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METABOLISME ENERGETIQUE MITOCHONDRIALDANSDES SITUATIONS DE PERTE DE POIDS

Jean-François Dumas

To cite this version:Jean-François Dumas. METABOLISME ENERGETIQUE MITOCHONDRIAL DANSDES SITUA-TIONS DE PERTE DE POIDS. Biochimie [q-bio.BM]. Université d’Angers, 2004. Français. <tel-00128547>

UNIVERSITE D’ANGERS Année : 2004

N° ordre : 624

METABOLISME ENERGETIQUE MITOCHONDRIAL DANS

DES SITUATIONS DE PERTE DE POIDS

THESE DE DOCTORAT

Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire

ECOLE DOCTORALE D’ANGERS

Présentée et soutenue publiquement

Le : 10 novembre

à : ANGERS

par : Jean-François DUMAS

Devant le jury ci-dessous :

M. Bernard FROMENTY (Rapporteur), Chargé de Recherche, INSERM

M. Eric FONTAINE (Rapporteur), Docteur, Université Joseph Fourier

M. Charles COUET (Examinateur), Professeur, Université de Tours

M. David MACHEREL (Examinateur), Professeur, Université d’Angers

M. Yves MALTHIERY (Examinateur), Professeur, Université d’Angers

Directeur de thèse: M. Patrick RITZ, Professeur, Université d’Angers

Nom et coordonnées du Laboratoire :

Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, INSERM EM 00.18,

CHU, 4 rue Larrey, 49033 ANGERS cedex 01

ED 363

Je tiens à remercier vivement :

Messieurs Eric Fontaine et Bernard Fromenty,

Sensible à l’intérêt que vous avez bien voulu porter à ce travail, en acceptant d’être

rapporteurs et ceci en dépit de vos charges, je vous prie de croire en ma profonde

reconnaissance.

Messieurs Charles Couet, David Macherel et Yves Malthièry,

Pour l’attention que vous avez portée à ce travail et pour l’honneur que vous me faites

en acceptant d’être examinateur malgré vos nombreuses charges, recevez ici l’expression de

mon profond respect. Je remercie également, Monsieur Yves Malthièry, pour son accueil au

sein du laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire.

Monsieur Patrick Ritz,

Avec enthousiasme, disponibilité, efficacité et sympathie, vous avez encadré ces

années de recherche. Vous avez pris une part prépondérante dans ma formation de jeune

chercheur et m’avez donné l’envie d’aller plus loin. L’excellence est assez rare pour que l’on

puisse la souligner. Vous resterez à jamais un exemple pour moi.

Angers Agglomération

Pour avoir soutenu le projet et financé mon salaire durant toute la durée de la thèse.

Monsieur Gilles Simard,

Pour votre temps passé à lire et corriger les articles et le manuscrit de cette thèse.

Messieurs Jean-Pierre Renou et Guy Bielicki,

Pour votre collaboration précieuse et efficace sur les expériences de RMN.

Monsieur Damien Roussel,

Pour m’avoir fait partager vos connaissances techniques et intellectuelles sur la

bioénergétique mitochondriale.

Mesdemoiselles, Mesdames et Messieurs Miriam Ryan, Laëtitia Lagoutte, Agnès Sallé,

Françoise Foussard, Olivier Douay, Pierre-Henri Ducluzeau, Gyasi Johnson, Matthieu

Arvier, Florent Favreau

Pour les discussions et conseils lors des réunions, pour la correction de l’anglais des

articles et pour l’aide technique dans certaines expériences.

Un travail de thèse c’est aussi tout ce qui se passe hors de la paillasse et hors du labo. Pour

tous ces très bons moments, autour d’un café ou autres boissons, autour d’un pique-nique, à

faire du vélo…je tiens aussi à remercier très chaleureusement, Agnès, Anne, Arnaud, Aurélie,

Carole, Caroline, Catherine, Cathy, Charline, Christelle, Chrystèle, Damien, Dany, Delphine,

Fabien, Florent, Gilles, Gyasi, Hélène, Jean-Fred, Julie, Julien, Laëtitia, Marc, Matthieu,

Mireille, Miriam, Nikki, Olivier, Patrick, Stéphanie, Valérie, Véro. Je doute qu'un travail de

thèse puisse se dérouler dans une ambiance plus sympathique que celle que vous avez su

créer.

Je m’en voudrais de ne pas également remercier très amicalement, Anne, Dominique,

Florence, Frédérique, Jean-Luc, Jocelyne, Philippe, Pascal, Patrice, Patricia, Yves, qui ont

aussi contribué à rendre ce parcours plus agréable.

Enfin merci à ceux qui auront fait l’effort de lire ces remerciements jusqu’au bout…

A mes parents,

A ma sœur,

A ma famille.

« La théorie, c'est quand on sait tout et que rien ne fonctionne. La pratique, c'est quand tout

fonctionne et que personne ne sait pourquoi. Ici, nous avons réuni théorie et pratique : Rien ne

fonctionne et personne ne sait pourquoi ! »

Albert Einstein

Abréviations

∆ψ : potentiel de membrane ∆p : force proton-motrice

ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire

ADP: adénosine 5'-diphosphate

AGL : acides gras libres

ANT : translocase des nucléotides adényliques

ARNm: acide ribonucléique messager

ATP: adénosine 5'-triphosphate

COX : cytochrome c oxydase

CS : citrate synthase

DEXA : absorptiométrie bi-photonique

DNP : dinitrophénol

EDL : muscle extenseur long des doigts

FADH2 : flavine adénine dinucléotide hydrogénée

FCCP : carbonylcyanide-p-trifluorométhoxyphenylhydrazone

GDPHmt : glycérol phosphate deshydrogenase mitochondrial

GR : récepteur aux glucocorticoïdes

HK : hexokinase

IL-1β : interleukine 1β

NADH : nicotinamide-adénine dinucléotide hydrogéné

NF-κB : facteur nucléaire κB

O : oxygène

PCr : créatine phosphate

PF : pair-fed

PGC-1 : coactivateur-1, gamma des récepteurs activés par les proliférateurs des peroxysomes

PIF : facteur d’induction de la protéolyse

PPAR-α : récepteur gamma activé par les proliférateurs des peroxysomes

RMN : résonance magnétique nucléaire

ROS: molécules réactives dérivées de l'oxygène

rT3 : tri-odo-thyronine inverse

SAB : sérum albumine bovine

SD : succinate deshydrogénase

SOD : superoxyde dismutase

T2 : di-iodo-thyronine

T3 : tri-odo-thyronine

T4 : tetra-iodo-thyronine

TMPD : N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine

TNF-α : facteur de nécrose de tumeur

UCP : protéine découplante

VIH : virus de l'immuno-déficience humaine

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

LISTE DES TABLEAUX ET DES FIGURES

TABLEAUX

Tableau 1. Etudes sur la dépense d’énergie en cas de perte de poids. verso page 19

Tableau 2. Métabolisme énergétique mitochondrial hépatique. verso page 35

Tableau 3. Métabolisme énergétique mitochondrial musculaire. verso page 36

FIGURES

Figure 1. Chaîne respiratoire mitochondriale. verso page 8

Figure 2. Tracé d’oxygraphie. verso page 10

Figure 3. Consommation d’oxygène en fonction du potentiel

de membrane. verso page 11

Figure 4..Complexe IV ou cytochrome c oxydase. verso page 13

Figure 5. Action de la restriction calorique sur le métabolisme

énergétique de mitochondries de foie. verso page 50

Figure 6. Mode d’action de la dexaméthasone sur le métabolisme

énergétique de mitochondries de foie. verso page 89

Figure 7. Mode d’action de la dexaméthasone sur le métabolisme

énergétique de mitochondries de muscle squelettique. verso page 90

SOMMAIRE

AVANT-PROPOS 1

FONCTIONS ENERGETIQUES MITOCHONDRIALES DANS LES SITUATIONS DE

PERTE DE POIDS: RESTRICTION CALORIQUE ET HYPERCATABOLISME. 8

I. Introduction 9

II. Régulation du rendement de la conversion d'énergie mitochondriale. 10

A. Découplage extrinsèque de la phosphorylation oxydative 11

1. Perméabilité membranaire. 11

2. Fuite de protons inductible 12

B. Découplage intrinsèque de la phosphorylation oxydative 14

1. Stœchiométrie H+/e

- 14

2. Stœchiométrie H+/ATP 15

III. Les situations de perte de poids. 17

A. La perte de poids volontaire. 18

1. Perte de poids volontaire et dépense d'énergie du corps entier 18

2. Quels sont les mécanismes de cette adaptation ? 21

a) La masse des organes métaboliquement actifs 21

b) Profil hormonal 21

(1) Hormones thyroïdiennes 21

(2) Leptine 22

c) Métabolisme énergétique mitochondrial: 25

(1) au niveau du foie. 26

(2) au niveau du muscle squelettique. 27

B. La perte de poids involontaire. 30

1. Perte de poids involontaire et dépense d'énergie du corps entier 31

2. Quels sont les mécanismes et causes responsables de cet état

d’hypermétabolisme ? 33

a) Inflammation et modifications endocriniennes 33

b) Phénomènes consommant de l'ATP 33

c) La masse des organes métaboliquement actifs 34

d) Augmentation de l’activité des protéines découplantes 37

e) Métabolisme énergétique mitochondrial 35

(1) au niveau du foie. 36

(2) au niveau du muscle squelettique. 36

IV. Conclusion 38

RESTRICTION CALORIQUE ET METABOLISME ENERGETIQUE

MITOCHONDRIAL 39

Article 1 52

Article 2 59

DEXAMETHASONE ET METABOLISME ENERGETIQUE MITOCHONDRIAL 77

Article 3 92

Article 4 102

Article 5 108

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 125

BIBLIOGRAPHIE 129

FICHES TECHNIQUES 159

Fiche technique n° 1. Isolement de mitochondries de foie 161

Enrichissement en mitochondries de foie (homogénat) 161

Fiche technique n° 2. Isolement des populations mitochondriales musculaires 163

Enrichissement en mitochondries de muscle (homogénat) 164

Fiche technique n° 3. Dosage protéique par spectrophotométrie 165

Fiche technique n° 4. Dosage enzymatique des complexes de la chaîne respiratoire par

spectrophotométrie 166

Fiche technique n° 5. Détermination de la consommation d’oxygène mitochondriale par

l’utilisation d’une électrode sensible à l’oxygène 175

Fiche technique n° 6. Détermination du potentiel de membrane par l’utilisation d’une

électrode sensible au TPMP 179

Fiche technique n° 7. Détermination de la relation entre la consommation d’oxygène

mitochondriale et le potentiel de membrane en condition non-phosphorylante 182

Fiche technique n° 8. Détermination de la relation entre la consommation d’oxygène

mitochondriale et le potentiel de membrane en condition phosphorylante 185

Fiche technique n° 9. Détermination de la synthèse d’ATP par spectrophotométrie 188

Fiche technique n° 10. Détermination du rapport ATP/O 190

Fiche technique n° 11. Quantification des cytochromes par spectrophotométrie 193

Fiche technique n° 12. Dosage de la concentration de glycogène par

spectrophotométrie 194

AVANT-PROPOS

1

Depuis 2000, le laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire développe un

thème de recherche animé par le professeur Patrick Ritz et centré sur la régulation de la

conversion énergétique mitochondriale chez le patient en situation de perte pondérale

influencée par l’état nutritionel. Les premières études sur ce sujet, peu exploré à l’époque, ont

débuté à mon arrivée, par des travaux sur des modèles expérimentaux animaux qui font partie

de ma thèse d’université.

La dénutrition est un processus dynamique qui résulte d’un déséquilibre entre apports

alimentaires et dépense d’énergie. Les conséquences sont multiples en termes de mortalité

augmentée, de morbidité et d’économie de santé: altération des fonctions immunitaires et

musculaires (autonomie), augmentation des durées et des coûts de séjour, diminution de la

qualité de vie (Morley, 1998). La dénutrition concerne tout particulièrement les personnes

âgées, avec une prévalence variant entre 5 et 85% selon les groupes, en fonction de leur

situation clinique et pathologique. De plus, un état de dénutrition peut intervenir très

rapidement (quelques jours), ce qui fait que cette pathologie se rencontre fréquemment chez

les personnes hospitalisées. Il s'agit donc d'une problématique de santé publique à cause de la

gravité des conséquences, du coût social et de l'incidence importante de cette pathologie.

Dans tous les cas, la dénutrition relève d'un déséquilibre entre apports et besoins. Elle peut

être consécutive à un défaut d'apport (restriction calorique et ses conséquences adaptatives)

et/ou à une augmentation des besoins (état d'hypercatabolisme et son environnement

physiopathologique). Cette distinction claire est parfois schématique et les situations cliniques

réelles sont parfois plus intriquées. Ainsi, par exemple chez les personnes âgées, la dénutrition

résulte d'une réduction des apports alimentaires (anorexie liée à l'âge, défaut d'adaptation de

l'alimentation et de l'appétit; Wilson et al., 2002), d’une anorexie induite par la maladie et

c'est souvent le facteur prédominant (Reilly, 2002). La dénutrition peut également résulter

d'une augmentation de la dépense d'énergie. Bien que celle-ci soit généralement modérée

(environ 10% en cas de fracture du col du fémur; Paillaud et al.., 2000) cela est suffisant pour

entraîner un déficit énergétique chronique (Ritz et Elia, 1999). Ces deux causes de perte de

poids apparaissent donc intimement liées en pathologie. D’un autre côté, une restriction

calorique de quelques jours est aussi un phénomène fréquemment rencontré en médecine

(préparation pour explorations fonctionnelles, situation pré-opératoire).

En cas de restriction calorique, le métabolisme de base s'adapte et génère un système

d'économie (Blanc et al., 2003). A l’inverse, l’état d’hypercatabolisme est paradoxal, puisque

2

la dépense d’énergie est augmentée, malgré des apports alimentaires réduits (Cunningham,

1990; Schwenk et al., 1996; Chiolero et al., 1997; Paillaud et al., 2000). Cependant, quelle

que soit la situation de perte de poids considérée, les mécanismes impliqués dans les

modifications de dépense d’énergie sont discutés. Parmi ceux-ci, il est tout à fait envisageable

que l’efficacité de synthèse de l’ATP mitochondriale soit modifiée, induisant en retour une

modification de la consommation d’oxygène du corps entier. En effet, plus de 90% de la

consommation d’oxygène de repos est d’origine mitochondriale, dont environ 80% couplée à

la synthèse d’ATP et 20% perdue sous forme de chaleur (Rolfe et Brown, 1997). Cependant

ce rapport ATP/O (efficacité de la phosphorylation oxydative) n’est pas constant. Par

conséquent, pour une demande en énergie (ATP) donnée, la consommation d’oxygène

correspondante sera diminuée si l’efficacité de la phosphorylation est améliorée. A l’inverse,

la consommation d’oxygène sera augmentée si le rapport ATP/O est diminué. Il est de plus

envisageable que ces modifications se déroulent entre autres dans le foie et les muscles

squelettiques, qui participent pour 50% au métabolisme de base (Rolfe et Brown, 1997).

Le but des travaux de cette thèse était donc l’étude du métabolisme énergétique

mitochondrial et de l’efficacité de la phosphorylation oxydative en particulier, dans deux

modèles de rats avec perte de poids (restriction calorique et dénutrition) à court terme

(quelques jours). L’étude du métabolisme énergétique consistait à déterminer l’ensemble des

mécanismes intervenant dans l’efficacité de la phosphorylation oxydative (respiration

mitochondriale, synthèse d’ATP, fuite de protons, activité et efficacité de la chaîne

respiratoire, quantification de l’expression de gènes codant pour des protéines de la chaîne

respiratoire).

La première partie de la thèse consiste en l’étude bibliographique du métabolisme

énergétique mitochondrial et ses relations avec la restriction calorique et l’hypercatabolisme.

La deuxième partie, concerne les différents travaux où nous avons étudié les

modifications du métabolisme énergétique de mitochondries isolées dans les deux modèles de

perte de poids (rat restreint en calories et rat traité par dexaméthasone).

Pour le modèle de restriction calorique, nous avons étudié l’impact de 3 jours de

restriction calorique (50% des apports alimentaires) sur le fonctionnement de la chaîne

respiratoire de mitochondries isolées de foie (premier article). Dans le deuxième article,

nous avions formulé l’hypothèse que l’adaptation du métabolisme énergétique des

mitochondries de foie était d’une part proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique

3

(rats restreints de 25, 50 et 75%), et que d’autre part, elle pouvait être sous le contrôle de la

tri-odo-thyronine (T3) et/ou de la leptine (analyse de corrélation pas à pas entre les paramètres

respiratoires et les concentrations plasmatiques des deux hormones).

Pour le modèle de dénutrition, dans le troisième article, nous avons déterminé

l’impact spécifique d’un traitement par dexaméthasone (5 jours à raison de 1,5 mg par jour et

par kg) sur le métabolisme énergétique de mitochondries de foie et de muscles squelettiques.

Dans le quatrième article, nous nous sommes intéressés tout particulièrement à la relation

entre le potentiel de membrane et la consommation d’oxygène en condition non-

phosphorylante (respiration état 4-oligomycine), ceci afin de déterminer la fuite de protons

et/ou l’efficacité de la chaîne respiratoire à former le potentiel de membrane dans des

mitochondries de foie et de muscles squelettiques chez les rats traités par dexaméthasone.

Le but du cinquième article, était d’analyser in vivo (résonance magnétique nucléaire du

phosphore 31) le métabolisme énergétique (détermination des concentrations en ATP, PCr) de

muscles squelettiques de rats traités par dexaméthasone.

Au cours de ces travaux, j’ai été amené à mettre en place les techniques d’isolement

des mitochondries (cf. fiches techniques n°1 et 2), de mesure de la consommation d’oxygène

sur mitochondries isolées de foie et de muscles (oxygraphie; cf. fiche technique n°5), de

mesure de l’efficacité de la phosphorylation oxydative (rapport ATP/O avec un système

enzymatique, hexokinase + glucose, générant des concentrations différentes et non-saturantes

d’ADP; cf. fiche technique n°10). Ces techniques sont couramment utilisées en routine. J’ai

aussi été amené à utiliser la technique de la mesure du potentiel de membrane (technique

apportée par Damien Roussel).

Au cours (et à la suite) de cette thèse, j’ai été amené à participer à une étude humaine

(thèse de Agnès Sallé) dont le but est l’analyse du métabolisme énergétique (au niveau du

corps entier et de mitochondries musculaires) chez des personnes obèses soumises à 6 mois de

restriction calorique. Dans cette étude, je réalise les mesures de respiration sur fibres

musculaires perméabilisées. J’ai aussi débuté une étude humaine qui a pour objectif de

déterminer le métabolisme énergétique (au niveau du corps entier et de mitochondries

musculaires) chez des personnes dénutries et ayant une fracture du col fémoral.

Ce travail de thèse a donné lieu aux publications et communications suivantes :

4

Publications

1) Food restriction affects energy metabolism in rat liver mitochondria. BBA 2004,

1670: 126-131.

Dumas JF, Roussel D, Simard G, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P.

2) Food restriction induces an adaptation in liver mitochondrial energy metabolism: a

role for leptin ? Soumis à Diabetes.

Dumas JF, Jonhson G, Roussel D, Savagner F, Gallois Y, Malthièry Y, Simard G, Ritz P.

3) Mitochondrial energy metabolism in dexamethasone-induced undernutrition model.

Br J Nutr. 2003, 90: 969-977.

Dumas JF, Simard G, Roussel D, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P.

4) Dexamethasone treatment specifically increases the basal proton conductance of rat

liver mitochondria. FEBS Lett. 2003 Apr 24;541(1-3):75-9.

Roussel D, Dumas JF, Augeraud A, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Simard G, Ritz P.

5) Dexamethasone impairs muscle energetics, studied by 31

P NMR, in rats. Sous

presse dans Diabetologia.

Dumas JF, Bielicki G, Renou JP, Roussel D, Ducluzeau PH, Malthièry Y, Simard G, Ritz P.

Communications

Orales

Effet de différentes intensités de restriction calorique sur le métabolisme

mitochondrial hépatique chez le rat. Congrès Groupe Français de Bioénergétique, septembre

2003.

Dumas JF, Roussel D, Johnson G, Simard G, Sallé A, Douay O, Foussard F, Malthièry Y,

Ritz P.

Adaptation des fonctions mitochondriales à la restriction calorique chez le rat. Forum

des Jeunes Chercheurs, juin 2002.

Dumas JF, Simard G, Roussel D, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P.

Affichées

5

Effets in vivo et ex vivo d'un traitement par dexamethasone sur le métabolisme

mitochondrial du muscle squelettique chez le rat. Congrès ALFEDIAM, mars 2004.

Dumas JF, Bielicki G, Roussel D, Renou JP, Simard, G, Malthièry Y, Ritz P.

Le foie participe à l’hypermétabolisme associé à un traitement par dexamethasone

chez le rat. Congrès ALFEDIAM, mars 2003.

Dumas JF, Simard G, Roussel D, Sallé A, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P.

Augmentation spécifique de la fuite de proton mitochondriale dans le foie chez le rat

traité par dexaméthasone. Relation avec le potentiel redox des mitochondries hépatiques.

Congrès ALFEDIAM, mars 2003.

Roussel D, Dumas JF, Augeraud A, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Simard G, Ritz P.

