mitocondri e metabolismo lipidico
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Materiali e metodi
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1. INTRODUZIONE
1.1 Il metabolismo energetico: mitocondri e metabolismo lipidico
1.1.1 I mitocondri
I mitocondri sono gli organelli subcellulari deputati al metabolismo
ossidativo dei substrati intermedi glucidici, lipidici e aminoacidici nei tessuti
animali [Darley-Usmar V. et al., 1994]. I mitocondri sono presenti in ogni
cellula in numero variabile e la loro densità è in genere proporzionale alla
capacità ossidativa tissutale. I mitocondri sono sede della beta-ossidazione
degli acidi grassi responsabile del catabolismo lipidico tissutale. Il ciclo degli
acidi tricarbossilici nella matrice mitocondriale catalizza inoltre a partire dai
prodotti del metabolismo intermedio glucidico, lipidico e proteico le reazioni
che creano equivalenti riducenti, a loro volta trasportati agli enzimi della
catena respiratoria.
I complessi enzimatici della catena respiratoria sono localizzati sulla
membrana mitocondriale interna e comprendono: complesso I (NADH
ubichinone reduttasi), II (succinico ubichinone reduttasi), III (ubichinolo
citocromo c reduttasi), IV (citocromo c ossidasi - COX). Gli elettroni sono
trasferiti dal NADH e dal FADH2 all’ubichinone, quindi ridotto ad
ubichinolo. L’ubichinolo citocromo c reduttasi veicola gli elettroni
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dall’ubichinolo al citocromo c, che diffondendo in senso laterale lungo la
superficie della membrana trasferisce gli elettroni a COX che a sua volta li
cede all’O2, riducendolo ad H20. Le reazioni ossidative sopra descritte si
associano secondo la teoria chemio-osmotica di Mitchell alla creazione da
parte dei complessi I, III e IV di un gradiente elettrochimico attraverso la
membrana mitocondriale interna [Mitchell P. et al., 1972]. Tale gradiente
protonico fornisce l’energia potenziale utilizzata dall’enzima ATP-sintetasi
(complesso V della catena respiratoria) per la produzione di adenosin
trifosfato (ATP) con legame ad alta energia tra adenosin difosfato (ADP) e
gruppo fosforico [Rawn JD. et al., 1990][Boss O. et al., 2000]. La sintesi di
ATP rappresenta il fine e il processo centrale del metabolismo in quanto i
legami ad alta energia in esso contenuti costituiscono la fonte di energia
chimica per tutte le reazioni cellulari endoergoniche. Il metabolismo
ossidativo mitocondriale fornisce la maggior parte dell’ATP cellulare e i
mitocondri hanno pertanto un ruolo fondamentale nell’utilizzazione dei
substrati intermedi per la produzione di energia chimica tissutale.
I mitocondri contengono molecole di DNA circolare della lunghezza
di circa 16.000 basi contenente geni codificanti per il dodici percento delle
subunità degli enzimi della catena respiratoria [Anderson S. et al., 1981], tra
cui sette subunità del complesso I, una del III, tre del IV, due del V. Ogni
mitocondrio contiene numerose copie di DNA, per un totale di centinaia di
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copie per cellula. Tale poliplasmia rappresenta un fattore importante nel
determinare l’impatto di mutazioni mitocondriali sul metabolismo energetico
cellulare e tissutale, che dipenderà infatti dalla proporzione di molecole
mutate in rapporto a quelle non alterate in ogni mitocondrio e in ogni cellula.
La trascrizione a mRNA e la sintesi delle proteine codificate dai geni
mitocondriali avviene nel mitocondrio e viene coordinata con quella delle
proteine mitocondriali codificate da geni nucleari mediante meccanismi
regolatori integrati che sono ancora in parte sconosciuti.
Sarà nostro interesse nel presente lavoro focalizzare l’attenzione su
citocromo c ossidasi (COX) e citrato sintetasi (CS). COX rappresenta infatti
l’enzima chiave e, a causa della sua posizione immediatamente precedente la
sintesi di ATP, generatore di flusso protonico nella catena respiratoria. COX è
un complesso enzimatico a configurazione metalloproteica localizzato nella
membrana mitocondriale interna [Hanson BJ. et al., 2001][Bruno C. et al.,
1999][D’aurelio M. et al., 2001]. La citocromo ossidasi umana è costituita da
13 subunità, le più voluminose delle quali, la I, la II e la III, costituiscono il
core catalitico dell’enzima e sono codificate dal DNA mitocondriale [Goldberg
A. et al., 2003]. Le altre subunità polipeptidiche alcune delle quali modulano la
catalisi, altre l’assemblaggio e la stabilità dell’intero oloenzima [Dagsgaard C.
et al., 2001], sono codificate da geni nucleari. La citrato sintetasi è
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essenzialmente localizzata nella matrice mitocondriale e rappresenta un enzima
chiave del ciclo di Krebs.
La produzione mitocondriale di ATP fornisce la maggior parte
dell’energia chimica necessaria alle funzioni tissutali. Il muscolo scheletrico ed
il fegato sono i tessuti responsabili di larga parte (oltre il 50%) del consumo di
ossigeno corporeo totale a riposo [Rolfe FSD. et al., 1999][Rolfe DF. et al,
1994]. Alterazioni del metabolismo energetico in questi tessuti hanno pertanto
un impatto rilevante sulla spesa energetica e sul bilancio energetico corporeo
totale. L’attività contrattile riveste un ruolo primario nel consumo energetico
del muscolo scheletrico. La contrazione muscolare è sostenuta dall’interazione
tra le teste miosiniche ed i filamenti di actina durante la quale le prime
idrolizzano l’ATP [Alberts B. et al, 1990]. Un considerevole consumo
energetico va associato inoltre al turnover delle proteine contrattili e strutturali
che costituiscono la massima parte della massa tissutale nell’ambito dei
processi di rimodellamento continuo (sintesi e breakdown) che ne garantiscono
l’efficienza [Nair KS. et al. , 2000] [Nair KS. et al., 1983][Rooyakers O. et al.,
1996][Charlton M. et al.,1998]. Anche per la sua massa elevata il muscolo
scheletrico ha inoltre un ruolo metabolico fondamentale nel determinare i livelli
di utilizzazione dei substrati lipidici e glucidici [Rawn JD. et al., 1990],
influenzandone in modo significativo il metabolismo corporeo totale. A
conferma di questa relazione, riduzioni marcate della massa muscolare quali si
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riscontrano ad esempio nell’invecchiamento o nel corso di malattie croniche
sistemiche si associano a una ridotta utilizzazione totale di glucosio e ad
un’aumentata incidenza di diabete mellito tipo II [Barzilai N. et al.,
1995][Evans WJ. et al., 1995][Lindstrom B. et al., 1997][Mc Donag MJ. et al.,
1984][Rolfe DF. et al., 1994][Nair KS. et al., 2000].
1.2 La regolazione del metabolismo lipidico muscolare
I principali processi metabolici che coinvolgono gli acidi grassi sono la
beta ossidazione mitocondriale e la sintesi da acetil-Coenzima A (lipogenesi)
[Winder WW. et al., 1999].
1.2.1 La lipoossidazione
Avviene come ricordato nella matrice mitocondriale. Sebbene gli enzimi
mitocondriali coinvolti siano ossidasi, un passaggio limitante della beta-
ossidazione è il trasporto degli acidi grassi dallo spazio citoplasmatico al
mitocondrio stesso. Tale reazione è catalizzata dalla carnitina-palmitoil
transferasi-I (CPT-I) che rappresenta quindi un importante bersaglio di studio
per la regolazione dei processi ossidativi lipidici.
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1.2.2 La lipogenesi
Il processo di sintesi di acidi grassi e successivamente di trigliceridi a
partire da acetil-Coenzima A e glicerolo prende il nome di lipogenesi. L’acetil-
Coenzima A carbossilasi (ACC) è l’enzima che catalizza la prima reazione di
questo processo e sede cruciale della sua regolazione [Winder WW. et
al.,1999]. ACC catalizza la sintesi di due molecole di acetil-Coenzima A a
malonil-Coenzima A. Il malonil-Coenzima A è a sua volta in grado di modulare
il flusso di acidi grassi verso la lipoossidazione in quanto le sue concentrazioni
sono inversamente proporzionali alla attività di CPT-I. Ridotti livelli di
malonil-Coenzima A stimolano pertanto CPT-I favorendo la beta-ossidazione
mitocondriale degli acidi grassi mentre un aumento di malonil-Coenzima A
favorisce le reazioni successive della lipogenesi che coinvolgono soprattutto la
sintetasi degli acidi grassi (FAS).
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1.2.3 Fattori di regolazione del metabolismo degli acidi grassi
Negli ultimi anni sono stati identificati importanti regolatori del
metabolismo degli acidi grassi in grado di modulare l’attività e il bilancio netto
tra lipoossidazione e lipogenesi nel muscolo scheletrico.
