t e rno . ( 6 ) .

3

Para cumplir e s t a s funciones es necesar io que e l te.jido e p i t e l i a l po-

sea l a s s i g u i e n t e s ca rac t e i - í s t i ca s e s t r u c t u r a l e s : i ) que sus c é l u l a s es tén

s e l l a d a s e n t r e s í a f i n de oponer iina bar rera a l a l i b r e d i fus ión de s o l u t o s

e n t r e el lumen y e l espacio i n t e r c e l u l a r . Las e s t r u c t u r a s que cumplen é s t a

función son l a s ' uniones oc'l usoras que forman un' verdadero c in turón alrededor

de l a s c é l u l a s .y cuya permeabilidad var ía de u n e p i t e l i o a o t r o . 2)'iiue

l a s pro te ínas de l a membrana plasmgtica que funcionan como bombas, acarreado-

r e s o receptores a hormonas se encuentren polar izadas , es d e c i r , o r ien tadas

preferencialmente en l a membrana a p i c a l , encontacto con el lumen o en l a b a - '

s o l a t e r a l , en contac to con e l t o r r e n t e c i r c u l a t o r i o . Esta propiedad permite

e l t r a n s p o r t e v e c t o r i a l de s u s t a n c i a s .

- - -

Actualmente es mucho l o que se conoce sobre l a e s t r x t u r a y f u n c i ó n de

l a s u.niones oc lusoras y sobre l a d i s t r i b u c i ó n de pro te ínas de membrana en

e l dominio ap ica l y b a s o l a t e r a l , en d i s t i n t o s e p i t e l i o s con d i s t i n t a s f u n -

c iones f i s i o l ó g i c a s , S i n embargo.pers is te l a nregunta acerca de cómo h ice

una c é l u l a e p i t e l i a l para generar y mantener e s t a d i s t r i b u c i ó n as imét r ica de

pro te ínas que provee a una cara de l a c é l u l a con moléculas que no se enctien-

t r an en e l lado opuesto.

E l s is tema ideal para e s t u d i a r e s t e problema es una oreparación de cé-

l u l a s en c u l t i v o que permita sembrar c é l u l a s a i s l a d a s , s i i r é t r i ca s y no oola

r izadas y que permita s e g u i r el curso temporal de l a fomación de u n epite-

l i o a r t i f i c i a l polar izado con todas l a s propiedades que se encuertren en u11

e p i t e l i o n a t u r a l . Una preparación que cumple muchos de e s tos reqiuisitoc es

la l i n e a c e l u l a r MDCK ( 1 4 ) con l a cual trabajaremos.

5. ANTECEDENTES

5.1 FORMACION DE MONOCAPAS EPITELIACES EN CULTIVO

La l í n e a c e l u l a r MDCK fue derivada de u n r iñón de perro Cocker Spaniel ,

a d u l t o , aparentemente normal. El c u l t i v o pr imario fue hecho en 1959 nor Ma-

4 I

! o

j L . l

i i * '

din & Darby'(50) y c a r a c t e r i z a d o en 1966 por Gausch e t a l .

t i e n e propiedades de' e p i t e l i o t u b u l a r renal y adenocarcinoma p a p i l a r (64)

Las c é l u l a s

m ú l t i p l e s nucleolos y f i g u r a s m i t o t i c a s anormales.

MDCK se probó i n 'vivo

a i s l a d a s de embriones de po l los . Una semana después' se d i a p n o s t i c a G m ú l t i -

p les . focos de adenocarcinoma's metas tás icos en e l cerebro de l o s animales ino-

Esta l í nea c e l u l a r

MDCK en c u l t i v o son ci tológicamente malignas, con núcleos grandes ' ' i '*" 'I

La oncosenicidad de l a s

por inyeceión intravenosa de suspensiones d e c é l u l a s

' 1 " I

j I

.i , ,, .

, .... i ,,, ..

I

, ... " I

, ,

a l - culados (45).

i -

I

soporte . La formación de e s t a s ampol1,as es inhibida par ouabaina ( I ) . Como

e s t e glucósido card iáco actúa muy específ icamente sobre e l mecanismo de bombeo

Leifihton y colaboradores demostraron además que cuando l a s c é l u l a s MDCK ; I : ,"_ I l i

1 crecen sobre un sopor te s ó l i d o e impermeable, forman amoollas o domos sue <' '- 1i *! - parecen r e s u l t a r del t r a n s p o r t e v e c t o r i a l de anua desde e l medii?, hacia el

domos) y barrerds a la difusión (uniones estrechas no permeahles a trazadores

Si se la compara con los epiteiios naturales, tiene Dor io mcromoleculares).

menos cuatro claras ventajas experimentales: 1) se la puede montar intacta en-

tre dos cámaras a fin de realizar estudios de flujo y eléctricos; 2 ) perriite

comparar los cursos temporales de la adquisición de determinadas catxcterísti-

cas químicas y estructurales con la aoarición de propiedades especiífhs de

transporte y permeabilidad; 3) permite manipular muchos de los factores w e

-

influencian el crecimiento y la diferenciación; 4) puede observarse su estado

y desarrollo por simple microscopía de fase y a s í seleccionar el momento ade-

cuado para probar sus propiedades. ( 1 4 ) .

. .

5.2 POLARIDAD

5 .2 .1 En e l teiid0 epitelial.

La característica fundamental de la membrana que rodea las células

epiteliales es su polaridad o asimetría. Desde e! punto de vista -~ fisiolóoico

esta se manifiesta por ejemplo, en que la cara externa de una célula epitelial

es muy permeable,al sodio, en tanto que la cara interna tiene una alta Permea-

bi1i.dad pasiva al potasjo y parece ser relativamente imDermeable al sndio; en

la cara interna existe un mecanismo de transporte activo que extriive iones so-

dio de las células intercambiándolos por iones potasio, en cambio la cara ex-

terna carece de bombas (38). Esta asimetría, sd manifiesta también al probar

el efecto de'hormonas y drooas; la hormona antidiurética, ,que estimula e l trans-

porte de sodio, y el glucósido cardiáco ouabaína, que. lo hloquea, solamente son

activos cuando se añade al medio que baña a la cara interna, en tanto que la

amilorida, que reduce la permeabilidad pasiva alsodio. sólo es activa cljando se

aplica por el lado m.ucoso (2,7,9).

Desde.el punto de vista anatómico se observa tambi.&n una marcada asimetría ___

6

kF, la cara externa puede presentar células epiteliales desnudas o cubiertas de

glucocbliz, en tanto que la interna está cubierta'por tejido conectivo. Los

oroanelos celulares no se disponen al azar sino que aparecen orientados. Asi,

por ejemplo, en el túbulo contorneado proximal de riñón de mamifei-o la? micro-

vellosidades están del lado luminal, en tanto que las mitocondrias '$.g alinean

del lado seroso. En cuanto a la membrana de la superficie lateralae las cé-

lulas epiteliales, presenta tres tipos de uniones intercelulares: 1 ) l a s unio-

nes estrechas o zonulae occludentes; 2) las uniones corunicantcs o nexus v 3)

los desmosomas o maculae adhaerentes (10,19,28,63,80). Actualmente eriste

bastante evidencia de que los desmosomas funcionan como puntos de adhesión en-

tre célula y célula, en tanto que la unión comunicante es la entidad responsa-

ble de la comunicación intracelular. Los desmosomas y las uniones cowunicantes

no constituyen barreras,a la difusión de sustancias a través de la ruta parace-

lular ya

están formados por un-pequeño nÚmero.de puntos o maculae aisladas.

que no son estructuras continuas a través del enterespacio, sino que

Además se

ha demostrado que la unión comunicante es permeable a trazadores de microscopia

electrónica tales como el lantano coloidal, peroxidaía, etc. La unión estrecha

en cambio, constituye la principal barrera para el pas'o de iones y moléculas' a

lo largo de los espacios laterales ya que ocupa toda la periferia de la capa ex-

. .

terna epitelial, en el extremo más exterior del espacio intercelular. Su con-

tinuidad convierte el paso a través de las uniones estrechas en una etapa ine-

ludible para las sustancias que cruzan el epitelio por la vía paraceluar.

5.2.2 En las monocapas de células " I C K

la asimetría de las células MDCK en cultivo .se manifiesta anat.ónicamente . -

por la presencia de algunas cilias .y de microvellosidades reoulírmente espa-

ciadas en la cara libre, en tanto que estas estructuras no aparecpn en la ca-

ra de cpntacto con el colágeno. Las mitocondiras y el aparato de Goloi se

. . , ,.

':, i

7

encuentran polar izados hacia e l lado seroso . También presentan polar idad

funcional ya que en una f racc ión de l a penetración de sodio a l a s cé lu l a s se

l l eva a cabo a t r a v e s de un canal s e n s i t i v o a amilor ida y l a s a l i d a se opera

pr incipalmente por una bomba s e n s i t i v a a ouabaína. Estructuralmente l a po-

l a r i z a c i ó n se reve la por l a l o c a l i z a c i ó n de microvel losidades y ves ícu las pi-

n o c í t i c a s , y por l a presencia de u n a n i l l o continuo formado por microfilamentos ,. -

de a c t i n a v i s u a l i r a d o s por inmunofluorescencia en l a pa r t e l a t e r a l de l a meni-

brana plasmática. Esta d ispos ic ión está relacionada a l a d i s t r i b u c i ó n de l a s

uniones e s t r e c h a s , que actúan como bar reras separando los comoonentes de l a

membrana ap ica l de l a b a s o l a t e r a l .

a l t a de p a r t í c u l a s intramembranales en e l lado basola te ra l de l a membrana p las -

rnática ( 1 4 ) .

También se encuentra una concentración más

Bioquímicamente l a a s i m e t r í a se manif ies ta .por l a d i s t r i b u c i ó n

de l a a l f a amino-peptidasa en l a cara ap ica l y de Na:K ATPasa en l a cara basola-

t e r a l de l a membrana plasmátíca (47).

3 .3 UNIONES OCLUSORAS

5.3.1. - E n e l t e j i d o e p i t m

En e p i t e l i o s formados por una s o l a capa de c é l u l a s l a s uniones es-

t rechas e s t á n l o c a l i z a d a s en e l extremo apica l de l o s espacios l a t e r a l e s . A

e s t e nivel const i tuyen un c in turón completo a l rededor de l a s c é l u l a s , de mo-

do que c u a l q u i e r s o l u t o que a t rav i .ese el e p i t e l i o por e n t r e l a s c é l u l a s nece-

sariamente t i e n e que a t r a v e s a r l a unión es t recha .

Examinando con microscopio e l e c t r ó n i c o de a l t a magnificación l a w c c i ó n

t ransversa l de una unión e s t r e c h a , se observa que l a s membranas en aposición

de dos c + l u l a s e p i t e l i a l e s adyacentes s e acercan v se a l e i a n a l t e r n a t i v a w r t e

una de o t r a ( 1 2 ) . Así, en un c o r t e delgado perpendicular a l a cara l a t e r a l de

8

l a s c é l u l a s y a l plano del e p i t e l i o . se ve que l a s membranas c e l u l a r e s t ienen

una s e r i e t n t e rce l u l a r .

Esta f u s i ó n de l a s membranas puede ser aparente o verdadera, ya que . s i e x i s t e

un poro t o r t u o s o de 20 A o menor e s t a t é c n i c a no l o resu lve .

de contactos puntuaies donde desaparece e l espacio

- La t é c n i c a de c r i o f r a c t u r a , que produce l a e s c i s i ó n de l a memhrqa a l o

la roo ,del plano c e n t r a l de l a b i c a p a l i í d i c a (57), permi'te ver que en l a re-

gión de l a unión e s t r e c h a e x i s t e una red sumamente ramificado de f i b r i l l a s í n -

termembranosas (15,21m72,60,64) que e s t á n en e l plano de l a membrana c e l u l a r .

Estas f i b r i l l a s aparecen como cordones en l a cara P o cara i n t e r n a de l a mem-

brana y como c a n a l e s , en l a ' c a r a E o c a r a ex terna .

Estudios con . t r azadores macromoleculares jndican qiie l a z m u l a occl d e n s .

es una bar rera importante para el pasa.ie de iones por l a ru t a pa1,acelular f Z R ,

5 4 ) . Sin embargo, en algunos e p i t e l i o s e l lantano ión ico puede p e n e t r a r l a (49 .