Le foie participe à l’adaptation du métabolisme énergétique à la restriction calorique

chez le rat. Congrès Journées Francophones de Nutrition, novembre 2002.

Dumas JF, Simard G, Roussel D, Sallé A, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P.

Autres publications

Oral supplements differing in fat and carbohydrate content: effect on the appetite and

food intake of undernourished elderly patients. Clin Nutr. 2004 Aug;23(4):683-9.

Ryan M, Sallé A, Favreau AM, Simard G, Dumas JF, Malthièry Y, Berrut G, Ritz P.

Kinetics and control of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria after

dexamethasone treatment. Biochem J. 2004 Jun 3.

Roussel D, Dumas JF, Simard G, Malthièry Y, Ritz P.

Effects of changes in water compartments on physiology and metabolism. Eur J Clin

Nutr. 2003 Dec;57 Suppl 2:S2-5.

Ritz P, Sallé A, Simard G, Dumas JF, Foussard F, Malthièry Y.

Adaptation de la dépense énergétique à la restriction calorique. Cahier de nutrition et

de diététique 2003, 38, 4, 2003.

Dumas JF, Sallé A, Ritz P.

6

Thyroid hormones and obesity. Ann Endocrinol (Paris). 2002 Apr;63(2 Pt 1):135-9.

Ritz P, Dumas JF, Sallé A, Simard G, Malthièry Y, Rohmer V.

Processing of vegetable-borne carotenoids in the human stomach and duodenum. Am J

Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003 Jun,284(6):G913-23.

Tyssandier V, Reboul E, Dumas JF, Bouteloup-Demange C, Armand M, Marcand J, Sallas M,

Borel P.

7

FONCTIONS ENERGETIQUES MITOCHONDRIALES DANS LES

SITUATIONS DE PERTE DE POIDS: RESTRICTION CALORIQUE ET

HYPERCATABOLISME.

8

I. Introduction

Les organismes aérobiques synthétisent l'ATP principalement par deux voies, (1) la

glycolyse dans le cytosol et (2) la phosphorylation oxydative sur la membrane interne de la

mitochondrie chez les eucaryotes. La phosphorylation oxydative représente la source

majoritaire d'énergie, puisqu’elle fournit 17 fois plus d’ATP que la glycolyse, pour une même

quantité de glucose dégradée.

La synthèse d'ATP par la mitochondrie est donc principalement couplée à la

consommation d'oxygène et représente 80% de la consommation d'oxygène au niveau de la

mitochondrie (Rolfe et Brown, 1997). De plus, 90% de la consommation d'oxygène de repos

(métabolisme de base), chez les mammifères, est d'origine mitochondriale (Rolfe et Brown,

1997). Il apparaît donc que la respiration et la synthèse d'ATP au niveau de la mitochondrie

sont deux éléments au centre du métabolisme énergétique.

La respiration consiste en une série de réactions d'oxydo-réduction, de donneurs

d'électrons (NADH + H+ et FADH2), provenant de la dégradation de métabolites (hydrates de

carbone, acides gras, acides aminés), vers un accepteur final, l'oxygène (cf. figure 1). Ce

transfert d'électrons a lieu au sein de la chaîne respiratoire et met en jeu des accepteurs

d’électrons (l'ubiquinone et le cytochrome c) et 4 complexes enzymatiques (le NADH

déshydrogénase ou complexe I, la succinate déshydrogénase ou complexe II, le cytochrome c

réductase ou complexe III et la cytochrome c oxydase ou complexe IV). Les complexes I, III

et IV permettent en plus le pompage de protons au travers de la membrane interne

mitochondriale vers l'espace intermembranaire, aboutissant ainsi à un gradient

électrochimique de protons ou force proton-motrice (∆p) qui est la somme du potentiel de

membrane (∆Ψ) et du gradient de pH (∆pH). Une quatrième pompe à protons, le complexe

F0-F1 ATP-synthétase, utilise l'énergie de la force proton-motrice pour coupler le retour de

protons vers la matrice mitochondriale avec la phosphorylation d'ADP en ATP. Le phosphate

inorganique (Pi), nécessaire pour cette réaction, est importé dans la mitochondrie par le

transporteur de phosphate. L’ATP formé est exporté dans le cytosol, en échange d'ADP, par la

translocase des nucléotides adényliques (ANT). L'ensemble représente ainsi la

phosphorylation oxydative et permet la synthèse d'ATP à partir de nutriments selon la théorie

du couplage chimiosmotique (Mitchell, 1961).

La mitochondrie obéit à un grand principe de la thermodynamique qui stipule que

l'énergie n'est ni créée, ni détruite, mais uniquement transformée d'une forme en une autre.

C'est le principe de la conversion d'énergie. De plus, selon le deuxième principe de la

9

thermodynamique cette conversion d'énergie ne peut pas se faire avec un rendement de 100%,

une partie de l'énergie étant convertie en chaleur. La notion de rendement de la conversion

d'énergie est donc primordiale pour la mitochondrie et toute activité métabolique

s’accompagnera d’une dissipation de l’énergie sous forme de chaleur ou thermogenèse.

D’un autre côté, les demandes en énergie ne sont pas constantes et varient fortement selon

l’état physiologique et pathologique. La phosphorylation oxydative est donc contrôlée

principalement pour répondre à deux objectifs: (1) réguler le taux de synthèse d’ATP et donc

le taux de la respiration et (2) réguler l’efficacité de la synthèse d’ATP et donc l’intensité de

la thermogenèse.

S’appuyant sur les principes de thermodynamique hors équilibre, Stucki (Stucki, 1980)

a introduit la notion de "missions" physiologiques pour la mitochondrie. Il a calculé 4 valeurs

de degré de couplage thermodynamique q (Kedem and Caplan, 1965), partant de l’idée que la

mitochondrie doit réduire l'efficacité de la phosphorylation oxydative pour produire une

quantité maximale d'énergie, ou augmenter l'efficacité pour économiser la réserve d'énergie.

Pour un taux de synthèse d'ATP maximum sans regard du coût énergétique, une valeur de q

égale à 0,786 a été calculée. Pour un taux de synthèse d'ATP maximal avec une efficacité

optimale, une plus haute valeur (0,91) était trouvée. Pour une production plus économique

d'ATP, une valeur de q égale à 0,953 était déterminée. Enfin, pour une production maximale

d'ATP tout en préservant au mieux la réserve énergétique, une valeur de 0,972 était trouvée.

Le taux et l’efficacité de la phosphorylation oxydative apparaissent donc comme des

paramètres très importants dans l'énergétique mitochondriale. Nous nous intéresserons ici

uniquement à l'efficacité de la phosphorylation oxydative et sa régulation.

II. Régulation du rendement de la conversion d'énergie mitochondriale.

L'efficacité de la phosphorylation oxydative est définie par le rapport de la quantité

d’ATP produite sur la quantité d’oxygène consommée (ATP/O). La diminution du couplage

de la phosphorylation oxydative correspond à tout phénomène capable de diminuer le rapport

ATP/O soit en modifiant la force proton motrice ("découplage extrinsèque") soit en diminuant

l'efficacité des pompes à protons ("découplage intrinsèque") c'est à dire en diminuant la

stœchiométrie H+/e

- ou en augmentant la stœchiométrie H

+/ATP

10

A. Découplage extrinsèque de la phosphorylation oxydative

Ce phénomène implique tous les composés ou mécanismes qui augmentent la

perméabilité de la membrane interne mitochondriale aux protons ou aux cations, induisant

ainsi une diminution de ∆p et donc une augmentation de l'oxydation de donneurs réduits

(perte d'énergie) et une augmentation de la thermogenèse. Le FCCP (Carbonylcyanide-p-

trifluorométhoxyphenylhydrazone) est le parfait exemple de molécule chimique utilisée pour

dégrader le gradient de protons (cf. figures 2 et 3).

1. Perméabilité membranaire.

En conditions non-phosphorylantes, le retour des protons, pompés par la chaîne

respiratoire, dans la matrice est lié uniquement à la non-parfaite imperméabilité de la

membrane interne. C'est Nicholls (1974) qui le premier montra que cette fuite de protons

augmentait de façon non-linéaire en fonction de l'intensité du potentiel de membrane. Cette

fuite de protons basale, présente dans les mitochondries de tous les tissus, a une intensité

variable. Il a ainsi été montré que la perméabilité aux protons de mitochondries de foie est

inversement corrélée à la masse corporelle (Porter et Brand, 1993; Brand et al. 2003), est

influencée par le statut thyroïdien (cf. figure 3; Hafner et al., 1988) et diffère entre les espèces

puisqu’elle est inférieure chez un reptile par rapport à celle d’un mammifère de même masse

corporelle (Brand et al., 1991). Cependant, les mécanismes précis de cette fuite de protons au

travers de la membrane interne de la mitochondrie restent mal connus (Rolfe et Brand, 1997;

Brand et al., 1999; Stuart et al., 2001). Parmi les hypothèses proposées, la variation de la fuite

de protons pourrait s'expliquer partiellement par une modification de la surface de la

membrane interne de la mitochondrie. Autrement dit plus la surface membranaire est

importante (mg phospholipides totaux/mg protéines mitochondriales) et plus la fuite de

protons est élevée (flux protons par mg protéines mitochondriales). Chez les mammifères,

69% de la différence de la fuite de protons liée à la masse corporelle s’expliqueraient par des

changements de surface membranaire (Porter et al., 1996). Donc plus les mammifères sont

petits (exemple de la souris) et plus les mitochondries de foie ont une surface de membrane

interne importante et plus la fuite de protons est élevée. De même, près de la moitié de la

variation de la perméabilité membranaire liée au statut thyroïdien s’explique par des

changements de la surface de la membrane interne (Brand et al., 1992). D’un autre côté, il

semble que la variation de la fuite de protons pourrait aussi s’expliquer par des modifications

des propriétés intrinsèques de la membrane interne. Ainsi, il apparaît que la perméabilité

11

membranaire aux protons dépend de l'aspect de la membrane interne (Fontaine et al., 1996;

Porter et al., 1996; Brand et al., 2003). Globalement la fuite de protons mitochondriale

hépatique corrèle positivement avec la concentration d'acides gras polyinsaturés, avec l’index

d’insaturation des acides gras composant les phospholipides. A l’inverse elle corrèle

négativement avec le taux en acides gras monoinsaturés et le taux d’acide linoléique (18:2 n-

6) (Fontaine et al., 1996; Porter et al., 1996; Brand et al., 2003). Par exemple, la composition

en acides gras de la membrane interne explique les variations de la fuite de protons entre

espèces (Brand et al., 1991) et celles liées à la masse corporelle chez les oiseaux (Brand et al.,

2003). Dans ce dernier cas, la diminution de la perméabilité membranaire mitochondriale

hépatique liée à l’augmentation de la masse corporelle s’expliquerait majoritairement par la

diminution du taux en acides gras polyinsaturés et/ou par l’augmentation du taux en acides

gras monoinsaturés des phospholipides (Brand et al., 2003). Cependant les mécanismes précis

de cette fuite de protons dépendante de la composition lipidique restent inconnus. Il est aussi

intéressant de noter que l'ajout in vitro de cardiolipines dans des mitochondries isolées de foie

entraîne une fuite de protons augmentée associée avec un léger découplage de la

phosphorylation oxydative (Bobyleva et al., 1997).

Cette fuite basale de protons représente une part importante du métabolisme de base.

Ainsi Rolfe et Brand (1996) ont montré que la fuite de protons de l'ensemble des organes

pouvait expliquer 20-25% de la dépense d'énergie de repos chez le rat. Cependant cette fuite

de protons ne serait pas seulement impliquée dans la thermogenèse, elle pourrait aussi jouer

un rôle dans l'élimination des radicaux libres en diminuant le potentiel de membrane de la

mitochondrie (Brand, 2000). En effet, la production de radicaux libres est dépendante de la

valeur du potentiel de membrane (Korshunov et al., 1997). Ainsi, une diminution de 10% du

potentiel de membrane résulte en une diminution de 75% du taux de production de radicaux

libres (Korshunov et al., 1997).

2. Fuite de protons inductible

A la différence de la fuite de protons basale, la fuite de protons inductible n’est pas

présente dans les mitochondries de tous les tissus.

Les protéines découplantes (UCP) apparaissent comme les premiers candidats

susceptibles d’induire une fuite de protons. En effet, depuis 1997, plusieurs nouveaux gènes

codant pour des protéines homologues à UCP1, protéine decouplante du tissu adipeux brun et

impliquée dans la thermogenèse, ont été découverts (UCP2, 3, 4 et 5; Fleury et al., 1997;

12

Vidal-Puig et al., 1997; Sanchis et al., 1998; Mao et al., 1999). Cependant, ces protéines ne

participent pas aux processus de thermogenèse et l’activité de découplage de la

phosphorylation oxydative induite par ces UCPs est plus une conséquence de leur fonction

principale qui reste encore mal connue (Collins et al., 2001; Argyropoulos and Harper, 2002;

Nagy et al., 2004). Une fonction probable de ces nouvelles UCPs serait de contrôler la

production de radicaux libres de l’oxygène (ROS) (hypothèse d’un « découplage modéré »;

Skulachev, 1998; Skulachev, 1999). En effet, il a été montré que l’inactivation de l’activité

d’UCP2, s’accompagne d’une augmentation de la formation de peroxyde d’hydrogène (H2O2)

mitochondrial (Negre-Salvayre et al., 1997). De plus, l’invalidation des gènes UCP2 et UCP3

dans des modèles de souris transgéniques (Arsenijevic et al., 2000; Vidal-Puig et al., 2000;

Brand et al., 2002) ou l’utilisation d’oligonucléotides antisens sur des lignées cellulaires

(Duval et al. 2002) ont confirmé qu’un défaut d’expression et donc d’activité de ces protéines

découplantes, s’accompagnait d’une augmentation de la production de ROS. Récemment, il a

été montré que les ROS et leur accumulation dans la matrice mitochondriale étaient des

coactivateurs obligatoires des UCPs (Echtay et al., 2002; Echtay et al., 2002; Talbot et al.,

2004). La nécessité de coactivateurs pourrait expliquer que l’augmentation de l’expression

des gènes UCPs n’entraine pas toujours une augmentation de l’activité découplante de ces

protéines. L’acide rétinoïque et les dérivés lipidiques de peroxydation, tel que le 4-

hydroxynonenal, seraient également des coactivateurs des UCPs (Echtay et al., 2003). De

même, il semble que les acides gras soient aussi capables de stimuler la fuite de protons

médiée par UCP2 et UCP3, mais que ceci nécessite la présence de coenzyme Q et implique la

formation de ROS (Echtay et Brand, 2001; Echtay et al., 2001; Moreno et al., 2003).

Quoiqu’il en soit, l’ensemble de ces études suggère que les radicaux libres sont capables de

stimuler la fuite de protons induite par UCP3 et UCP2 directement et indirectement (via la

formation de dérivés lipidiques de peroxydations). Ainsi stimulées, UCP2 et UCP3

limiteraient la formation de ROS par la chaîne respiratoire, participant ainsi à la détoxification

de la matrice mitochondriale (Himms-Hagen et Harper, 2001; St-Pierre et al., 2002; Goglia et

Skulachev, 2003; Schrauwen et al., 2003).

Une fuite de protons induite par les acides gras a aussi été montrée pour d’autres

transporteurs d’anions mitochondriaux tels que l’ANT et l’antiport glutamate/aspartate

(Samartsev et Mokhova, 1997; Wojtczak et Wieckowski, 1999).

13

B. Découplage intrinsèque de la phosphorylation oxydative

Ce phénomène, qui fut suggéré pour la première fois par Pietrobon et al. (1981; 1983),

implique tous les composés ou mécanismes qui entrainent une diminution de l'efficacité des

pompes à protons, c'est à dire qui diminuent la stœchiométrie H+/e

- ou qui augmentent le

rapport H+/ATP. A la différence du découplage extrinsèque, le découplage intrinsèque n'est

pas couplée à une diminution de la force proton-motrice. On distingue 1) le "slip-redox" (ou

« patinage » des pompes à protons au sein de la chaîne respiratoire) qui résulte en un pompage

d'un nombre réduit de protons pour un même taux de transport d'électrons dans la chaîne

respiratoire, conduisant ainsi à une augmentation de l'oxydation de donneurs réduits (perte

d'énergie redox) pour le maintien d'un même gradient de protons, 2) le découplage de l'ATP-

synthétase (ou « patinage » de la pompe à protons au sein du complexe ATP-synthéthase) qui

résulte en une stœchiométrie H+/ATP augmentée conduisant ainsi à une diminution de la

synthèse d'ATP.

1. Stœchiométrie H+/e

-

Un tel découplage des réactions chimiques et du pompage des protons est en théorie

possible aux 3 sites de pompage des protons (complexes I, III et IV). Cependant, seul un

changement de stœchiométrie H+/e

- au niveau de la cytochrome c oxydase (COX) semble

avoir une signification physiologique in vivo (Murphy, 1989; Papa et al., 1994). Chez les

eucaryotes comme chez les procaryotes, il semble que la stœchiométrie H+/e

- au niveau de la

COX soit de 1 (Babcock et Wikstrom, 1992; Ferguson-Miller et Babcock 1996).

Si la variation de la stœchiométrie H+/e

- au sein de la COX est maintenant bien acceptée

(Murphy, 1989; Papa et al., 1994; Kadenbach, 2003), le mécanisme moléculaire de

translocation des protons et en particulier le couplage entre le transport des électrons et le

pompage des protons restent eux encore discutés (Wikstrom, 2000; Ludwig et al., 2001;

Richter et Ludwig, 2003). Quel que soit le mécanisme de pompage des protons, il doit

impliquer une translocation d’un électron au cœur de l’enzyme (centre bi-nucléaire composé

des noyaux hémiques a3 et Cub, site de réduction du dioxygène) accompagnée par le

mouvement d’un proton pour maintenir une électro-neutralité (Rich, 1995; cf. figure 4). Ainsi,

le transfert d’électrons de l’hème a au centre binucléaire ne peut se faire sans le transport de

protons. Les modèles les plus récents proposent cette étape comme le lieu du couplage entre

le transport des électrons et le pompage des protons. Les protons seraient transportés soit de

l’hème a à l’hème a3 et dirigés vers l’espace intermembranaire (pompage de protons) soit de

14

l’hème a au centre binucléaire et utilisés pour la réduction du dioxygène en eau (pas de

pompage de protons). La prépondérance de l’une ou de l’autre de ces deux voies serait sous le

contrôle de l’état redox et/ou de changements conformationnels du cœur de l’enzyme, de

facteurs cinétiques (intensité du flux d’électrons) et thermodynamique (intensité de la force

proton-motrice) (Capitanio et al., 1996; Brzezinski et Larsson, 2003; Wikstrom et al., 2003).

Il a ainsi été montré que la stœchiométrie H+/e

- de la COX diminue en fonction de

l’augmentation du potentiel de membrane (Murphy et Brand, 1988), du gradient de pH et du

flux d’électrons (Capitanio et al., 1991; Papa et al., 1991; Capitanio et al., 1996).

De plus, il semble que la stœchiométrie H+/e

- de la COX soit aussi fonction du type de

tissu et plus précisément de l’isoforme de la sous-unité VIa de la COX présente (Kadenbach,

2003). Ainsi, dans les tissus musculaires, l’isoforme VIaH a une stœchiométrie H+/e

-

diminuée en présence d’un fort rapport ATP/ADP mitochondrial (Frank et Kadenbach, 1996).

A l’inverse, la stœchiométrie H+/e

- de l’isoforme VIaL (présente dans les tissus non

musculaires) n’est diminuée qu’en présence de palmitate (Lee et Kadenbach, 2001). Une telle

diminution de la stœchiométrie H+/e

- de la COX pourrait induire une thermogenèse tissu

spécifique.

Ces changements mécanistiques de la stœchiométrie H+/e

- au sein de la COX auront

d’autant plus d’impact sur l’efficacité de la phosphorylation oxydative, qu’il existe aussi, à

plus long terme, une variation du nombre d’unité fonctionnelle de ce complexe enzymatique

(mitogenèse). Cette adaptation quantitative a été suggérée par Piquet et al (2000), qui

montrent que chez des rats soumis à une intoxication chronique par de l'éthanol, la diminution

du contenu de la COX (nombre de cytochrome a + a3) est associée à une diminution de son

activité, à une diminution de la perte d’énergie redox au sein de la chaîne respiratoire et à une

augmentation de l'efficacité de la phosphorylation oxydative dans des mitochondries isolées

de foie. Ceci a été confirmé par Nogueira et al. (2001), qui ont montré que dans certaines

conditions physiologiques ou pathologiques (rats hyperthyroïdiens, hypothyroïdiens, rats

soumis à un régime pauvre en acides gras poly-insaturés), la diminution du taux en

cytochrome a + a3 s'accompagnait d'une augmentation de l’efficacité de la chaîne respiratoire

pour maintenir un potentiel de membrane donné et d’une augmentation du rapport ATP/O.

Physiologiquement, une telle variation de l’efficacité de l’activité de la COX est capable

d’influencer la thermogenèse (Kadenbach, 2003), le rendement de la phosphorylation

oxydative (Piquet et al., 2000) et pourrait prévenir la production de radicaux libres (Papa et

al., 1997).

