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Métodos Alternativos para Enumeração e Identificação de

Microrganismos

• QUESTÕES DE PROVAS;QUESTÕES DE PROVAS;• CONTEÚDO DAS PRÓXIMAS AULAS;CONTEÚDO DAS PRÓXIMAS AULAS;• EXERCÍCIOS CONCEITUAIS;EXERCÍCIOS CONCEITUAIS;

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TESTES DE CONTROLE NO

PROCESSOMONITORAÇÃO

AMBIENTAL

TESTES DO PRODUTO TERMINADO

Histórico

A tarefa do laboratório de microbiologia na área farmacêutica consiste em prover, para todo o processo de produção, informações de natureza microbiológica, tais como:

Histórico

Para este propósito, o microbiologista deve dispor de métodos analíticos confiáveis e exatos, que permitam a enumeração e identificação de microrganismos;

Falhas neste aspecto conduzirão a sistemas fora de controle, ocasionando como consequência a possibilidade de uso, pelo paciente, de produto potencialmente inseguro, além de perdas para a empresa;

Disponibilizando tecnologia e instrumentos levando-se em conta o ambiente da indústria farmacêutica, que é altamente regulado;

Histórico

A área de métodos rápidos e automação têm se desenvolvido aceleradamente nos últimos 15 a 20 anos;

Assim, observa-se uma abordagem conservadora e que apresenta a necessidade de rígidos requisitos de validação;

Histórico

9000-8000 a.c.

A maioria dos testes efetuados hoje continua a ter por base métodos seculares, desenvolvidos pelos microbiologistas pioneiros;

Louis Pasteur Robert Koch Joseph Lister

Isto ocorre porque esses métodos são simples e não dispendiosos, podem ser muito eficientes, e têm uma longa história de aplicação;

Histórico

Testes baseados na diluição seriada e recuperar os microrganismos usando meio de cultura estéril, sólido ou líquido;

Porém, existem limitações decorrentes da baixa velocidade do crescimento microbiano, seleção do meio de cultura e respostas heterogêneas;

Assim, verificou-se a necessidade da criação de uma força tarefa, que trabalhando conjuntamente para implementar os novos testes publicou um relatório designado PDA Technical Report nº 33, Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing Methods (PDA, 2000);

Histórico

O relatório influenciou na publicação de diversos outros capítulos e, como resultado, os métodos microbiológicos rápidos passaram a ser vistos e considerados para implementação na indústria;

Então surge a questão se os novos métodos são tão bons quanto os métodos clássicos ou convencionais.

É necessário avaliar, validar e obter aprovação na implementação das novas técnicas;

Histórico

O período do desenvolvimento de kits de testes imunológicos ocorreu de 1975 a 1985, enquanto de 1985 a 1995 o foco recaiu sobre as provas genéticas e a reação de polimerase (polymerase chain reaction – PCR);

Novos paradigmas

De 1965 a 1975 enfatizou-se a miniaturização e o desenvolvimento de kits diagnósticos;

A tendência atual tem, de modo geral, se dirigido ao âmbito do biosensor e da tecnologia do chip, contando com instrumentação e automação;

Novos paradigmas

Porém, a maioria dos métodos disponibilizados aos microbiologistas farmacêuticos e aceitos pelas autoridades regulatórias, baseiam-se em métodos de cultivo;

Por exemplo, se for identificada contaminação num teste em processo, um ciclo de fabricação pode ser interrompido e o problema corrigido;

Novos paradigmas

Considerando os vários dias de incubação, e o impacto dessa demora levar à perda de produtos contaminados;

Assim, podendo ser poupado o alto custo do produto terminado e dos inventários e evitando a redução da flexibilidade de resposta à demanda;

Outra desvantagem relativa à abordagem usual ou tradicional consiste no fato de que métodos de cultivo empregados podem não ser capazes de recuperar todos os microrganismos presentes na amostra-teste;

Novos paradigmas

O que pode resultar na potencial liberação de produto contaminado;

Novas tecnologias microbiológicas, que superam todas ou algumas das limitações dos métodos convencionais, estão disponíveis;

Existem certos sistemas cujos resultados podem ser obtidos em tempo real, tornando possível obter monitoramento ambiental ou biocarga de insumos antes do início da produção;