83). El grado de permeabilidad de l a unión e s t r e c h a e s el que determina en qué

medida contr ibuye l a r u t a p a r a c e l u l a r a l t r a n s p o r t e t r a n s e p i t e ' l i a l . . ,As í , l a

c l a s i f i c a c i ó n de u n e p i t e l i o comohermético o permeable depende en última ins-

tanc ia de cuán permisivis sean sus uniones .es t rechas . Corresponde entonces

anal i z a r cuáles son l o s c r i t e r i o s y determinaciones experimentales que l l evan

'a c a r a c t e r i z a r l a permeablil idad de una unión e s t r echa .

Durante l o s años 60 comenzaron a acumularse bas tan tes evidencias ind i r ec -

tas apoyando l a idea que l a s d i f e r e n c i a s e n t r e l o s d i s t i n t o s e .pi te1ios podrían

deberse al grado.de permeabilidad de sus r u t a s parace lu la res (34,49,76,80).

Alrededor de 1970 ya e x i s t í a n numerosas observaciones que suaer ían que en ves í -

cula de cone.jo, l a ru ta e ra predominantemente paracel u l a r . Esta.; observaciones

i n c l u í a n l a s i m e t r í a de l o s potenc ia les de d i f u s i ó n ; e l e f e c t o sobre e ¡ poten-

c i a l de d i fus ión de l a a l t e r a c i ó n de l a s concentraciones i n t i a c e l u l a r e s ; l a

ba.ja r e s j s t e n c i a e l é c t r i c a ; y l a baja s e l e c t i v i d a d , evidenciada por una d i fe-

Casa abierta al tiempo

UNiVERSiOAO AlhXNOM A METROF'OLITANA-IZTAPALAPA

4,

Junio l", 1984.- 9

&B. GuadalilpB Partida Secretaria Academica de la b.C,BtC, P r e s e n t e .

Me dirijo & ust d para informarle que la alumna d0NICA MONTERO LOMELI; matr 1 cula 80222780, ha cumplido con l a s 7 4 0 horas previst de Su Servicio Social trabajando en .los laboratorios de l de Bioqufmica y Biofísica del DeE to. de Ciencias. de la Salud d esta Unidad, en el proyecto titulado: ''Polaridad de las c z lulas epiteliales: destino de una protefna basolateral 'equivocadamente' insertada en la membrana apical de las célu as MDCK".

sideracidn el Informe Final de su'trabajo y manifiesto mi conformidad con éste.

La alumna Montero Lomelf ha presentado a mi con - ,. 7%

< I

A t e n t a m e n t _ - %

Dra. Graciela Beaty

AVE. Purisma y Micholíln. Iitapalapa, Mlixiea 13, O. F., Tslr 686-03-22.686.16-1 1

e ,

Parodi

9

rencia re la t ivamente pequeña e n t r e l a s permeabilidades a l ca t ión monovalente

ids permeable y a l menos permeable (4,5,17).

Sin eiibargo l a evidencia concluyente sobre el predominio de una ruta

p a r a c e l u l a r de e s t e t i p o de e p i t e l i o s fue provis ta nor dos t i p o s de experi- c

m n t o s (22,23): 1) Anál i s i s de cable de ves icu la de Necturus y 2 ) m a z o de

v o l t a j e en ves ícu la de Necturus. En cavbio, o t r o s e p i t e l i o s como l a piel de

rana, l a ve j iga de sapo y tor tuqa y e l conducto sa l iva1 submandibular t i enen

ma muy a l t a r e s i s t e n c i a t r a n s e p i t e l i a l . En e s t o s casos l a r e s i s t e n c i a t o t a l

e s igual a l a que cabe e s p e r a r de l a s r e s i s t e n c i a s en s e r i e de l a s dos caras

opuestas de l a s c é l u l a s e p i t e l i a l e s y e l camino quesigupn l o s iones e s predonii-

nantemente i n t r a c e l u l a r ( 1 4 ) .

deben s e r pues, re la t ivamente herméticas.

En e s t o s e p i t e l i o s l a s uniones i n t e r c e l u l a r e s

Claude y Goodenough (16 ) en 1973 in ten taron una c l a s i f i c a c i ó n de lo s eo i -

t e l i o s en función de su r e s i s t e n c i a t r a n s e p i t e l i a l .

cuentran una c o r r e l a c i ó n d i r e c t a e n t r e e l número de f i b r i l l a s de l a u n i ó n es-

t recha y l a permeabilidad p a r a c e l u l a r . sin embargo, otros inves t ioadores (51)

hal lan que e s t a c o r r e l a c i ó n no e x i s t e ; a s í por ejemplo e l í l e o de conejo y l a

t s t o s mismos au tores en-

ve j iga u r i n a r i a de sapo t i e n e n una red de f i b r i l l a s muv semeiante y sin embar-

90, mientras que el primero es permeable a l lantano y t i e n e todas l a s cai-acte-

r í s t i c a s de un e p i t e l i o hermético, e l segundo es impermeable al l an tano y po-

see propiedades de u n e p i t e l i o hermético. Estos resu l tados i n d i c a r í a n que

cada una de l a s f i b r i l l a s que se ven en l a c r i o f r a c t u r a no es homolonable a

una bar re ra de permeabilidad aunque podría o c u r r i r oue l a bar re ra fuese l a

s u s t a n c i a contenida e n t r e e l l a s (28) .

5.3.2 En l a s monocapas de c é l u l a s M D C K

La unión es t recha e s t á c o n s t i t u i d a por un con.junto de 1 a 7 f i b r i l l a s

i n t e r p u e s t a s e n t r e e l lumen y e l espac io i n t e r c e l u l a r que fortran una red de; I

cordones en l a c a r a P y de cana les en l'a cara E. Los cordones y l o s canales

E n e l curso de unos pocos nanómetros el patrón de comple-

.jidad puede v a r i a r de 7 a 2 Ó 3 f i b r i l l a s p a r a l e l a s t a l v como ocurre en l o s

túbulos proximal y d i s t a l de l o s e p i t e l i o s na tura les . (58 ) .

cha de l a monocapa MOCK es impermeable a t razadores macromoleculares t a l e s

como l a peroxidasa . y e l l a n t a n o . c o l o i d a 1 .

es tán en r e g i s t r o .

La unión e s t r e -

c - La posición de 1.0s complejos de unión hacia l a s u p e r f i c i e l i b % de l a s

c é l u l a s y l a apar ic ión de rnicrovellosidades y c i l i a s en l a cara l i b r e indican

. que é s t a corresponde a l lado luminal de l o s e p i t e l i o s n a t u r a l e s .

5 . 4 MECANISf+IOS DE POLARIZACION

Si bien l a a s i m e t r í a anatómica, e s t r u c t u r a l , funcional y bioauimica

de l a s c é l u l a s e p i t e l i a l e s e s t á razonablemente c a r a c t e r i z a d a , se desconocen

has ta ahora l o s mecanismos responsables de e s t a po lar izac ión . Nos prenunta-

nus entonces ¿Cómo hace una c é l u l a , s imét r ica a l momento de sembrarse, para

p o l a r i z a r s e has ta formar p a r t e de una monocapa e p i t e l i a ' con microvel losida-

des y complejos de unión en . l a c a r a a p i c a l , que no aparecen en l a b a s o l a t e r a l ? ;

o bien, ¿flu6 señal reciben l a s pro te ínas de membrana para d i r i g i r s e e i n se r -

t a r s e en uno u o t r o dominio?

Podríamos s impl i f i . car l a s ideas v igentes sobre l a @ m i s de l a p o l a r i - I

I I dad en dos grandes p o s i b i l i d a d e s , .que por o t r a pa r t e no son mutuamente oxclu-

yentes.

1. Que l a s pro te inas de membrana poseen una señal química que l e s s i r v a pa-

ra i n y e c t a r s e polarizadamente, por e.jemplo c i e r t o t i p o de azúca,res proce-

sados en e l a p a r a t o de Golgi.

2 . Que l a s pro te ínas de membrana se i n s e r t e n a l a z a r en uno y o t r o dominio

y sea l a c é l u l a quien maneje un mécanisvo de r e d i s t r i b u c i ó n que q u i t a

c i e r t a s p r o t e í n a s de l a ap ica l para r e i n s e r t a r l a s en l a b a s o l a t e r a l ,y v i -

ceversa .

I

11

-. c - !

S i bien e l primer mecanismo parece más económico que el senundo, debe-

ms considerar e l hecho experimental que una c é l u l a rec ién sembrada t i e n e

sus componentes de membrana randomizados y que al ponerse en contacto con

e l sustrato y/o con celulas vecinas p o l a r i z a esos mismos componentes.

Por o t ra p a r t e se sabe que l a enzima i n t e s t i n a l sacarosa isomaltasa es L

inser tada en l a membrana b a s o l a t e r a l an tes de su apar ic ión d e f i n i t E a en l a

s u p e r f i c i e ap ica l (11,20,32,70). Siempre se encuentra una cant idad de

Na :K ATPasa asociada con e l borde en c e p i l l o ap ica l de l a s c é l u l a s de túbulo

renal (4O,41). De igual forma se detec tan cant idades ,var iab les de proteína

G del virus VSV en l a s u p e r f i c i e ap ica l de l a s c é l u l a s M D C K in fec tadas ( 6 5 ) .

Por o t r a p a r t e . e s t e primer mecanismo h a s i d o extensamente estudiado s iquien-

do e l camino post- t raduccional de pro te inas ' de membrana (59,62,71) y de l a s

glucoproteínas de c i e r t o s v i rus encapsulados que t ienen l a propiedad de gemar

polarizadamente (65 ,66) .

t r a r cuál es o en qué organelo se adquiere l a señal de a s i m e t r í a ( 2 4 , 2 5 , ' 2 R ,

29,39,53,56,64,67,,75).

después del Golbi , posiblemente en d i s t i n t o s t ipos de ves ícu las ' cub ie r t a s de

c l a t r i n a (35 ) .

S i n embargo, has ta ahora n o h a s i d o pos ib le encon-

Hoy se piensa que s i é s t a seña'l e x i s t e debe e s t a r

Nosotros decidim0.s explorar l a segunda p o s i b l i l i d a d : buscar s i e x i s t e

un mecanismo c e l u l a r de red is t s ibuc , ión .

picamente basa l , como e l l a Na:K ATPasa en l a membrana ap ica l de l a s c é l u l a s

KICK y ver si l a céiu' ia l a to le ra o l a remueve y ' e n caso que l a remueva ver s i

es capaz de r e i n s e r t a r l a en el dominio adecuado.

La. idea es i n s e r t a r una proteína t í -

6. OBJETIVOS.

,6.1. GENERALES

Es tudiar s i l a c é l u l a posee un mecanismo de r e d i s t r i b u c i ó n de pro te ínas

membranales capaz de remover un? proteína "equivocadamente" i n s e r t a d a I

en I d c a r a ap ica l (ej: l a Na:K ATPasa) y r e u b i c a r l a en e l doiriinio adecuado,

en e s t e caso e l b a s o l a t e r a l .

6 .2 . PARTICULARES

Debido a que e s t e es un proyecto m u l t i d i s c i p l i n a r i o e l S e r Q i o So-

c i a l t r a t a r á del a i s lamiento y f luoresce inac ión de Na:K ATPasa de T ñ ó n 1 - de per ro . I -*

L

"I

1 -

c

L

e

L

9. PROGRAMA Y METODOLOGPA D E T R A B A J O

7.1 PURIFICACION D E Na:K ATPasa DE MEDULA ROJA D E R I Ñ O N DE P E R R O

7.1.1 DISECCION DE MEDULA ROJA DE R I Ñ O N (35 )

1. Conservar l o s riiiones en solución f r í a después de haherlos removido cuando no se e s t é haciendo l a d i secc ión .

2. La d isecc ión debe hacerse en un v i d r i o o charola de nieta1 que se con- s e r v e a 0°C sobre h i e lo . ,

3. Hace'r uncorte s ag i t a1 a t r avés del r iñón con u n b i s t u r í .

4 . Con e l l ado plano de l a mitad del r iñón hacia abajo, q u i t a r ca s i t o - da l a cor teza granular de c o l o r oscuro con u n b is tur í . En e s t e mo- mento l a mitad del r iñón puede s e r bañada en solución Fría para renio- ve'r l a sangre y aumentar e l c o n t r a s t e e n t r e l a cor teza y l a médula. Con agujas de d i s e c c l ó n , q u i t a r l a c o r t e z a granular que aueda, &,jando l a médula l i s a .