15

D'un autre côté, l'efficacité de la chaîne respiratoire à former le gradient de protons

peut aussi être due à une variation de la proportion d'électrons délivrés au premier site de

couplage par rapport au deuxième site de couplage. Ainsi, le nombre de protons pompés

dépend du site d’entrée des équivalents réduits (cf. figure 1). Quand l’oxydation des substrats

se fait préférentiellement par le complexe II (pas de pompage concomitant de protons;

oxydation des acides gras), la quantité de protons pompés par électron transféré est moindre

que dans le cas où les substrats sont oxydés préférentiellement par le complexe I (pompage

concomitant de protons; oxydation du glucose). Ceci peut être la conséquence de

modifications physiologiques: augmentation du taux d'acides gras oxydés; ou mécanistiques:

prépondérance du transport du NADH par la navette glycerol-phosphate par rapport à la

navette malate-aspartate. En effet l’oxydation du NADH, au niveau du complexe I, se fait du

côté matriciel de la membrane interne mitochondriale, et cette dernière est imperméable au

NADH. Les équivalents réducteurs du NADH sont donc transportés du cytosol dans la

mitochondrie par l’intermédiaire de deux navettes: glycérol-phosphate et malate-aspartate.

Dans le premier cas les équivalents réducteurs sont transportés du NADH cytosolique à un

FADH2 mitochondrial alors que dans le deuxième cas les équivalents réducteurs sont

transférés du NADH cytosolique à un NADH mitochondrial. Ainsi, la stimulation de

l'expression du gène de la Glycérol Phosphate DesHydrogenase mitochondrial (GPDHmt), en

particulier dans le foie et le cœur, pourrait être un des mécanismes par lesquels les hormones

thyroïdiennes agissent sur la thermogenèse (Gong et al., 1998). Une telle surexpression de la

GPDHmt favorisera l’utilisation de la navette glycérol-phosphate, ce qui diminuera le nombre

d’équivalents réduits oxydés au niveau du complexe I et donc le nombre de protons pompés

par électron transféré.

2. Stœchiométrie H+/ATP

Ce découplage a lieu au niveau de la F0-F1 ATP-synthétase et n'affecte pas le taux de la

respiration mitochondriale mais diminue la quantité d'ATP synthétisé pour un flux de protons

donné, induisant donc une diminution du potentiel phosphate. Bien que cela soit moins connu,

il semble que le complexe F0-F1 ATP synthase puisse fonctionner avec une stœchiométrie

variable (H+/ATP). Ceci a été montré entre autres pour des mitochondries isolées de foie de

rat (Rigoulet et al., 1990; Rigoulet et al., 1998), où l'ajout d'almitrine tout en augmentant la

stœchiométrie H+/ATP diminuait le rapport ATP/O. Krenn et al (1993) ont montré que chez

certains procaryotes, la stœchiométrie H+/ATP variait en fonction du pH.

16

Cependant, si les mécanismes moléculaires de la synthèse d'ATP sont très étudiés

(Junge et al., 2001; Senior et al., 2002; Weber et Senior, 2003), le fonctionnement du

couplage entre la translocation des protons et l'ATP formé reste lui méconnu.

L'importance in vivo du découplage de la F0-F1 ATP-synthétase dans la régulation de la

synthèse d'ATP ou pour la génération de la force proton-motrice en cas d'anomalie de la

chaîne respiratoire, reste encore mal déterminé.

En conclusion, la majorité de l’ATP cellulaire est synthétisée dans la mitochondrie par

la phosphorylation oxydative. Le taux et l’efficacité de la phosphorylation (ATP/O) qui sont

sous le contrôle complexe de divers paramètres (activité de la chaîne respiratoire, force

proton-motrice…) et molécules (acides gras, hormones…) sont sujets à d’importantes

variations et font de la phosphorylation oxydative un challenge majeur dans la recherche en

bioénergétique. Il est donc parfaitement concevable et requis de vouloir expliquer des

modifications du rendement de la conversion d’énergie du corps entier (balance entre les

apports et les besoins énergétiques), en analysant le métabolisme énergétique de

mitochondries isolées.

III. Les situations de perte de poids.

Une perte de poids est le résultat d'une balance énergétique négative, c’est à dire que les

apports alimentaires sont insuffisants pour équilibrer les dépenses d'énergie. Il faut distinguer

la perte de poids volontaire due à une restriction calorique consciente (amaigrissement chez

l'obèse, amincissement chez le sportif), de celle involontaire (dénutrition, maladies, cancers,

isolement chez la personne âgée…) qui s'explique soit par une diminution des apports

alimentaires associée à une anorexie, soit par une augmentation des besoins

(hypermétabolisme et hypercatabolisme), soit par les deux à la fois. Nous nous intéresserons

ici à la relation entre la dépense d'énergie et la perte de poids.

La dépense énergétique est classiquement divisée en plusieurs compartiments: le

métabolisme de base (ou thermogenèse obligatoire), la thermogenèse facultative et l'activité

physique.

Le métabolisme de base représente environ 60-75% des dépenses énergétiques quotidiennes

chez un individu sédentaire, et correspond à la production de chaleur par un organisme entier

sous des conditions stables (thermo-neutralité, éveil et à jeun chez les mammifères). Cette

production de chaleur correspond à la consommation d'énergie nécessaire pour assurer les

17

fonctions vitales de l'organisme (travail des pompes membranaires pour le maintient des

gradients ioniques, renouvellement des protéines…) et dépend par conséquent de l'importance

et de l'efficacité thermodynamique de cette activité métabolique basale (Rolfe et Brown,

1997). Les espèces homéothermes ont ainsi un métabolisme actif plus important que les

ectothermes (Else et Hulbert, 1981). De même, pour un travail mécanique identique, le

muscle de mammifères génère plus de chaleur que celui d'un reptile (Woledge et al., 1989).

La thermogenèse facultative est l'augmentation de la dépense d'énergie en réponse à des

stimuli tels que la prise alimentaire, l'exposition au froid, le stress, l'administration de drogues

ou d'hormones capables de stimuler le métabolisme.

L'activité physique est la composante la plus variable de la dépense d'énergie totale d'un

individu.

A la différence du métabolisme de base qui ne dépend que de facteurs intrinsèques

(masse maigre, masse grasse, âge, sexe …), la thermogenèse facultative et l’activité physique

sont aussi dépendants de facteurs extrinsèques: la quantité d’aliments ingérée, l’exposition au

froid pour la thermogenèse facultative, la durée et l’intensité des exercices musculaires pour

l’activité physique.

A. La perte de poids volontaire.

Cette perte de poids suppose une restriction calorique. En terme de régulation de

l’énergie, il apparaît vital qu’en réponse à une baisse des apports énergétiques, les dépenses

d’énergie soient diminuées. Dans ce cas, il est tout d’abord envisageable que suivant cette

adaptation, le poids (et plus particulièrement la masse maigre) diminue progressivement

jusqu'à ce que les dépenses égalent les apports d'énergie. Cependant, il est impensable qu'un

homme ou un animal puisse perdre indéfiniment du poids sans que cela n'ait de conséquences

néfastes en terme de santé. Il apparaît donc primordial qu’une adaptation à la restriction

calorique plus rapide et plus active se mette en place. Cette dernière implique que la dépense

d’énergie soit diminuée de façon plus importante que ne peut l’expliquer la perte de poids,

ceci dans le but de stopper cette dernière. Autrement dit, cette adaptation métabolique signifie

que pour une même valeur de masse maigre, la dépense énergétique doit être moindre.

1. Perte de poids volontaire et dépense d'énergie du corps entier

Une diminution de la dépense d'énergie du corps entier en réponse à une restriction

calorique est montrée par de nombreuses études (méta-analyses de 12 études, Astrup et al,

18

1999; de 22 études, Thompson et al, 1996; de 14 études, Blanc et al, 2003). Bien que la

plupart des études portent sur le métabolisme de base, la dépense d'énergie sur 24 heures est

également diminuée (Leibel et al., 1995; Doucet et al., 2003). La principale explication

avancée est la diminution du poids et de la masse métaboliquement active. Ainsi, la masse

maigre, qui est constituée en autres de la masse musculaire, est un déterminant important de la

dépense d'énergie sur 24 heures (81% de la variance), de la dépense d’énergie de repos (69%

de la variance) et est liée à l’activité physique (71% de la variance) (Ravussin et al., 1986).

Cependant, c’est la diminution du métabolisme de base qui aura le plus d’impact puisqu’il

représente 60 à 75% de la dépense d’énergie totale. Quoiqu’il en soit, que cela concerne la

diminution de la dépense d’énergie liée au métabolisme de base ou celle dépendante de

l’activité physique, tout dépend de la nature et de l'intensité de la perte de poids. Il semble que

plus la restriction calorique est intense et plus la perte de masse maigre est importante dans la

perte de poids (Hill et al., 1985; Sweeney et al., 1993). De même, il a aussi été montré que la

dépense énergétique liée à l'activité physique est diminuée avec la restriction calorique et que

ceci n'est pas toujours dû à une diminution de l’intensité de l’activité physique (Hill et al.,

1985; Even et Nicolaidis, 1993; Leibel et al., 1995; Weyer et al., 2000). Enfin, la diminution

de la dépense d’énergie induite par la restriction calorique peut aussi être la conséquence

d'une baisse de la thermogenèse post-prandiale, qui s'explique par la diminution de la quantité

ingérée (Even et Nicolaidis, 1993) mais aussi par une diminution réelle de l'effet thermique

des repas (diminution de la quantité de chaleur par g d'aliment) (Forsum et al., 1981; Hill et

al., 1985).

Si la diminution de la dépense d'énergie en valeur absolue est bien établie (Ramsey et

al., 2000), l’existence d’une réelle adaptation métabolique à la restriction calorique reste

discutée. Est-ce que la dépense d'énergie diminue aussi indépendamment de la variation du

poids et des changements de composition corporelle, et par conséquent de façon plus

importante que ne le voudrait la simple perte de masse corporelle ?

Une des explications à cette controverse provient de la méthode statistique utilisée pour

normaliser les changements de dépense d'énergie en réponse à la restriction calorique.

Récemment, Blanc et al. (2003) suggéraient qu'il est préférable d'utiliser une approche basée

sur des régressions (ANCOVA) par rapport à la classique comparaison du rapport dépense

d’énergie/poids ou dépense d’énergie/masse maigre, laquelle est susceptible de biaiser les

résultats (Ritz et al., 1999). Ainsi, en ré-analysant de façon homogène 14 anciennes études

(portant sur le rat, le singe et l'homme), ces auteurs montrent que la dépense d'énergie totale

ajustée pour la masse corporelle diminue en réponse à une restriction calorique. Cette

19

adaptation métabolique s'expliquait essentiellement par une diminution du métabolisme de

base ajustée pour le taux de masse maigre (Blanc et al., 2003).

Il est également possible que dans certaines études, un trop petit nombre de sujets (6 < n

< 12) ne permette pas de détecter des différences de dépense d’énergie inférieures à 10-15%.

En effet, pour mettre en évidence une différence de 5% de la dépense d’énergie de repos

(moyenne avec un écart-type de 5%) avec un risque alpha de 5% et une puissance de 90%, il

faut un effectif de 25 personnes par groupe. Ainsi, Astrup et al. (1999), dans une méta-analyse

de 12 études (cf. tableau 1), mettent en évidence un métabolisme de base (ajusté pour la

masse maigre) inférieur de 5,1% chez des anciens obèses ayant perdu du poids suite à une

restriction calorique, par rapport à des personnes appariées pour la masse maigre et n'ayant

jamais été obèses.

En résumé, il apparaît qu'une adaptation métabolique se développe en réponse à une

restriction calorique et une perte de poids. Cependant il semble important de préciser quelques

points:

• la diminution de la dépense d'énergie correspond surtout à une diminution du métabolisme

de base (méta analyse de Blanc et al, 2003; Doucet et al, 2003).

• l'intensité de cette adaptation métabolique ne semble pas dépendre de l'intensité de la perte

de poids. Ainsi, Leibel et al. (1995) montrent qu'une perte de poids de 10 ou 20% suite à une

restriction calorique aboutit à une même diminution de la dépense d'énergie de base

(normalisée par la masse maigre). De même, Hill et al. (1985) rapportent que chez des rats

ayant subi des pertes de poids différentes (20 et 30% de leur poids initial) le métabolisme de

base résultant est le même. Enfin, dans une étude de Weinsier et al. (2000), le métabolisme de

base (ajusté pour les taux de masses maigre et grasse), était significativement diminué (-6%)

dès le 10è jours de restriction calorique mais n'était plus modifié durant la période restante de

restriction calorique (3-5 mois) en dépit d’une perte de poids correspondante de 13 kg.

• en corollaire du précédent point, l'effet d'une perte de poids n'aura pas le même impact sur

le métabolisme de base selon que les mesures seront effectuées dans une période d'adaptation

(restriction calorique) ou durant la phase suivante (période de stabilisation du nouveau poids).

Ainsi, il semble que la dépense d’énergie ajustée diminue rapidement après l’initiation d’une

restriction calorique, mais que cette diminution ne persiste que quelques temps (2 à 3 mois)

après le retour à la normale du niveau d’alimentation et ceci même si le poids se stabilise ou

continue de diminuer (Elliot et al., 1989; Wadden et al., 1990; Froidevaux et al., 1993). Il

20

semble en tout cas très improbable que cette adaptation du métabolisme de base se majore au-

delà d’une année de stabilisation d’un poids réduit (Wyatt et al., 1999).

2. Quels sont les mécanismes de cette adaptation ?

a) La masse des organes métaboliquement actifs

Le foie et le muscle sont responsables, à eux deux, de 50% de la dépense d'énergie de

repos. Une diminution de la masse de ces tissus est donc susceptible de diminuer la dépense

d’énergie en valeur absolue. De plus, le foie est un tissu à forte activité métabolique, chez

l’homme par exemple, il contribue pour 17-25% de la dépense d’énergie de repos totale mais

ne représente que 2% de la masse corporelle. A l’inverse, le muscle, qui représente 25-30%

du métabolisme de base et 20% de la masse corporelle totale, a une faible activité

métabolique. Par conséquent, si la perte de masse hépatique (par exemple) est

proportionnellement plus intense que celle d’organes à l’activité métabolique plus faible (par

exemple, le muscle squelettique), une diminution supplémentaire de la dépense d’énergie (en

valeur absolue ou ajustée) pourra être observée.

Chez l'animal, en réponse à une perte de poids, l’ensemble des études montre que la

masse du foie en particulier et des viscères en général, est la première à diminuer et ceci de

façon relativement supérieure à la perte de poids total (Ramsey et al., 2000). La masse

musculaire quant à elle, ne diminue que plus tardivement et de façon moins importante.

Ramsey et al. (2000) concluent qu'une perte de masse des tissus hautement métaboliques

participe à la phase initiale de l'adaptation métabolique en réponse à une restriction calorique.

b) Profil hormonal

(1) Hormones thyroïdiennes

Les hormones thyroïdiennes sont considérées comme le principal régulateur

physiologique de la dépense énergétique (métabolisme de base et thermogenèse facultative),

non seulement en accélérant le turnover de l’ATP mais également en diminuant l'efficacité de

la synthèse d’ATP. Les mécanismes biochimiques et moléculaires expliquant ces effets

restent assez peu connus. Ces phénomènes cellulaires qui impliquent directement ou

indirectement l'appareil de production d'énergie mitochondrial se divisent brièvement en 3

modes d'action: les effets immédiats (quelques minutes à quelques heures) qui sont véhiculés

principalement par la di-iodo-thyronine (T2) et impliquant des voies non-génomiques, les

21

effets directs à moyen-termes (plusieurs heures à quelques jours) qui impliquent un rôle de la

T3 sur la transcription du génome mitochondrial, et les effets indirects à moyen-termes qui

impliquent un rôle de la T3 sur la transcription du génome nucléaire (Freake et Oppenheimer,

1995; Wrutniak-Cabello et al., 2001; Goglia et al., 2002; Scheller et al., 2003; Silva, 2003).

La restriction calorique conduit à une diminution de la concentration sérique de T3 et

une augmentation de la conversion de la tetra-iodo-thyronine (T4) en la forme inactive (tri-

odo-thyronine inverse, rT3) (Kelly, 2000; Krotkiewski, 2002). Ceci participe probablement à

l’adaptation métabolique induite par la restriction calorique. Ainsi Weinsier et al. (2000)

montrent, d’une part que chez des femmes obèses soumises à une restriction calorique, la

concentration de rT3 est significativement augmentée tandis que le taux de T3 et le rapport

T3/rT3 sont diminués et d’autre part que ces paramètres évoluent parallèlement à la

diminution du métabolisme de base ajusté pour les taux de masse maigre et de masse grasse.

De même, une étude réalisée chez des personnes obèses et non-obèses montre qu'une perte de

poids, respectivement, de 20 et 10% (4-10 semaines de restriction calorique, 800 kcal/jour)

s'accompagne d'une diminution de 10% du métabolisme de base ajusté, d'une diminution de la

concentration sérique de T3 et d'une augmentation de celle de rT3 (Rosenbaum et al., 2000).

Enfin, Astrup et al. (1996) montrent que chez des femmes « post-obèses », le métabolisme de

base ajusté pour les taux de masse grasse et de masse maigre est moindre (8%) que celui de

femmes de même poids n'ayant pas eu besoin de maigrir. Ceci s'accompagne d'une diminution

de la quantité de T3 plasmatique. Après ajustements pour ces concentrations de T3, la

différence de dépense énergétique disparaît entre les femmes post-obèse et celles qui ne l'ont

jamais été.

L'ensemble des ces études indique donc qu'une diminution du taux plasmatique de T3

peut, au moins en partie, expliquer l'adaptation métabolique induite par une restriction

calorique, mais sans pour autant prouver de façon formelle qu’il existe un lien de causalité

entre les deux phénomènes.

(2) Leptine

La leptine, produit du gène ob (Zhang et al, 1994), participe à la régulation de la masse

corporelle (essentiellement la masse grasse) en diminuant la prise alimentaire et en

augmentant la dépense énergétique, chez le rongeur (Campfield et al., 1995; Halaas et al.,

1995; Pelleymounter et al., 1995). Ces effets sont médiés principalement par le système

nerveux central (Halaas et al., 1997). De plus, son action sur la dépense d’énergie pourrait

22

être plus marquée dans les cas de restriction calorique, où son taux sérique est diminué,

contribuant ainsi aux mécanismes d’épargne de l’énergie et de normalisation de la balance

énergétique (Doring et al., 1998). Ainsi, le traitement par leptine entraîne, chez des souris

restreintes en calories, une augmentation de la dépense d’énergie, alors que chez des souris

nourries ad-libitum, il diminue simplement la prise alimentaire sans modifier le métabolisme

de base (Doring et al., 1998). Des résultats préliminaires, obtenus chez l’homme, vont dans le

même sens. Ainsi, il a été montré que durant une période de stabilisation d’un poids réduit

(suite à une restriction calorique), l’injection de leptine (à doses suffisantes pour restaurer les

concentrations initiales) majore la perte de poids (Rosenbaum et al., 2002).

Lors d’une restriction calorique, les études humaines et animales montrent une

diminution du taux sérique de leptine (Maffei et al., 1995; Considine et al., 1996; Scholz et

al., 1996; Rosenbaum et al., 1997; Dubuc et al., 1998; Wadden et al., 1998; Doucet et al.,

2000), sans qu’il n’y ait de relation entre l’intensité de la perte de poids et le taux basal ou la

variation en leptine (Niskanen et al., 1997; Dubuc et al., 1998; Wadden et al., 1998). Ainsi la

restriction calorique, par elle-même, serait un plus fort déterminant de la variation du taux de

leptine que ne le serait la perte de poids associée, au moins durant les premiers temps de la

restriction calorique (2 premiers mois) et pour des pertes de poids inférieures à 10% du poids

initial (Havel et al., 1996; Wadden et al., 1998). De plus, il apparaît que la diminution du taux

de leptine sérique est plus forte durant la phase dynamique de perte de poids que durant la

phase de stabilisation (Rosenbaum et al., 1997).

Parmi les paramètres hormonaux et métaboliques (insuline, cortisol, glucose, acides

gras et hormones thyroïdiennes), seul les taux plasmatiques de glucose et d’acides gras sont

corrélés avec les variations de concentration de leptine, induites par la restriction calorique

chez l’homme (Jenkins et al., 1997; Niskanen et al., 1997; Dubuc et al., 1998; Keim et al.,

1998; Torgerson et al., 1999; Wisse et al., 1999). En particulier, plus les taux d’acides gras

sont augmentés et plus la concentration de leptine est diminuée. Ceci suggère que la

diminution du taux de leptine induite par une restriction calorique pourrait être régulée par le

métabolisme lipidique (augmentation de la lipolyse) et glucidique (diminution de l’utilisation)

dans les adipocytes. Toutefois, certaines études montrent que la variation de la masse grasse

n’est pas toujours le seul déterminant de la diminution du taux de leptine sérique, le taux de

leptine circulant étant diminué même après ajustement pour les variations de masse grasse

(Havel et al., 1996; Rosenbaum et al., 1997; Wadden et al., 1998; Doucet et al., 2000). Ainsi,

la leptine ne serait pas un simple régulateur du poids et de la masse grasse en particulier, mais

plutôt un signal de déplétion des réserves en énergie dans les cas de restriction calorique.