Novos paradigmasEstes novos métodos apresentam resultados no mesmo dia ou em até 2 dias, muito mais rápido quando comparado aos métodos tradicionais;

Adicionalmente, há métodos rápidos que não dependem de cultivo, assim, não exigem o crescimento de microrganismos;

• Detecção de presença ou de ausência de microrganismos em uma amostra-teste;

Métodos MicrobiológicosOs métodos de testes microbiológicos podem ser divididos em três amplas categorias gerais, de acordo com a sua finalidade:

• Enumeração de microrganismos presentes na amostra-teste;

• Caracterizar e identificar microrganismos que são recuperados de produto ou do ambiente;

• Tecnologias baseadas no crescimento;

Métodos MicrobiológicosConsiderando as tecnologias para testes de controle de qualidade microbiológico, com ênfase nas inovadoras, podemos classificá-las em:

• Tecnologias baseadas na viabilidade;

• Tecnologias baseadas nos componentes celulares, ou artefatos;

• Tecnologias baseadas nos ácidos nucleicos;

Tecnologias Baseadas no CrescimentoParâmetros bioquímicos ou fisiológicos refletem o crescimento dos microrganismos e, sendo dependentes do crescimento destes, não são caracterizados como testes realmente rápidos;

Adicionalmente, a seletividade inerente de meios de cultura e suas condições de incubação limitam a faixa de microrganismos a serem enumerados;

As tecnologias baseadas no crescimento e suas aplicações incluem:

Tecnologias Baseadas no Crescimento

Bioluminescência ATP e AK

Tecnologias Baseadas no CrescimentoA medida de bioluminescência do ATP para análise microbiológica é amplamente usada na indústria de alimentos e cosméticos, para várias aplicações, incluindo monitoramento e testes de produtos terminados;

Nos últimos anos tem crescido o interesse dos laboratórios farmacêuticos por estes sistemas;

Comercialmente disponíveis, há três sistemas com potencial uso na indústria farmacêutica:


Rapidscreen®

MicroStar®

PallChek®


Detecção colorimétrica e da pressão do headspace de produção de CO2


Utilização de carbono, reações bioquímicas e fisiológicas

MANITOL

GLICOSE e LACTOSE


Impedância e condutividade (detecção de bioburden)


Plaqueamento Espiral

Permite a automatização na semeadura de

amostras, evitando contaminações cruzadas e diminuindo o tempo e o

número de placas;


Membrana filtrante hidrofóbica

Pour plate e semeadura da amostra em superficie


Método dos tubos múltiplos

Tecnologias Baseadas na ViabilidadeBaseiam-se na coloração vital de componentes bioquímicos das células microbianas, ou ainda na fluorescência da clivagem enzimática de substratos fluorogênicos das paredes celulares;

Como não se baseiam no crescimento dos microrganismos, podem ser universais e rápidos;

Suas aplicações incluem:

Microscopia direta de filtro epifluorescente

Tecnologias Baseadas na Viabilidade

Citometria de Fluxo

Tecnologias Baseadas em Componentes Celulares ou Artefatos

Baseiam-se na medida de componentes celulares que proporcionam um alto grau de especificidade conduzindo a resultados rápidos;

As desvantagens incluem a possível necessidade de elevado número de células para alguns tipos de testes, sua alta especificidade, necessidade de grandes bases de dados e mudança de paradigma, ao tratar microrganismos (entidades bioquímicas) como substâncias químicas;



• Perfis de ésteres metílicos de ácidos graxos;

• Espectrometria de massa por dessorção e ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF);

• Técnicas de fluorescência de anticorpos;

• Ensaio de imunossorbância ligada à enzima;



• Aglutinação de látex;

• Ensaio de endotoxina;

• Coloração de Gram;

Tecnologias Baseadas nos Ácidos Nucleicos

Baseiam-se na detecção de sequências de ácidos nucleicos. São limitadas pela preparação de amostra, captura do alvo, amplificação e detecção das sequências de ácidos nucleicos;


• Sondas de ácidos nucleicos;

• Amplificação de DNA - PCR;


• Técnicas de sequenciamento do RNAr, porções 16S e 23S;

• Impressões digitais (fingerprint) – PCR – baseadas na sequência repetitiva;

• Amplificação da transcrição – mediada em tempo real;

• Pyrosequencing;


• Riboprinting automatizado;

• Mapeamento óptico;

OBRIGADO

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