5. Remover todo l o pos ib le l a médula i n t e r i o r c o l o r crema. Se puede d e i a r aproximadamente 20% de medula i n t e r i o r , pero cas i nada de cor teza en l a d i secc ión f i n a l .

6 . Congelar l a médula a 1 6 que se hizo disección en N2 l í q u i d o y crrar-

Solución: 250 d4 sacarosa , 3OmY h i s t i d i n a , In): E D T A , DE 7 . 1 , ai iadir O . 1% Mercaptoetanol (p?lE) antes de usa r l a .

d a r a -7O'C. Un riñón da 2-30 de ma te r i a l .

7.1.2

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9 .

10.

11.

12.

13.

14.

13

PREPARACION D E MICROSOMAS

Descongelar parcialmente e l t e , j ido en solución f r i a . La temperatura no debe exceder de 0°C. Usar aproximadamente lOOg de te , j ido .por cada l i t r o de so luc ión .

Moler e l t e j i d o en una l icuadora durante 40 seg. a 4 ° C .

Homogeneizar con 5 golpes de motor. 0°C durante l a operación. Evi ta r que se forme espuma. ,,

F i l t r a r e l homogeneizado por una gasa.

Cent r i fugar e l homogeneizado f i l t r a d o en e l r o t o r Sorval l G S A durante 15 m i n . a 6,500 rpm. Guardar e l sobrenadante a 0°C.

Resuspender l a p a s t i l l a del no. 5 en aproximadamente medio volumen de l a s o l u c i ó n . f r í a . en e l no. 5.

Conservar e l homoaeneizador a

c -.

-ai

Repet i r l a s homogeneizaciones y c e n t r i f u g a r como

J u n t a r sobrenadantes de lo s números 5 y 6

Cent r i fugar por 40 m i n . a 20,000 rpm en Rotor Beckman t i p o 21.

Aspirar e l sobrenadante y resuspender l a p a s t i l l a suavemente soplando solución encima de l a p a s t i l l a con una pipeta Pasteur . No tomar el mater ia l ca fé oscuro (mi tocondr ias ) . helada. El volumen f i n a l de l a p a s t i l l a resuspendida dehe s e r 3-4 veces e l peso o r i g i n a l de l a médula.

Homogeneizar con 3 golpes de motor a 0°C.

Lavar l a s p a s t i l l a s con solución

Cent r i fugar e l homogeneizado a 20,000 rpm. 30 min. en el r o t o r Beckman 21.

Resuspender l a capa s u p e r i o r blanca de l a p a s t i l l a con una p ipe ta Pas- t e u r dejando l a p a s t i l l a ca fé oscuro.

Repet i r números 11 y 1 2 .

Congelar l o s microsomas en N2 l í q u i d o y guardar a -70°C.

SoluciÚn: 250 mM sacarosa , 30 I$' h i s t i d i n a , 1 mM E D T A , pH 7 . 1 , añadi r 0 .1% f3ME an tes de usar lo .

Rotores: GSA y Beckman t i p o 21

7.1.1 TITULACION CON SDS. Esta t i t u l a c i ó n t i e n e el f i n de encont rar l a concentración Óptima de SDS para su p u r i f i c a c i ó n . Nota: (1) La concentración de proteína microsomal debe s p r aproximadavente

2 . 0 rng/ml durante l a s o l u b i l i z a c i ó n . La sol ,ub,i l ización de mez- c l a s menos concentradas r e s u l t a en una pureza,.inás pobre y con menor a c t i v i d a d .

!

üiUVUiSíDN AUTWIOM WBRWOLIiAM l4 !5ERVICiOS DOCUMENTALES

Qiy1II m W M A ( 2 ) Se debe usar SDS r e c r i s t a l i z a d o . La f i l t r a c i ó n en c a l i e n t e r e -

mueve el l a u r i l - a l c o h o l del SDS. Las t i t u l a c i o n e s con SDS contaminado son más amplias y con una cola al f i n a l de l a t i t u l a c i ó n .

i i F'"

- 1 .....

I - I - ; . C"

iL I

j_ iL c

c

L

c

I \

SDS contaminado con l a u r i l - a l c o h o l - - -

SDS r e c r i s t a l i z a d o c

1. Mezclar los s i g u i e n t e s componentes a l a concentración f i n a l ind ica- da entre p a r é n t e s i s ; Proteína microsomal ( 2 mg/ml), ATP (3.2nii.l) p ME (l%), b u f f e r imidazol csp.

2 . Agitar suavemente durante 10 m i n .

~

3. Separar a l í c u o t a s a l a s que s e añade SDS en concentraciones va r i a - b l e s ( O a 1 . 2 m g / m l ) .

4 . Después de 30 min. a temperatura ambiente d i l u i r l a inezcla de s o l u h i - l i z a c i ó n 1/10 con solución 6 f r i a .

Soluciones: A.

Esto d e t i e n e l a s o l u b i l i z a c i ó n .

Proteína microsomal ATP BME SDS

Concentración Dara sol Iibi 1 i zaci ón

2 . 0 mg/ml 3 . 2 mM 1% O a 1 . 2 mg/ml

B. Imidazol 25'mM, EDTA 1 mM, pH 7 . 5 a 23"C, ATP 4OmM en l a misma s o l u c i ó n , pH 7 .5

7 . 1 . 4 . PREPARACION DE ATPasa

1. S o l u b i l i z a c i o n . Se l l e v a a cabo en l a s mismas condiciones usadas en l a t i t u l a c i ó n con SDS. Detener l a s o l u b i l i z a c i ó n poniendo l a prepa- ración en baño de h i e lo has ta que l a te i rperatura sea menor a 10°C.

2 . Preparar g r a d i e n t s de sacarosa

7 . 3 5 ml de s o l u b i l i z a c i ó n

3 ml 159 sacarosa en solución 5.80 ml 28:' sacarosa en solución

3.20 ml 37' sacarosa en solución

L

I,

CI 15

I -

r

3 '

L

c

L !

Ir:, ~

I

b ) c e n t r i f u g a r a 43,000 rpm por 75 min. en r o t o r Ti 60

c ) La ATPasa de Na y K queda en l a i n t e r f a s e de 28%- 37%. Descar- tar l a banda s u p e r i o r (15 - 28%) y l a p a s t i l l a .

d ) D i l u i r 1 : 2 en 250 mM sacarosa , 30mM h i s t i d i n a , 1 mM EDTA, nH 7.1 1% M E .

e ) Cent r i fugar como en b y resuspender en e l mismo b u f f e r s inpME.

f ) Congelar en N 2 l í q u i d o y guardar a -70°C.

Soluciones: 25 ~ P M imidazol , 1 r&l EDTA, pH 7 . 5 a 23°C

L - Div id i r en a l í c u o t a s en tubos de microcent r í fuqa . --+.

ATP 40 mM en l a misma so luc ión , pP 7 . 5 15% de sacarosa en so luc ión de imidazol 28% de sacarosa en so luc ión de imidazol 37% de sacarosa en soliJcion de iniidazol 250 rrfl saca rosa , 25 niY h i s , 1 mM EDTA, pH 7 . 1

7 .1 .5 DETERMINACION DE PROTEINAS POR E L METODO DE LOWRY

A . SOLUBILIZACION DE PROTEINAS Y ELIMINACION D E INTERFERENCIAS

1. Tomar 102. de l a muestra problema y 1le.var a 100 A

2 . Tomar 1 0 r d e 1 y llevar a 3 m l con agua d e s t i l a d a ( e s t o eouiva le 1 X d e l a muestra o r i g i n a l ) .

3. Agregar 25Xde deoxicola to de sodio a l 2%

4 . Mezclar en vortex y, espe ra r 15'min.

5 . Agreoar 1 ml de ác ido t r i c l o r o a c é t i c o a l 24:: y mezclar

6. Cent r i fugar a 3,300 g durante 3D.min.

a tomar

7. Aspi ra r con una p ipe ta Pas teur conectada al vac ió , e l sobrenadante .

8. Agregar 1 ml de agua d e s t i l a d a .

B. DETERMINACION DE PROTEINAS

1. Mezclar 100 p a r t e s de so luc ión A con 1 p a r t e de so luc ión B para formar e l agente a c t i v o .

s tandard o l a i i ues t r a ) . 2 . Poner e n t r e 10 y IDO 9 de pro te ína en 1000 k d e a w a ( sea el

r' 3. Agregar 3 ml de agente a c t i v o a 2 .

'T 4. Incubar a temperatura ambiente durante 10 niin. 47 5. Agregar 300,Ade . l a so luc ión C .

c

'I 'ncubar a temperatura ambiente durante 45 iq , , l . c

i -"

16

L

'CI.

:-

7. Leer densidad Óptica a 660 nni

8. Hacer curva standard con albúmina (10 - 100 g) siguiendo los pasos 1-6.

9 . Trabajar siempre oor t r i p l i c a d o

Soluciones: A . Nazco3 2%; NaOH 0:4%; t a r t r a t o de Na y K a l 0.17 i

.. B. CuS04 a l 0.5%

C. F o l í n 1:1.5 en agua. Se prepara en e l momentode usar

D. Deoxicolato de sodio 2%

E. Acido t r i c l o r o a c é t i c o a l 24%

7.1.6 ACTIVIDAD DE ATPasa

1. Mezclar en el momento colución A (5 m l ) , solución B (5 m i ) , solu- c ión C (5 m i ) y 10 m l de agua helada. Esto r e su l t a en KCL 20 mM, Mg'C12 3 mM; NaCl 100 d, ATP Na2 6 mM, HisC1 30 NM.

2. Hacer ensayos l o r cuadripl icado. 00s con ouabaina v dos con oua- baína 2 x 10 - M.

3. Poner en cada tubo 0.5 ~l de 1.

4. Agregar 10Xde ouabaína lo'* M a los tubos que deben l l e v a r l a .

5. Incubar durante 15 min a 37°C.

6. Agreqar 1Oh de muestra ( Ó 1x del o r i a i n a l ) .

7. Ag i tar gentilmente en vortex

8. Incubar durante 30 min a 37°C

9. In t roduc i r en h ie lo .

10. Agregar 7.5 m l de agua a cada tubo

11. Agregar

12. Esperar 10 min. y leer a 660 nm.

13. Hacer control igua l pero mantenerlo cn h i e l o .

14.Hacer blanco con 8 m l de agua + 1 m l Moo4+ Soluciones.

1 m l de Moo4 a cada tubo y 1 m l . de SOdFe.

1 m l S04Fe. A. KCL 100 mM; MgC12 7.5 mM; pH 6.8

E. NaCl 500 BM; MgC12 7.5 mM; pH 6.8

C. ATP Na2 30 mM; HisCl 150 mM; ph 6.8

D. Stock ouabaína M en strophantina M en OWF.

a.

17 , .,<. >.,.

”.,. 7.1.7 GEL ELECTROFORESIS (42,74)

I. MONTAR PLACAS L

11.

111.

I V .

1. En una g r a d i l l a de p a l i t o s montar: a p lacas de v i d r i o limpiadas con acetona b 1 reg le ta c ) agarraderas metál icas d) tapar con paraf i lm

2. Poner en un tubo 1 m l de agua y 1 m l de A (polínie&s) y aq i ta r

3. Agregar 2 5 q l d e B (cata l izador ) y ag i ta r .

4. Agregar 50p1 de C ( ca ta l izador )

5. Rápidamente meter en l a cámara chorrelndolo por el borde. G e l i -

-*

f i c a instantáneamente.

GELES DE SDS

Pol iacr i lamida - urea (10%) . La urea da mayor resolución pero t a r - da más (3 hrs . vs 16 hrs ) . En este caso se usará 10% acr i lan ida s i n urea.

AGREGADO DE SOLUCIONES.

t

1. Tapón separadov. a ) Poner en un vaso l a s soluciones 1 -,4. agitar^ 2 min. a t e m e -

b) Agregar l a solución 5 y a g i t a r fuertemente durante 40 seg.

c ) Aspirar ‘rápidatxente con jer inga con punta de gonia.

d) Correr lo rápidamente entre l a s placas.

e) Para que no haga ondas poner 1 Ó 2 in1 de SDS a l 2” (1/2 cm)

r a t ura ambiente.

con. p ipeta Pasteur.

f ) Esperar de 7 a 15 m i n .