23

Quel que soit le mode de régulation, la concentration de leptine pourrait être un

paramètre important dans la régulation de la dépense énergétique. Ainsi, Doucet et al. (2000)

trouvent que chez des hommes obèses soumis à une restriction calorique (15 semaines), la

variation du taux sérique de leptine est le meilleur déterminant de la variation du métabolisme

de base même après ajustement pour les changements de composition corporelle (masse

maigre et masse grasse). Chez des femmes obèses et non obèses, Havel et al. (1996) montrent

que la variation de la dépense d’énergie de repos corrèle avec les variations des taux de

leptine, de masse grasse et de masse maigre. De plus, Wadden et al. (1998) montrent qu’après

40 semaines de restriction calorique (mais pas après 20 semaines), il existe une corrélation

entre la diminution du taux de leptine et la diminution de la dépense d’énergie de repos. En

revanche, chez des personnes obèses et non-obèses ayant perdu 10 ou 20% de leur poids

initial, Rosenbaum et al. (2000) ne trouvent pas de relation entre la dépense d’énergie ajustée

pour la variation de composition corporelle (masse grasse et maigre) et le taux de leptine

plasmatique.

L’ensemble des ces études suggère que si la leptine peut intervenir dans l’adaptation du

métabolisme de base lors d’une restriction calorique, cette hormone n’apparaît pas toutefois

comme le signal majeur dans l’homéostasie de l’énergie.

Les mécanismes biochimiques et moléculaires pouvant expliquer l’effet de la leptine sur

la dépense d’énergie et particulièrement dans l’adaptation métabolique induite par une

restriction calorique sont encore peu connus. Quels qu’ils soient, ces mécanismes semblent

indépendants de l’effet thermogène des hormones thyroïdiennes. En effet, Wang et al. (2000)

montrent que chez des rats thyroïdectomisés, 3 semaines de traitement par la leptine induit

une augmentation du métabolisme de base (+11%) similaire à celle induite par 3 semaines de

traitement par T3 (+9%). De plus, l’injection couplée de T3 et de leptine entraînait une

augmentation de 24% du métabolisme de base. Cette étude suggère que la leptine est capable

de stimuler la dépense d’énergie de repos indépendamment de la présence d’hormones

thyroïdiennes mais qu’elle pourrait avoir des mécanismes communs et ainsi agir en addition

de la T3 pour stimuler le métabolisme de base. Au niveau musculaire, l’ajout in vitro de

leptine stimule la consommation d’oxygène de muscles de souris ob/ob (souris déficiente en

leptine fonctionnelle) mais n’a pas d’effet chez des souris db/db (souris déficiente en

récepteurs fonctionnel à la leptine) (Dulloo et al., 2002). Ceci suggère une action

thermogénique directe de l’hormone impliquant les récepteurs périphériques à la leptine et

n’impliquant donc pas une action centrale sur le système sympathique comme pour d’autres

tissus (tissu adipeux brun, foie, cœur et reins). De leur côté, McClelland et al. (2004), dans un

24

modèle de rats obèses possédant une mutation récessive du gène du récepteur à la leptine (rats

cp/cp), montrent que l’activité enzymatique de la citrate synthase (CS) est supérieure dans les

seuls homogénats de gastrocnemius (pas d’effet dans les homogénats de foie, de soleus, de

tibialis antérieur et de cœur). Par ailleurs, ces auteurs ne trouvent pas de différence de

l’activité spécifique de la COX et ceci quel que soit le tissu considéré. Enfin, l’ajout in vitro

de différentes doses de leptine, pendant 3 jours, dans des cultures cellulaires musculaires

(C2C12 et So18) n’entraîne ni de modification de l’activité enzymatique de la COX et de la

CS, ni de différence du taux d’ARNm du gène de la CS mais une diminution du niveau de

transcrits du gène UCP2 (McClelland et al., 2004). Dans une autre étude, Cusin et al. (1998)

montrent que chez des rats traités pendant 4 jours par de la leptine (infusion intra-

cérebroventricullaire) les niveaux d’ARNm UCP3 sont maintenus dans le quadriceps en

comparaison de rats restreints en calorie (car appariés pour la nourriture avec les rats traités

avec la leptine). Enfin, Zou et al. (2004) trouvent chez des rats restreints de 40% pendant 4

semaines, une corrélation positive entre le taux de leptine sérique diminué et l’intensité de

l’activité enzymatique de la citrate synthase de gastrocnemius, suggérant qu’il y a une

diminution de la masse mitochondriale musculaire parallèle à celle du taux en leptine.

Au niveau du foie, Melia et al. (1999) trouvent que la fuite de protons de mitochondries

isolées de souris ob/ob est supérieure à celle de souris contrôles, et que le traitement des

souris ob/ob avec de la leptine normalise cette cinétique au niveau de celle des souris

contrôles. Cette élévation de la fuite de protons chez les souris ob/ob n’est pas due à un

découplage induit par les acides gras.

L’ensemble des ces études montre 1) un rôle stimulant de la leptine sur le métabolisme

énergétique musculaire, impliquant aussi une action directe de l’hormone, 2) que cette

thermogenèse pourrait s’expliquer par une augmentation de la fuite de protons UCP-

dépendante, 3) à l’inverse la leptine diminuerait la fuite de protons de mitochondries de foie,

4) en cas de restriction calorique, la diminution du taux de leptine pourrait aussi

s’accompagner d’une diminution de la masse mitochondriale musculaire.

Finalement, la leptine semble jouer un rôle dans l’adaptation métabolique induite par une

restriction calorique, et ceci probablement plus au niveau du muscle squelettique. Cependant,

des travaux étudiant plus particulièrement le rôle de la leptine lors d’une restriction calorique

au niveau des tissus musculaire et hépatique sont nécessaires pour répondre à certaines

questions. La restriction calorique est-elle une simple situation d’hypoleptinémie ? Ou existe-

t-il un lien de causalité entre les deux phénomènes ?

25

c) Métabolisme énergétique mitochondrial:

Il existe peu d'études sur le métabolisme énergétique cellulaire au cours de la restriction

calorique. La majorité des études est réalisée chez le rat et dans le but de comprendre les

mécanismes participant à l'augmentation de la longévité induite par une restriction calorique.

Cependant, il est envisageable que l'adaptation métabolique induite par une restriction

calorique s'explique en partie par des modifications du métabolisme mitochondrial.

(1) au niveau du foie.

Les études qui rapportent les effets de restriction calorique à moyen-terme ou de forte

intensité (> 75%) montrent une diminution de la consommation d'oxygène de mitochondries

isolées de foie de rat (Gold et Costello, 1975; Ramanadham et Kaplay, 1979; Ferreira et Gil,

1984; Lambert et Merry, 2004). Ainsi Gold et Costello (1975) trouvent chez des rats restreints

à 25% des apports alimentaires habituels pendant 7 jours, une légère diminution (-5%) de la

respiration à l'état 4 sous succinate (pas d’autres substrats respiratoires utilisés et pas de

mesure de la respiration à l'état 3). De même, 14 jours de restriction totale en protéines

entraînent une diminution de la consommation d'oxygène mitochondriale en conditions

phosphorylante (-23% pour l'oxydation du glutamate, -27% pour succinate et -26% pour

l'ascorbate + TMPD) et non-phosphorylante (-18% pour les seules oxydations du succinate et

de l'ascorbate + TMPD) (Ferreira et Gil, 1984). Cependant, il semble que cette diminution soit

passagère puisque Ramanadham et Kaplay (1979) montrent que si la respiration à l'état 3

(sous glutamate/malate et succinate) est diminuée après 3 à 5 semaines de restriction

calorique, elle est augmentée après 7 à 9 semaines. De plus, des études de plus longues durées

(6 mois) ne retrouvent pas cette diminution de la consommation d’oxygène dans des

mitochondries isolées de foie (Lambert et Merry, 2004; Ramsey et al., 2004).

Une telle diminution de la consommation d'oxygène mitochondriale peut s'expliquer, au

moins en partie, par une baisse de l'activité de la chaîne respiratoire. Ainsi, Gold et Costello

(1975) trouvent une respiration à l'état découplé (sous DNP et succinate) diminuée de 30%.

De même, Ferreira et Gil (1984) montrent une diminution du nombre de protons pompés par

la chaîne respiratoire durant une respiration à l'état 3 (-31% pour l'oxydation du glutamate, -

28% pour le succinate et -30% pour l'ascorbate + TMPD). Ces derniers résultats suggèrent, de

plus, que cette diminution de l'activité de la chaîne respiratoire, due à la restriction calorique,

implique obligatoirement le complexe IV, sans toutefois exclure un effet localisé ailleurs dans

la chaîne respiratoire. Cependant, il apparaît que l'activité enzymatique du complexe IV ne

26

diminue que plus tardivement chez des rats en restriction calorique, puisque 3 à 5 semaines de

diète ne modifie pas significativement l'activité spécifique de la COX (Ramanadham et

Kaplay, 1978; Desai et al., 2000) alors que 7 à 9 semaines de restriction calorique induisent

une diminution de l'activité maximale du complexe IV (Ramanadham et Kaplay, 1978). D'un

autre côté, il a été montré que la restriction calorique s'accompagne chez le rat d'une

diminution de la quantité de cytochromes, en particulier du taux de cytochromes a + a3

(Ramanadham et Kaplay, 1978; Ferreira et Gil, 1984). Ainsi, Ferreira et Gil (1984) rapportent

une diminution de 22% du taux de cytochromes constituant la COX après 14 jours de

restriction totale en protéines. De leur côté, Ramanadham et Kaplay (1978) trouvent une

diminution de l'ensemble des cytochromes assurant le fonctionnement de la chaîne

respiratoire (a + a3, b et c + c1) chez des rats restreints en calories depuis au moins 7 à 9

semaines. Ainsi, une diminution en cytochromes au niveau du complexe IV peut très bien

expliquer, au moins en partie, la diminution de la consommation d'oxygène mitochondriale.

De plus, une telle diminution de la quantité de cytochrome a + a3 a été associée à une

augmentation de l'efficacité de la phosphorylation oxydative (Piquet et al., 2000; Nogueira et

al., 2001; cf. paragraphe II.B.1).

Quelques études rapportent aussi des variations de l'activité du complexe I. Ainsi,

Ferreira et Gil (1984) montrent une diminution de 40% de la vitesse maximale d'oxydation du

NADH par le complexe I, chez des rats restreints totalement en protéines pendant 14 jours. Or

le complexe I exerce un contrôle majeur sur la consommation d'oxygène de mitochondries

isolées de foie (Inomoto et al., 1994; Rossignol et al., 2000). A l’inverse, Desai et al. (2000)

trouvent une augmentation de l'activité enzymatique du complexe I (+62%) dans une situation

de restriction calorique moins intense (4 semaines et une perte de poids de 35% contre 14

jours et une perte de poids de 80% dans l'étude de Ferreira et Gil (1984)). La durée de la

restriction calorique et l’importance de la perte de poids pourraient expliquer cette divergence.

Enfin, Ferreira et Gil (1984) montrent une diminution de 23% de l'activité ATPasique.

Ce résultat est une preuve indirecte d'une possible diminution de l'activité phosphorylante qui

pourrait en retour expliquer la diminution de la respiration lors d’une restriction calorique.

En conclusion, l'ensemble de ces quelques études montre qu'une restriction calorique

d'intensité ou de durée assez importante (au moins une semaine et/ou -75% de la prise

alimentaire), s'accompagne d'une diminution de la consommation d'oxygène mitochondriale

hépatique et que cet effet pourrait s’expliquer par une diminution de l'activité de la chaîne

respiratoire impliquant probablement la COX et/ou l’activité du complexe ATP-synthétase.

27

(2) au niveau du muscle squelettique.

De nombreuses études montrent que la restriction calorique s'accompagne d'une

diminution de la consommation d'oxygène de mitochondries isolées de muscle squelettique

(Hansen-Smith et al., 1977; Ardawi et al., 1989; Lal et al., 2001; Madapallimattam et al.,

2002). Ainsi, Ardawi et al. (1989) trouvent, chez des rats restreints à 25% de la prise

alimentaire de rats nourris ad libitum pendant 21 jours, une diminution de la respiration à

l'état 3 et 4 (-21 et -27% pyruvate + malate, -21 et -19% palmitoyl-l-carnitine + malate et -35

et -28% 2-oxoglutarate + malate) dans des mitochondries isolées de gastrocnemius. De même,

Lal et al. (2001) rapportent, chez des rats soumis à 23 mois de restriction calorique (restriction

de 34%), une diminution de 23% de la consommation d'oxygène (sous oligomycine et avec

succinate) des mitochondries isolées de muscles squelettiques de la patte arrière.

Cette diminution de la consommation d'oxygène mitochondriale semble dépendre de

l'importance de la perte de poids durant la période d'adaptation à la restriction calorique.

Ainsi, Madapallimattam et al. (2002) montrent une corrélation logarithmique négative entre le

taux de respiration à l'état 3 de mitochondries de gastrocnemius et le pourcentage de

changement de masse obtenu chez des rats restreints de 75% pendant 5, 6, 7, 8, 10 et 11 jours.

Il en résulte que la restriction calorique ne s'accompagne d'effets significatifs que chez les

animaux ayant perdu 29% de leur masse initiale et seulement pour la respiration à l'état 3

(pyruvate + malate, glutamate + malate et succinate) (Madapallimattam et al., 2002). De

même, la respiration mitochondriale pourrait aussi être influencée par la durée de la restriction

calorique. Ainsi, Bevilacqua et al. (2004), montrent que la consommation d’oxygène en

condition phosphorylante de mitochondries de muscles squelettiques (patte arrière) est

diminuée chez des rats restreints (-40% de la prise alimentaire de rats témoins) pendant 2 et

10 semaines mais n’est pas modifiée chez des animaux restreints depuis 6 mois.

Cette diminution de la consommation mitochondriale secondaire à une restriction

calorique pourrait aussi dépendre du type de fibres musculaires. Ainsi, Hansen-Smith et al.

(1977) trouvent une diminution de la respiration à l'état 3 sur des biopsies de quadriceps blanc

mais pas de changement au niveau du quadriceps rouge de rats restreints (régime réduit en

quantité: -60% de la prise alimentaire; et en qualité: -50% de protéines dans le régime pour un

premier groupe, régime réduit en quantité: -60% de la prise alimentaire pour un second

groupe) durant 8-10 semaines. Il est intéressant de noter que ces auteurs montrent que cette

diminution de la consommation d'oxygène s'accompagne d'une perte totale de fibres de types

IIa dans le quadriceps blanc sans que la structure des autres types de fibres ne soit affectée.

28

Cependant, ceci n'est observé que pour les rats qui sont restreints à la fois en quantité et en

qualité. Malheureusement, l'analyse microscopique n'étant pas suffisamment complète

(méthode qualitative et non quantitative) il est impossible de conclure pour les auteurs si cette

perte de fibres musculaires est la seule explication à la diminution de la respiration pour ce

groupe de rats.

La diminution de la consommation d'oxygène associée à une restriction calorique peut

aussi s'expliquer par une diminution de l’activité de la chaîne respiratoire et en particulier de

l'activité des ces complexes enzymatiques. Ainsi, Bevilacqua et al. (2004) rapportent une

diminution de l’activité oxydante (analyse top-down) de mitochondries de muscles

squelettiques de rats restreints de 40%. Cet effet de la restriction calorique semble toutefois

dépendant du temps, puisque la diminution est moins forte après 10 semaines qu’après 2

semaines et disparaît au-delà de 6 mois. La restriction calorique s’accompagne d’une

diminution de l’activité enzymatique des complexes I, II et III (Feuers, 1998; Briet et

Jeejeebhoy, 2001) qui s’atténue ou s’inverse avec une restriction à plus long terme (17 mois

contre 7 mois) (Feuers, 1998). En plus de montrer que l’activité des complexes I et III

corrèlent négativement avec les changements de masse durant la phase d’adaptation à la

restriction calorique, Madapallimattam et al. (2002) rapportent des corrélations positives entre

l’activité des complexes I et III et la respiration à l’état 3 respectivement sous glutamate +

malate, pyruvate + malate, et glutamate + malate, pyruvate + malate et succinate. Partant du

fait que l’intensité de la diminution de la consommation d’oxygène mitochondriale était la

même selon que le substrat utilisé impliquait (glutamate + malate et pyruvate + malate) ou

n’impliquait pas le complexe I (succinate), Madapallimattam et al. (2002) concluent que la

diminution de l’activité enzymatique du complexe III représente l’étape limitante de la

respiration associée à une restriction calorique. Ceci est en accord avec le fait que le complexe

III représente une étape limitante importante de la consommation d’oxygène de mitochondries

musculaires (Rossignol et al., 2000). En revanche, Madapallimattam et al. (2002) ne trouvent

pas d'effet de la restriction calorique sur le taux d'oxydation de l'ascorbate + TMPD, ni sur

l’activité enzymatique du complexe IV. Par ailleurs, Briet et Jeejeebhoy (2001) ne rapportent

pas d’effet de 7 jours de restriction calorique (-75% de la prise alimentaire de rats témoins)

sur l’activité enzymatique de la COX sur mitochondries de soleus. Seul Feuers (1998)

rapporte une augmentation de l’activité enzymatique du complexe IV, au niveau de

mitochondries isolées de gastrocnemius de souris restreintes de 40% mais pendant 17 mois.

En revanche, il semble peu probable que la diminution de la respiration (en conditions

phosphorylante et non-phopshorylante) puisse s’expliquer par une diminution de la fuite de

29

protons et/ou de l’activité de phosphorylation, en tout cas lors de restriction à court-terme (< 6

mois). En effet, Bevilacqua et al. (2004) montrent que ces deux paramètres (analyse « top-

down ») sont diminués chez des rats restreints (- 40%) depuis 6 mois mais inchangés après 2

et 10 semaines de restriction calorique.

En conclusion, l'ensemble de ces études montre qu'une restriction calorique d'intensité

ou de durée assez importante (au moins 2 semaines et/ou -35% de la prise alimentaire)

s'accompagne d'une diminution de la consommation d'oxygène mitochondriale musculaire

squelettique. De plus, il semble que l'effet de la restriction calorique passe par une diminution

de l'activité enzymatique du complexe III.

En conclusion, la perte de poids volontaire s’accompagne d’une diminution de la

dépense d’énergie du corps entier, impliquant essentiellement une diminution du métabolisme

de base. Cette diminution de la dépense d’énergie persiste après ajustement pour les variations

de composition corporelle. Cette adaptation métabolique s’explique par des mécanismes

passifs: diminution de la masse des tissus à forte activité métabolique (essentiellement le foie)

proportionnellement supérieure à la perte de poids totale et par des mécanismes actifs:

diminution de la consommation d’oxygène mitochondriale hépatique et musculaire, sans

amélioration prouvée de l’efficacité de la phosphorylation oxydative. Il semble que les

hormones thyroïdiennes et la leptine, dont les taux plasmatiques sont diminués, jouent un rôle

dans cette adaptation à la restriction calorique, soit en régulant les mécanismes actifs

précédemment cités, soit en agissant sur d’autres mécanismes du métabolisme énergétique

mitochondrial.

B. La perte de poids involontaire.

Elle est définie comme une perte de poids supérieure à 5% de la masse corporelle

habituelle dans le dernier mois ou 10% dans les 6 derniers mois (manuel de Résident

Assessment Instrument). Assurément plus néfaste que la perte de poids volontaire dès le

moment qu’elle devient trop importante, elle est ainsi un facteur d’augmentation de la

mortalité et de la morbidité (Wallace et al., 1995; Morley, 1998). Nous nous intéresserons ici

aux cas de dénutrition consécutifs à un état d'hypercatabolisme.

Dans de nombreux cas d'hypercatabolisme associés à des maladies, la perte de poids

résulte principalement d'une perte de masse des tissus musculaires et graisseux, qui est due à

30

une prévalence des processus cataboliques sur les phénomènes anaboliques, en plus d'une

anorexie. Cependant, les mécanismes impliqués dans ce phénomène restent mal connus.

L'ensemble de ces mécanismes met en jeu divers facteurs du système central et

périphérique (hypothalamus, hormones, cytokines, facteurs nutritionnels…) (Marks et Cone,

2001; Schwartz, 2001; Argiles et al., 2002; Baracos, 2002; Langhans, 2002; Nandi et al.,

2002; Tisdale, 2002; Costelli et Baccino, 2003). Brièvement, il apparaît que dans un état

d'hypercatabolisme, l’augmentation de la protéolyse musculaire est due principalement à

l'activation du système protéasome ATP-ubiquitine dépendant. Ce système protéolytique est

essentiellement induit par le TNF-α et les glucocorticoïdes via NF-κB dont les taux sont

augmentés en réponse de la phase aiguë lors de sepsis ou de traumatisme. Dans le cas

particulier des cancers, le système protéasome ATP-ubiquitine dépendant est également activé

par des facteurs tumoraux tel que PIF (proteolysis-inducing factor).

1. Perte de poids involontaire et dépense d'énergie du corps entier

De nombreuses maladies et conditions médicales (cancers, diabètes, brûlures, fracture

du col fémoral…) peuvent s'accompagner d'une augmentation de la dépense d'énergie.