Tra questi spiccano il peroxisome-proliferative activator receptor-
gamma (PPARgamma), il PPAR-alpha, il PPAR-gamma coactivator-1alpha
(PGC-1alpha) e il regolatore metabolico kinasi AMP-dipendente (AMPK).
a) PPARgamma: il PPARgamma è un fattore di trascrizione nucleare
in grado di modulare la trascrizione di numerosi geni coinvolti nel
metabolismo lipidico [Hevener AL. et al., 2003][Jove M. et al.,
2004][Lapsys NM. et al., 2000][Norris AW. et al., 2003][Olefsky
JM. et al., 2000][Way JM. et al., 2001][Rhee J. et al., 2003].
PPARgamma è espresso in vari tessuti tra cui il tessuto adiposo dove
ha un ruolo adipogenico e lipogenico. Nel muscolo scheletrico in
particolare PPARgamma è stato dimostrato avere livelli di
espressione proporzionali a geni lipoossidativi [Lapsys NM. et al.,
2000].
b) PPARalpha: PPARalpha è un fattore nucleare di regolazione
trascrizionale appartenente alla stessa famiglia di PPARgamma. Il
suo ruolo principale appare associato alla stimolazione della beta-
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ossidazione degli acidi grassi soprattutto in condizioni di digiuno e
dopo esercizio fisico [Leone TC. et al., 1999].
c) PGC-1alpha: PGC-1alpha appare associato a un incremento
coordinato della capacità ossidativa mitocondriale e di ossidazione
degli acidi grassi in diversi tessuti [Rhee J. et al., 2003][Patti ME. et
al., 2003][Mootha VK. et al., 2003][Puigserver P. et al., 2003][Attie
AD. et al., 2003]. Un aumento dell’interesse verso PGC-1alpha si è
verificato in seguito alla scoperta di una sua ridotta espressione e
attività nel muscolo scheletrico di pazienti con insulino-resistenza e
diabete tipo 2 [Patti ME. et al., 2003][Mootha VK. et al.,
2003][Puigserver P. et al., 2003][Attie AD. et al., 2003]. In tali
condizioni patologiche una ridotta espressione di PGC-1alpha
potrebbe rappresentare un potenziale mediatore delle alterazioni del
metabolismo lipidico-mitocondriale, che a loro volta sono ipotizzate
avere un ruolo patogenetico-causale nella insulino-resistenza [Patti
ME. et al., 2003][Mootha VK. et al., 2003][Puigserver P. et al.,
2003][Attie AD. et al., 2003].
d) AMPK: AMPK svolge un ruolo centrale nella regolazione del
bilancio tra lipogenesi e ossidazione lipidica in vari tessuti
comprendenti il fegato [Winder WW. et al., 1999] e il muscolo
scheletrico [Yamauchi T. et al., 2002]. Inoltre AMPK svolge un
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ruolo rilevante anche nella regolazione del metabolismo glucidico e
la sua attivazione determina una soppressione della gluconeogenesi
epatica [Lochhead PA. et al., 2000][Yamauchi T. et al., 2002].
AMPK è un eterotrimero costituito da tre subunità α,β,γ. La subunità
α contiene il dominio chinasico e contribuisce al legame con l’AMP.
La coespressione delle tre subunità è richiesta per garantire l’attività
chinasica. La regolazione dell’attività di AMPK è principalmente
legata ai livelli di fosforilazione del residuo treoninico della subunità
catalitica, a sua volta almeno in parte dipendente dal rapporto delle
concentrazioni intracellulari di AMP e ATP. L’attivazione di AMPK
per mezzo della fosforilazione determina una cascata di eventi, così
riassumibile:
- Attivazione della lipoossidazione per fosforilazione dell’enzima
ACC, che, venendo così ad essere inattivato, riduce il suo prodotto
metabolico, il malonil CoA, importante inibitore di CPT-I. In tal
maniera si aumenta la quota di acidi grassi che penetra all’interno del
mitocondrio e che vengono dirottati alla ß-ossidazione.
- Possibile stimolazione della biogenesi mitocondriale muscolare
- Inibizione della lipogenesi
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1.3 L’insulina
1.3.1 L’insulina e il metabolismo intermedio
L’insulina ha un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo
intermedio . L’insulina è il maggiore ormone anabolico in grado di favorire
l’accumulo e la conservazione dei substrati nonchè la loro utilizzazione in
senso anabolico inibendone nel contempo il catabolismo. L’insulina è
responsabile della captazione del glucosio e della sua utilizzazione per la sintesi
di glicogeno nei tessuti periferici insulino-sensibili tra cui il muscolo
scheletrico ed il fegato [Rhee J. et al., 2003]. L’insulina inoltre inibisce la
produzione epatica di glucosio da precursori non glucidici [Rasmussen BB. et
al., 1999][Revers RR. et al., 1984]. In assenza di insulina quale si verifica nel
diabete tipo 1 l’utilizzazione di glucosio muscolare è ridotta e la produzione
dello stesso è nettamente aumentata, risultando in un aumento netto delle
concentrazioni plasmatiche (iperglicemia) [Rasmussen BB. et al., 1999][Revers
RR. et al., 1984].
L’insulina ha anche importanti effetti sul metabolismo lipidico inibendo
la lipolisi nel tessuto adiposo e l’ossidazione degli acidi grassi tissutali
favorendo la lipogenesi e l’accumulo di trigliceridi nello stesso, nonché nel
fegato [Rajala MW. et al., 2003][Randle PJ. et al., 1963]. Una riduzione
dell’ossidazione degli acidi grassi da parte dell’insulina si può riscontrare anche
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nel muscolo scheletrico [Rajala MW. et al., 2003][Randle PJ. et al., 1963]. In
carenza di insulina la lipolisi nel tessuto adiposo è aumentata con conseguente
incremento degli acidi grassi circolanti che a livello epatico vengono captati e
ossidati in eccesso determinando un’abnorme produzione dei corpi chetonici
(acetoacetato, β-idrossi butirrato, acetone) [Ruderman NB. et al., 1999].
Infine l’insulina stimola l’anabolismo proteico riducendo la proteolisi e
questo effetto può acutamente determinare una riduzione dei livelli circolanti di
aminoacidi se questi non sono mantenuti da supplementazione esogena, quale
tipicamente si verifica durante il pasto. La carenza di insulina causa pertanto
perdita di massa proteica, soprattutto evidente a livello muscolare scheletrico
[Charlton M. et al., 1998][Nair KS. et al., 1995][Biolo G. et al., 1993][Smith
OL. et al., 1989][Ashford AJ. et al., 1986].
Aumenti delle concentrazioni circolanti di insulina si riscontrano, in
condizioni fisiologiche, soprattutto in presenza di introito calorico nel periodo
post-prandiale [Rhee J. et al., 2003]. In queste condizioni aumenti anche
moderati della glicemia stimolano la secrezione pancreatica di insulina. Gli
effetti metabolici globalmente riassunti nel paragrafo precedente appaiono
pertanto riconducibili e finalizzati all’utilizzo a scopo anabolico dei substrati
introdotti attraverso la dieta. La capacità dell’insulina di stimolare la
utilizzazione (soprattutto a livello muscolare) del glucosio risulta di
fondamentale importanza nel determinare l’omeostasi del metabolismo
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glucidico [Rhee J. et al., 2003][Samec S. et al., 2002]. Condizioni in cui questa
capacità è patologicamente ridotta, tra le quali spicca l’obesità, sono
globalmente definite come insulino-resistenti e l’insulino-resistenza del
metabolismo glucidico ha un enorme impatto socio-sanitario essendo alla base
del diabete tipo 2, la cui incidenza sta assumendo proporzioni epidemiche nel
mondo occidentale e nei paesi in via di sviluppo.
1.3.2 L’insulina e il metabolismo lipidico-mitocondriale
Effetti dell’insulina sull’espressione genica e la funzione mitocondriale
sono emersi recentemente in modelli non-diabetici umani e animali [Huang X.
et al., 1999][Stump CS. et al., 2003][Boirie Y. et al., 2001]. Studi recenti hanno
infatti dimostrato rilevanti effetti della somministrazione di insulina
sull’espressione genica mitocondriale in soggetti sani. Huang et al. riportavano
in soggetti umani non-diabetici un aumento dei livelli di RNA relativi ad
enzimi della catena respiratoria quali l’NADH deidrogenasi e la citocromo c
ossidasi (COX) dopo infusione endovenosa di insulina a livelli paragonabili a
quelli post-prandiali per due ore [Huang X. et al., 1999]. Gli effetti dell’insulina
sull’attività mitocondriale risultano essere almeno in parte tessuto-specifici.