2. Tapón concentrador.

a ) Se prepara igual que e l separador.

b ) Mientras se ag i ta 40 seg. qu i tar e l SDS inv i r t iendo las p l a c a s Secar con s e r v i l l e t a s de papel.

c ) Poner e l buffer concentrador rápidamente con jer inoa.

d ) L lenar hasta 1/2 cin abajo del bord?.

PEINE. a ) Meter e l peine de lado b ) Enderezarlo y de ja r lo a 1 cm de l a in te r fase

(despega e l peine y e n t r a en ondas) d ) Esperar de 7 a 15 inin.

V . Cámara de e l e c t r o f o r e s i s .

1. Sostener cada placa a l a cámara con 4 aqar iaderas de p l á s t i c o

2 . Ajustar para que no haya fugas por aba jo .

3. Agregar solución J has ta t a p a r l o s e l e c t r o d o s . , i V I . SIEMBRA D E MUESTRAS.

1.

2.

3.

4.

5.

-.b Montar placas en l a cámara.

Q u i t a r e l peine con cuidado de no p a r t i r el c a r r i l .

Agi tar l a muestra y meterla con una microjer inga en e l w z o .

Lavar l a microjer inga con solución K.

Poner l a muestra corr iendo l a microjer inga de lado del c a r r i l .

VII. PREPARACION DE LAS MUESTRAS

1. Poner 50 > de muestra en u n tubo Eppendorf.

2. . Agregar 50 Ade solución K ( s i l a muestra fuera una p a s t i l l a agre- gar 50Ade SDS a l 2% .y 100

3. Agregar 25 mg/ 200 de urea s ó l i d a .

4. Agregar 5 A de@ME.

5. Calentar agua ,en un v a s i t o a lOO"C,. Meterle u n tube de v i d r i o para que no brinque.

de solución i: 2x.

6 . Meter e l tubo Eppendorf con l a muestra y d e j a r l o s 1 - 2 m i n .

7 . Agi tar l a muestra a n t e s de sembrar.

V I I I . MONTAJE D E C E L D A

1. La celda se pone en u n r e c i p i e n t e que contenga solución Y,.

2. Q u i t a r burbu.jas para que haga contacto.

.3 . Ponerle l a tapa .

4. Conectar l o s bornes a l a fuente de poder. !

r

19

I x . CONDICIONES DE CORRIDA.

Buchler 3-1500 Vol ta je 0-1000 v D C Tiempo 180 m i n I Corr ien te 0-200 mA

Sol uciones . A. Acrilamida 0.8% en agua. Bis acr i lamida 0.8% en agua.

B. TEMED 8.4% en agua

C. P e r u s l f a t o de amonio 12.5% en agua.

D . Buffer 4x pH 8.8; TRIS 1 .5 M, SDS 0 .4% en agua.

E. Buffer 4x pH 6 .8 ; TRIS 0.5 M; SDS 0.47- en a g u a .

I - 1

F. Stock Acrilamida 30%, Bis ac r i l amida*0 .8% en agua.

G . SDS 2% en agua.

H. T E M E D 8.4% en agua.

, I . P e r s u l f a t o de amonio 12.5% en agua.

,.

i

t J . Tampon de c o r r i d a . TRIS 0.025 M, g l i c i n a 0.192 M, SDC 0 . 1 % ; D H 8 . 3 .

K. Tampón muestra 2x. TRIS 0.0625 M , SDS Z%, o l i c j n a lo:<, p i ronina O.OCl%;

' b Ajustar pH con cua lqu ie r ác ido sa l vo HCL

pH 6.8 con mucho H C 1 . i,

L. Tampón separador .

I 1) Buffer pH 8.8 2 ) Bisacr i lamida 3 j Agua 4 ) TEMED 5 ) Persul f a t o

M Tampón concentrador.

1) Buffer pH 6.8 2 ) Bisacr i lamida 3 ) Agua 4 ) TEMED 5 ) P e r s u l f a t o

5 ., 10' 5 ml 5 mi

3.32 6 . 6 11.68 8.4

100 x 100 1 200 A 200 2

2.5 1.0 6.5

40 A 75 A

1.5

20

X. TINCION DE PLACAS.

1. Teñir l a s placas con azul de Coomasie a l 0.25% durante una hora

2. Desteñir con solución C por media hora.

3. Bañar en ácido acét ico a l IO?> por 12 hrs.

Soluciones.

A. E.

C.

7.2

c Azul de Coomasie a l 0.25% - Desteñidor 5:5:1 - Acido acét ico 10%

MARCAJE DE Na:K ATPasa

St! parte de ATPasa de Na y K pur i f i cada unida a membranas

1. Centr i fugar l a enzima a 45, 0700 durante 45 min en ro tor T i 60

2. Resuspender en solución A a concentración f i n a l de 1 mg de proteína/ml.

3. Preparar i sot ioc ianato de f luoresceína en diniet i l formamida. Concen- t rac ión f i n a l 15 mM. Debe usarse solución rec ién preparada. No a l - macenar en p lás t i co .

4. Tener l a enzima en suspensión con ag i tac ión semilenta a temperatura ambiente (20°C) y agregar FITC hasta una conrentraciónfinal de 20.t11

5. Incubar en baño de agua a 20°C durante 45 w i n con agitac ión.

6. Parar e l marcaje diluyendo l a suspensión 10 veces en solución E helada.

CON FLUORESCEINA ( # + )

7. Centrifugae a 45,000 por 45 min. en ro tor T i 60. Resuspender con Pas- teur y je r inga. Centr ifugar ot ras 3 veces con igual volumen para l a - var exceso de f luoresceína.

8. E l sedimento f i n a l se resuspende en C a una concentración f i n a l de 1 rng de proteína/ml. Se d7vide en porciones de 100.. Se en f r í a ráp i- damente y se guarda a - 70°C. (Poner l o s v i3 les en frasco oscuro).

azul de Coomasie y s i n t e ñ i r bajo l u z UV. 9. Medir ac t i v idad de ATPasa . (no debe haver) y correr geles teriidos con

Soluciones: A . NaCl 100 niM; TRIS-EDTA 1 mM, T R I S HC1 50 mM; pH 9.2 B. Solución E, Tris C1 50 mM, TRIS EDTA i BM; ph 8.0 C . Sacarosa 10% en solución E

2 1

8. RESULTADOS O ACTIVIDADES DESARROLLADAS.

Se l l e v ó a cabo e l aislamieiito de l a ATPasa de Na y .K dos veces. En

l a primera se p a r t i ó de 100 a. de médula r o j a de r iñón. Se real ' izó

paración de microsomas

de proteína por m l . de solución ( ve r g f a f i c a 8.1). A l r e i l i z a r l a t i t u l a c i ó n

la pre-

en l a cuai se obtuvo una Concentración de 10.44 m o

en SDS. se h i c i e ron 4 so lub i l izac iones d i s t i n t a s de l a preparaciÓLcon 4 con-

centraciones d i s t i n t a s de SDC ( tab la 8.1) para e l e a i r aquel la coneentración

de SDS que diera en l a preparación de ATPasa en aradientes de sacarosa':

1) mejor separación de interfases

2) mejor rendimiento y

3) mejor gel e l e c to r fo res i s

-.

A l r e a l i z a r l o s i rad ientes de sacarosa se obtuvo una separación de ban-

das ma,yor en l a concentración 0.4 que ne l a 9.6, 0.5, y 9.7. Las p a s t i l l a s

obtenidas después de l a centr i fugación por gradientes a simple v i s t a . fue ron

en orden decreciente mayores en l a concentración O.!.,. 9.5, 0 . 6 , 0.7.

A l l l e v a r a cabo l a Última centr i fupación para 13 separación de l a

ATPasa no s.e obtuvo ningún resultado.

En l a segunda pur i f i cac ión se p a r t i ó de 150 0 de médula r g i a de r iñón.

Se r e a l i z ó l a preparación de microsomas en l a cual se obtuvo una concentración

de 15.3 mg de proteína por m i l i l i t r o de solución (qráf ica 8.7) .

l a so lub i l izac ión en SOS y a l r e a l i z a r l o s gradientes de sacarosa h u b o proble-

mas técnicos con l a centf i fuga por l o que se perdió e l mater ia l de esta se-

Se r e a l i z ó

gunda pur i f i cac ión.

Mientras se r e so l v í an l o s problemas

b ib l i oo rá f i c a acerca de l a evolución del

tener una respuesta a l a polaridad de l a

t e l i a l . Dicha r e v i s i ó n b i h l i o a r á f i c a se

l a s act iv idades real izadas.

técnicos se r ea l i zó una r ev i s i ón

complejo ATPasa tratando as í de ob-

ATPasa de Fla y K en e l t e i i d o en i-

I I I

inc luye a cnntinuación dentro de

L

L

*.?

c-

r- L

r Li

P-

i

Y-

.-..

? *hm-.

23 i.

L

~ /-" 'i L.,

j

r ' I I L

Concentración f i n a l de : ,BDS.~~:.c.(m~/ml )

9 .4

0.5

O. 6

O. 7

SDS ( 5 ~io/n i l )

435

556

682

. 814

TABLA 8.1. Se l levaron a cabo cua t ro concentraciones difereii . tes de

SDS para probar cuál daba: mejor separación de i n t e r f a s e s

en e l g rad ien te de sacarosa , mejor rendiri iento de pro te ína ,

y mejor gel e l e c t r o f o r é s i s .

i

c

I -

r-

i r -

.- ,:I

24

- EVOLUCION DEL COMPLEJO ATPasa

INTRODUCC I O N .

E l complejo ATPasa se acopla a l metabolismo

v i vas . En eucariotes involucran a este complejo

a l a f os fo r i l a c i ón ox idat iva y fo tos in té t i ca a s í

de cas i todas l a s cé lu las

l a s í n t e s i s de ATP l i g d a

como l a e l a b o r G 6 n de - c

energía necesaria para el transp.orte a c t i vo a t ravés de l a s membranas ce lu-

l a res , en tanto q w e n orocariotes es te comlejo también t i ene l a fi.inci6n de

s í n t e s i s de ATP más 1.a de bombeo de protones en anaerobiosis (IO'.

Muchas proteínas y ácidos nucleicos son " f ó s i l e s vi.vientes" en e l sen-

ti.do de que sus esturcturas han sid.0 conservadas dinámicamente por e l proceso

de evolución por b i l l ones de años. Sus' secuencias de aminoácidos y r luc leót i-

dos ocurren ahora como formas relacionadas reconocibles en eycar iotes y pro-

- car io tes , habiendo evolucionado de secuencias ancest.rales comunes pot- un

gran número de pequeños cambios.

información a nosostros para conocer l a evolución remprana de especies bio-

lóg icas y sus procesos bioquírnicos ( 6 9 ) .

Es tas secuencias Dueden t r a e r su f i c i en te

La omnipresencia del complejo ATPasa suqiere oue apareció en fases tem-

pranas de l a evolución. Los estudios de evolución de este cornoleio se basan I , I

en l a comparación de l a s subunidades est ructura les . de l a comosic ión de ariino-

ácidos, l a s sens ib i l idades a d i ferentes inhibidores aue t ienen l o s d i s t i n tos

complejos estudiados y l a b ios ín t es i s de l o s d i ferentes complejos.

EVOLUCION DE LA ENERGIA METABOLICA CELULAR.

Las. ves ícu las .y l a s riiicelas de fosfo l íp idos nresentes en l a so0.a p r i v i -

genia formaron cata1 izadores pr imi t ivos (de supe r f i c i e ) ' y foi-i,l?s ren l i c a t i v a s

p r imi t i vas . La unión de l í p i d o s con su carácter anf ipát ico v su ar ren lo re -

gular de cartas supe r f i c i a l e s pudo absorber moléculas y l l e v a r 3 caho funcio-

nes c a t a l í t i c a s pr imi t ivas .