Cependant, un problème méthodologique majeur reste la détermination d'un constituant

corporel pour servir de dénominateur du métabolisme de base. Ainsi, Jatoi et al. (2001)

mesurent la dépense d'énergie chez des patients cancéreux selon 4 techniques: dépense

d'énergie de repos non-ajustée mesurée par calorimétrie, dépense d'énergie de repos ajustée

pour la masse maigre déterminée par absorptiométrie bi-photonique (DEXA), dépense

d'énergie de repos ajustée pour la masse cellulaire mesurée par dilution du 40

K et dépense

d'énergie de repos ajustée pour la masse d'eau totale déterminée par dilution d'eau tritiée.

Comparant les valeurs à celles de personnes contrôles, ces auteurs ne trouvent pas de

différence pour la dépense d'énergie de repos non-ajustée et celle ajustée pour la masse d'eau

mais montrent une augmentation de la dépense d'énergie de repos ajustée, soit pour la masse

cellulaire, soit pour la masse maigre chez les patients cancéreux. Ceci suggère qu’avec une

normalisation adéquate, la dépense d’énergie de repos est augmentée par kg de masse

métaboliquement active. En effet, en cas d’hypercatabolisme, il y a une perte de masse

musculaire or ce tissu à une faible activité métabolique (15 kcal/kg/jour). Donc si le rapport

de la masse musculaire sur la masse du foie (tissu à forte activité, 200 kcal/kg/jour) diminue,

on s’attend à une augmentation de la dépense d’énergie de repos ajustée pour la masse

métabolique. Par contre, si la dépense d’énergie est exprimée en valeur absolue (non-ajustée),

31

son augmentation pourra être masquée du fait de la perte musculaire. De plus, un état

d'hypercatabolisme peut se caractériser, entre autres, par un turnover protéique, au niveau du

corps entier, augmenté (augmentation de la protéolyse et diminution de la synthèse protéique

dans le muscle squelettique et augmentation de la synthèse de protéines dans le foie). Ces

phénomènes qui sont demandeurs d'énergie peuvent donc induire une augmentation de la

dépense d'énergie de repos. Globalement, tout dépend de l’importance de chacun des

phénomènes précédents et seule une normalisation appropriée de la dépense énergétique

(masse maigre, masse cellulaire) permet de mettre en évidence un état d’hypermétabolisme.

Ainsi, Bosaeus et al. (2001) ont déterminé la dépense d'énergie de repos chez 297 patients

atteints de divers cancers (tumeurs solides). Chez ces patients, 43% avaient une forte perte de

poids (perte supérieure à 10%) et 29% avaient un poids stable (valeur comprise entre 95 et

105% du poids habituel). Ces auteurs déterminent ainsi un hypermétabolisme (valeur de

dépense d'énergie de repos supérieure à 110% de la valeur prédite) chez 48,5% des patients et

une dépense d'énergie normale (valeur comprise entre 90 et 110% de la valeur prédite) pour

50,2% de la population étudiée, sans toutefois qu'il n'y ait de différence significative en

fonction de la variation du poids. Par contre, la dépense d'énergie de repos normalisée par le

poids était plus haute chez les patients ayant subi une forte perte de poids en comparaison de

ceux ayant un poids stable. Bien que la nature de la perte de poids ne soit pas renseignée

(masse musculaire, masse grasse, eau…), ces résultats suggèrent que chez certaines personnes

une forte perte de poids masque une augmentation des besoins en énergie.

Quoiqu’il en soit, il semble que dans de nombreuses situations associant perte de poids

et hypercatabolisme, il existe un hypermétabolisme. Ceci est décrit dans les cas de sepsis

(Chiolero et al., 1997), de fracture du col du fémur (Paillaud et al., 2000), d’infection par le

VIH (Schwenk et al., 1996), de brûlures (Cunningham, 1990). De plus, si toutes les études ne

rapportent pas systématiquement une augmentation de la dépense d’énergie de repos, toutes

font au moins référence à une grande variabilité des données. Ainsi, Knox et al. (1983) ont

mesuré la dépense d'énergie de repos chez 200 patients atteints de différents cancers et 200

patients normaux. Alors que chez les patients normaux ces auteurs montrent une bonne

corrélation entre le métabolisme de base mesuré et celui prédit (variation de l'ordre de ± 10-

15%), chez les patients cancéreux les valeurs de dépense d'énergie de repos variaient entre 50

et 175% des valeurs prédites. Cet exemple tend à montrer qu’il existe bien une dysrégulation

du métabolisme de base et qu’il est donc très difficile de prédire la dépense d’énergie de repos

dans des situations de perte de poids involontaire. D’un autre côté, même si cette

augmentation de la dépense d’énergie de repos reste dans certaines situations, mineure (+5-

32

10%), un tel état d’hypermétabolisme soutenu sur le temps peut contribuer à une balance

d'énergie négative à moyen et long terme.

Quoiqu’il en soit, on aboutit donc au final à une situation paradoxale où la diminution

des apports caloriques ne s’accompagne plus d’une économie d’énergie au niveau du corps

entier comme c’est le cas en cas de restriction calorique. Dans ces situations d’agression,

l'objectif des différents mécanismes d'adaptation n'est plus d'épargner au maximum les

réserves énergétiques et protéiques pour maintenir le plus longtemps possible un équilibre

nutritionnel mais, au contraire, d'utiliser tous les moyens métaboliques à disposition (dont la

synthèse de nouvelles protéines) pour lutter contre l'agression.

2. Quels sont les mécanismes et causes responsables de cet état d’hypermétabolisme ?

Les mécanismes précis pouvant expliquer l’augmentation de la dépense d’énergie de

repos demeurent assez mal connus. De plus, de nombreuses études concernent la cachexie

cancéreuse qui reste un cas particulier d’hypercatabolisme. En effet, dans ces affections

malignes, la présence, la localisation et le type anatomique de la tumeur sont des facteurs

déterminants.

a) Inflammation et modifications endocriniennes

Des travaux suggèrent que l’inflammation par une production excessive de cytokines

puisse influencer le métabolisme énergétique. Ainsi, Roubenoff et al. (1994) rapportent une

corrélation entre la production de TNF-α et IL-1β et l'augmentation de la dépense d'énergie

de repos, chez des patients atteints de cachexie rhumatoïde. D'autres auteurs ont montré une

association entre un hypermétabolisme, une perte de masse maigre et la production de

cytokines suite à une injection de ces dernières (Warren et al., 1987; Hellerstein et al., 1989;

Seaton et al., 1990; Hoshino et al., 1991; Nguyen et al., 1999). De même, le traitement par

glucocorticoïdes augmente les dépenses énergétiques chez l'homme (Brillon et al., 1995;

Tataranni et al., 1996) et augmente l’activité du complexe IV dans le muscle de rats (Weber et

al., 2002).

L’ensemble de ces études montre qu’en situation d’agression, l’inflammation et les

modifications endocriniennes agissent sur le métabolisme de base.

b) Phénomènes consommant de l'ATP

33

Dans un état d'hypercatabolisme, en réponse aux demandes, le turnover des substrats est

augmenté. Ces métabolismes étant également demandeurs d'énergie, il en résulte que la

contribution relative des différentes réactions consommant de l'énergie au métabolisme de

base pourra être changée. Ainsi, chez des patients souffrant de brûlures, Wolfe et al. (1987)

rapportent une augmentation du turnover des cycles des acides gras et glycolytique-

néoglucogénique. De même, Yu et al. (1999) montrent que la synthèse protéique totale, la

néoglucogenèse, le cycle de l'urée et le turnover des substrats (acides gras et glucose)

représente respectivement 22, 11, 3 et 21% de l'augmentation de la dépense d'énergie de repos

du corps entier chez des personnes gravement brûlées. Enfin, chez l’homme, Brillon et al.

(1995) montrent que l’augmentation du turnover protéique expliquerait entre 7 et 22% de

l’augmentation de la dépense d’énergie de repos suite à une injection d’hydrocortisone

acétate.

c) La masse des organes métaboliquement actifs

Si l’hypercatabolisme entraîne une diminution de la masse musculaire, à l’inverse la

masse des tissus viscéraux peut être maintenue voire augmentée à cause de l’inflammation

chronique et ceci est notable pour le foie. Il y a donc une augmentation relative de la masse

des tissus à forte activité métabolique par rapport à la masse musculaire plus faiblement

active. L’augmentation de la dépense d’énergie sera d’autant plus importante que celle-ci sera

normalisée par la masse cellulaire et que l’augmentation de la masse des tissus correspondra

réellement à une augmentation de tissu métaboliquement actif (protéines fonctionnelles).

Oudart et al. (2000) rapportent dans un modèle de rats rendus cancéreux, une augmentation de

21% de la masse relative du foie (g/100g masse animal). Néanmoins, ces auteurs ne précisent

pas si cette augmentation de la masse hépatique est due à une augmentation de tissu

métaboliquement actif ou uniquement le fait d’une augmentation du contenu en eau ou en

lipides, ce qui dans ce cas n’entraînerait pas d’augmentation de la dépense d’énergie.

Quoiqu’il en soit, cette augmentation de la masse des tissus à forte activité métabolique,

même si elle n’est que relative à la perte de tissu musculaire, est sans doute un déterminant

important de l'hypermétabolisme. Ainsi, Yu et al. (1999) rapportent chez des patients

gravement brûlés, une augmentation de 63% de la contribution du foie dans la consommation

d'oxygène totale (passant de 17% chez un individu sain à 27,8% chez un patient brûlé).

d) Augmentation de l’activité des protéines découplantes

34

A ce jour, seules des modifications de l’expression des protéines découplantes ont été

mises en évidence lors d’état d’hypermétabolisme.

Dans un modèle de cachexie cancéreuse du rat, il a été montré que le TNF-α pouvait être

responsable de la stimulation de la transcription des gènes UCP2 et UCP3 dans le

gastrocnemius (Sanchis et al., 1998; Bing et al., 2000). Dans une autre étude, l'administration

de cette cytokine à des rats provoque une augmentation du taux des ARNm UCP2 et UCP3 au

niveau du gastrocnemius 6 h après l’injection (Busquets et al., 1998). Chez des souris,

Faggioni et al (1998) montrent que l'inflammation induite par le lipopolysaccharide (LPS; 16

h après l’injection) stimule l'expression du gène UCP2, non seulement dans le muscle

squelettique mais également dans le foie. De plus, ces auteurs mimaient ces sur-expressions

géniques en injectant directement soit TNF-α soit IL-1β. Dans un modèle de sepsis (ligature

ponction du cæcum), Sun et al. (2003) montrent une augmentation des taux d’ARNm et en

protéine du gène UCP3 dans le muscle squelettique (soleus et EDL) de rats, 16 h après

l’intervention. De plus, le traitement de ces rats par un antagoniste des récepteurs aux

glucocorticoïdes (RU-38486) inhibaient ces sur-expressions, tandis que l’injection de

dexaméthasone à des rats témoins mimait l’augmentation des taux de l’ARNm et de la

protéine UCP3. Cette stimulation par les glucocorticoïdes se vérifiait également à la suite de

l’ajout in vitro de dexaméthasone, montrant ainsi que l’effet de l’état septique sur UCP3 était,

au moins en partie, médié par les glucocorticoïdes. Enfin, chez des souris, 18 h après

l’injection de dexaméthasone, Gong et al. (1997) trouvent une augmentation des taux

musculaires d’ARNm UCP2 et UCP3.

Finalement, si ces modifications de l’expression des protéines découplantes se

traduisent concrètement par une augmentation de l’activité de fuite de protons, il est alors

envisageable que le rendement de la phosphorylation oxydative sera diminué et que la

dépense d’énergie sera augmentée.

e) Métabolisme énergétique mitochondrial

Les études portant sur l’inflammation et les modifications endocriniennes, présentes lors

d’un état d’hypercatabolisme, suggèrent que le métabolisme énergétique mitochondrial puisse

être altéré, expliquant ainsi une partie de l’hypermétabolisme. De plus, selon les lois de la

thermodynamique, l’homéostasie de l’énergie est régie à la fois par le taux et l’efficacité des

flux. En conséquence, une forte production d’énergie ne sera possible qu’au détriment d’une

diminution de son efficacité de production. En contrepartie, cette moindre efficacité de la

35

synthèse d’énergie induira une perte d’énergie supplémentaire. Ainsi, le métabolisme

mitochondrial peut expliquer l’hypermétabolisme 1) du fait d’une dysrégulation de son

fonctionnement lié à l’inflammation par elle-même (exemple d’une diminution du couplage

de la phosphorylation oxydative), la mitochondrie est dans ce cas la victime de

l’inflammation, 2) du fait d’une adaptation de son fonctionnement (diminution de l’efficacité

de synthèse de l’ATP) dans le but de satisfaire la demande d’énergie augmentée par ailleurs,

la mitochondrie est cette fois-ci au service des phénomènes demandeurs d’énergie.

(1) au niveau du foie.

De nombreuses études rapportent l’effet des glucocorticoïdes (modèle

d’hypercatabolisme) sur la respiration mitochondriale hépatique (cf. tableau 2). En résumé,

bien que ces études divergent sur l’effet des glucocorticoïdes sur les taux de respiration, il

apparaît cependant que quels que soit la molécule, le substrat et la durée utilisés, les

glucocorticoïdes induisent, le plus souvent, une diminution de l’efficacité de la

phosphorylation oxydative (rapports ATP/O ou ADP/O diminués). De plus, il semble que

l’ensemble des effets des glucocorticoïdes sur la consommation d’oxygène mitochondriale

soient des effets directs puisque l’ajout in vitro de ces composés est capable de moduler les

paramètres respiratoires. Ainsi, l’injection de methylprednisolone entraîne une diminution de

la respiration à l’état 3 et à l’état découplé et du rapport ADP/O (succinate et pyruvate +

malate mais pas ascorbate + TMPD) dans des mitochondries de foie de rats (Martens et al.,

1991). Ces auteurs montrent aussi que l’effet est proportionnel à la dose injectée. De même,

Gomez-Puyou et al. (1963) montrent une respiration à l’état 3, respectivement diminuée et

augmentée suite à l’ajout in vitro d’hydrocorticostérone et de triamcinolone, pour les substrats

malate et glutamate (pas d’effet pour le succinate). De plus, ces auteurs trouvent un rapport

P/O diminué avec la triamcinolone pour les 3 substrats.

(2) au niveau du muscle squelettique.

Quelques études rapportent l’effet de traitements par glucocorticoïdes sur le

métabolisme énergétique de mitochondries isolées de muscles squelettiques (cf. tableau 3).

D’après ces études, il semble que le traitement par glucocorticoïdes puisse s’accompagner

d’une altération du rendement de la phosphorylation oxydative musculaire, mais que cet effet

ne serait que de courte durée et disparaîtrait après quelques jours (au mieux 11 jours et chez le

rat).

36

De leur côté, Koerts-de Lang et al. (2000) rapportent les effets ex vivo de 14 jours de

traitement par triamcinolone chez le rat, et montrent une anomalie du métabolisme

énergétique mitochondrial musculaire avec une diminution du statut énergétique. En effet, les

concentrations en ATP, PCr et créatine totale étaient diminuées. De façon intéressante, ces

auteurs utilisent également un groupe apparié pour la perte de poids présentant aussi une

diminution des concentrations en ATP et PCr mais moins importante que chez les rats traités

par triamcinolone. Ceci suggère que dans un état d’hypercatabolisme, il y a une redistribution

de la synthèse d’ATP par la PCr en réponse à une production mitochondriale défectueuse et

que ceci ne semble pas le fait unique de la perte de poids mais implique aussi des

modifications induites par les glucocorticoïdes. De même, des résultats obtenus dans un

modèle de rats infectés (ligature ponction du caecum) vont dans le même sens. Il a ainsi été

montré in vivo (RMN du 31

P) qu’il y a une diminution de 20% du rapport PCr/ATP sans

modification de la concentration en ATP, associée à une augmentation de 20% du taux

d’hydrolyse de la PCr et une augmentation du taux d’ADP (Jacobs et al., 1991). Ces résultats

suggèrent que l’ATP est maintenu au détriment de la PCr et que la voie principale de synthèse

de l’ATP, la phosphorylation oxydative, est défectueuse (augmentation de l’ADP).

Cependant, il est aussi possible que le métabolisme mitochondrial participe à

l’hypermétabolisme simplement suite à une augmentation de son activité et donc sans une

diminution de son efficacité à synthétiser l’ATP. Ainsi, Weber et al. (2002) trouvent une sur -

expression (+100%) des gènes mitochondriaux COX II, COX III et du gène nucléaire du

cytochrome c, associée à une augmentation (+100%) de l’activité enzymatique de la COX,

dans le quadriceps de rats traités pendant 3 jours avec de la dexaméthasone aboutissant à un

taux de glucocorticoïdes circulant similaire à celui d’un stress sévère. Ces auteurs retrouvent

les mêmes effets sur des cellules musculaires (C2C12) traitées par dexaméthasone pendant 3

jours. Ces stimulations, qu’un antagoniste aux récepteurs nucléaires des glucocorticoïdes (RU

486) annulent, s’accompagnaient d’une diminution du taux de lactate cellulaire. Ceci suggère

un shift vers la production d’ATP par la voie de la phosphorylation oxydative (Weber et al.,

2002). Les auteurs concluaient ainsi que l’augmentation de l’activité de la COX, reflétant une

augmentation de l’activité de la chaîne respiratoire et une augmentation de la masse

mitochondriale musculaire, pouvait expliquer, en partie, l’augmentation de la dépense

d’énergie observée lors de stress sévère.

En conclusion, la perte de poids involontaire s’accompagne volontiers d’une

augmentation de la dépense d’énergie du corps entier. Cette augmentation du métabolisme de

37

base semble être la conséquence de l’inflammation et des modifications endocriniennes

induites par l’état d’hypercatabolisme, qui vont stimuler de nombreux cycles demandeurs

d’énergie. Cette augmentation de la dépense d’énergie peut aussi s’expliquer par une

altération de l’efficacité de la phosphorylation oxydative mitochondriale au niveau du foie et

du muscle squelettique. Cependant, il reste à déterminer si ceci est la conséquence des

modifications endocriniennes ou si c’est une adaptation du métabolisme énergétique pour

faciliter une production plus importante en énergie.

IV. Conclusion

Dans ces deux situations de balance énergétique négative, il existe donc un paradoxe

entre la perte de poids volontaire (restriction calorique) qui aboutit à une adaptation du

métabolisme pour épargner l’énergie, et la perte de poids involontaire (diminution des apports

alimentaires et hypercatabolisme) où cette adaptation est perdue et où une augmentation de la

dépense d’énergie est observée. Il est également intéressant de noter que même au niveau du

métabolisme énergétique mitochondrial tout semble différent. Dans le premier cas, il apparaît

que la mitochondrie (hépatique et musculaire), peut-être sous le contrôle de la leptine et de la

T3, diminue sa consommation d’oxygène sans modifier l’efficacité de sa synthèse d’ATP. A

l’inverse, dans le cas de la perte de poids involontaire, la mitochondrie (hépatique et

musculaire) pourrait être le moteur d’une perte d’énergie encore plus importante, en

diminuant son efficacité de synthèse d’ATP, pour répondre à l’augmentation de la demande

d’énergie due à l’inflammation.

38

RESTRICTION CALORIQUE ET METABOLISME ENERGETIQUE

MITOCHONDRIAL

39

Articles 1 et 2:

Food restriction affects energy metabolism in rat liver mitochondria. Dumas JF,

Roussel D, Simard G, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P. Biochim Biophys Acta. 2004 Jan

22;1670(2):126-31.

Food restriction induces an adaptation in liver mitochondrial energy metabolism:

a role for leptin ? Dumas JF, Johnson G, Roussel D, Savagner F, Gallois Y, Malthièry Y,

Simard G, Ritz P. Soumis à Diabetes.

Au cours d’une restriction calorique, les études rapportent une diminution de la

dépense d’énergie totale du corps entier (Thompson et al., 1996; Astrup et al., 1999; Blanc et

al., 2003). Bien que cette diminution de la dépense d’énergie s’explique en partie par la perte

de poids et en particulier par la perte de masse maigre, les études montrent également

l’existence d’une réelle adaptation à la restriction calorique. Autrement dit la restriction

calorique s’accompagne d’une diminution de la dépense d’énergie supérieure à ce que le

voudrait la simple perte de masse corporelle. Cependant, les mécanismes biochimiques et

moléculaires pouvant expliquer cette adaptation métabolique restent discutés.

Parmi les hypothèses, il est proposé qu’une diminution de la taille des tissus et des

organes et particulièrement ceux qui ont une forte activité métabolique (rapport de la

contribution à la dépense d’énergie du corps entier sur la contribution à la masse corporelle

totale) puisse expliquer une partie de la diminution de la dépense d’énergie de repos (Ramsey

et al., 2000). Mais ceci ne sera vrai que si la perte de masse de ces tissus ou organes est

proportionnellement supérieure à la perte de masse corporelle totale. Le foie et le muscle

représentent à eux deux 50% de la dépense énergétique de repos (Rolfe et Brown, 1997). Le

foie est un tissu à forte activité métabolique: chez l’homme par exemple, il contribue pour 17-

25% de la dépense d’énergie de repos totale (environ 200 kcal par kg et par jour) mais ne

représente que 2% de la masse corporelle. A l’inverse, le muscle, qui représente 25-30% du

métabolisme de base (environ 15 kcal par kg et par jour) et 20% de la masse corporelle totale,

a une faible activité métabolique. Par conséquent, si la perte de masse hépatique (par

exemple) est proportionnellement plus intense que celle d’organes à l’activité métabolique

plus faible (par exemple, le muscle squelettique), une diminution supplémentaire de la

dépense d’énergie (en valeur absolue ou ajustée) pourra être observée.