Uno studio della sintesi proteica mitocondriale in diversi tessuti (muscolo
scheletrico e cardiaco, fegato), ha dimostrato che, in presenza di stimolazione
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della sintesi proteica nei mitocondri muscolari, si rilevava una concomitante
soppressione della stessa in quelli epatici, mentre non si rilevavano alterazioni
significative nel muscolo cardiaco [Boirie Y. et al., 2001]. Ulteriori studi hanno
dimostrato che l’infusione di insulina per 8h aumentava nel muscolo scheletrico
(vasto laterale) i livelli di mRNA e la sintesi proteica mitocondriali nonchè
l’attività enzimatica di COX e della citrato sintetasi [Stump CS. et al., 2003] in
volontari sani quando l’infusione di aminoacidi esogeni preveniva la riduzione
dei livelli di aminoacidi circolanti che si osserverebbe fisiologicamente a causa
dell’effetto soppressivo insulinico sulla proteolisi muscolare [Nair KS. et al.,
1995]. Tali studi suggeriscono quindi un effetto stimolante la funzione
mitocondriale muscolare da parte dell’iperinsulinemia acuta. Occorre peraltro
ricordare che l’insulina non si è dimostrata in grado di stimolare la funzione
mitocondriale muscolare a livello di attività enzimatiche e di produzione di
ATP in assenza di infusione di aminoacidi con riduzione dei livelli
aminoacidici circolanti [Young ME. et al., 2001]. Questo risultato suggerisce
una stretta interazione tra substrati e insulina negli effetti mitocondriali di
quest’ultima.
Il riscontro di effetti stimolanti dell’insulina sul metabolismo
mitocondriale muscolare almeno in condizioni sperimentali appare inoltre
almeno in parte non coordinato con effetti già sopra ricordati di inibizione del
metabolismo ossidativo degli acidi grassi che tuttavia avviene interamente nei
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mitocondri [Rajala MW. et al., 2003][Randle PJ. et al., 1963][Shetty GK. et al.,
2004]. Non sono peraltro disponibili studi che abbiano simultaneamente
valutato gli effetti di un’iperinsulinemia acuta fisiologica sulla funzione
ossidativa mitocondriale e sul metabolismo lipidico nel muscolo scheletrico.
1.3.3 L’insulino-resistenza e la funzione mitocondriale
Occorre inoltre ricordare che una riduzione della funzione mitocondriale
muscolare e una ridotta capacità ossidativa degli acidi grassi si associano a
condizioni di iperinsulinemia cronica moderata in condizioni quali obesità e
diabete tipo 2 [Anderwald C. et al., 2002][Barazzoni R. et al., 2004][Barazzoni
R. et al., 2005][Harano Y. et al., 1972]. Tali alterazioni si associano a un
accumulo tissutale muscolare di trigliceridi e sono state recentemente ipotizzate
essere alla base della insulino-resistenza che caratterizza tali patologie
[Barazzoni R. et al., 2001][Barazzoni R. et al., 2003][Barazzoni R. et al.,
2003][Jove M. et al., 2004][Kristal BS. et al., 1997][Murata M. et al., 2002].
Una ridotta funzione mitocondriale e lipoossidativa potrebbe infatti
direttamente contribuire all’accumulo di trigliceridi nonchè a una eccessiva
deposizione di tessuto adiposo contribuendo direttamente alla genesi
dell’obesità [Barazzoni R. et al., 2001][Barazzoni R. et al., 2003]Barazzoni R.
et al., 2003][Jove M. et al., 2004][Kristal BS. et al., 1997][Murata M. et al.,
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2002][Diez JJ. et al., 2005]. Da ricordare a livello molecolare che la ridotta
funzione mitocondriale si associa a ridotta espressione di regolatori del
metabolismo lipidico-mitocondriale quali PGC-1alpha [Patti ME. et al.,
2003][Petersen KF. et al., 2004][Pickup JC. et al., 1997][Puigserver P. et al.,
2003].
1.4 Gli acidi grassi
1.4.1 Gli acidi grassi e l’insulino-resistenza
Un eccesso di acidi grassi circolanti è stato associato in modo
consistente a una riduzione dell’azione insulinica e a insorgenza di insulino-
resistenza [Attie AD. et al., 2003]. Tali effetti negativi si riscontrano sia
acutamente che in condizioni di cronico eccesso [Attie AD et al.,
2003][Barazzoni R. et al., 2001][Barazzoni R. et al., 2003][Barazzoni R. et al.,
2004]. Un aumento cronico del grasso corporeo quale riscontrabile nell’obesità
e pressochè costantemente nel diabete tipo 2 si associa a un eccesso di acidi
grassi circolanti legato soprattutto a un aumentato rilascio da parte
dell’aumentata massa adiposa, che appare essere maggiormente spiccato a
livello di tessuto adiposo addominale-viscerale [Attie AD. et al., 2003]. Gli
acidi grassi rappresentano pertanto un potenziale mediatore dei difetti
metabolici in modelli di obesità. L’infusione endovenosa di acidi grassi
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(generalmente effettuata utilizzando preparazioni di trigliceridi ed eparina)
riduce inoltre la captazione di glucosio tissutale e in particolare quella
muscolare sia in condizioni basali che durante infusione concomitante di
insulina anche in soggetti sani o in modelli animali fisiologici. La capacità di
interferire con la azione insulinica muscolare anche in soggetti normalmente
insulino-sensibili suggerisce che gli acidi grassi giochino un ruolo precoce nella
patogenesi della riduzione della azione insulinica associata a sovrappeso e
obesità. La conoscenza dei meccanismi attraverso i quali gli acidi grassi
inducono insulino-resistenza potrebbe pertanto risultare determinante nella
comprensione della sua origine e storia naturale.
Nonostante i meccanismi attraverso i quali un eccesso lipidico determina
insulino-resistenza siano oggetto di intensissimo studio in quanto chiave
fondamentale nella comprensione di tale alterazione metabolica, essi non sono
tuttavia noti. In particolare i meccanismi potenziali degli effetti degli acidi
grassi sull’azione insulinica rimangono in larga parte da definire. L’infusione di
acidi grassi può acutamente alterare la cascata del segnale insulinico riducendo
selettivamente i livelli di attivazione di alcune proteine chiave tra cui PI3-
kinasi [Kruszynska YT. et al., 2002]. I dati disponibili indicano inoltre quali
potenziali meccanismi in tal senso la competizione tra substrati lipidici e
glucidici per l’utilizzazione ossidativa (ipotizzata fin dal secolo scorso nel
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concetto del ciclo di Randle) [Shetty GK. et al., 2004][Shulman GI. et al.,
2000][Stump CS. et al., 2003]. Inoltre gli acidi grassi potrebbero contribuire a
ridurre l’azione insulinica muscolare in modo indiretto attraverso un aumento
dello stress ossidativo sistemico [Ueno N. et al., 2004]. Lo stress ossidativo è
stato infatti dimostrato ridurre a livello del tessuto adiposo l’espressione di
ormoni che favoriscono l’azione insulinica quali l’adiponectina [Ueno N. et al.,
2004] con concomitante aumento dell’espressione di ormoni proinfiammatori e
riducenti l’insulino-sensibilità quali TNF-alpha e interleukina-6 [Wang J. et al.,
1998]. Lo stress ossidativo tissutale potrebbe inoltre inibire direttamente
l’espressione genica mitocondriale [Way JM. et al., 2001].
1.4.2 Gli acidi grassi e il metabolismo lipidico
Gli effetti di modificazioni della disponibilità di acidi grassi liberi su
vari meccanismi regolatori del metabolismo lipidico non sono completamente
noti. Tra i principali meccanismi emersi negli ultimi anni risulta peraltro
dimostrabile un effetto stimolante degli acidi grassi sull’attivazione di
PPARgamma, a sua volta associato ad aumento di espressione di alcuni geni
lipoossidativi [Barazzoni R. et al., 2003]. In modo speculare al riscontro di
effetti stimolanti in alcune condizioni sperimentali dell’insulina (ormone
lipogenico e antilipoossidativo) sulla funzione mitocondriale, l’associazione di
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un eccesso di acidi grassi con insulino-resistenza e ridotta funzione
mitocondriale-lipoossidativa muscolare potrebbe apparire in contrasto con
queste osservazioni. Non è comunque nota l’interazione tra acidi grassi e
PPARgamma in presenza di eccesso di insulina. Inoltre rimangono da chiarire
gli effetti potenziali degli acidi grassi su altri meccanismi regolatori del
metabolismo lipidico tra cui i livelli di attivazione di AMPK e quelli di
espressione di PPARalpha e PGC-1alpha in assenza o in presenza di
iperinsulinemia. Infine non sono chiariti i potenziali effetti acuti di un eccesso
di acidi grassi sulla capacità ossidativa mitocondriale muscolare.
1.5 Metodi di studio dell’azione insulinica: il clamp iperinsulinemico-
euglicemico
Dal punto di vista sperimentale il clamp iperinsulinemico-euglicemico
rappresenta una metodica ampiamente utilizzata per la misurazione dell’azione
insulinica e lo studio degli effetti acuti dell’insulina sul metabolismo
intermedio in vivo in modelli sia umani che animali [Winder WW. et al.,
1999][Yamauchi T. et al., 2002]. Il principio della metodica si basa sull’effetto
ipoglicemizzante dell’insulina legato essenzialmente alla stimolazione della
utilizzazione di glucosio da parte dei tessuti periferici. Il muscolo scheletrico
rappresenta il maggiore mediatore di questo effetto per la sua dipendenza
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dall’insulina per la regolazione dell’utilizzazione di substrati e per la sua massa
totale nell’organismo. Per l’aumento della captazione tissutale del glucosio la
glicemia tenderebbe a calare ma tale effetto deleterio è controllabile nel clamp
iperinsulinemico-euglicemico attraverso l’infusione di destrosio basata sul
monitoraggio frequente dei livelli glicemici [Winder WW. et al.,
1999][Yamauchi T. et al., 2002]. La quantità di glucosio infusa rappresenta un
indice riproducibile e considerato gold-standard della sensibilità insulinica
corporea totale.