25

La generación química de uniones anhídridas pudo permitir l a síntesis de

ma.cromoléculas (ácidos nucleicos, Proteínas, lípidos) sin l a deshidratación

física via evaporación. Inicialmente, muchos de estos conipuestos existían,

uno específico para cada reacción, desde una gran variedad de cotyuestos aci ,

fosforil y tionil, c.omo los encontrados en los sistemas 'biológicos acutuales c -

hasta compuestos como carbodiimidas, usados

ca de proteínas y ácidos nucleicos.

amp1 iariiente en l a síLtesis quími-

Para el desarrollo de l a vida, un paso m$s fue necesario, l a uniformación

de l a moneda eneroética.

grada sólo pudo aparecer hasta que tin s o l o compuesto

para generar intermediarios ricos en energía para la síntesis de proteínas,

grasas y lípidos.

MEWRANAS Y CANALES PROTEICOS.

La posibilidad de la existencia de una célula inte-

nudiera ser utilizado

El ATP fue seleccionado muy temorano en la evolución.

Sólo después de l a evolución del ATP como una moneda eneroética pudo

entonces ser ventajoso limitar la difusión y encerrar a estas reacciones

en membranas. Las fermentaciones en un espacio tan cerrado llevaban a una

baja del pH interno, disminuyendo las reacciones de síntesis y catalizando

las de hidrblisis (61).

Inicialmente, tal sistema tuvo que gotear protones hacia el exterior I

para contrarrestar l a baja del pH.

Péptidos muy simples ( valinomicina y niqericina) y l o s proteinoides de Fox

Así se desarrollaron canales de orotones.

pueden incrementar selectivamente l a permeabilidad de iones en las bicapas

1 ipídicas.

De una oran variedad de canales de iones, los supuestos procariotes se-

leccionaron un canal de orotones que dió luqar a una proteína oue se tine a

diciclohexil-carbodiimida (DCCD). Es en este punto cuando anarenteinente

diviroieron de los supuestos eucariotes que seleccionaron un acarreador di-

ferente (30'.

26

CONFIGURACION Y FUNCION D E L COMPLEJO ATPasa

ATPasa de HS

Membranas acoplantes como l a membrana i n t e r n a mitocondrial , l a membrana

de l o s t i l a c o i d e s de l o s c l o r o p l a s t o s y regiones e s p e c i a l i z a d a s de todas l a s

membranas b a c t e r i a n a s contienen . u n complejo pro te ico capaz de u t i x z a r l a - eneigta:? derivada del t r a n s p o r t e de' e l e c t r o n e s en l a s f n t e s i s de ATTa p a r t i r

de ADP y f ó s f o r o inorgánico, y/o de u t i l i z a r l a energía derivada de l a hidró-

l i s i s de ATP para v a r i o s procesos como el t r a n s p o r t e de iones (31) .

E. Racker y sus colegas han encontrado que cuando se somete a a n i t a c i ó n

mecánica o a t ra tamiento con tripsyna y urea a ves ícu las submitocondriales

f o s f o r i l a n t e s preparadas de mitocondrias de r e s , r e s u l t a n dos fracciones: . 1)

ves ícu las de membrana capaces de cata1 i z a r e l t r a n s p o r t e de e l e c t r o n e s pero

no l a f o s f q r i l a c i ó n de A D P y 2 ) una f racc ión proteica, s o l u b l e que c a t a l i z a -

la h i d r ó l i s i s de a t p pero no el t r a n s p o r t e de e l e c t r o n e s . Las ves ícu las - t r a t adas de e s t a forma no re t ienen corpúsculos de Racker en su s u p e r f i c i e ex-

terna , como se observó por microscopía e l e c t r ó n i c a de c o n t r a s t e negat ivo.

Este descubrimiento s u g i r i ó que l o s corpúsculos de Racker es tán involucrados

en l a f o s f o r i l a c i ó n acoplada a l t r a n s p o r t e de e l e c t r o n e s . Cuando l a s dos - I

f racc iones sccombinan se r e s t a u r a una c a f t i d a d s i g n i f i c a t i v a de l a a c t i v i d a d

de f o s f o r i l a c i ó n oxida t iva .

La a c t i v i d a d de fosfor i lac . ión es desacoplada por 2 , 4 d i n i t r o f e n o l e . - lnhibi.da por oligomi.cina. . De t a l e s experimentos de recons t i tuc ión Racker y

sus colegas concluyeron que l a membrana mitocondrial cont iene l a s enzimas pa- l

ra e l t r a n s p o r t e de e l e c t r o n e s , mientras que l a soli ible representa a l coniple-

j o enzimático requerido para l a formación de ATP. Las pro te ínas s o l u b l e s ne-

c e s a r i a s para l a res taurac ión de l a a c t i v i d a d energé t ica acoplante de l a Fern-

brana mitocondiral son llamadas f a c t o r e s acoplantes (601.

,

I

c

I C

i -

c

L_

Los compleSos de ATPasa translocadores de Hf de bacter ias, mitocondrias

y c loroplastos t ienen estructuras muy sirni lores. Son enzimas unidas a membra-

nas compuestas de un sector membranal Fo, con una porción extramembranal adhe-

r ida, F1. Bajo condiciones

f i s io lóg icas encadena e l gradiente de protones a t ravés de l a membrana con l a

formación de ATP a p a r t i r de ADP y P i (55). F1 contiene s i t i o s c a k a l í t i c o s v

reguladores que unen ATP y ADP (31).

Fo contiene un canal transmembranal de protones.

1

- En todas l a s especies examinadas, F1 con-

!

t i e n e 5 pol ipéptidos diferentes;d,,+,a, 6 , E , en orden -decreciente de pes.0 mo-

lecu la r . La estequiometría posible es de 3 d : 34 :16 :la :l.c.

La f racc ión Fo está compuesta por 3 ppl ipéptidos: I , I I y 111.. E l p o l i -

péptido 111 ex is te como un hexámero.

t i d i n a y se une a DCCD con pérdida de l a habi l idad para acarrear protones.

Las ot ras dos subunidades están involucradas en l a unión F en su or ientac ión

correcta a l a membrana ( f i g . 8.1)

Típicamente no contiene tr'iptofano o h i s -

1'

LOS valores reportados d e . l o s pesos moleculares de l a f racc ión F' p u r i f i - 1 cada de membranas bacter ianas caen en un rango de 250 x 19 3 a 400 x 10 3 . Los

de E c o l i están en los 1 ,A- pesos.mo1eculares'de l a s subunidades de l a f racc ión F

s iguientes rangos: (18)

3 subunidad r~ : 54 x lo3 - 60 x 10

fi : 52 lo3 - 56 lo3 a : 32 lo3 - 35 lo3 5: 21 l o3

3 3 L : 11 x 10 - 13 x 10

ATPasa de Na' y K'

La mayoría de las cé lu las ariiniales contienen un sistema d~ transporte ho-' I

i t mcelu . la r , que ocurre a t ravés de l a membrana c e l u l a r . para extraer No

el medio y mantener un,a concentración i n t r a c e l u l a r de Y, a l t a . is t .e es un t i-

po de transporte a c t i v o que u t i l i z a energía metabólica. Hay evidencia que su-

g iere que esta bomba de Na y K es también esencia l para l a operación de bom-

hacia t

+ t

! x-.

! I .-

r I_

1 - REPRESENTACION ESQUEMAT~CA DEL COMPLEJO

ATPasa de Ht (ESTRUCTURA MINIMA,GASADA EN KAGAWA (1978) ) ,

i -

r-

._

, ..-

..- , P

..- -

.-

, .-

I -

, $ &

i c

I C !

! ¿ !

I r- i ¿

bas de olucosa y aminoácidos.

La mayoría de l a s cé lu las animales mantienen e l potasio i n t r a c e l u l a r a una

Concentración a l t a y constante, entre 120 y 160mM, mientras que l a concentración

de sodio i n t r a c e l u l a r es usualmente más baja, menos de 10 mM. Un oradiente ver-

dadero de iones sodio y potasio ex i s te a t ravés de l a membrana c e l u l a r , ya que

e l f l u i d o ex t r ace lu l a r de los mamíferos contiene una concentrac i th relat ivamente .

a l t a de sodio, acerca de 150 mM, v una concentración de potasio muy baja, comun-

m n t e menor a 4 nil!.

L

--r

La constancia de l a concentración de iones potasio interna

es mantenida por l a extrrisión de sodio, que requiere energia, afuera de l a cé-

l u l a y por e l reemplazo por iones potasio promovido por un sistema de transporte

act ivo que es l a ATPasa de Na' y K t (43).

Concentraciones relat ivamente a l t a s de potasio interno se requieren para

var ios procesos v i t a l e s en l a economía o función interna de cé lu las animales.

Una es l a b ios ín tes i s por ribosomas, ot ra es que var ias enzinias requieren potasio

para su ac t i v idad máxima como l a piruvato cinasa que requiere de estí! ion Dara

su ac t i v idad máxima en l a secuencia g l u c o l í t i c a .

También están involucrados oradientes de iones sodio y potasio a t ravés de

l a membrana c e l u l a r para 'mantener e l potencial de membrana en te j idos exci tables

en l a propagación del impulso nervioso, l a rea.bsorciÓn de solutos por el rifión y

l a toma de nutr ientes por e l in test ino, entre otros (27) .

En l o s 1950's se.prov6 que el ATP proveía a este transporte de l a eneraía

necesaria en e i r t r o c i t o s h.umanos , l isados y resel lados ( f an tamas ) .y en axon q i -

gante.de calamar.

transporte act ivo , pero no l o hace cuando se encuentra só lo en e l exter ior . E l

glucósido cardiac0 , ouabaína, inhibe e l transporte ac t i vo completamente, mientras

que no t i ene efecto en e l transporte pasivo de sodio hacia e l ex te r io r y de oota-

si0 hacia e l i n t e r i o r , o en e l transporte de c a l c i o fuera de l a cé lu la . La O L I O -

E l AT'P cuando se encuentra de,ntt-o de ? a cé lu la , sost iene a l

I

baína inhibe ea transporte sólo cuando está en e l exter ior de l a cé lu la . Todo

Y 4;:

30

ind ica que e l sistema de transporte está embebido en l a membrana, puede un i r

ATP en e l i n t e r i o r d e . l a cé lu la y un inh ib idor especí f ico en e l exter ior . +

La caracter izac ión cuant i t a t i va más elegante del transporte a c t i v o de Na t

y K . f u e hecha con fantasmas de e r i t roc i tos . , E l transporte a c t i v o de cualquie-

r a de l o s dos iones requiere de l a presencia.de1 ot ro ion en e l l ado opuesto

de l a membrana. . E l rad io de transporte de Na a K está completamente acopla- c t + -T.

do, 3 iones sodio fuera por dos iones potasio adentro. Concentraciones a l t a s de

sodio en el ex te r io r y potasio en e l i n t e r i o r pueden manejar a l a bomba hacia

a t rás y causar l a . s í n t e s i s de ATP a p a r t i r de ADP y P i , igual como parece que

en l a membrana de mitocondrias u cloroplastós, un gradiente electroquímico de

H , l l e v a a l a ' s i n t e s i s de ATP. t

+ La ATPasa de Na+ y K ha si.do pur i f i cada de var ias c lases de te j ido , y en

todos l o s casos se ha encontrado que contiene dos t inos d i ferentes de subunidades

prote icas. La subunidad más grande, llamada , t i ene un peso molecular de

aproximadamente 95,000 daltons.

ATP, como se demostró'por su unión con e l grupo tern.inal fosfato, marcado radio-

ConFiene e l s i t i o a c t i v o para l'a h i d r á l i s i s de

activamente de l a molécula de ATP.

de unión para ouabaína (43). Ya que el ATP y l a ouabaína actuán desde lados

.opuestos de l a membrana, se puede conc lu i r que l a subunidad

na completamente.

Es ta subunidad también contiene e l s i t i o

a t rav iesa l a rnernbra-

La subunidad más pequeña, l l a m a d a a , t i e n e un peso molecular de aproxima-

damente 40,000 daltons y es una glucoproteina. Es posible c rear anticuerpos

en contra de l a s dos subunidades que inhiben l a act i .v idad enziniática pero l a

función bioquimica de l a subunidadp todavía no se conoce ( f i g . 8.2) .

Estudi0.s bioquimicos de enlaces cruzados nos dicen algo acerca de l a es-

tructura d e . l a enzima. Un enlace covalente entre subunidades adyacentes se

puede formar por reacción de l a enzima con imidoesteres, aflentes que reaccio-

nan con residuos de l i s i n a . Estos enlazan cruzadamente una subunidadecon una p .