L’adaptation métabolique à la restriction calorique peut aussi s’expliquer par une

diminution du métabolisme énergétique mitochondrial. En effet, plus de 90% de la

consommation d’oxygène de repos est d’origine mitochondriale, dont 80% couplée à la

40

synthèse d’ATP et 20% perdue sous forme de chaleur (Rolfe et Brown, 1997). Par

conséquent, si la respiration mitochondriale est diminuée, la consommation d’oxygène du

corps entier le sera aussi. Ce phénomène sera encore plus important si la part non couplée à la

synthèse d’ATP (fuite de protons et « slip redox ») est diminuée et donc que l’efficacité de

synthèse de l’ATP est augmentée (augmentation du rapport ATP/O). Dans ces conditions,

pour une demande en énergie donnée, la consommation d’oxygène correspondante sera

inférieure. Au niveau du foie, l'ensemble des études (Gold et Costello, 1975; Ramanadham et

Kaplay, 1979; Ferreira et Gil, 1984; Lambert et Merry, 2004; Ramsey et al., 2004) rapportent

qu'une restriction calorique d'intensité ou de durée assez importante (au moins une semaine

et/ou -75% de la prise alimentaire) s'accompagne d'une diminution de la consommation

d'oxygène mitochondriale hépatique, mais que cet effet semble passager et disparaît au-delà

de quelques mois. Cependant les études ne montrent pas de variation de l’efficacité de la

phosphorylation oxydative (ADP/O; Ramanadham et Kaplay, 1979; Ferreira et Gil, 1984).

Dans les mitochondries musculaires, les résultats montrent qu'une restriction calorique

d'intensité ou de durée assez importante (au moins 2 semaines et/ou -35% de la prise

alimentaire) s'accompagne d'une diminution de la consommation d'oxygène (Hansen-Smith et

al., 1977; Ardawi et al., 1989; Lal et al., 2001; Madapallimattam et al., 2002; Bevilacqua et

al., 2004). Là encore, le couplage de la phosphorylation oxydative n’apparaît pas être affecté

par la restriction calorique (Madapallimattam et al., 2002).

En résumé, il apparaît donc logique de penser que l’adaptation métabolique à la

restriction calorique peut s’expliquer en partie par des mécanismes passifs (perte de masse

tissulaire des organes) et des mécanismes actifs (diminution du métabolisme énergétique

mitochondrial) au niveau du muscle et du foie qui participent pour 50% au métabolisme de

base. Cependant, tout est encore discuté au sujet des possibles médiateurs de cette adaptation.

Les hormones thyroïdiennes sont considérées comme le principal régulateur

physiologique de la dépense énergétique (métabolisme de base et thermogenèse facultative),

non seulement en accélérant le turnover de l’ATP mais également en diminuant l'efficacité de

la synthèse d’ATP. La restriction calorique conduit à une diminution de la concentration

sérique de T3 et une augmentation de la conversion de la T4 en la forme inactive (rT3) (Kelly,

2000; Krotkiewski, 2002). Au niveau mitochondrial, la diminution du taux de T3 (rats

hypothyroïdiens) s’accompagne d’une amélioration de l’efficacité de la phosphorylation

oxydative concomitante à une diminution de la consommation d’oxygène et de la perte

d’énergie redox (Harper et Brand, 1993; Nogueira et al., 2002). Il est, par conséquent, tentant

41

de rapprocher ces résultats observés en hypothyroïdie des phénomènes observés au cours de la

restriction calorique où la concentration de T3 est diminuée.

De plus en plus de travaux portent sur l’étude de la leptine et des ses effets sur le

métabolisme énergétique et montrent que cette hormone est capable de réguler la dépense

d’énergie autrement que par son action sur la prise alimentaire. Ainsi, chez des souris dont le

gène de la leptine a été invalidé, l’hormone induit une stimulation de la consommation

d’oxygène de muscles (Dulloo et al., 2002) alors qu’elle entraîne une diminution de la fuite de

protons de mitochondries de foie (Melia et al., 1999). De plus, il a été montré que la leptine

stimule le métabolisme de base chez le rat et que cet effet n’est pas dépendant du statut

thyroïdien mais additif à celui-ci (Wang et al., 2000). De telles relations entre le métabolisme

énergétique du corps entier et la leptine semblent aussi exister au cours de la restriction

calorique. Ainsi il a été montré que la diminution de la concentration plasmatique de

l’hormone, qui accompagne la restriction calorique, corrèlent positivement avec la diminution

de la dépense d’énergie du corps entier (cf. paragraphe III.A.2.b.(2) de l’introduction

bibliographique). De même, il a été montré que chez des patients soumis à une perte de poids

et dont la dépense d’énergie totale et les concentrations sériques de T3 et leptine étaient

diminuées, l’injection de leptine entraînait une normalisation de la dépense d’énergie et de la

concentration de T3 aux niveaux précédents la perte de poids (Rosenbaum et al., 2002).

L’ensemble de ces résultats suggère que la leptine joue un rôle dans la régulation du

métabolisme de base au cours d’une restriction calorique, et que les mécanismes impliqués

puissent agir directement sur le métabolisme mitochondrial.

La restriction calorique de quelques jours est un phénomène fréquemment rencontré

en médecine (préparation pour explorations fonctionnelles, situation pré-opératoire). Elle est

aussi présente en cas de dénutrition. Cependant, à notre connaissance, il n’existe pas de

travaux concernant l’effet d’une restriction à court terme, en dehors de celles basées sur des

jeûnes totaux. L’ensemble des résultats provient donc d’études sur la restriction calorique à

moyen et long terme (1 semaine à plusieurs mois). Il n’a donc pas été établi que

l’adaptation métabolique existait après quelques jours de restriction calorique. Dans ce

cas, rien ne dit non plus si les mécanismes mis en place sont les mêmes que ceux induits

par une restriction à moyen terme.

Nous avons choisi d’étudier le foie, car c’est un organe qui à une forte activité

métabolique (200 kcal par kg et par jour). De plus, chez l’animal soumis à une restriction

calorique (le plus souvent un jeûne total), l’ensemble des études montre que la masse du foie

en particulier est la première à diminuer et ceci de façon relativement supérieure à la perte de

42

poids total (Ramsey et al., 2000). A l’inverse, la masse musculaire ne diminue que plus

tardivement et de façon moins importante (Ramsey et al., 2000). De plus, il a été montré que

la masse du foie varie très rapidement en fonction du niveau d’alimentation et corrèle

positivement avec la dépense d’énergie de repos (Koong et al., 1985). Cependant de part son

importance dans le métabolisme de base, le muscle fait également l’objet d’études au sein de

notre équipe (travaux de thèse de Gyasi Johnson).

Résultats

Les résultats de notre premier article montrent qu’une restriction énergétique de 50%

pendant 3 jours s’accompagne d’une diminution de la consommation d’oxygène, de

mitochondries de foie, en conditions non-phosphorylante, phosphorylante et découplée, sous

succinate. A l’inverse, avec un substrat du complexe IV, la respiration mitochondriale n’est

statistiquement diminuée qu’à l’état 3. D’après l’analyse des effets de la restriction calorique

sur la phosphorylation oxydative (analyse « top-down »), il apparaît que la restriction

calorique induit une diminution de l’oxydation des substrats, mais ne modifie ni la fuite de

protons, ni l’activité de phosphorylation. Par ailleurs, la diminution de l’activité de la chaîne

respiratoire ne semble pas s’expliquer par une diminution de l’activité enzymatique d’un de

ces complexes, puisque aucune de ces dernières n’est modifiée hormis l’augmentation de

l’activité du complexe IV.

En terme de poids, 3 jours de restriction calorique induisent une diminution de la masse du

foie (-17%) supérieure à la perte de masse totale des animaux (-13%). Quel que soit le groupe

de rats, l’hydratation du foie (g d’eau/g de tissu) n’était pas différente.

Notre deuxième étude montre que la respiration à l’état 3 diminue de façon

proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique (-25, -50 et -75%) pour l’ensemble des

substrats des complexes I et II mais pas pour le complexe IV. De même, la consommation

d’oxygène sous FCCP corrèle négativement avec l’intensité de la restriction calorique. A

l’inverse, il n’y a pas de corrélation entre la respiration à l’état 4-oligomycine et l’intensité de

la restriction calorique à l’exception de celle sous glutamate. Quel que soit le substrat utilisé,

il n’y a pas de corrélation entre l’efficacité de la phosphorylation oxydative (ATP/O et q) et

l’intensité de la restriction calorique (sauf corrélation positive pour ATP/O sous glutamate).

L’étude de la cinétique du potentiel de membrane en fonction de la consommation d’oxygène

en condition non-phosphorylante (état 4-oligomycine) montre un décalage des courbes vers la

droite chez les rats restreints en comparaison de celle des rats témoins. Ainsi, l’ensemble des

potentiels de membrane (pour la partie non linéaire des courbes) est maintenu avec une

43

consommation d’oxygène inférieure chez les rats restreints en calorie. Pour le plus haut

potentiel de membrane commun, par exemple, la consommation d’oxygène correspondante

est diminuée de 34, 42 et 18% respectivement pour les groupes restreints de 25, 50 et 75%,

par rapport à celle de groupe témoin. Concernant l’activité enzymatique des complexes de la

chaîne respiratoire, seule celle du complexe IV augmente significativement avec l’intensité de

la restriction calorique.

Proportionnellement à l’intensité de la restriction, la masse du foie est diminuée de façon plus

importante que la masse des animaux. Cette diminution tissulaire s’explique par une

diminution du taux de glycogène et de la quantité de protéines totales et mitochondriales,

puisque ces paramètres corrèlent négativement avec l’intensité de la restriction calorique (P =

0.134 pour la quantité de protéines mitochondriales).

Les concentrations plasmatiques de leptine et T3 sont diminuées en proportion de l’intensité

de la restriction calorique.

L’expression des gènes de la superoxide dismutase (SOD) et des sous-unités I, et IV de la

COX est augmentée proportionnellement à l’intensité de la restriction calorique. En revanche,

la quantité d’ARNm du peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1 (PGC-1) ne

corrèle pas avec l’intensité de la restriction calorique.

Enfin, bien que de nombreux paramètres (respiration, expression des gènes) corrèlent à la fois

avec les concentrations de leptine et de T3, seul la leptine apparaît être un déterminant de leur

variation (analyse de régression pas à pas). Ainsi, la leptine explique entre 16 et 40% de la

variation de la respiration à l’état 3.

Discussion

Nos résultats confirment qu’en réponse à une restriction calorique et ce dès 3 jours, la

perte de masse du foie est supérieure à la perte de masse corporelle. De plus nous montrons

que cela est proportionnel à l’intensité de la restriction calorique. Ces résultats complètent

ceux des études de Ramsey et al (2004) et de Bevilacqua et al. (2004) où la perte de masse du

foie augmente avec la durée de la restriction calorique (respectivement, 1 mois vs. 6 mois et 2

semaines vs. 2 mois, vs. 6 mois) et de façon plus intense que la perte de poids corporelle des

animaux. Bien que cette perte tissulaire s’explique en grande partie par une diminution du

taux en glycogène, il apparaît néanmoins que la masse protéique et à un moindre degré celle

mitochondriale diminue aussi avec l’intensité de la restriction calorique. Par conséquent, nos

résultats montrent bien qu’en réponse à une restriction calorique, il y a une diminution de la

masse métabolique du foie proportionnellement plus importante que la perte de masse

44

corporelle du rat. Or le foie est un important contribuant au métabolisme de base (17-25% de

la dépense d’énergie de repos; Rolfe et Brown, 1997). Ceci suggère donc que ce mécanisme

passif est capable d’expliquer une partie de l’adaptation métabolique, et ce rapidement après

l’initiation de la restriction calorique (3 jours). Le fait que cette diminution de la masse du

foie soit proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique renforce l’intérêt d’une telle

adaptation tissulaire pour une économie d’énergie. Ainsi, plus la restriction est intense et plus

l’adaptation métabolique est importante. Ceci complète les résultats à plus long terme. Ainsi,

il a été montré que chez des rats restreints pendant 2 semaines, 2 ou 6 mois, la perte de masse

du foie était de plus en plus forte et que cette évolution était parallèle à la diminution de la

dépense d’énergie du corps entier (Bevilacqua et al., 2004).

Au niveau du métabolisme énergétique mitochondrial, nos résultats montrent une

diminution de la consommation d’oxygène en condition phosphorylante et de façon moindre

en condition non-phosphorylante. En effet, seule la respiration à l’état 3 diminue en

proportion de l’intensité de la restriction calorique. Ces résultats confirment et complètent

ceux de précédentes études (Gold et Costello, 1975; Ramanadham et Kaplay, 1979; Ferreira et

Gil, 1984; Lambert et Merry, 2004; Ramsey et al., 2004) qui montrent qu'une restriction

calorique à moyen terme (une à plusieurs semaines) s'accompagne d'une diminution de la

consommation d'oxygène mitochondriale hépatique, mais que cet effet semble passager et

disparaît au-delà de quelques mois. Nous montrons que cette adaptation existe dès 3 jours et

est proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique.

Une telle diminution de la respiration en condition phosphorylante peut s’expliquer

par 1) une diminution de l’activité de la chaîne respiratoire, 2) une diminution de la perte

d’énergie rédox (diminution de la fuite de protons et/ou augmentation de l’efficacité de

pompage des protons au sein de la chaîne respiratoire), 3) une amélioration de l’efficacité de

pompage des protons au sein du complexe ATP-synthéthase. Nos résultats indiquent une

diminution de l’activité de la chaîne respiratoire. Ceci se vérifie avec l’analyse « top-down »

(utilisée pour la première fois en cas de restriction calorique, à notre connaissance) qui montre

une diminution de l’activité du bloc d’oxydation des substrats, mais également avec les

respirations en condition découplée (sous FCCP) qui reflètent directement l’activité de la

chaîne respiratoire. Une diminution de l’activité de la chaîne respiratoire implique soit un

défaut de transport et/ou de déshydrogénation du substrat soit une diminution du transfert des

électrons au sein de la chaîne respiratoire. Il semble improbable qu’il y ait une altération du

transport et de la déshydrogénation des substrats. En effet, l’utilisation de certains substrats

qui met en jeu l’activité de différents transporteurs et déshydrogénase résultent malgré tout en

45

une diminution de la respiration du même ordre de grandeur (exemple du glutamate et du

pyruvate). De plus, l’analyse top-down est réalisée avec le succinate, or nous ne trouvons pas

de différence dans l’activité de la succinate déshydrogénase. Nos résultats ne montrent pas de

différence de l’activité enzymatique des complexes de la chaîne respiratoire, à l’exception de

celle du complexe IV qui est augmentée. Parmi les accepteurs d’électrons le long de la chaîne

respiratoire, nous ne trouvons pas de diminution de la concentration en cytochromes (a + a3, c

+ c1 et b) de la chaîne respiratoire. Bien que nous n’ayons pas déterminé la concentration en

coenzyme Q, il a été montré que de 5 semaines de restriction calorique (-17%) entraîne une

augmentation de sa concentration dans le foie de rat (Willis et al., 1997). Cependant, il n’est

pas totalement exclu que la concentration du coenzyme Q soit diminuée avec une restriction à

court terme. Quoiqu’il en soit, nos résultats suggèrent que 3 jours de restriction calorique

s’accompagne d’une diminution de l’activité d’oxydation des substrats probablement liée à

une diminution du taux de transfert des électrons le long de la chaîne respiratoire.

La construction de la cinétique du potentiel de membrane en relation avec la

consommation d’oxygène à l’état 4-oligomycine montre un décalage des courbes vers une

diminution du gaspillage d’énergie (décalage vers la droite) chez les rats restreints. Ainsi pour

le maintien des plus forts potentiels de membrane, la consommation d’oxygène est inférieure

chez les rats restreints. D’après l’allure des courbes (décalage vers des potentiels plus forts et

des respirations plus faibles), nos résultas suggèrent une diminution de la fuite de protons.

Actuellement, la cytochrome c oxydase est le seul site de couplage reconnu où, dans certaines

conditions physiologiques, il existe une variation de la stœchiométrie H+/e

- (Piquet et al.,

2000; Nogueira et al., 2002). Cependant avec l’analyse de l’activité de la COX (respiration à

l’état découplé avec le substrat ascorbate + TMPD), nos résultats ne montrent pas de

différence entre les différents rats. Ceci renforce l’idée d’une diminution de la fuite de protons

chez les rats restreints. Quoiqu’il en soit, cette diminution de la fuite de protons ne semble pas

un mécanisme déterminant dans l’adaptation à la restriction calorique. En effet, elle est faible

et n’est pas proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique. Ces résultats sont en

accord avec ceux de Ramsey et al. (2004) qui montrent une légère diminution de la fuite de

protons chez des rats restreints depuis 1 mois mais pas de variation après 6 mois de restriction

calorique. De leur côté, Lambert et Merry (2004) rapportent une augmentation de la fuite de

protons chez des rats restreints depuis 6 mois. Par conséquent, bien que la fuite de protons soit

un fort déterminant de la consommation d’énergie cellulaire (Rolfe et Brand 1996), il est peu

probable qu’elle représente un mécanisme majeur dans l’adaptation du métabolisme

énergétique mitochondrial à la restriction calorique.

46

Au niveau de la phosphorylation, nos résultats ne montrent ni de modification du taux

de synthèse d’ATP (exception faite d’une diminution avec le glutamate et le pyruvate), ni de

variation de l’activité du bloc de phosphorylation (analyse « top-down »). Par conséquent,

pour un potentiel de membrane donné, le taux de synthèse n’est pas augmenté. Nos résultats

divergent de ceux de Ferreira et Gil (1984) qui suggèrent une diminution de l’activité de

phosphorylation puisqu’ils montrent une diminution de l’activité ATP-ase de mitochondries

de foie chez des rats restreints en protéines depuis 15 jours. De leur côté, Lambert et Merry

(2004) rapportent une augmentation de l’activité du bloc de phosphorylation dans des

mitochondries de foie de rats restreints depuis 6 mois. Dans nos travaux, nous n’avons pas

étudié la relation directe entre la force proton-motrice, la consommation d’oxygène et la

synthèse d’ATP. Il ne nous est donc pas possible de conclure sur l’efficacité intrinsèque de

l’activité ATP-synthéthase. Dans le cas où l’efficacité de la synthèse d’ATP serait améliorée

(diminution du rapport H+/ATP), il est attendu qu’un taux de synthèse donné sera obtenu avec

une force proton-motrice inférieure, elle-même générée par conséquent avec un taux

d’oxydation des substrats inférieure. Dans notre étude, il n’est donc pas totalement exclu que

l’efficacité de pompage de l’ATP-synthéthase soit améliorée. En effet, la diminution de

l’activité de la chaîne respiratoire devrait résulter en une force proton-motrice plus faible chez

les rats restreints. Malgré ceci, le taux de synthèse n’est pas diminué, ce qui suggère que

l’efficacité de synthèse de l’ATP est améliorée. Cependant si cet effet existe, il reste malgré

tout inférieur à la diminution de l’oxydation des substrats puisque le rapport ATP/O n’est pas

diminué en proportion de l’intensité de la restriction calorique.

Collectivement ces résultats suggèrent que 3 jours de restriction calorique

s’accompagne d’une diminution de la consommation d’oxygène mitochondriale en condition

phosphorylante qui s’explique par une diminution de l’activité de la chaîne respiratoire, et que

ceci est proportionnel à l’intensité de la restriction calorique.

L’ensemble de l’adaptation métabolique mitochondriale se met en place sans

amélioration de l’efficacité de synthèse de l’ATP. En effet, ni le rapport ATP/O ni le

coefficient de couplage thermodynamique q ne sont modifiés en proportion de l’intensité de la

restriction calorique. Nos résultats confirment ceux obtenus lors de restriction à moyen terme

(2 à 9 semaines) qui ne montrent pas de variation du rapport ADP/O (Ramanadham et Kaplay,

1979; Ferreira et Gil, 1984). Cependant, il est presque surprenant de ne pas trouver de

modification du couplage de la phosphorylation oxydative. En effet, dans une situation où les

apports sont réduits, il semble plus intéressant que, dans un but d’économie, l’animal puisse

produire une même quantité d’énergie pour une utilisation de substrats réduite. A l’inverse,

47

nos résultats suggèrent que l’économie en substrats (diminution de l’activité de la chaîne

respiratoire) doit s’accompagner d’une production d’énergie elle aussi diminuée. Il n’en reste

pas moins que cette diminution de la consommation d’oxygène dans les mitochondries de foie

peut tout de même représenter une diminution non négligeable de la consommation

d’oxygène au sein du tissu entier. Ce qui est en retour capable d’expliquer une partie de la

diminution du métabolisme de base et ce dès 3 jours de restriction calorique.

Finalement, au niveau du foie la restriction calorique s’accompagne de mécanismes

passifs (diminution de la masse active de l’organe) et actifs (diminution de la respiration

mitochondriale). L’ensemble de ces mécanismes est capable d’induire une diminution de la

consommation d’oxygène au niveau du corps entier. De plus, cette adaptation métabolique

apparaît rapidement (3 jours) et est proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique.