Oltre a consentire la misurazione della sensibilità insulinica il clamp
iperinsulinemico-euglicemico consente di studiare gli effetti di un’elevazione
acuta (in genere della durata di due-tre ore) dell’insulinemia su vari parametri
metabolici sia plasmatici (monitorabili attraverso prelievi ematici seriati) che
tissutali (monitorabili attraverso biopsie o raccolta di tessuti al termine dello
studio in modelli animali). Il clamp rappresenta in particolare un eccellente
modello di condizione prandiale in cui si verifica un aumento dei livelli di
insulinemia con mantenimento dei livelli glicemici. Occorre peraltro ricordare
che l’infusione di insulina induce anche una riduzione dose-dipendente dei
livelli circolanti di acidi grassi liberi (da inibizione della lipolisi) e degli
aminoacidi (da inibizione della proteolisi muscolare). Gli effetti di questi
substrati possono quindi essere ulteriormente studiati associandone l’infusione
a quella dell’insulina. In particolare l’infusione di acidi grassi può essere
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effettuata utilizzando preparazioni commerciali di trigliceridi con eparina
(attivatore della lipoproteina lipasi e favorente quindi la liberazione degli acidi
grassi stessi). L’infusione o l’assenza di acidi grassi permettono, attraverso il
confronto tra le due condizioni sperimentali, di valutarne il ruolo nella
regolazione acuta dell’azione insulinica.
Materiali e metodi
21
2. SCOPI dello STUDIO
L’insulina è il principale ormone anabolico post-prandiale che gioca un
ruolo centrale nella regolazione del metabolismo glucidico e lipidico. Studi
recenti hanno suggerito un ruolo dell’insulina nella regolazione della funzione
mitocondriale muscolare che a sua volta appare essere proporzionale alla
sensibilità insulinica tissutale. Un aumento della disponibilità di substrati
lipidici e in particolare di acidi grassi riduce sia acutamente che cronicamente
la sensibilità insulinica. Non è noto se gli effetti metabolici acuti di un eccesso
di acidi grassi coinvolgano alterazioni della funzione mitocondriale e delle vie
regolatrici del metabolismo lipidico-mitocondriale muscolare.
Scopi del presente studio sono stati di valutare i potenziali effetti acuti di
modulazione da parte degli acidi grassi liberi dell’azione insulinica su
utilizzazione corporea di glucosio (insulino-sensibilità), metabolismo
mitocondriale-lipidico muscolare e sue vie regolatrici.
Materiali e metodi
22
3. MATERIALI e METODI
3.1 Protocollo sperimentale
3.1.1 Animali
Sono stati studiati diciannove ratti maschi di ceppo Wistar acquistati
dalla ditta Harlan-Italy di San Pietro al Natisone (UD). Dopo l’acquisto, gli
animali sono stati stabulati in gabbie aerate ospitanti da sei a dieci ratti presso
lo stabulario dell’Università degli Studi di Trieste in ambiente controllato alla
temperatura costante di 22°C e cicli luce-buio di 12 ore. I ratti sono stati
alimentati con una dieta standard (Harlan 2018).
3.1.2 Infusione
In tutti gli animali si procedeva al mattino in condizioni di digiuno da
due ore alla incannulazione dell’arteria e della vena caudale come
precedentemente descritto in condizioni di anestesia locale (lidocaina) [ZenKui
G. et al., 2003]. Dopo incannulazione gli animali erano mantenuti in una gabbia
di plexiglass con apertura circolare dalla quale veniva fatta fuoriuscire la coda
che era mantenuta fissata a un supporto associato alla gabbia. Dopo un periodo
di ambientamento pari a circa trenta minuti veniva effettuato un prelievo dalla
cannula posizionata nell’arteria caudale per la misurazione della glicemia
Materiali e metodi
23
basale e lo stoccaggio di plasma per la successiva misurazione dei livelli basali
di ormoni e metaboliti. I ratti così incannulati venivano casualmente assegnati a
uno tra i tre seguenti protocolli:
a) Clamp (n=6): in questo gruppo veniva infusa nella vena caudale
mediante pompa Harvard di precisione (Harvard Apparatus Pump 22) una
dose di insulina (Humulin R, Lilly, insulina umana 100 UI/mL) pari a 10
mU/ Kg di peso corporeo × min. [Thien T. Tran et al., 2003][Rossetti L. et
al., 1990] attesa indurre un’iperinsulinemia paragonabile a quella
postprandiale [Thien T. Tran et al., 2003][Rossetti L. et al., 1990][Santurè
M. et. Al., 2002][Rao H. et al., 1993]. L’insulina veniva in precedenza
diluita in 5 mL di soluzione salina con circa 70 microlitri di sangue
dell’animale [Barazzoni R. et al., Diabetes 2003]. Durante l’infusione di
insulina venivano prelevati ogni dieci-quindici minuti campioni ematici per
la misurazione della glicemia e sulla base di tali rilevazioni era modulata
una infusione di glucosio al 33% mirata a mantenere livelli glicemici stabili
intorno ai valori basali. Dopo 150 minuti veniva effettuato un prelievo di 1
mL per nuove misurazioni di ormoni e metaboliti al termine dell’infusione
insulinica. Subito dopo veniva somministrata attraverso la vena caudale una
overdose di pentobarbitale sodico (40 mg/mL) e dopo il raggiungimento
dell’anestesia si procedeva rapidamente al prelievo del muscolo
Materiali e metodi
24
gastrocnemio che veniva congelato in azoto liquido e conservato quindi a –
80°C sino al momento delle analisi.
b) NEFA (n=7): animali preparati in modo indentico ricevevano
identica infusione di insulina e prelievi per modulazione dell’infusione di
glucosio. Gli animali ricevevano inoltre dall’inizio dello studio l’infusione
di trigliceridi (Ivelip 20% Clintek Baxter, emulsione lipidica iniettabile a
600 µL/hr) ed eparina (Epsoclar, Biologici Italia Labor. Eparina sodica 2500
UI/5 mL) parallelamente a quelle di insulina e glucosio. Prelievi ematici,
anestesia e prelievo del muscolo erano eseguiti con procedure identiche a
quelle seguite per il gruppo sopra descritto.
c) Controllo (n=6): gli animali assegnati a questo gruppo venivano
preparati in modo identico agli altri e ricevevano però una infusione di
soluzione salina in luogo di quella di insulina, in assenza di infusione di
trigliceridi. Venivano comunque effettuati i prelievi per la misurazione della
glicemia in modo identico agli altri gruppi e si procedeva all’infusione di un
ulteriore volume di soluzione salina basato su quello di glucosata ricevuto
da ogni animale sottoposto a clamp iperinsulinemico. Prelievi ematici,
anestesia e prelievo del muscolo erano eseguiti con procedure identiche a
quelle seguite per gli altri gruppi.
Materiali e metodi
25
3.2 Attività enzimatica di citocromo ossidasi e citrato sintetasi
40 mg circa di muscolo gastrocnemio venivano ripuliti da eventuali
impurità (connettivo, tendini e tracce ematiche) e sottoposti ad
omogeneizzazione per ottenere una misura diretta dell’attività degli enzimi
mitocondriali Citocromo c Ossidasi (COX) e Citrato Sintetasi. I frammenti
venivano omogenati a freddo (+4°C) in una soluzione di Set Buffer (EDTA 2
mM, TRIS BASE 10 mM, pH 7.4). Al preparato ottenuto (aliquote minime di
25 µl) sono stati di seguito aggiunti 350 µl di KPI Buffer (KH2PO4 in H2O
portato a pH 7.4 con KOH 10 M) realizzando in tal modo le aliquote finali
impiegate per le analisi.
Per la misurazione dell’attività enzimatica di Citocromo c Ossidasi
(COX) aliquote di ciascun campione (200 µl) venivano incubate a 4°C per 20
minuti con una soluzione di Digitonina (10 mg di Digitonina - 25 mg di BSA in
5 mL di KPI 50 mM, pH 7.4) allo scopo di rompere le membrane mitocondriali.
La reazione è stata successivamente attivata dall’aggiunta dei suoi substrati
[800 µl di soluzione reagente così costituita: 500 mg di BSA, 10 ml di KPI 50
mM, MgCl2, citocromo c ridotto (25 mg) ed acido ascorbico (17.6 mg in 10 ml
di KPI 50 mM) a pH 7.4] e l’analisi della cinetica della reazione veniva quindi
eseguita allo spettrofotometro (SPECTRA max Plus 384, Molecular Devices).
La quantità di citocromo c che risultava essere ossidata è stata misurata alla
Materiali e metodi
26
lunghezza d’onda (λ) di 240-260 nm per un intervallo di tempo di 3 minuti. La
rilevazione in cinetica del segnale risultante veniva automaticamente eseguita
ogni 10 secondi.