,- !

! ? , ,

i ,- I-

,-

, c

L

P L.

F-

I I + - 5

bi

i FIG. 8.2 MODELOS DE LA ESTRUCTURA DE LA ATPasa DE rlat Y Kt. a ) FUVCIBN IN- DEPENDIENTE DE LA UNIDAD CON PASO DE CATIONES A TRAVES DE LA ES-

TRUCTURA DE LA SUBUNIDAD (36). b) REDIBUJADO DE I M L L I K et al ( 8 2 )

PARA ILUSTRAR.LA ESTRUCTURA OLIGOMERICA ( )2

32

tt L o - f e n a n t r o l i n a cúpr ica (Cu ) c a t a l i z a e l en lace cruzado de l a s dos

2ubunidades-C oxidando grupos s u l f h i d r i l o adyacentes a un enlace d i s ú l f i d o .

Un modelo a t r a c t i v o para l a e s t r u c t u r a es e n t o n c e s p - ; P , en e l cual l a enz i -

m t e n d r í a mitades s i m é t r i c a .

l o s modelos c i n é t i c o s d e t a l l a d o s para l a acción de l a enzima y con L l a medida

estequiométr ica de l a unión de ouabaína y ATP pero todavía e s t á abAerto a de-

Este modelo e s t á de acuerdo con alounos de

ba te . Puede s e r pos ib le que l a verdadera e s t r u c t u r a seaf,xp,(27).

ATPasa de Cat'

En l a r e l a j a c i ó n de un músculo e s q u e l é t i c o , cuando e l impulso nervioso

de un nervio motor cesa y regresa a su es tado polar izado o r i q i n a l , e l ex te -

r i o r de l a membrana c e l u l a r e s cerca de 60mV más p o s i t i v o que e1 i n t e r i o r .

Similarmente, l a membrana del r e t í c u l o sarcoplásmico regresa a su estado o r ?

q i n a l . El c a l c i o presente en el sarcoplasma es ahora t ranspor tado , en u n

proceso que r e q u i e r e e n e r g í a , a t r a v é s de l a membrana a l a s c i s t e r n a s del

r e t í c u l o sarcoplásmico, para que l a concentración de iones c a l c i o sea l l e v a -

da a su concentración baja de descanso. El t r a n s p o r t e a c t i v o de C a t + del

sarcoplasma a i r e t í c u l o sarcoplásmico ha s i d o es tudiado directamente por m e - todos bioquímicos. ~ Cuando e l r.Úsculo e s q u e l é t i c o es homogeneizado, el r e t í -

cu lo sarcoplásmico s e fragmenta en pequeñas ves ícu las c e r r a d a s , que pueden

s e r a i s l a d a s fác i lmente por. c e n t r i f u a a c i ó n d i f e r e n c i a l como l a f r a c c i h micro-

somal.

Se ha encontrado que l a s suspensiones de e s t a s ves ícu las acumular iones

c a l c i o rápidamente en presencia de un exceso de ATp y u n anión como e l fos-

! f a t o p o r . l a acción de una bomba de ATP dependiente de iones c a l c i o .

Por cada molécula de ATP h idro l izada a A D P + P i , dos iones c a l c i o son I acumulados en l a vpsícula .junto con e l fo s fa to . Estas preparaciones son c a - I

paces de r e m v e r iones c a l c i o del media a una concentración niás baja que - 0.1 micromolar. La ATPasa de Ca ha s i d o e x t r a í d a del r e t í c u l o sarcoplásmi- tt

33

co y obtenida en forma pura soluble.

mente 100,000 y const i tuye una f racc ión grande de l a proteína t o t a l de l a

membrana. La molécula de ATPasa se f o s f o r i l a durante l a h i d r ó l i s i s de ATP

estimulada por Ca . (43).

Tiene un peso molecular de aproximada-

tt

c

AMINOACIDOS DE LAS SUBUNIDADES 1

ATPasa de Ht

La proteína que une OCCD es l a Única proteína del complejo ATPasa que

ha s i d o , secuenciada hasta ahora. Su composición de aminoácidos es 1imit.a-

da ,no contiene h i s t i d i n a .y t r ip tofano y hay una. homología c l a ra entre p ro te í-

nas análogas de S. cerev i s i ae .y -- N. crassa.

fuentes vegetales, de bacter ias y mamiferos han sido también secuenciadas y

m e s t r a n c a r a c t e r í s t i c a s de fuer te homología ( 30). ( F i g . 5.3)

Prote ínas que se unen a DCCD de

ATPasa de Nat y Kt

En l a tab la 8.2 l o s residuos de aminoacidos de l a s subunidades d y -p están agrupados en t r e s grupos de acuerdo a ' l a s propiedades de sus cadenas

l a t e r a l e s . Los residuos con cadenas l a t e r a l e s aromáticas contribuyen a l a

hidrofobicidad cuando l a magnitud de energía l i b r e de formación de una i n t e r -

fase con agua crece con e l tamaño de l a cadena l a t e r a l . Estos residuos se

encuentran dentro de l a proteína o e.n ' l a bicapa l i í d i c a .

resid.uos de t r ip tofano están en ' la bicapa como en l a ATPasa de C a t t donde

18 Ó 19 tr iptofanos están en los segmentos no secuenciados hidrofóbicos.

Las cadenas l a t e r a l e s hidrofóbicas forman e l 457 en l a subunidad oc

La mayoría de los

y e l 42% en l a subunidad p .

por e s t a r dentro o fuera del comparimento acuoso.

l a secuencia de l a subunidad <se conoce. La secuencia terminal N de l a -

La alanina y prol ina t ienen poca preferencia

Sólo una pequeña parte de

34

. f Tyr-Ile-Gly-Ala-

Asn-Leu-Gly-Met-

10

20 30

40 50

la - I le -Leu - Gly-Phe-Ala Leu-Ser

la-I le-Leu-GlpPhe-Ala __ ' 70 * 60

a-Lys- 80

Fig .8 .3 Estructuras pr imar ias de l a s p ro te ínas que se unen a DCCO de

S. c e r e v i s i a e (secuencia s u p e r i o r ) y N. Crassa - (secuencia in-

f e r i o r ) (30) * s i t i o de unión a DCCO

L

i

r

35

s u b u n i d a d d e s : NH~-Gly-Arg-Acn-Lys-Tyr-Glu-Pro-Ala-Ala-Ser-Glu-, y l a t e r -

minal carboxi es Ser-Thr-Tyr-COOH. La secuencia a l rededor del s i t i o de fos-

f o r i l a c i ó n de l a subunidad 4 e s (Thr o Ser)-Asp(F)-Lys con una c i s t e í n a acer -

ca de 4 res iduos del res iduo f o s f o a s p á r t i c o en e l lado amino te rmina l . La

misma secuencia se encuentra a l rededor de u n f o s f a t o a s p a r t i l en l a 4TPasa

de Cat+ del r e t í c u l o sarcoplásmico. c - --c

En l a subunidad p l a secuencia del amino terminal e s : NH2- Ala-Gly-

Trp-Al a-Lys-G1 u-G1 u-Gly (36 ) .

H E T E R O G E N E ~ D A D E N LAS SUBUNIDADES. PROTEICAS:

Se ha ido acumulando evidencia para d i f e r e n c i a s e s t r u c t u r a l e s menores

e n t r e s u b u n i d a d e s d y p de d i f e r e n t e s c é l u j a s y Órganos y también para d i -

f e r e n c i a s en e s t r u c t u r a s de s u b u n i d a d e s a en una misma pereparación. Feque-

La subunidad 4 de ñas var iac iones en pesos moleculares se han observado.

l a glándula- r e c t a l de t iburón t i e n e u n .peso molecular mayor que l a s suhuni-

d a d e s d d e l órgano e l é c t r i c o . d e angula , r iñón de perro y de camarón.

El contenido de carbohidra tos es mayor en l a subunidad < d e l a ATPasa

de Na y K de riñón que l a subunidad PC del Órgano e l é c t r i c o de angu i l a . + t

Han s i d o observadas d i f e r e n c i a s en l a secuencia de aminoácidos. E l ami-

no terminal de l a s u b w i d a d d es g l i c i n a para r iñón , a lanina para aláiidula

r ec t a l y s e r i n a para e l órgano e l é c t r i c o .

El amino terminal de l a subunidad p es a lan ina en l a s t r e s e spec ie s .

En el t e j i d o c e r e b r a l e s t á n presentes dos formas moleculares de subunidades

oc de l a ATPasa de Na

a ouabaína y en l a e s t r u c t u r a de l a subunidad DC. Una forma t i ene l a misma

s e n s i b i l i d a d por ouabaína

músculo e s q u l é t i c o y riñón.

t y K'. Las dos formas d i f i e r e n en su s e n s i b i l i d a d

5 x 10-4M) que e l mUsculo card iac0 de r a t o ,

a c é l d l a s g l i a , ya que es ob- Está re lacionada

tenida de a s t r o c i t o s en c u l t i v o s c e l u l a r e s primarios de cerebro de ra ta neo-

36

TABLA 8.2

COMPOSICION DE LAS SUBUNIDADES DE LA ATPasa DE Na' Y Kt DE LA MEDULA RENAL

EXTERIOR DE PERRO (36).

Cadenas 1,ateral es hidrofó- bicas

Triptofano Fen i 1 a 1 an i na Tirosina Leucina Val ina Metionina Isoleucina Pro1 ina A l ani na

Cadenas l a t e r a l e s h i d r o f í - l i c a s neutras

Treonina Serina C i s t eí na G1 i c i n a

Cadenas l a t e r a l e s ión icas

Acido aspárt ico Acido glutámico Arg i n i na L i s i na Hi st i d i na

Carbohi dratos

Nac-G1 ucosami na Nac-galactosamina k n o s a Galactosa G1 ucosa Fucosa k i d o s i á l i c o

15 38 22 89 64 22 62 44 79

58 69

9 77

101 100 45 54 18

3 10 9

4

8 18 16 24 19 7

17 19 14.

14 22 2 33

33 39 16 33 2

36 3 9

20 3

13

3 7

nata. La otra forma está localizada en el axolema de nervios niielinizados.

Es más sensible a la ouabaína

mayor peso molecular, llama'da 4 - t , que es más larga flue oc por unos 20

residuos de aminoácidos. Los enlaces sensibles a tripsina parecen estar más

protegidos e n d + y los grupos sulfhidrilo más expuestos en &+que en oc .

M) y contiene una subunidad oc de

- Se ha propuesto que los residuos

a estructuras en la oosición del

extra en d + sirven para anclar l a bomba nodo de Ranvier.

BIOSINTESIS DEL COMPLEJO ATPasa

ATPasa de Na' y K'

La biosíntesis de subunidades ha sido estudiada en cultivo de celulas

epiteliales de riñón de perro de la línea MDCK y en sistemas de células l i -

bres. Las células crecen en monocapas y exhiben tin transporte transcelular. 35 Después de marcarlos con (~ S) .metionina las subunidades se aislan por inmuno-

precipitación con anticuerpos purificados de afinidad por las subunidades de

la ATPasa de Na' y.K'. La subunidad ,6 no glucosilada es detectada como

una cadena con un peso molecular de 38,000 en células tratadas con tunicami-

cina que bloquea

la glucosilación en el retículo endoplásmico la masa mol.ecular de la suhuni-

dad ,6 alcanza 45,00@ daltons. Esta forma inmadura atraviesa el Colni donde

una segunda etapa de glucosilación incrementa la masa molecular a aproximada-

mente 60,070 daltons en un paso sensible a monensina.

la glucosilación en el retículo endoplásmico. Des~iiés de

La subunidad& parece ser sintetizada en polisoilias libres y descargada

al citoplasma antes de ser insertada en la membrana plasmática. La subunidad

d marcada con 35S puede ser aislada del cultivo MDCK. In vitro, la IqG

anti subunidad OC precipita a los péptidos marcados con 35S o112 son sintetiza-

dos por polisomas libres pero no por polisomas unidos, pero la traducción ',!- vitro es.incompleta con una masa más pequeña del producto (@5,000 daltons)

que la obtenida en síntesis celular.

La interacción entre la subunidadp en la membrana y la subunidad x eii

el citoplasma puede ser un evento importante en la inserción post-traduccional

en el retículo endoplásmico.