Cette graduation en fonction de l’intensité de la restriction calorique tend à prouver la réalité

d’une telle adaptation et montre bien l’importance de tels mécanismes pour le métabolisme

énergétique et la survie de l’animal.

De façon très intéressante nos résultats montrent que la leptine pourrait être un facteur

déterminant des variations du métabolisme énergétique dans les mitochondries de foie (entre

24 et 60% de ces variations s’expliquent par les variations en leptine), et ce de manière

indépendante et plus importante que la T3. Actuellement, les hormones thyroïdiennes sont

encore considérées comme les plus forts déterminants du métabolisme énergétique.

Cependant, bien que ces résultats ne soient que de simples analyses de corrélations, il semble

que dans une situation de restriction calorique, la T3 ne joue pas (ou moins) de rôle

déterminant sur la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial. Il apparaît donc très

improbable que les effets induits par la restriction calorique soient directement liés à ceux

rencontrés en situation d’hypothyroïdisme. Ainsi, en cas de restriction calorique, la

diminution de la consommation d’oxygène de mitochondries hépatiques ne s’accompagne pas

d’une amélioration de l’efficacité de la phosphorylation oxydative comme lors

d’hypothyroïdisme (Nogueira et al., 2002). Il est évident que dans les cas d’hypothyroïdisme

étudiés, les concentrations de T3 plasmatiques sont inférieures à celles rencontrées après 3

jours de restriction calorique. Cependant, même dans ces conditions, si la T3 avait une

influence chez les rats restreints, cela ressortirait avec les analyses de corrélation. Quoiqu’il

en soit, il apparaît un rôle prépondérant de la leptine sur le métabolisme énergétique de

mitochondries de foie de rats restreints en calories. En cas de restriction calorique, de

nombreuses études montrent une implication de la leptine sur le métabolisme énergétique au

niveau du corps entier. Ainsi, il a été montré que la diminution de la concentration

48

plasmatique de l’hormone, qui accompagne la restriction calorique, corrèle positivement avec

la diminution de la dépense d’énergie du corps entier (cf. paragraphe III.A.2.b.(2) de

l’introduction bibliographique). A l’inverse, il n’existe qu’une seule étude (à notre

connaissance) portant sur la relation entre la leptine et le métabolisme énergétique de

mitochondries de foie et aucune en cas de restriction calorique. Dans cette étude, l’injection

de leptine, à des souris dont le gène pour l’hormone est invalidé, entraîne une diminution de la

fuite de protons de mitochondries de foie (Melia et al., 1999). Dans notre étude, il apparaît

improbable que la leptine joue sur la fuite de protons, puisque cette dernière n’est pas altérée

de façon proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique.

En revanche, la corrélation entre les concentrations de leptine et les taux d’ARNm du

gène de la SOD pose la question du rôle de l’hormone en cas de restriction calorique. La SOD

fait partie des enzymes qui servent à la détoxification de la cellule contre les ROS. De même,

une diminution de la force proton-motrice est susceptible de réduire la production de ROS

(Korshunov et al., 1997). De plus, il a été montré qu’une déficience en COX est souvent

associée à une augmentation de la production de ROS (Di Giovanni et al., 2001; Cardoso et

al., 2004). Or nos résultats montrent que la concentration en leptine corrèle 1) positivement

avec l’activité de la chaîne respiratoire (état découplé), ce qui est susceptible d’induire une

diminution de la force proton-motrice, et 2) négativement avec l’augmentation de l’activité et

de l’expression de la COX. Une des théories du vieillissement et de l’effet bénéfique de la

restriction calorique sur l’allongement de la durée de vie implique un rôle pour les ROS

(Harman, 1956; Harman, 1998). Ainsi, les études sur les relations entre ces trois paramètres

rapportent une diminution de la production de ROS mitochondriale en cas de restriction

calorique à long (plusieurs mois) et moyen terme (2 semaines) (Lopez-Torres et al., 2002;

Drew et al., 2003; Bevilacqua et al., 2004; Lambert et Merry, 2004). Cependant les

mécanismes impliqués restent discutés et semblent différents selon la durée de la restriction

calorique et le tissu considéré. Ainsi, Lambert et al. (2004) rapportent chez des rats restreints

depuis 6 mois, une diminution de la production de ROS de mitochondries de foie liée à une

diminution de la force proton-motrice. Cette diminution de la force-proton motrice

s’expliquerait par une diminution de l’activité de la chaîne respiratoire et une augmentation de

la fuite de protons (analyse « top-down »). De leur côté, Wu et al. (2003) et Rao et al. (1990)

suggèrent que la diminution de la production de ROS s’explique à long terme, par une

augmentation de l’activité et de l’expression des enzymes antioxydantes en général, et de la

SOD en particulier. Enfin, Bevilacqua et al. (2004) montrent une diminution de la production

de ROS dans des mitochondries de muscles chez des rats restreints depuis 2 semaines, 2 ou 6

49

mois. Cependant, tandis que les mécanismes impliqués à moyen terme (2 semaines et 2 mois)

semblent être une diminution de la consommation d’oxygène, de l’activité de la chaîne

respiratoire et de la force proton-motrice, il apparaît que les effets induits par une restriction à

long terme impliquent plutôt une diminution de la consommation d’oxygène et de la fuite de

protons. Par conséquent, nos résultats suggèrent que 3 jours de restriction calorique sont

suffisants pour induire des mécanismes capables de limiter la production de ROS et encore

présents par ailleurs à moyen et long terme (au moins en partie). De plus, ces mécanismes

sont proportionnels à l’intensité de la restriction calorique et semblent contrôlés par la leptine.

Cependant, rien ne permet d’affirmer si ces mécanismes de lutte contre les ROS sont des

mécanismes de prévention (mécanismes anti-vieillissement) ou s’ils sont induits par une

augmentation de la production de ROS. En effet, l’initiation d’une restriction calorique se

caractérise, en autres, par une prépondérance de l’oxydation des lipides sur celle des glucides

(MacDonald et Webber, 1995). Or des études suggèrent que l’oxydation des lipides entraîne

une augmentation de la production de ROS (Boveris et al., 1972; Boveris et Chance, 1973). Il

n’est donc pas exclu que les mécanismes décrits ci-dessus se mettent en place, en réponse à

une surproduction de ROS dans les mitochondries.

Pour répondre à cette question, il pourrait être intéressant de déterminer, la cinétique

des différents paramètres (force proton-motrice, consommation d’oxygène, activité et

expression de SOD, activité et expression de la COX, production de ROS, concentration en

leptine) en fonction du temps (veille du 1er

jour de restriction, 1er

, 2e et 3

e jour de restriction

calorique) chez des rats restreints à 50% et des rats témoins et avec ou sans traitement par la

leptine pour chacun des deux groupes. Ce protocole permettrait en plus de déterminer si

l’effet de la restriction calorique implique réellement une action de la leptine.

Quoiqu’il en soit, nos résultats suggèrent que 3 jours de restriction calorique sont

suffisants pour induire une adaptation du métabolisme énergétique de mitochondries de foie.

Cette adaptation qui est proportionnelle à l’intensité de la restriction calorique est capable

d’expliquer une partie de la diminution du métabolisme de base. De même, les mécanismes

impliqués sont favorables à une diminution de la production de ROS plutôt qu’à une

amélioration de l’efficacité de la phosphorylation oxydative. L’ensemble de cette adaptation

pourrait être sous le contrôle de la leptine.

De nombreux effets métaboliques de la leptine sont médiés par le système

sympathique (Friedman et Halaas, 1998). Mais, la leptine est aussi capable d’agir directement

sur des tissus cibles et ce par le biais de ses récepteurs (Muoio and Lynis Dohm 2002). Tandis

que ces mécanismes périphériques sont relativement clairs concernant le métabolisme des

50

lipides et des glucides, il existe très peu de données sur le mode d’action de la leptine sur la

régulation de l’activité et de l’expression des enzymes de la chaîne respiratoire. Cependant, il

a été montré que la leptine peut stimuler directement la respiration de muscle squelettique

(Dulloo et al., 2002) et ce par des voies de signalisation similaires à celles impliquées dans la

régulation des métabolismes du glucose et des acides gras (Ceddia et al., 2001). Les

récepteurs à la leptine sont également présents au niveau du foie (Wang et al., 1996).

Cependant, dans nos résultats rien ne nous permet de dire si les effets de la leptine sur le

métabolisme énergétique mitochondrial hépatique sont directs ou indirects. Quoiqu’il en soit,

il est intéressant de constater que nos résultats montrent que la leptine corrèle à la fois avec

l’expression des gènes nucléaires et mitochondriaux de la COX (sous-unité IV et I). Ces

résultats suggèrent que la leptine pourrait réguler de façon coordonnée l’expression des gènes

mitochondriaux et nucléaires. Nos résultats montrent également que la leptine corrèle avec les

taux en ARNm de PGC-1 et que PGC-1 corrèle avec les concentrations de COX I et IV. Or

PGC-1 fait partie des co-activateurs connus pour réguler de façon co-ordonnée le génome

mitochondrial et nucléaire (Goffart et Wiesner, 2003). Il a ainsi été montré que PGC-1 était

capable de réguler l’expression de COX I et IV dans des muscles de rats (Garnier et al.,

2003). Il est, par conséquent, tentant de spéculer que la leptine est capable de réguler

l’expression de la COX dans une situation de restriction calorique à court terme (cf. figure 5).

Par ailleurs, nos résultats montrent que la leptine corrèle avec les autres paramètres

respiratoires (consommation d’oxygène en conditions phosphorylante et découplée), mais

cette fois de façon positive. Il semble donc, que si la leptine régule la phosphorylation

oxydative, les mécanismes impliqués ne sont alors pas tous les mêmes. De même, il n’est pas

exclu que la leptine interagisse avec d’autres hormones, elles-mêmes affectées par la

restriction calorique, pour réguler le métabolisme énergétique mitochondrial. Ainsi, en cas de

restriction calorique, il a été montré que la taux circulant en glucocorticoïdes était augmenté

(Yaktine et al., 1998; Giovambattista et al., 2000; Liu et al., 2002). Or, il a également été

montré que la dexaméthasone pouvait inhiber les voies de signalisation de la leptine (Ishida-

Takahashi et al., 2004).

Toutes ces hypothèses sont autant de questions que de futurs travaux à mener.

51

ARTICLE 1

Food restriction affects energy metabolism in rat liver mitochondria.

Dumas JF, Roussel D, Simard G, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P. Biochim Biophys Acta.

2004 Jan 22;1670(2):126-31.

52

Food restriction affects energy metabolism in rat liver mitochondria

Jean-Franc�ois Dumas, Damien Roussel, Gilles Simard, Olivier Douay, Franc�oise Foussard,Yves Malthiery, Patrick Ritz*

INSERM EMI-U 00.18, Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moleculaire, Medecine B, CHU, F-49033 Angers Cedex 01, France

Received 28 April 2003; received in revised form 23 October 2003; accepted 12 November 2003

Abstract

To examine the effect of 50% food restriction over a period of 3 days on mitochondrial energy metabolism, liver mitochondria were

isolated from ad libitum and food-restricted rats. Mitochondrial enzyme activities and oxygen consumption were assessed spectrophoto-

metrically and polarographically. With regard to body weight loss (�5%), food restriction decreased the liver to body mass ratio by 7%.

Moreover, in food-restricted rats, liver mitochondria displayed diminished state 3 (�30%), state 4-oligomycin (�26%) and uncoupled state

(�24%) respiration rates in the presence of succinate. Furthermore, ‘‘top-down’’ elasticity showed that these decreases were due to an

inactivation of reactions involved in substrate oxidation. Therefore, it appears that rats not only adapt to food restriction through simple

passive mechanisms, such as liver mass loss, but also through decreased mitochondrial energetic metabolism.

D 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: Calorie restriction; Energy metabolism; Mitochondrion; Oxidative phosphorylation; Respiratory chain complex

1. Introduction

Most human and non-human studies show that energy

restriction decreases energy expenditure [1]. Moreover, in

some but not all studies, there is an adaptation to energy

restriction, i.e. energy expenditure becomes lower than

that expected for body mass [1]. However, the precise

mechanisms responsible for this adaptation remain un-

clear. A decline in organ mass may be an explanation.

Indeed, although internal organs (liver, kidney, heart,

gastrointestinal tract. . .) represent less than 10% of body

weight, they contribute 50–70% of energy expenditure [2]

and resting energy expenditure per gram of tissue in

internal organs is several-fold higher than that of muscle

or adipose tissue. During starvation, weight loss initially

involves tissues with a high metabolic rate, namely the

liver and gastrointestinal tract, then other organs or tissues

[3–5]. The same chronological pattern is observed during

energy restriction [1]. It is therefore possible that changes

in liver mass could be responsible for much of the initial

change observed in whole-animal energy expenditure with

food restriction.

In addition to this, arterio-venous differences in oxygen

concentration (a proxy measure of organ energy expendi-

ture) are reduced by 35–60% in the liver and splanchnic

tissues while they are only reduced by 5% in muscle tissue

[6–8]. Together, these studies suggest that caloric restriction

induces a ‘‘passive’’ adaptation of energy metabolism (be-

cause of organ weight loss) as well as a ‘‘dynamic’’

adaptation (visceral organs energy expenditure becomes

more reduced than expected for their given weight loss).

This metabolic adaptation therefore implicates decreased

mitochondrial oxygen consumption as found during medi-

um-term (several weeks) food restriction [9–11]. This

decrease in mitochondrial respiration could be partly

explained by a reduced Na+-K+-ATPase activity [9], or by

a decrease in cytochromes a + a3 content [10]. However, few

studies exist and all concern the effects of medium-term

energy restriction only.

Adaptation of whole-body energy metabolism is well

described after a period of several weeks but less so after

short periods of energy restriction ranging between 3 and 10

days [12–15]. However, in human clinical practice, many

patients are exposed to short-term caloric restriction. In such

circumstances, data suggest that a decrease in energy

expenditure [1] and an adaptation of energy metabolism

0304-4165/$ - see front matter D 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

doi:10.1016/j.bbagen.2003.11.002

Abbreviations: DCPIP, 2,3-dichlorophenolindophenol; PMS, phenazine

methosulfate; RCR, respiratory control ratio; TPMP, triphenylmethylphos-

phonium

* Corresponding author. Tel.: +33-241354499; fax: +33-241354969.

E-mail address: paritz@chu-angers.fr (P. Ritz).

www.bba-direct.com

Biochimica et Biophysica Acta 1670 (2004) 126–131

occur due to food restriction [16,17]. However, there is no

information regarding the relative contribution of visceral

organ weight loss and changes in cellular energy conversion

during short-term food restriction. Therefore, the aim of this

study was to investigate changes in (1) liver weight and (2)

liver mitochondrial metabolism following a short-term (3

days) 50% food restriction using top-down metabolic con-

trol analysis.

2. Materials and methods

2.1. Animals

The present investigation was performed in accordance

with the guiding principles in the care and use of animals.

Sixteen male Sprague–Dawley rats, born and bred in our

animal facilities, were housed in individual cages at 9 weeks

of age (300–350 g). Animals were provided with water ad

libitum and a standard diet (U.A.R A04) consisting (by

weight) of 16% protein, 3% fat, 60% carbohydrate and 21%

water, fiber, vitamins and minerals. The metabolizable

energy content was 2.9 kcal/g. Half of the rats (control)

were fed ad libitum, while the other half were food-restrict-

ed and received 50% of the food given to the control group.

The experimental design was conducted for 3 days. On the

4th day, the animals were fasted overnight before they were

killed by decapitation. This overnight fasting is used to

reduce liver glycogen content to minimal levels. Liver was

removed rapidly and weighed. Some tissue samples were

immediately used for respiration measurements and the

remainder were frozen in liquid nitrogen and stored at

� 80 jC in order to measure enzyme activity levels.

2.2. Liver water content determination

A portion of liver (1–2 g) was weighed and placed in an

oven at 85 jC to dry for 24 h. Dry weights were measured

and the wet-to-dry weight ratio was calculated for the

determination of liver water content.

2.3. Liver mitochondria preparations

The liver was removed, weighed and immediately placed

in an ice-cold isolation medium consisting of 250 mM

sucrose, 1 mM EGTA and 10 mM Tris/HCl, pH 7.4. Liver

mitochondria were isolated by modifications of the differ-

ential centrifugation procedure used previously by Krahen-

buhl et al. [18]. The liver (5–6 g) was minced with scissors

and homogenized using a Potter–Elvehjem homogeniser (7

strokes) in the isolation medium (8 ml/g tissue). The

homogenate was centrifuged at 600� g for 10 min. The

resulting supernatant was filtered through cheesecloth, then

centrifuged at 7000� g for 10 min. The pellet was resus-

pended in the isolation medium (10 ml/g tissue) and then

centrifuged at 3500� g for 10 min. The resulting pellet was

resuspended in a minimal volume of respiratory medium,

consisting of 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA, 2

mM MgCl2, 3 mM HEPES (pH 7.4) supplemented with

0.3% (w/v) bovine serum albumin (BSA). Protein concen-

tration was determined by using the Bicinchoninic acid

Assay kit (Interchim, Montluc�on, France) with BSA used

as a standard.

2.4. Mitochondrial respiration

Oxygen was measured with a Clark oxygen electrode

(oxygraph Hansatech), in a 2-ml glass cell, thermostatically

controlled at 30 jC, with constant stirring. The mitochondria

(0.5 mg protein/ml) were incubated in the same respiratory

reaction medium as described above and saturated with room

air. Substrate concentrations were 5 mM succinate and 5 mM

ascorbate + 0.5 mM N,N,NV,NV-tetramethyl-p-phenylenedi-

amine (TMPD). Inhibitor concentrations included 5 AM

rotenone (to inhibit complex I of the respiratory chain) and

3 AM myxothiazole (to inhibit complex III). The active state

of respiration (state 3) was initiated by the addition of 150

AM ADP. The basal non-phosphorylating respiration rate

(state 4) was obtained by the addition of 3 ng/Al of oligo-

mycin. The uncoupled state of respiration was initiated by

the addition of 2 AM of carbonyl cyanide p-trifluoromethox-

yphenylhydrazone (FCCP). RCR refers to the ratio of

oxygen consumed after adding ADP to that consumed in

the presence of oligomycin.

2.5. Mitochondrial membrane potential

The mitochondrial membrane potential was determined

from the distribution of lipophilic cation triphenylmethyl-

phosphonium (TPMP+) using a TPMP-sensitive electrode.

The TPMP electrode was calibrated with sequential 1 AM

additions up to 4 AM TPMP+, then respiratory substrate was

added to start the reaction. After each run, 2 AM FCCP was

added to dissipate the membrane potential and release all

TPMP back in to the medium for baseline correction. Noted

that the assay medium was supplemented with 80 ng/ml

nigericin to collapse any pH difference across the inner

membrane. Membrane potential was calculated as described

previously by Brand [19], assuming a TPMP binding correc-

tion of 0.42 (Al/mg of protein)� 1 for liver mitochondria [20].

2.6. Experimental approach to top-down elasticity analysis

To quantitatively determine the effect of food restriction

on oxidative phosphorylation processes in liver mitochon-

dria, we used top-down elasticity analysis. As previously

described [21], we divided the oxidative phosphorylation

system into three blocks of reactions linked by the common

intermediate membrane potential (DW): one block contains

the reactions that produce DW (the substrate oxidation

block, including substrate translocases, dehydrogenases,

respiratory chain complexes) and two blocks that consume

J.-F. Dumas et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1670 (2004) 126–131 127

the DW, the phosphorylation block (including the ATP

synthase and the adenine nucleotide and phosphate trans-

locases) and the proton leakage block (including the passive

permeability of the mitochondrial inner membrane to proton

and any cation cycling reactions).

This analysis involves measuring the kinetics responses

of each block of the system to changes in the common

intermediate, the mitochondrial membrane potential. By

comparing the kinetic curves for the all three reaction blocks

in control and food-restricted conditions, it is easy to

identify which blocks have a changed kinetic response to

DW and so can be identified as primary site affected by the

experimental condition.

The kinetic response of the proton leak to DW was

obtained in non-phosphorylating mitochondria in the pres-

ence of oligomycin (1 Ag/ml) as the respiration rate was

titrated by the sequential addition of malonate up to 4 mM

(region A in Fig. 1). The kinetic response of the substrate

oxidation block to DW was determined from the slope of a

plot of respiration rate against Dw by manipulating the ATP

synthesis capacity from state 3 (500 AM ADP) to resting

respiration measured in the presence of oligomycin (1 Ag/

ml) (region B in Fig. 1). The kinetic response of the

phosphorylation block to DW was determined in phosphor-

ylating mitochondria in the presence of the saturating

amount of ADP (500 AM). The state 3 respiration rate

was titrated by the sequential addition of malonate up to

0.25 mM and, at any given DW, the value of the respiration

rate for the proton leak was subtracted (region C in Fig. 1).

In all measurements, the respiration rate and membrane

potential were assessed simultaneously using electrodes

sensitive to oxygen (Oxygraph Rank Brothers) and to the

potential-dependent probe TPMP+. The liver mitochondria

(1 mg/ml) were incubated in respiratory reaction medium

(see Section 2.3) supplemented with nigericin (80 ng/ml)

and rotenone (5 AM) before the TPMP electrode was

calibrated with 4 AM TPMP+. When required, oligomycin

or ADP was also added before the addition of TPMP+.