Per la misurazione dell’attività enzimatica della Citrato Sintetasi le
aliquote di omogenato (100 µl) sono state incubate in soluzione Tris Buffer
(TRIS BASE, Sigma T6791, PM 121.2 in H2O con aggiunta di TRITON 0.1%)
ed ai reagenti (Dithionitrobenzoate DTNB, AcetylCoA, Li-sale 95% ed
Ossalacetato). La quantità di citrato prodotta anche in questo caso è stata
misurata spettrofotometricamente con una λ del raggio incidente di 412 nm. Le
letture sono state eseguite come nel caso precedente con rilevazioni in cinetica
ogni 10 secondi per una durata complessiva di 3 minuti per ogni campione
[Barazzoni R. et al., 2000].
3.3 Western Blotting
Utilizzando la metodica del Western Blotting è stato possibile misurare i
livelli di proteina relativi all’enzima kinasi AMP-dipendente (AMPK).
Frammenti di muscolo del peso di 60-70 mg sono stati omogeneizzati a freddo
(+4°C) in Buffer di lisi (Ripa Buffer) con aggiunta di inibitori di proteasi [10
µg/mL Leupeptina, 10 µg/mL Aprotinina, 1mM Sodio Ortovanodato e 1 mM
Fenilmetilsulfonilsolfato (PMSF)]. La composizione del Buffer di lisi è stata la
Materiali e metodi
27
seguente: 50 mmol/L Tris HCl, 0.1 mmol/L EDTA, 0.1 mmol/L EGTA, 0.1%
Sodio Dodecilsolfato (SDS), 0.1% deossicolato, 1% Igepal. L’omogenato è
stato poi centrifugato a 13000 rpm per 20 minuti a +4°C con lo scopo di
rimuovere la frazione insolubile del pellet. Separato il surnatante dal pellet
(eliminato) il contenuto proteico presente nell’estratto è stato quantificato come
segue: 60 µg di proteine totali sono stati separati su gel di Acrilamide al 12% e
successivamente trasferiti su membrana in nitrocellulosa. La metodica si è
svolta complessivamente in quattro giorni.
Il primo giorno è stato preparato il gel e volumi predeterminati di
campione corrispondenti ad un quantitativo caricato di 60 µg sono stati
eguagliati tra loro, per raggiungere i 18 µL con l’aggiunta di PBS (Phospate
Buffer Saline). Quindi è stato aggiunto il Loading Buffer (Buffer di
caricamento) contenente β-mercaptoetanolo e dopo un’incubazione di 5 minuti
alla temperatura di 95°C i campioni venivano caricati nel gel ed il campo
elettrico attivato. Le proteine sono state separate in base al peso molecolare ad
amperaggio pari a 7 mA.
Nel secondo giorno il gel è stato prelevato e preparato per il
trasferimento su membrana. Prima del transfer il gel è stato incubato per 20
minuti in Transfer Buffer, una soluzione di TBS 1X e Tween 0.1% con
aggiunta di metanolo. Anche la membrana di nitrocellulosa è stata incubata per
Materiali e metodi
28
15 minuti in Transfer Buffer. Ai fini del trasferimento è stato utilizzato il
Transfer Apparatus (Hoefer TE 70, Semi-dry Transfer Unit. Amersham
Bioscences) e successivamente la membrana è stata colorata col Rosso Ponceau
per poter visualizzare le bande proteiche e verificare che quantità omogenee di
proteina fossero contenute in ogni campione, quindi lavata ed incubata
overnight in Blocking Buffer (Washing buffer e latte in polvere al 5%) su
agitatore basculante.
Nel terzo giorno è stata preparata l’ibridizzazione con anticorpo primario
murino rivolto contro la Treonina in posizione 172 dell’AMPK (anticorpi
acquistati da Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). A tale scopo la
membrana è stata posta in una busta da ibridizzazione insieme al Blocking
buffer unitamente all’anticorpo primario con una diluizione di 1:750 ed infine
incubata overnight a +4°C, su agitatore basculante.
Nel quarto giorno la membrana è stata lavata (due lavaggi da 15 minuti
ciascuno a RT su agitatore basculante) con Washing Buffer (TBS 1X e Tween
0.1%) per rimuovere l’eccesso di anticorpo primario non ibridizzato sulla
membrana. Quindi è stato preparato l’anticorpo secondario: un anticorpo di
coniglio coniugato con perossidasi e diretto contro l’IgG murina (Jackson
Immunoresearch, West Grove, PA) con una diluizione di 1:2000. La membrana
è stata nuovamente posta in una busta di ibridizzazione insieme all’anticorpo
secondario ed al Blocking Buffer, sigillata e lasciata ad incubare per un’ora a
Materiali e metodi
29
temperatura ambiente e su agitatore basculante. Dopo la seconda serie di
lavaggi analoga alla precedente, la membrana ha subito il trattamento
necessario allo sviluppo della chemioluminescenza, in camera oscura, dopo
esposizione per 5-10 minuti ad una lastra fotografica (Kodak Biomax MR,
Kodak, Rochester, NY). L’immagine ottenuta è stata infine quantificata
mediante densitometria. I risultati singolarmente ottenuti sono stati divisi per il
valore medio del gruppo di controllo e quindi moltiplicati per 100 per
esprimere i dati in percentuale del gruppo di controllo.
3.4 Real Time PCR
La real time-Polymerase Chain Reaction permette di ottenere una
quantificazione altamente sensibile e precisa dei livelli di mRNA del gene di
interesse. Con la real time PCR (ABI Sequence Detection System 7900,
Applied Biosystems) sono stati misurati i livelli di trascritti di alcuni regolatori
essenziali della sintesi e dell’ossidazione degli acidi grassi e dei trigliceridi. In
particolare sono stati misurati i livelli di trascritto dell’enzima Carnitina
Palmitoil Transferasi I (CPT-I) quale enzima limitante l’ossidazione degli acidi
Materiali e metodi
30
grassi ed inoltre misurati i livelli di mRNA di PPARgamma, PPARalpha e
PGC-1alpha.
L’RNA totale è stato estratto da frammenti di circa 40 mg del muscolo
totale crioconservato (Tri Reagent, Molecular Research Center, Cincinnati, OH,
USA). 1 µg di RNA totale è stato poi retrotrascritto a cDNA (RNA Reverse
Transcription KIT, Applied Biosystems) ed amplificato con la metodica della
PCR, utilizzando primers e sonde specifiche selezionate con il software Primer
Express (Applied Biosystem) dalle sequenze geniche ottenute tramite il
software GenBank, in maniera tale da ibridizzarsi a specifiche sequenze
desossiribonucleotidiche presenti in ogni singolo gene di interesse.
Le sonde per i geni bersaglio erano associate all’estremo 5’ con 6’-carbossifluoresceina (FAM), un marker
fluorescente, e all’estremo 3’ con 6’-carbossitetrametil-rodamina (TAMRA), un marker denominato quencher, poichè in grado di
assorbire la fluorescenza del primo. La vicinanza spaziale tra i due marcatori impedisce pertanto la liberazione di segnale
fluorescente sino a quando la sonda non interagisce con lo specifico cDNA. Quando la sonda si è legata alla sequenza specifica,
l’attività 5’ esonucleasica della DNA-polimerasi permette la liberazione del segnale a fluorescenza, misurata dalla real time PCR,
che risulta essere proporzionale alla quantità del cDNA iniziale. I primers e le sonde utilizzate sono state le seguenti:
PPAR-α (GenBank NM 013196): FP: TGGAGTCCACGCATGTGAAG RP: CGCCAGCTTTAGCCGAATAG
Probe:
TGCAAGGGCTTCTTTCGGC
PPAR-γ (GenBank NM 03124): FP:ACCAGGGAGTTCCTCAAAAGC
RP:GCAAACTCAAACTTAGGCTCCATAA
Probe: TGCGGAAGCCCTTTGGTGA
Materiali e metodi
31
PGC-1α (GenBank NM 031347): FP: GGCCGGAGCAATCTGAGTTA RP: GGCCGTTTAGTCTTCCTTTCCT
Probe:CGCACAACTCAGCAAGTCCTCA
GTGC
L’rRNA ribosomiale 28S era utilizzato come gene di riferimento per la
normalizzazione di tutti i risultati per i geni bersaglio, e veniva amplificato
separatamente utilizzando i seguenti primes e sonde (GenBank V01270):
28S rRNA (GenBank V01270):FP: TGGGAATGCAGCCCAAAG RP: CCTTACGGTACTTGTTGGCTATCG
Probe:TGGTAAACTCCATCTAAGGCTAAATACCGGC
I campioni di cDNA sono stati amplificati utilizzando la TAQ DNA
polimerasi per quaranta cicli di amplificazione in condizioni standard. Ad ogni
ciclo è stata misurata la quantità di fluorescenza liberata, che come ricordato
risulta proporzionale alla quantità iniziale di trascritto. La quantificazione finale
di ogni campione è stata ottenuta mediante curva standard, amplificata nello
stesso esperimento. La quantità di RNA ribosomiale 28S è stata misurata in
modo analogo separatamente, ed è stata utilizzata per normalizzare i risultati
per i singoli geni bersaglio evitando in questo modo imprecisioni dovute a
potenziali differenze realizzatesi tra i campioni durante il processo di
Materiali e metodi
32
isolamento dell’RNA, o per diversità nell’efficienza delle reazioni di
retrotrascrizione. I risultati per ogni gene bersaglio sono stati divisi per il valore
del corrispondente rRNA 28S, ed espressi come percentuale della media del
gruppo di controllo.