Wickner (82) formuló la hipótesis en que la membrana es la que dispara c - para explicar la inserción post-traduccional. -

La proteína después de su síntesis se dobla en una forma compatible con

el medio acuoso en el citoplasma. El redoblamiento de la proteína es dispara'-

do al encuentro con la membrana blanco tal que las segmentos hidrofCbicos es-

tén expuestos, permitiendo así la penetracikn de la proteína a la 'bicapa.

La hipótesis de la señal clásica no puede asegurar la disoosición de

las proteínas que cruzan la membrana. más de una vez y que tienen el amino ter-

minal expuesto a la superficie citoplasmática.

inserción post-traduccional .está de acuerdo con la .observación de oge la siibu-

nidad d. posee varios seamentos transmembranales y que expone su avino terminal

a la superficie de la membrana citoplasmática.

El esquema propuesto para la

Otro esquema atractivo es el que Propone un papel como señal de recepción

y de referencia, a 1a.subunidad $3 inactiva para la orientación asiv6trica co-

rrecta de la subunidad 4 en la membrana.

ATPasa de Cat' t t El mecanismo propuesto para la biosintesis de la ATPasa de Na y K es

completamente diferente al de la proteían en el retículo sarcoplásmico, la

ATPasa de Cat'.

señal. La ATPasa de Ca es insertada primero a la membrana del retículo en-

doplásmico rugoso antes de ser transferida al retículo sarcoplásmico. Sabatini.

et -- al. (68) han desarrollado una hipótesis general para el mecanismo de inser-

ción cotraduccional de proteínas, como la ATPasa de Cat+, COI: más de tin entre-

cruzamiento de membrana y con el amino termianl exouesto a l a superficie ci-,

Esta proteína es sintetizada en polisomas adheridos sin una tt

I

39

toplilsmáti ca.

LA INTERFASE LIPOPROTEICA Y SU INTERACCION CON DIFERENTES ATPasas

La función más importante de l a s membranas es l a formación de un compar-

t imiento. Las membranas permiten a l a cé lu la l a retención de iones, coenri-

mas, enzimas y otros ingredientes esencia les para l a v ida.

e l transcurso de l a evolución adquir ieron canales y acarreadores ?e permi-

t i e ron l a comunicación entre l a c é l u l a y e l medio.

Las rfmbranas en

La estructura primaria de l a membrana es una bicapa fos fo l ip íd i ca . Es-

t a estructura va de acuerdo con l a s funciones primarias de l a membrana. Las I I

asociaciones entre l o s componentes de l a membrana var ían arandemente. Algu- ! nos compuestos prote icos son muy hidrofóbicos y s o n , d i f i c i l e s de d i soc ia r de

ot ros componentes. Como reg la , l o s componentes hidrofóbicos están l o c a l i za-

dos en e l centro y l o s h i d r o f í l i c o s perifér icamente.

Dentro de l o s fosfol ip idos podemos d i ferenc iar entre co.mponentes per i f é-

r i c o s que son accesibles a l a acción de fosfol ipasac solubles en anua v l í -

pidos internos que.no l o son(60).

tt t$ ATPasa

En 1977, E.M. Bevers e_' (8) t ra taron membranas de Acholeplasma l a i d l a w i i __

B con fosfoZipasa A2 de páncreas de cerdo y fosfo l ipasa C de B a c i l l u s ce-

P~US para h i d r o l i z a r completamente e l fos fa t id i lg l i c e r o l .

._ ~ _ _ _ - ,

E l 90% del fos fa t i ' d i lq l i ce ro l puede se r h idro l izado con focfo l ipasas

y C, s i n perder l a activida.d de l a ATPasa dependiente de Mg, pero l'a hidró-

l i s i s del 10% de f o s f a t i d i l g l i c e r o l res tante reduce fuertemente l a a c t i v i -

dad de ésta ATPasa.

.Al incubar la preparación con fosfol ipasa, l a disminución de la ATPasa

es muy l en ta y ocurre sólo cuando l a mayoria del f o s f a t i d i l g l i c e r o l ha sido

hidrol izado. Se han dado dos expl icaciones a esta inact ivac ión l en ta . U i a

.

peq.ueña cantidad de f o s f a t i d i l g l i c e r o l es necesaria para mantener l a conf i-

guración a c t i v a de l a ATPasa de Mp

punto por l a proteína en contra del ataque de l a fosfo l ipasa .

bación prolongada con fosfol ipasa puede h i d r o l i z a r tambi6n este f o s f a t i d i l -

g l i c e r o l con una pérdida correspondiente de l a ac t iv idad enzimática.

b io conformacional resu l tante de l a proteína puede se r r e v e r s i b l i aiiadiendo

f o s f a t i d i l g l i c e r o l a l sistema. Otra expl icac ión puede se r que é c t z sea r e -

querido para l a estabi. l idad de l a ATPasa de figtt pero no está protegida por

l a prote ína. As í , todo e l f o s f a t i d i l g l i c e r o l puede se r h idrol izado, pero

ya que e l l í p i d o no está involucrado directamente en l a h i d r ó l i s i s del ATP,

l a enzima guarda su ac t i v idad i n i c i a l completamente.

tt y es proteaida a l a vez hasta, ciert.0

Sólo l a incu-

E l can-

6

AtPdsa de Na' y Kt

Varios segmentos transmembranales ident i f i cados en l a subunidad -.y tani-

bién en l a p pueden atravesar l a bicapa, pera n i e l aspecto est ructura l n i

el funcional de l a s asociaciones l ipoprote icas de l a s proteínas de l a bomba

están bien elucidadas. t t

La ac t i v i dad de l a ATPasa de, Na y K posee requerimientos más complejos

de l a fase l i p i d i c a que l a s reacciones parc ia les : unión de ATP, fosfor i lac ión,

fosfatasa de potasio y unión de auabaína, La proteína s i n l í p i d o s es capaz de

u n l r ATP con p a r i af in idad, e l i on potasio se une a l a enzima uerc no t i ene ya

ningún efecto 'en l a a f in idad por ATP, sugiriendo que no puede haber cambios

conformaciona1,es para e l funcionamiento de l a prote ína. ! La readic ión de l i p i d 0

restaura e l antagonismo del nucleót ico y K' y l a ac t i v idad de l a ATPasa de 1

. . t t Na y K . Así. l a función de s i t i o s para l a unión de nuc leót idos 'y cat iones

puede s e r independiente de 1 ípidos, mientras que e l rearreg lo conformacional

de la proteína requiere de l a asociac ión con los l í p i d o s .

T i tu lac iones deta l ladas de enzima s i n l íp idos , muestran que se necesita

n 6 s ' l í p i d o para ? a generación de l a ac t i v idad de l a ATPasa que para l a a c t i -

41

vidad de f o s f a t a s a del ion potas io .

La a c t i v i d a d de l a ATPasa de Na t t y K no puede s e r sos ten ida después

del reemplazo de f o s f o l i p i d o s con o t r o s a n f i f i l o s como se ha demostrado para

l a ATPasa de Ca La conversión enzimstica de f o s f o l i p i d o en l a enzima em-

,bebida en l a membrana s u g i e r e que l a ATPa,sa de Na

f o s f o l i p i d o s cargad0.s negativamente pero a una a c t i v i d a d moleculaEreducida.

tt ,

t t ¡ y K puede funcionar sin

t t 1' La ATPasa de Na y K unida a membrana cont iene l í p i d o s en exceso de l o s

La composición f o s f o l i p í d i c a .se parece a l a requeridos para su a c t i v i d a d .

de l a membrana plasmática con 9.77 mg de f o s f o l í p i d o y 0.23 mg de c o l e s t e r o l

por mg de pro te ína .

121 son neutros y 28 son ác idos .

Hay 149 moles de f o s f o l í p i d o por unidad-p de l a cual

Los l i p j d o s i n t e r f á s i c o s muestran energ ías de in te racc ión baj.as con l a .

P a r t e de l a a t r a c c i ó n es explicada por in te racc iones de carga en- pro te ína .

t r e pro te ína y grupos polares . La proteína inf luenc ía l a composición l i p í d i -

ca en l a i n t e r f a s e l levando a una inmovilización preferenc ia l de l a s espec ies

cargadas negativamente.

Al te rac iones del es tado f í s i c o de l a porción a p o l a r de l a bicapa con

temperatura , contenido de cole .s tero1, l o n g i t u d de l a cadena .y grado de insa tu- ,

ración pueden a f e c t a r l a a c t i v i d a d de l a ATPasa de Na y K.. t t

Una h i p ó t e s i s a t r ac t . i va e s que l a s funciones c a t a l í t i c a s y l a s . t r a n s i c i o -

nes en t a s a s a l t a s e n t r e l a s conformaciones de l a ATPasa de Na y .K requieren

l íp idos que pueden

hidrofóbica de l a pro te ian que e s t á hacia el fondo de l a bicapa y .también pue-

de . reacc ionar con cadenas l a t e r a l e s caroadas de l a prote.ina a u n nivel de lo s

grupos polares de l o s l í p i d o s . ( 36)

t t

ser proporcionales a l a s dimensiooes. de una . s u p e r f i c i e

! 1

La función de l a ATPasa de Ygtt en A. l a i d l a w i i \\odavia no es bien en-

tendida pero su dependencia en ácidos f o s f o l i p í d i c o s y su d i s p o c i c i h en l a

mombrana indican una semejanza con l a ATPasa de Va y K y l a PITPasa del r e -

t í c u l o sarcopIásmico(8) .

t t

, . , . . , , . , . . . . 42

Warren e t a l (79) mostraron que l a ATPasa del r e t í c u l o sarcoplásmico

re t iene su ac t i v idad máxima hasta que quean 130 moléciilas de fosfo l íp ido por

mlécu la . de ATPasa.

flECANISM0 DE LAS ATPasas

¿CANAL O ACARREADOR? L

--* ATPasa de Ht

Todas l a s membranas de bacter ias, mitocondrias, y c loroplastos t ienen

un posible canal de protones sens i t i vo a DCCD. La proteína es pequeña y a l -

tamente hidrofóbica, es extra ída en cloroformo-metano1 y t i e n e una corrposi-

ciÓn de aminoácidos pr imi t i va , típicamente no contiene h i s t i d i n a n i t r i p t o -

fano.

hidrofóbicos predominan y existen grupos ácidos que parece se r q?ie acarrean

a l o s protones.

estos grupos y previene l a t ransferencia de H

En l a secuencia de esta proteína de Neurospora -__ crassa l o s residuos

La DCCD, e l e c t r ó f i l a e hidrofóbica, reacciona con uno de t

a través de l a proteína (32).

Existen t r e s modelos para e l mecanismo de acción de l a bomba de proto-

nes, i lus t rados en l a f igura 8.4 (60).

E l primero, basado en l a teor ía quimiosmótica de M i t c h e l l , invoca un

f l u j o de protones v í a Fo y una interacc ión d i recta entre e l fos fa to y e l f l u -

jo de protones con un ataque concertado en el ADP. Los otros dos mecanismos

son ind i rectos , requieren que e l f l u j o de protones de lugar a iun cambio con-

formational en l a proteína. E l segundo mecanismo prooone que l a l i be rac ión

de ATP es resul tado de un cambio canformacional. En el tercero el cambio con-

formational da lugar a cambios químicos en e l s i t i o act ivo y permite l a i n -

teracc i6n de P i con e l residuo a s p a r t i l para formar un intermediario foriiado

por proteína l igada a un a c i l f o s f a t o .

- ATPasa de Nat y Kf y ATPasa de Ca"

Se han hecho estudios en membrana con éstas dos ATPasas y se han l legado

e

DI RECTA (QU IM IOSMOTI CA)

' c I - 2. INDIRECTA c

a ) VIA UN INTERMEDIARIO flUIMICO l - I -

b) VIA LIBERACION DE ATP FIRMEMENTE UNIDO

j- 4TF

FIG. 8.4. TRES MECANISMOS DE FORMACION DE ATP. ACTIVACION DEL GRUPO CARBOXILO POR MEDIO DE UN CAYBIO CONFO9MACIONAL

DE LA PROTEINA. EN 2 b) EL CAMBIO CONFORYACTC4AL i7FSUI.TA DE LA LIRE RACION DE ATP DE LA PROTEINA

EN 2 a ) EL ASTERISCO INDICA U'JA

__ (60).

c

L

43

a formular mecanismos igua les para ambas.