3.5 TBARS
La misurazione dei TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive
Substances) (OXItek TBARS Assay Kit) costituisce un saggio d’elezione
per lo screening ed il monitoraggio della perossidazione lipidica, tra i
maggiori indicatori dello stress ossidativo. La metodica è in grado di fornire
importanti informazioni sull’attività dei radicali liberi in situazioni
patologiche. I campioni biologici contengono una serie di sostanze che
possono reagire con l’acido tiobarbiturico, tra le quali gli idroperossidi
lipidici e le aldeidi che aumentano come risultato di uno stress ossidativo.
La Malonildialdeide (MDA) forma un addotto in rapporto 1:2 con l’acido
tiobarbiturico. I TBARS, nel tempo, tendono a tornare a livelli normali in
una maniera che dipende dalla presenza di sostanze antiossidanti. In pratica,
essi sono espressi e quantificati in termini di equivalenti di malondialdeide
(MDA). Nel presente saggio, standards di MDA a concentrazione nota sono
Materiali e metodi
33
utilizzati per la costruzione di una curva di riferimento contro la quale sono
stati poi rapportati i campioni oggetto del monitoraggio.
Nella preparazione del Buffer Reagente per il TBA (Acido
Tiobarbiturico) 0.53 gr di acido tiobarbiturico sono stati disciolti in 50 mL
di soluzione Diluente 1 (contenente acido acetico) e quindi addizionati con
altrettanti mL della soluzione Diluente 2 (contenente idrossido di sodio). Il
TBA è stato solubilizzato sino a completo scioglimento nel mix di soluzioni
1 e 2 posto su agitatore magnetico. Per la preparazione dei campioni 100 µL
di plasma sono stati preparati in provette di vetro con una pari quantità (100
µL) di soluzione SDS (sodiododecilsolfato). Successivamente sono stati
aggiunti 2.5 mL per ogni campione del buffer Reagente con il TBA ed il
tutto è stato lasciato ad incubare per 60 min. a +95 °C. Le provette di vetro
in questa fase sono state coperte da biglie di vetro, anch’esse incluse nel kit.
E’ seguita quindi una seconda incubazione effettuata lasciando le provette in
ghiaccio per 10 min. al fine di produrne il raffreddamento. Dopo una
centrifugazione di 15 min. a 3000 rpm è stata eseguita la lettura del
sovranatante. La quantificazione è stata effettuata spettrofotometricamente
ad una lunghezza d’onda (λ) di 532 nm misurando l’assorbanza prodotta dal
campione.
Materiali e metodi
34
3.6 Dosaggio plasmatico dei NEFA
Per la determinazione quantitativa in vitro degli acidi grassi liberi nel
plasma è stato utilizzato un test enzimatico colorimetrico (NEFA C, Metodo
ACS-ACOD-MEHA, Wako Chemicals GmbH, DE).
3.7 Analisi statistica dei dati
L’analisi statistica dei dati nei tre gruppi di studio è stata effettuata
mediante analisi della varianza tra i tre gruppi (ANOVA) utilizzando poi il
testi t di Student per dati non appaiati per confrontare dati tra i singoli
gruppi separati in caso di differenze significative (P<0.05) risultate al test
ANOVA. Sono stati considerati statisticamente significativi valori di
probabilità (P) inferiori a 0.05. I dati sono stati presentati come media ± SE.
35
4. RISULTATI
4.1 Dati corporei, insulino-sensibilità, parametri emato-chimici
Il peso corporeo era sovrapponibile nei tre gruppi sperimentali (Tabella
1), così come paragonabili erano i pesi dei pannicoli adiposi epididimale e
retroperitoneale. Sovrapponibili erano anche le corrispondenti percentuali del
peso corporeo attribuibili ai pannicoli adiposi misurati. Infine, per disegno
sperimentale, identiche erano le glicemie iniziali e finali durante il clamp
iperinsulinemico-euglicemico con o senza infusione di acidi grassi.
La quantità di glucosio infusa negli ultimi trenta minuti del clamp
calcolata secondo formule standard (infusione di glucosio in mg/g peso
corporeo al minuto) rappresenta un indice accurato di insulino-sensibilità della
cui misurazione è considerato il gold-standard [DeFronzo RA. et al,
1981][Barazzoni R. et al., 2003]. Tale valore era significativamente ridotto nel
gruppo di animali trattati con infusione di insulina e acidi grassi rispetto al
gruppo trattato con sola insulina, indicando un’insulino-resistenza acuta (Figura
1).
I livelli plasmatici di acidi grassi liberi erano paragonabili basalmente
nei tre gruppi. Nel gruppo trattato con insulina i livelli di acidi grassi si
36
riducevano (in accordo con il noto effetto inibitorio sulla lipolisi da parte
dell’insulina). Nel gruppo trattato con insulina e acidi grassi le concentrazioni
di questi ultimi aumentavano come prevedibile (Figura 2).
4.2 Capacità ossidativa ed espressione di regolatori del metabolismo
lipidico-mitocondriale
Nel muscolo gastrocnemio le attività degli enzimi mitocondriali
citocromo c ossidasi (COX) e citrato sintetasi (CS) non erano modificate nel
gruppo trattato con sola insulina nelle presenti condizioni sperimentali. Tuttavia
l’infusione di insulina e acidi grassi riduceva l’attività enzimatica di COX
(P<0.05) confrontata sia al gruppo di controllo che al gruppo trattato con sola
insulina. Un simile trend che non raggiungeva la significatività statistica si
osservava per CS (Figura 3).
L’infusione di acidi grassi in parallelo a quella di insulina aumentava i
livelli di mRNA di PPARgamma confrontati a quelli tra loro paragonabili
osservati negli altri due gruppi (Figura 4). Non vi erano al contrario
modificazioni nei livelli di mRNA per PPAR-alpha e PGC-1alpha in nessun
gruppo sperimentale (Figura 4).
37
Infine il livello di attivazione di AMPK (determinato attraverso la
misura della sua fosforilazione) non si modificava in risposta a infusione di
insulina indipendentemente dalla presenza di acidi grassi (Figura 4).
4.3 Stress ossidativo
I livelli di stress ossidativo venivano determinati utilizzando la
misurazione dei TBARS come descritto (Metodi). L’infusione di acidi grassi
aumentava significativamente lo stress ossidativo rispetto ai valori basali nel
gruppo trattato con acidi grassi ma non in quelli infusi con insulina o con
soluzione salina (Figura 5a). Le differenze tra valori basali e valori al termine
del clamp erano significativamente diverse nel gruppo trattato con insulina e
acidi grassi rispetto agli altri gruppi sperimentali (Figura 5b).
I livelli di TBARS alla fine del clamp correlavano negativamente con la
sensibilità insulinica nei due gruppi infusi con insulina con o senza acidi grassi
(Figura 6). Una correlazione negativa (r2=0.21; P<0.05) si riscontrava anche tra
livelli di TBARS alla fine del clamp e attività enzimatica muscolare di COX in
tutti gli animali.
38
5. DISCUSSIONE
Lo studio è stato finalizzato a determinare gli effetti di
un’iperinsulinemia acuta e fisiologica sulla utilizzazione insulino-indotta del
glucosio (indice di insulino-sensibilità), sullo stress ossidativo misurato a
livello plasmatico e sulla capacità ossidativa mitocondriale e su alcuni tra i
principali regolatori del metabolismo lipidico-mitocondriale nel muscolo
scheletrico di ratto. Tali effetti venivano determinati in presenza di una
fisiologica riduzione (causata dalla inevitabile soppressione della lipolisi
insulino-indotta) o un incremento (provocato da infusione esogena di
trigliceridi e eparina) dei livelli degli acidi grassi liberi circolanti. I risultati
indicano che: 1) un’infusione di insulina mirata a determinare
iperinsulinemia fisiologica in presenza di normoglicemia non modifica
significativamente lo stress ossidativo, la capacità ossidativa mitocondriale
nonchè l’espressione a livello trascrizionale di PPARgamma, PPARalpha,
PGC-1alpha e la fosforilazione di AMPK; 2) in presenza di identiche
condizioni sperimentali, il parallelo incremento dei livelli circolanti di acidi
grassi liberi riduceva la sensibilità insulinica, aumentava lo stress ossidativo
e induceva una soppressione della capacità ossidativa mitocondriale
39
nonostante un incremento dell’espressione di PPARgamma e in assenza di
modificazioni dei livelli di PPARalpha, PGC-1alpha e AMPK attivata.
5.1 Gli effetti dell’insulina
Lo studio ha chiaramente indicato che un aumento acuto dei livelli
insulinemici, indotto con velocità di infusione dell’ormone attesa indurre
incrementi paragonabili a quelli osservati nel periodo post-prandiale e per un
periodo di tempo analogo, non modifica in modo sostanziale alcuni
indicatori fondamentali del metabolismo lipidico-energetico muscolare. Il
dato è in accordo con risultati in vivo che non confermano effetti stimolanti
dell’insulina di per sè sul metabolismo proteico mitocondriale muscolare in
vivo nell’uomo [Barazzoni et al., 2003]. Al contrario alcuni recenti studi
avevano indicato un ruolo stimolatore centrale dell’insulina nella regolazione
del metabolismo energetico muscolare in presenza di concomitante infusione
aminoacidica mirata a prevenire la riduzione dei livelli di aminoacidi
circolanti in presenza di iperinsulinemia [Stump CS. et al., 2003][Boirie Y.
et al., 2001]. Globalmente questi dati rafforzano il concetto dell’importanza
dell’interazione tra ormoni e substrati-nutrienti nelle risposte adattative
metaboliche in vivo. In particolare la presenza di aminoacidi sarebbe cruciale
per il suo ruolo permissivo nel mantenere la velocità di sintesi proteica anche
40
a livello mitocondriale [Stump CS. et al., 2003][Boirie Y. et al., 2001] che a
sua volta potrebbe permettere un aumento delle molecole mitocondriali e
della capacità ossidativa. Nel presente studio si può presumere una riduzione
dei livelli aminoacidici come invariabilmente osservato in analoghe
condizioni sperimentali in vivo [Stump CS. et al., 2003][DeFronzo RA. et
al., 1981][Barazzoni R. et al., 2003].
Occorre peraltro considerare che il presente studio dimostra per la
prima volta una riduzione a livello muscolare dell’attività di enzimi della
catena respiratoria legata a incremento acuto degli acidi grassi circolanti.
Tale risultato suggerisce che gli effetti dell’iperinsulinemia sulla funzione
mitocondriale muscolare in assenza di concomitante infusione lipidica
possano essere almeno in parte indiretti e risultanti dall’effetto soppressivo
dell’ormone sulla lipolisi e la conseguente riduzione degli acidi grassi
circolanti [Stump CS. et al., 2003][Boirie Y. et al., 2001]. Sulla base di
queste considerazioni gli acidi grassi sono introdotti come importante
componente della regolazione del metabolismo energetico muscolare che
appare in grado di modulare gli eventuali effetti insulinici soprattutto nel
periodo post-prandiale. Poichè il livello di acidi grassi liberi generalmente
non cala in presenza di iperinsulinemia post-prandiale per il concomitante
introito di alimenti che compensa la soppressione della lipolisi, i risultati
dello studio suggeriscono indirettamente che un aumento della funzione
41
ossidativa mitocondriale muscolare non abbia un ruolo determinante
nell’adattamento metabolico acuto all’assunzione di alimenti.
Nelle presenti condizioni sperimentali l’infusione isolata di insulina
non modificava l’espressione di PPARgamma e di altri regolatori del
metabolismo lipidico tra cui AMPK attivata. Soprattutto per quanto riguarda
i livelli di PPARalpha, PGC-1alpha e AMPK attivata tali osservazioni
suggeriscono un sostanziale equilibrio dello stato metabolico tissutale, in
quanto tali regolatori sono stimolati soprattutto da una riduzione della
disponibilità di substrati e di energia quale si osserva ad esempio in
condizioni di digiuno [Hevener AL. et al., 2003][Jove M. et al.,
2004][Lapsys NM. et al., 2000][Norris AW. et al., 2003][Olefsky JM. et al.,
2000][Way JM. et al., 2001][Rhee J. et al., 2003][Leone TC. et al.,
1999][Patti ME. et al., 2003][Mootha VK. et al., 2003][Puigserver P. et al.,
2003][Attie AD. et al., 2003][Winder WW. et al., 1999][Yamauchi T. et al.,
2002][Lochead PA. et al., 2000]. In particolare tale ipotesi è in accordo con
una stimolazione della disponibilità di glucosio prevelentemente a livello
muscolare come atteso nelle presenti condizioni sperimentali. Un effetto
diretto dell’insulina sull’espressione di PPARgamma, PPARalpha, PGC-
1alpha e sulla fosforilazione di AMPK muscolare non è supportato dai
risultati dello studio.
42
5.2 Gli effetti degli acidi grassi
I risultati sostengono fortemente il nuovo concetto che un aumento
acuto di concentrazioni di acidi grassi circolanti in presenza di
iperinsulinemia-normoglicemia ha un effetto inibitorio sulla funzione
mitocondriale muscolare. Il dato suggerisce che una riduzione della capacità
ossidativa muscolare possa contribuire all’effetto di inibizione della
utilizzazione di glucosio insulino-indotta attribuito agli acidi grassi e
chiaramente confermato dal presente studio.
La funzione mitocondriale muscolare è infatti emersa in anni recenti
come un importante regolatore dall’azione insulinica con particolare
riguardo all’utilizzazione del glucosio [Anderwald C. et al., 2002][Barazzoni
R. et al., 2004][Barazzoni R. et al., 2005][Harano Y. et al., 1972]. Una
riduzione della capacità ossidativa muscolare si riscontra infatti in presenza
di obesità e diabete tipo 2 [Anderwald C. et al., 2002][Barazzoni R. et al.,
2004][Barazzoni R. et al., 2005][Harano Y. et al., 1972] [Barazzoni R. et al.,
2001][Barazzoni R. et al., 2003][Barazzoni R. et al., 2003][Jove M. et al.,
2004][Kristal BS. et al., 1997][Murata M. et al., 2002] ed entrambe le
condizioni sono caratterizzate da insulino-resistenza con pressochè
inevitabile aumento dei livelli di acidi grassi circolanti [Anderwald C. et al.,
2002][Barazzoni R. et al., 2004][Barazzoni R. et al., 2005][Harano Y. et al.,
43
1972] [Barazzoni R. et al., 2001][Barazzoni R. et al., 2003][Barazzoni R. et
al., 2003][Jove M. et al., 2004][Kristal BS. et al., 1997][Murata M. et al.,
2002]. I dati del presente studio indicano pertanto nell’eccessiva
disponibilità di acidi grassi un potenziale importante mediatore diretto
dell’insulino-resistenza in tali condizioni, soprattutto in presenza di loro
elevazioni acute in presenza di iperinsulinemia come generalmente
osservabile nel periodo post-prandiale.
Gli acidi grassi aumentavano acutamente i livelli di stress ossidativo
stimato mediante l’importante marker di perossidazione lipidica
rappresentato dai livelli di TBARS, indicativi della produzione di
malonildialdeide. Lo stress ossidativo è implicato in alterazioni a medio-
lungo termine delle strutture tissutali che possono comprendere i mitocondri
con modificazioni del DNA e delle strutture lipidiche e proteiche [Harman
D. et al., 1981][Linnane AW. et al., 1989][Trounce I. et al., 1989][Fallace
DC. et al., 1992][Mooradian AD. et al., 1994][Aksenova MW. et al., 1998].
Per tali motivi e per l’elevata concentrazione di ossidanti nel mitocondrio
stesso lo stress ossidativo è stato implicato nella patogenesi delle disfunzioni
mitocondriali croniche associate all’invecchiamento [Harman D. et al.,
1981][Linnane AW. et al., 1989][Trounce I. et al., 1989][Fallace DC. et al.,
1992][Mooradian AD. et al., 1994][Aksenova MW. et al., 1998]. Tuttavia i
risultati del presente studio suggeriscono effetti acuti a livello mitocondriale
44
muscolare, supportati dalle associazioni negative dei livelli di TBARS
circolanti con insulino-sensitività e attività di citocromo c ossidasi
muscolare. Tali effetti potrebbero essere mediati da effetti negativi diretti
sulla trascrizione mitocondriale, come suggerito da precedenti studi nel
diabete tipo 1 [Kristal BS. et al., 1997]. A livello molecolare la disfunzione
mitocondriale potrebbe inoltre essere direttamente mediata dal legame della
malonildialdeide con strutture mitocondriali come precedentemente
suggerito in altri tessuti [Liu J. et al., 2002]. Risulta importante sottolineare
come un aumentato stress ossidativo si riscontri in condizioni associate a
insulino-resistenza quali l’obesità e il diabete mellito tipo 2, così come
nell’invecchiamento [Furukawa S. et al., 2004][Harman D. et al.,
1981][Linnane AW. et al., 1989][Trounce I. et al., 1989][Fallace DC. et al.,
1992][Mooradian AD. et al., 1994][Aksenova MW. et al., 1998]. Sulla base
delle precedenti considerazioni i presenti risultati suggeriscono un ruolo
significativo dello stress ossidativo mediato dagli acidi grassi nel loro effetto
negativo su funzione mitocondriale muscolare e nell’insulino-resistenza.