E l primer mecanismo . involucra l a formación de un intermediario químico

& ' l a knzima y está basado en evidencia experimental con l o s dos t ipos de

ATPasas. Evidencia de l a formación de una fosfoenzima como intermediario ha

sido obtenida de estudios de intercambio de ADP y ATP.

Cat'

luego desnaturalizada, se puede detectar una fosfoenzima con propiedades ca-

r a c t e r í s t i c a s de un grupo a c i l o . Un residuo a s p a r t i l o de l a proteina ha s i-

do ident i f i cado como e l que l l e v a a l grupo fos for i lo .

Cuando la,-ATPasa de L

Y t o l a de Na- y K es incubada can ATP además de un cat ión aprggiado'y

Es te modelo propone que l o s iones cruzan l a membrana por interacc iones

h i d r o f l l i c a s con residiios cargados en l a s in ter fases de una o más subunida-

des proteicas. en l a membrana ( f i g . 8.5).

La energía de h i d r ó l i s i s de ATP l l e v a a un transporte ac t i vo causando

cambibs conformacionales e n l a enzima. La enzima se f o s f o r i l a covalentemen-

te por ( 8 P ) s i están presentes iones sodio, s i se añaden iones de notasio,

e l fosfato unido covalentemente s e descarga. E s t e comportamiento sugiere que

l a reacción de transporte consiste en un proceso c í c l i c o : E l sodio se une,

causando una fos for i l ac ión de l a enzima y un cambio conformacional uara que e l

sodio sea movido a l lado opuesto de l a membrana, después se une e l potasio

que es movido a l otro lado a l mismo tiempo que e l intermediario fosfor i lado se

h idro l iza y 1a.conformación regresa a l a i n i c i a l - (27 ) ( f ig . 8.6)

0tro.modelo s,ugiere que l o s iones Na y Kt o l o s de Ca

32

t tt crucen l a meni-

brana a t ravés .de un canal acuoso o compartimento formado por proteína en e l

i n t e r i o r hidrofóbico de l a membrana.

EVOLUCION DEL FRAGMENTO F1 DE LA ATPasa de Ht

Un canal de protones evolucionó antes que e l fragmento F1 de l a ATPasa.

Es te ú1 timo, supuestamente, evo1 ucionó

c ienc ia del canal para mover protones.

como una bomba, incrementando l a e f i -

Esta evolución puede es ta r re f le jada

f 1

43 b

FIG. 8.6. CAMBIOS CONFORMACIONALES

D E N a t Y K'. (27).

LICOS PA.RA L TRANSPORTE P C T I V O

L

en l a posic ión " s u p e r f i c i a l " de F1 en re lac ión con l a membrana.

Así como l a sens ib i l idad a DCCD es Uha c a r a c t e r í s t i c a común a todas l a s

ATPasas con canales de protones, l a sens ib i l i dad a 4-cloro 7 nitrobenzofura-

zano (Nbf-Ci) es común a todos los fragmentos F1 de l a s ATPasas desde-Ciiz-

tr iduim spp. hasta mitoccndrias.

La estructura de l a subunidad F1 de mitocondriac y c loroplastos es muy

s imi lar , s i no idént ica .

de re lac iona con supuestos ancestros mitocondriales (R. rubrum) y 'ancestros

de c loroplástos (c ianobacte~r ias) a un ancestro común par,a l o s dos. Otras bac-

. t e r i a s diversas, - E. c o l i ( 4 ) , S. f aeca l i s , H. phle i , muestran ATPasas s imi la-

pes.

Entonces podemos t razar a esta e s t r u c t u r T a través

La subunidad F1 fue f i j a d a muy temprano en l a evolución (30). . .

Estudios de l a s secuencias de aminoácidos y de DNA en E. c o l i - y de

te ínas cons t i tu t i vas del complejo bovino muestran que di ferentes partes del

complejo han evolucionado a velocidades d i ferentes .

que contienen s i t i o s reguladores y catalizadores,, respectivamente, se Iian con-

servado mucho más entre mitocondrias bovinas y E. c o l i que l a s proteínas de

mombrana de l a subunidad Fo. Parece s e r que l a s subunidades estuvieron sujetas

a d i ferentes proce,sos de.ev.oluciÓn. En e l caso de l a s proteinas de membrana,

parece ser que l a se lecc ión opera predominantemente en l a hidrofobicidad de

l a secuencia (aunque gru.pos funcionales involucrados directamente en . l a .c.on-

ducción de protones se ha conservado).

pro-

Las subunidades oi y p

Las secuencias de l a s proteínas A y p de E. c o l i -_ t ienen ot ra ca rac te r i s-

t i c a importante; sus s'ecuencias están relacionadas y han evolucionado de un

ancestro común. debe haber,

ocurrido hace más de 1.2 x 10 años, antes de que aparecieran l o s eucar iotes.

La dupl icación genetica que da lugar a e l l a s ,

9 , .

Una importante implicación de esta homología es

nera s imi l a r . Aunque t ienen diferentes papeles

parece e s t a r relacionada con l a propiedad común

c lus ión está basada en e l descubrimiento de que

que-ypse doblan de una nia-

en l a c a t á l i s i s l a homología

de un i r ADP y ATP. Es ta coil-

l a s secuencias-ypcontienen

4 5

secuencias s igni f icat ivamente s imi lares a o t ras enzimas que unen ADP y ATP,

notablemente entre e l l a s están l a ATPasa de Ca , miosina, fosfofructocinasa y tt

adeni 1 atocinasa (78).

La función de subunidades adic ionales en complejos ATPasa 'super iores ' es

desconocida.

ATPasa de un papel h i d r o l í t i c o a uno de s í n t e s i s ,s iguiendo e l d e s c o l l o de

otras b,ombas de protones oxidat ivas o funcionales con l a luz . (Ver f io . 8 .7 )

Se puede suger i r que fueron requeridas para l a conversión de l a c

I. DISCUCION Y CONCLUSIONES.

En l a s dos décadas, desde que Peter M i t che l l formuló su teor ía nuimios-

Fn e l mÓtica, l o s pr inc ip ios básicos han rec ib ido mucho apoyo exnerimental.

caso de !as bacter ias, hemos sabido Dor algún tiempo que l a cadena resp i ra to-

r i a y el aparato fo tos in té t i co transportan protones hacia afuera a t ravés de

l a membrana plasmática, aenerando un gradiente de potencial electroquímico, y

que l a c i r cu lac ión de protones a t ravés de l a membrana da el poder para l a s.ín-

t e s i s de ATP, l a acumulación de muchos iones y metabolitos, l a rotac ión de f l a -

gelos y ot ras funciones importantes.

t ravés de l a membrana plasmática de cé lu las eucar iót icas , con ATPasas e lec t ro-

génicas como l a fuente de. corr iente . Los protones l l e v a n l a cor r i en te en hon-

gos, a lgas ,y cé lu las vepetales, mient,iqas que en cé lu las animales l a ATPasa

de Na

l a función pr inc ipa l de l a cor r i en te de iones en cél i i las euca i i6 t icas y proca-

r i ó t i c a s , a s í ambas han desarrol lado sistemas s imi lares para l l .evar a cabo es-

Corrientes de iones análorias ocui-ron a

t t y K+ l l e v a a cabo l a c i r cu lac ión de Na . La a'curulación de solutos es

I ta función.

E l origen de l a s ATPasas y su re lac ión entre c loroplastos, mitocondrias y i procariotes está basado' implícitamente en el modelo de Maroulis y en e l de Raven

46

fosfo l íp idoe

ácidos nucle icos

proteinoides

ATP

censibi l idarl i nh i - bidores en la l i n e a m i tocondrial

Células

Canales iónicos -- a

__ t t

Na /H ionóforo(? ) Canal de Ht I L m O

N 3

- A * I I

ATPasa de membrana ATPasa de membrana int r ínseca . extr ínseca

Clostr idium ATPasa con 4 subunid.

Chromatium

tetasa (8 Baci 11 us subuni dades )

Escher ichia

Ca ATPasa 1

termo- plasma

/ \ t t '

Na /K ATPaea++\ I I (0)

I 1 I I

' W L al > . O L

Rhodocpirillum

E .r

.r bacter ia Paracoccus

.r ,--

I I

membranas eucarió- t i c a s

honpos

c 1 o ro p l a s t,os

anima1 es

F io . 8.7 RELACIONES POSTULADAS ENTRE ATPasas DE MEMBRPNA. ( N E Y ) sensible

a N- et i lmaleimida. ( O ) sens ib le a ouabaína (T!'

47

I c.-

.-. *-

I

1 - I C I - i

c

I i 1 -

l -

L

c

<c

y S m i t h en l a evolución del mecan?smo auimiosmótico

Las AtPasas de Nat y ,Kt y de ,Cat+ pudieron ha ter evolucionado a t r avés t t de u n ionóforo de Na /H . Un a n c e s t r o común pudo haber s i d o u n micoplasma t e r -

m o f í l i c o , T. acidophilum, que muestra va r i a s c a r a c t e r í s t i c a s sugir iendo u n a po-

s i b l e r e l a c i ó n con l a s c é l u l a s e u c a r i ó t i c a s .

Estudios p o s t e r i o r e s de l a e s t r u c t u r a molecular d e t a l l a d a y sui. mecanismos, j -

de 1a.s secuencias de aminoácidos en el s , i t i o que une ATP y iones d d a s d i f e r e n -

t e s ATPasas, 'as i . como l a s in te racc iones de l a enzima con la'membrana nos reve la-

r í a n a l g o más sobre l a pos ib le evolución y polar idad t i p i c a de este complejo.

10. RESUMEN.

Una de l a s c a r a c t e r í s t i c a s e s e n c i l e s de l a s c é l u l a s e p i t e l i a l e s es l a pola-

rizac,iÓn de l a s pro te ínas de su membrana plasmática.

pliamente d e s c r i t a para u n gran número de e p i t e l i o s , s i n embargo no se conocen

l o s mecanismos por l o s cua les l a c é l u l a e p i t e , l i a l adquiere y mantiene e s t a o r i e n -

tac ión preferenc ia l de sus pro te ínas plasmáticas . Un sistema ideal para e s t u d i a r

e s t e problema es un c ( i1 t ivo .de c é l u l a s que permita s e g u i r e l cur'os temporal de

l a formacidn de un . e p i t e l i o a r t i f i c i a l polar izado con todas l a s .propiedades que

'se encuentran en u n e p i t e l i o n a t u r a l . 'Una preparación que cumple muchos de e s t o s

r e q u i s i t o s e s l a l i n e a c e l u l a r MDCK.

Esta propiedad e s t á am-

Las ideas vigentes sobre l a génesis de. l a polar idad y que no son mutuamente

excluyentes son:

1) Que l a s p r o t e í n a s de membrana poseen una seña l . química que l e s s i r v a para in- ,

y e c t a r s e polarizadamente, por ejemplo, c i e r t o t i p o d e azúcares procesado en

e l a p a r a t o de Golgi ,

2 ) Que l a s pro te ínas de membrana se i n s e r t e n a l a z a r en uno y otro dovniriio y sea

l a c é l u l a quien maneje un-mecanismo de r e d i s t r i b u c i ó n que q u i t a c i e r t a s prote:

inas de l a ap ica l para r e i n s e r t a r l a s en l a b a s o l a t e r a l y viceversa.

48

.<,

c

‘I L

Rosotros decidimos explorar la segunda posibilidad: buscar si existe un

mecanismo celular de redistribución.

mente basal de las células MDCK , como la ATPasa de Na y K ,en la membrana

La idea es insertar una proteína típica- I

t t

apical y ver si la célula la tolera o la remueve y en caso que la remueva ver

si e$ capaz de reinsertarla en el dominio adecuado.

Debido a que este es un proyecto multidisciplinario se t r a t a k e n este -t t

y K . Servicio Social del aislamiento y fluoresceinación de la ATPasa de Na

Por fallas técnicas que no fueron posibles de resolver inmediatamente

una revisión bibliográfica de la evolución del complejo ATPasa para obtener una

respuesta a la polaridad de la ATPasa de Na y K en el tejido epitelial.

se hizo

t . t I

49

12. LITERATURA CITADA.

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