L’incremento acuto di acidi grassi circolanti durante iperinsulinemia non
modificava l’espressione di PPARalpha e PGC-1alpha, nè l’attivazione di
AMPK. Pertanto tali regolatori non appaiono giocare un ruolo determinante
nella riduzione della capacità ossidativa della catena respiratoria mediata dagli
acidi grassi stessi. Gli acidi grassi aumentavano peraltro l’espressione
45
trascrizionale di PPARgamma. Tale effetto è in accordo con dati precedenti e
riflette la regolazione da parte di substrati lipidici di tale mediatore [Hevener
AL. et al., 2003][Jove M. et al., 2004][Lapsys NM. et al., 2000][Norris AW. et
al., 2003][Olefsky JM. et al., 2000][Way JM. et al., 2001][Rhee J. et al., 2003].
Un’attivazione del PPARgamma in vari tessuti attiva risposte metaboliche
tessuto-specifiche [Hevener AL. et al., 2003][Jove M. et al., 2004][Lapsys NM.
et al., 2000][Norris AW. et al., 2003][Olefsky JM. et al., 2000][Way JM. et al.,
2001][Rhee J. et al., 2003]. Nel muscolo scheletrico PPARgamma appare
associato all’espressione di geni lipoossidativi [Lapsys NM. et al., 2000] e in
alcuni studi ad aumentata funzione mitocondriale [Barazzoni R. et al., 2005].
Inoltre la inattivazione di PPARgamma specificamente nel tessuto muscolare si
associa a insulino-resistenza in modelli animali [Norris AW. et al., 2003].
Appare pertanto improbabile che l’upregolazione dell’espressione di
PPARgamma abbia avuto un ruolo causale nella soppressione della attività di
citocromo ossidasi. Un incremento dei livelli di acidi grassi liberi si osserva
anche in condizioni di digiuno in cui l’insulinemia è tipicamente ridotta
[Barazzoni R. et al., 2005] e l’ossidazione di substrati lipidici anche a livello
muscolare è mantenuta o aumentata [Barazzoni R. et al., 2005]. Pertanto è
ipotizzabile che un effetto stimolante sulla funzione ossidativa muscolare
mediata dalla stimolazione dell’espressione di PPARgamma da parte degli acidi
grassi si associ fisiologicamente a condizioni di digiuno. Tale interazione
46
appare essere alterata in presenza di iperinsulinemia nelle presenti condizioni
sperimentali. Un aumentato livello di stress ossidativo (quale non si osserva in
condizioni di digiuno) con alterazione diretta della funzione mitocondriale
potrebbe contribuire a questo effetto.
47
6. CONCLUSIONI
In conclusione il presente studio ha dimostrato che un aumento dei
livelli di acidi grassi circolanti ha un impatto negativo su insulino-sensibilità,
stress ossidativo e attività enzimatica mitocondriale muscolare in un modello
sperimentale di ratto durante iperinsulinemia acuta. I dati suggeriscono un
meccanismo potenziale alla base dell’insulino-resistenza associata a obesità
e diabete tipo 2 in presenza di eccesso di acidi grassi circolanti, soprattutto
nel periodo post-prandiale.
48
Legenda alle Figure
Figura 1: Utilizzazione di glucosio insulino-mediata nei due gruppi di
animali trattati con insulina o con insulina e acidi grassi *: P<0.05 vs
Con.
Figura 2: Concentrazioni plasmatiche di acidi grassi liberi nei tre gruppi
sperimentali all’inizio e alla fine del clamp. *: P<0.05 vs Basale; i valori
dopo clamp nei gruppi Ins e Ins+FFA sono significativamente diversi dai
corrispondenti valori nel gruppo Con.
Figura 3: Effetti dell’infusione di insulina senza (Ins) o con (Ins+FFA)
acidi grassi sull’attività enzimatica di citocromo c ossidasi (COX) e
citrato sintetasi (CS) *: P<0.05 vs Con e Ins.
Figura 4: Effetti dell’infusione di insulina senza (Ins) o con (Ins+FFA)
acidi grassi sui livelli di mRNA di PPARgamma (a), PPARalpha (b),
PGC-1alpha (c) e sulla fosforilazione di AMPK (d). *: P<0.05 vs Con e
Ins.
Figura 5: a) Concentrazioni plasmatiche di TBARS nei tre gruppi
sperimentali all’inizio e alla fine del clamp. *: P<0.05 vs Basale e vs Con
e Ins. b) Modificazioni della concentrazione di TBARS nei tre gruppi
sperimentali in risposta alle infusioni. *: P<0.05 vs Con e Ins.
49
Figura 6: Correlazione tra livelli plasmatici di TBARS alla fine del
clamp e utilizzazione di glucosio insulino-mediata nei ratti trattati con
insulina o con insulina e acidi grassi.
50
Tabella 1: peso corporeo totale, peso dei pannicoli di tessuto adiposo (TA)
epididimale e retroperitoneale, loro percentuale del peso corporeo, glicemia
iniziale (t=0) e finale (t=150).
_____________________________________________________________
Con Ins Ins-FFA
Peso Corporeo (g) 318±4 314±3 314±5
TA epididimale (g) 2.30±0.09 2.58±0.17 2.30±0.09
TA retroperitoneale (g) 3.36±0.32 3.59±0.28 3.86±0.21
% peso corporeo 2.09±0.15 2.27±0.18 2.21±0.14
Glicemia (t=0, mmol/l) 5.8±0.6 5.7±0.3 5.5±0.4
Glicemia (t=150, mmol/l) 5.6±0.4 5.8±0.5 5.6±0.6
_____________________________________________________________
51
Figura 1
Utilizzazione di g lucosio
insu lino-me diata
0
0,1
0,2
mg
/min
.g b
od
y w
eig
ht
*
Ins+FFA
Ins
52
Figura 2
Acidi Grassi Libe ri
0
1
2
3
4
mm
ol/l
*
*
Clamp
Basal
Con Ins Ins-FFA
53
Figura 3
Ins
Con
Ins+FFA
0
200
400
600
800
mic
rom
ol/
min
. g
pro
tein
COX CS
*
54
Figura 4
Ins
Con
Ins+FFA
0
200
400
600
800
1000
1200p
erc
en
t o
f c
on
tro
lPPARgamma *
0
50
100
150
200
250
300
pe
rce
nt
of
co
ntr
ol
PGC-1alpha
55
0
50
100
150
200
250
300
pe
rce
nt
of
co
ntr
ol
p-AMPK
0
50
100
150
200
250
300p
erc
en
t o
f c
on
tro
lPPARalpha
56
Figura 5
TBARS
0
10
20
30
40
50
60
70
mm
ol/
l
*
Con Ins Ins-FFA
- 10
0
10
20
30
40
50
mm
ol
Modificazioni
TBARS
*
a)
b)
Ins
Con
Ins+FFA
57
Figura 6
R2 = 0, 4826
0
20
40
60
80
100
0, 00 0, 05 0, 10 0, 15 0, 20 0, 25
Utilizzazione di glucosio insulino-mediata
(mg/g min)
TB
AR
S
58
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8. RINGRAZIAMENTI
Desidero esprimere un sentito ringraziamento al prof. Luigi Cattin per la
professionalità e la disponibilità usate nei miei confronti durante la
preparazione della tesi. Ringrazio inoltre il prof. Gianfranco Guarnirei per la
cortesia con la quale mi ha permesso di frequentare il laboratorio di Ricerca
della Clinica Medica. Un profondo ringraziamento va al dott. Rocco Barazzoni
per la disponibilità e l’interesse con cui mi ha seguito: un sostegno importante
nelle fasi di preparazione ed elaborazione del presente studio. Desidero inoltre
ringraziare la dott.ssa Michela Zanetti per la gentilezza e l’esperienza con la
quale mi ha dato consigli e suggerimenti utili. Un riconoscimento particolare va
al dott. Marco Stebel ed alle sue collaboratrici (Paola e Cristina) per gli
insegnamenti e l’aiuto fornitomi nella delicata fase di lavoro con gli animali.
Non dimentico inoltre la dott.ssa Alessia Pirulli per l’amicizia e l’importante
aiuto che ha saputo darmi ed il supporto e la professionalità del sig. Cadelli
nella fase di preparazione chirurgica degli animali.
Un ringraziamento affettuoso è rivolto al personale tecnico del
laboratorio, alle sig.re Anna Maria Semolic, Mariella Sturma ed Anna
DeSanctis che con pazienza e dedizione mi hanno guidato nell’apprendimento
74
delle principali tecniche di laboratorio. Allo stesso modo ringrazio Barbara e
Rossella. Grazie a tutte voi per l’amicizia ed il sostegno.
Grazie anche ai miei adorati nonni per la pazienza e l’affetto con i quali
mi hanno sostenuto in questi anni. Un ringraziamento speciale va a Giulietta
perché le sue parole sono sempre venute dal cuore. Ricordo e ringrazio inoltre i
miei cari amici Elisa, Giorgio, Ale, Jenny, Giovanni ed Emanuele per la
sopportazione e l’aiuto a superare i momenti di tensione. Grazie anche a
Claudia e a Silvia per quest’ultimo anno di vita triestina.