Respiration was then initiated by the addition of 4 mM

succinate.

2.7. Mitochondrial enzyme activities

Frozen liver (10–30 mg) was thawed and homogenized

with a Potter–Elvehjem homogeniser (7 strokes) in an

isolation medium consisting of 220 mM mannitol, 75 mM

sucrose, 10 mM Tris and 1 mM EGTA, pH 7.2. Each

homogenate was centrifuged at 600� g for 10 min and

the resulting supernatants were filtered through cheesecloth.

All procedures were performed at 4 jC. Activities of citrate

synthase, succinate dehydrogenase and complexes I, III and

IV were measured spectrophotometrically at 37 jC in the

supernatant fraction through the modified procedures of

Malgat et al. [22] in agreement with the Mitochondrial

Diseases group of Association Franc�aise de Myopathie.

The activity of citrate synthase was measured in a

reaction medium consisting of 100 mM Tris/HCl, 40 Ag/

ml 5,5V-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), 1 mM oxaloacetate,

0.3 mM acetyl CoA and 4% of Triton X 100, pH 8.1. After

3 min of incubation, the reaction was initiated by adding the

homogenate (20 to 50 Ag proteins) and the change in optical

density at 412 nm was recorded for 3 min.

The activity of succinate dehydrogenase was measured

by following the reduction of 2,6-dichlorophenolindophenol

(DCPIP), in the presence of phenazine methosulfate (PMS)

at 600 nm. Homogenate (20 to 50 Ag proteins) was

preincubated in a buffer containing 50 mM KH2PO4, 16

mM succinate, 1.5 mM KCN, 100 AM PMS, pH 7.5 for 5

min. The reaction was initiated by the addition of 103 AM

DCPIP and the optical density was recorded for 3 min.

The activity of complex I was determined by monitoring

the oxidation of NADH at 340 nm. Homogenate (40 to 100

Ag proteins) was preincubated for 3 min in 820 Al of

distilled water. Following this, 10 mM KH2PO4, 2 mM

KCN, 5 Ag/ml antimycin A, 100 AM decylubiquinone, 1.3

mg/ml BSA, 5 mMMgCl2, pH 7.5 were added. The reaction

was initiated by adding 200 AM NADH and the change in

the optical density was analysed for 3 min. In parallel, the

NADH decylubiquinone reductase activity was also mea-

sured in the presence of 12.7 AM rotenone. The specific

activity of complex I was the difference between NADH

oxidation activity with and without the rotenone.

The activity of complex III was determined by monitor-

ing the reduction of cytochrome c at 550 nm. Homogenate

(20 to 50 Ag proteins) was incubated, for 30 s, in a reaction

medium consisting of 35 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2.5

mg/ml BSA, 1.8 mM KCN, 125 AM oxidized cytochrome c,

12.5 AM rotenone and 62.5 mM EDTA, pH 7.5. The

reaction was initiated by adding 80 AM decylubiquinol

and the optical density was measured for 3 min. The

Fig. 1. Kinetic responses of the proton leak (region A), the substrate

oxidation block (region B) and the phosphorylation block (region C) to

changes in membrane potential (DW) in liver mitochondria from food-

restricted (.) and control rats (o).

J.-F. Dumas et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1670 (2004) 126–131128

nonenzymatic reduction of cytochrome c was measured

under the same conditions after the addition of 10 Ag/ml

antimycin A. The specific activity of complex III was

calculated by subtracting the activity of the nonenzymatic

reaction from that of the total activity of complex III.

The activity of complex IV was measured by monitoring

the oxidation of reduced cytochrome c at 550 nm. A 50 AM

solution of reduced cytochrome c (92% to 97% reduced

using dithionite) in 10 mM KH2PO4, pH 7.0 was preincu-

bated for 5 min. The reaction was initiated by adding the

homogenate (20 to 50 Ag proteins) and the change in optical

density was measured for 1.5 min.

2.8. Statistical analysis

Results were expressed as meanF S.D. Means were

compared using either ANOVA for repeated measurement

or Student’s t test where appropriate. A P value < 0.05 was

considered significant.

3. Results

3.1. Animals

Food-restricted and control groups did not differ with

respect to body weight at the beginning of the experimental

procedure (281F 23 vs. 285F 37 g in the food-restricted

and the control group). Food restriction slowed the growth

rate of the rats, leading to a significant 5% loss in their

initial body mass after 3 days of treatment. At the same

time, the control rats had an increased body mass of 8%.

Food restriction significantly decreased liver mass by 17%

(7.6F 0.6 vs. 9.1F1.0 g in food-restricted and control rats)

and the liver-to-body weight ratio by 7% (3.02F 0.21 g/100

g vs. 3.24F 0.22 g/100 g in food-restricted and control

rats). Liver water content (g water/g liver) was not affected

by food restriction (66.0F 8.4% vs. 62.1F 4.3% per liver in

food-restricted and control rats).

3.2. Effect of food restriction on liver mitochondrial enzyme

activities and respiratory parameters

We tested the quality of mitochondrial preparations by

measuring the specific citrate synthase activities in fresh

mitochondria with or without Triton X-100. We found

95.8F 0.6% and 95.2F 1.8% (P= 0.438) of intact mito-

chondria in liver preparations from control and food-restrict-

ed rats.

There was a slight and almost statistically significant

increase (+26%) in the enzyme activity of complex IV in

food-restricted rats (P= 0.057) (Table 1). We did not find

any significant differences in the specific activities of citrate

synthase, succinate dehydrogenase, and complexes III and I

between food-restricted and control rats (Table 1).

With succinate as substrate, oxygen consumption in con-

ditions of phosphorylation (state 3) as well as in minimum

respiratory activity (state 4-oligomycin) was significantly

decreased by 30% in food-restricted rats (Table 2, see also

Fig. 1, region A). Uncoupled state respiration with succinate

was significantly decreased by 24% by food restriction.

Table 2 also shows that state 3 respiration in the presence

of ascorbate/TMPD was marginally decreased by food

restriction (�17%, P= 0.051). Whatever the substrate used,

RCR was not affected by food restriction (Table 2).

3.3. Kinetics responses of proton leak, substrate oxidation

and phosphorylation system to changes in Dw

Fig. 1 depicts the kinetic responses of the proton leak

(region A), the substrate oxidation block (region B) and the

Table 1

Effects of food restriction on liver mitochondrial enzyme activitiesa

Enzymatic activity

(nmol/min/

mg protein)

Food-restricted

rats

Control

rats

P value

Citrate synthase 158F 23 152F 26 0.609

Succinate

dehydrogenase

107F 30 96F 19 0.358

NADH-ubiquinone

reductase

(Complex I)

18F 6 19F 10 0.684

Ubiquinol-cytochrome

c reductase

(Complex III)

86F 52 101F 81 0.665

Cytochrome

c oxidase

(Complex IV)

126F 29 100F 21 0.057

a Enzymatic activities were determined at 37 jC in liver 600� g

homogenate as described in Materials and methods. Values are expressed as

meanF S.D. for eight animals.

Table 2

Effects of food restriction on respiratory parameters in liver isolated

mitochondriaa

Respiratory

substrates

(natoms oxygen/

min/mg protein)

Parameters Food-restricted

rats

Control

rats

P value

Succinate State 3 69F 7yy 99F 16 0.002

State 4 13.7F 2.3yy 18.4F 2.3 0.004

RCR 5.1F1.3 5.4F 0.8 0.763

Uncoupled

state

92F 31y 121F 21 0.013

Ascorbate/

TMPD

State 3 123F 14 148F 27 0.051

State 4 81F16 94F 16 0.178

RCR 1.5F 0.2 1.6F 0.1 0.578

Uncoupled state 163F 30 190F 40 0.179

a Mitochondria were isolated from liver as described in Materials and

methods. Respiration rate was determined at 30 jC with succinate and

TMPD/ascorbate as substrates. Values are expressed as meanF S.D. for

eight animals. State 3 was the ADP-stimulated respiration. State 4 was the

control state of respiration measured in the presence of oligomycin.

Uncoupled state was the FCCP-stimulated respiration. RCR was the

respiratory control ratio.

J.-F. Dumas et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1670 (2004) 126–131 129

phosphorylation block (region C) to changes in DW in liver

mitochondria from food-restricted and control rats. It shows

that the substrate oxidation system is less active in food-

restricted mitochondria than in control ones. Indeed, at any

given value of DW, the amount of oxygen used to support

the activity of the substrate oxidation reactions is lower in

food-restricted animals. In contrast, the proton flux and the

phosphorylating system were the same in food-restricted

and control mitochondria at any given DW.

4. Discussion

The present study shows that 3 days of caloric restriction

results in (1) a decrease in the relative liver mass, and (2) a

decrease in state 4-oligomycin and state 3 oxygen consump-

tion rates in isolated liver mitochondria, which can be

explained by a decreased activity of the substrate oxidation

system as measured by top-down metabolic control analysis.

Three days of food restriction led to a significant weight

loss (�5%) in the rats. Such a reduction in body size

generally results in a lowering of whole-body energy

expenditure because of reduced maintenance requirements

[1]. More interesting than body mass change, which is a

poor indicator of metabolic adaptation during restriction

[13], is the change in organ mass. In the present study, food-

restricted rats had a significant decrease in liver weight and

liver-to-body weight ratio when compared to their ad

libitum counterparts. This is consistent with the fact that

the liver and gastrointestinal tract, with their high metabolic

rates, are the first to lose mass following energy restriction

or total starvation [1]. This change in liver mass does not

appear to be related to a decrease in water mass, as liver

hydration (g water/g liver) was not affected by food restric-

tion. In consequence, it is unlikely that a change in glycogen

content was sufficient to fully explain the loss in liver mass.

Such a change in internal organ mass may therefore con-

tribute to a decrease in whole energy expenditure in a food-

restricted animal.

The main finding reported in this work is that 3 days of

food restriction significantly decreased phosphorylative as

well as non-phosphorylative mitochondrial oxygen con-

sumption rate in the presence of succinate. Our results agree

with data obtained from medium-term (2-week) food re-

striction studies, which reported a decreased oxygen con-

sumption in state 3 (�27%) and state 4 (�18%) respiration

with succinate as substrate [10]. As shown in Fig. 1, this

lower oxygen consumption is due to a decrease in the rate of

the reactions that generate proton motive force, and does not

involve changes in the activity of the proton leak pathway or

the reactions that form and export ATP. The substrate

oxidation system includes the activities of the substrate

translocases, the dehydrogenases and the respiratory chain

complexes. A change in substrate dehydrogenase activity

can be excluded since there was no difference in mitochon-

drial succinate dehydrogenase activity. The mitochondrial

enzyme activities were not decreased, therefore suggesting

that the decrease in uncoupled state respiration is the

consequence of either altered succinate transport or de-

creased electron transfer along the respiratory chain (com-

plex II, ubiquinone, complex III, cytochrome c and complex

IV). Oxygen consumption with ascorbate/TMPD as sub-

strate was decreased to a lesser extent than that using

succinate (�15% vs. �30% with ascorbate/TMPD and

succinate). This result suggests that the effect on the rate

of substrate oxidation reactions caused by food restriction is

at least partly located at the level of cytochrome c oxidase.

Moreover, the decrease in oxygen consumption rates with

ascorbate/TMPD could have been attenuated by the slight

increase in the enzyme activity of complex IV. Therefore, a

decrease in the content of cytochromes a + a3 could be an

explanation to the decrease in the rate of substrate oxidation

reactions. Such a change in cytochromes a+ a3 concentra-

tion, associated with a decrease in oxygen consumption, has

already been found in the liver of food-restricted rats after 2

weeks [10]. Although it is not sure that 3 days of food

restriction is sufficient to modify the content of the electron

transport chain content, it remains a possibility.

Collectively, these results show that the liver mitochon-

dria of food-restricted rats pumped less protons under both

resting (state 4-oligomycin respiration) and phosphorylating

conditions (state 3 respiration). This decrease in substrate

oxidation activity [10] is therefore apparent after only 3 days

of reduced food intake. It seems therefore that a continuum

exists regarding the effects of food restriction on liver

mitochondrial oxygen consumption. This decrease in the

capacity of substrate entry and/or electron transport within

the respiratory chain tends to lower membrane potential. A

decrease in mitochondrial membrane potential causes a

decreased formation of ROS [23], occurrences that have

been proposed as mechanisms to explain the extended life-

span from long-term energy restriction [24], and decreased

proton leak and redox slipping [25,26]. The latter occur-

rences that have never been studied in the liver of long-term

food-restricted rats, in turn may result in decreased thermo-

genesis and increased oxidative phosphorylation efficiency.

Consequently, the present results may help to aid in the

understanding of the biochemical mechanisms involved in

decreased whole-body energy expenditure as induced by

food restriction. Indeed, this decrease in substrate oxidation

could represent a notable energy saving in a situation where

energy supply becomes more critical, as could be the case

during more severe (higher in intensity or duration) food

restriction than that used in the present study. On the

contrary, the present short-term adaptation could be dramat-

ic in a situation where energy demand suddenly becomes

more important. Indeed, according to the thermodynamic

theory, energy homeostasis relies on both the rate and

efficiency of oxidative phosphorylation. Therefore, the

consequence of this expected higher oxidative phosphory-

lation efficiency would be a low rate of ATP synthesis. This

could have negative consequences in the face of a sudden

J.-F. Dumas et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1670 (2004) 126–131130

increase in energy demands (for example, an infection

occurring while energy is restricted).

In conclusion, 3 days of a 50% reduction in food intake is

sufficient to induce significant passive (decreased liver

mass) and active (decreased mitochondrial oxygen con-

sumption) adaptation of liver energy metabolism, which

occur further in medium-term food restriction. The decrease

in respiration rate is the consequence of a reduced substrate

oxidation activity. Further experiments are necessary, how-

ever, to specify the exact mechanisms involved in short-term

food restriction.

Acknowledgements

The authors thank Pierre Legras, Jerome Roux and

Dominique Gilbert for animal care, Antoine Augeraud for

technical assistance and Miriam Ryan for reviewing the

English manuscript. This work was supported by grants

from Contrat de Plan Etat Region 2000-2004.

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J.-F. Dumas et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1670 (2004) 126–131 131

ARTICLE 2

Food restriction induces an adaptation in liver mitochondrial energy metabolism: a role

for leptin ?

Dumas JF, Johnson G, Roussel D, Savagner F, Gallois Y, Malthièry Y, Simard G, Ritz P.

Soumis à Diabetes.

59

Food restriction induces an adaptation in liver mitochondrial energy metabolism: a role

for leptin ?

Jean-François DUMAS, Gyasi JOHNSON, Damien ROUSSEL, Frédérique SAVAGNER,

Yves GALLOIS, Yves MALTHIERY, Gilles SIMARD and Patrick RITZ*

Laboratory of Biochemical and Molecular Biology, Angers, France.

*for correspondance, Medecine B, CHU, F-49033 ANGERS Cedex 01

tél 33 241354499, fax 33 241354969, e-mail paritz@chu-angers.fr

Short running title: energy metabolism in food-restricted rats

60

ABSTRACT

To gain insight into the mechanisms of food restriction (FR) on mitochondrial energy

metabolism, mitochondria were isolated from liver of control and 25, 50 and 75% FR rats

over 3 days. Liver to body mass and liver mitochondrial mass were decreased proportionally

to the FR intensity suggesting a reduction in liver oxygen consumption. Moreover, in

proportion to the FR intensity, state 3 respiration was decreased and superoxide dismutase

(SOD) and cytochrome c oxidase (COX) gene expression were increased. The decrease in

respiration was accounted for by a decrease in the respiratory chain activity. ATP/O ratio was

unaffected by FR. Although most of mitochondrial parameters changes correlated with both

T3 and leptin concentration, they were predicated only by leptin.

In conclusion, these results suggest that 3 days of FR induce an adaptation in oxygen

consumption proportional to the FR intensity. Such an adaptation is able to participate to the

decrease in whole-body energy expenditure induced by FR. On the other hand, the decrease in

mitochondrial respiration is likely aimed at reducing reactive oxygen species (ROS)

production in co-ordination to the increase in SOD, but does not affect ATP synthesis

efficiency. Leptin appears to be the key regulator involved in this adaptation.

Abbreviations: CoQ, coenzyme Q; DCPIP, 2,3-dichlorophenollindophenol; FFA, free fatty

acid; FR, food restriction; PMS, phenazine methosulfate; RCR, respiratory control ratio;

ROS, reactive oxygen species; SOD, superoxide dismutase; TPMP,

triphenylmethylphosphonium.

61

Food restriction (FR) is used both for weight management and to study increased longevity in

various animal models. It is well accepted that FR decrease energy expenditure at the whole-

body level (1) and that part of the changes in energy metabolism are independent of the

changes in body size and composition (2). This adaptation to FR could be partly explained by

1) a decrease in liver mass, a high metabolic tissue that accounts for 20% of resting energy

expenditure in rats, and 2) a decrease in liver mitochondrial oxygen consumption (3). Such a

decrease in respiration could have a different significance depending on whether it is or not

associated with an increase in the ATP synthesis efficiency. As already described, it appears

that energy homeostasis relies on both the rate and efficiency of oxidative phosphorylation,

the consequence of a better oxidative phosphorylation efficiency is a low rate of ATP

synthesis and conversely the cost of a high rate is a decreased efficiency (4, 5). Therefore, an

increase in ATP synthesis efficiency could be dramatic in the face of a sudden increase in

energy demands. On the contrary, such a decrease in mitochondrial oxygen consumption

without a better ATP synthesis efficiency could represent a notable energy saving in a

situation where energy supply becomes critical. Moreover, such a decrease in respiration

without a better ATP synthesis efficiency would be more interesting if the adaptation was

proportional to the intensity of food restriction as found in muscle mitochondria (6). In this

case, the more restricted the animal is, the more efficient will be adaptation.

On the other hand, adaptation of mitochondrial oxygen consumption during FR could be

aimed at reducing ROS production, more so than making the ATP synthesis more efficient.

Indeed, one of the most widely accepted theories of aging, proposes that a decreased

production of ROS by mitochondria is a mechanism underlying the anti-aging effects of FR

(7, 8). However, little is known about the precise mechanisms underlying the reduced ROS

generation. Interestingly, Lambert and Merry (9) have shown that rats restricted in food

between 6 and 18 months exhibited a decrease in the liver mitochondria ROS production rate

that was attributed to a decrease in membrane potential consequent to a decreased activity of

respiratory chain. On the other hand, it has been found that antioxidant systems, including

superoxide dismutase (SOD), is increase by long-term FR (10, 11).

FR has been shown to decrease circulating triiodothyronine (T3) and leptin concentrations in

rats (12-16). Hypothyroidism has been shown to decrease oxygen consumption and proton

leak in liver (5, 17). Moreover, thyroid hormone is known to affect mitochondrial respiration,

in part, by altering the expression of the mitochondrial electron transport chain proteins (18).

Among the mitochondrial gene affected, is COX gene expression (19, 20). On the other hand,

leptin treatment has been reported to increase the whole-body oxygen consumption in rat and

62

this effect is additive to that of T3 (21). Furthermore, leptin was shown to increase

mitochondrial respiration in ob/ob mice (22, 23). Thus, we have hypothesised that decreased

serum hormone levels of leptin and T3 could play a role in the FR-induced decreased liver

energy metabolism. The aim of this study was to investigate changes in (1) liver

mitochondrial metabolism, COX and SOD gene expression, and (3) serum T3 and leptin

concentrations following 3 days of 25, 50 and 75% FR.

RESEARCH DESIGN AND METHODS

Animals. The present investigation was performed in accordance with the guiding principles

in the care and use of animals. Twenty-four male Sprague-Dawley rats, born and bred in our

animal facility, were housed in individual cages at 12 weeks of age (350-400g). Animals were

provided with water ad libitum and a standard diet (U.A.R A04) consisting (by weight) of

16% protein, 3% fat, 60% carbohydrate and 21% water, fiber, vitamins and minerals. The

metabolizable energy content was 2.9 kcal/g. Rats were randomly separated into 4 groups of 6

rats as follows: control fed (CON) group, the 25% FR group, the 50% FR group and the 75%

FR group. The rats in the CON group consumed the standard diet ad libitum while the other

rats were food-restricted and received 75% (25% FR group), 50% (50% FR group), 25%

(75% FR group) of the control group daily food consumption. The experimental design was

conducted for 3 days. On the 4th

day, the animals were killed by decapitation. Liver was

removed rapidly and weighed. Some of the liver was immediately used for respiration, ATP

synthesis and cytochrome measurements and the remainder were frozen in liquid nitrogen and

stored at -80°C in order to measure enzyme activity, glycogen content and gene expression

levels.

Glycogen content determination. Glycogen concentration was determined by a method

adapted from that described by Good et al. (24). Briefly, a solution of 40% KOH (1 ml/100

mg tissue) was added to 100-150 mg of frozen liver and mixed thoroughly. After incubation

at 100°C for 30 min, a solution of 95% ethanol (4 volumes) was added and mixed thoroughly.

After precipitation (12 h, 4°C) and centrifugation (3000 g, 10 min, 4°C), glycogen pellet was

hydrolysed by 2 N HCl (1 volume) at 100°C for 3 h. A solution 2 N KOH was added to

neutralize the sample. Glucose was then determined by spectrophotometer at 505 nm. A

combined glucose oxidase and peroxidase solution was added and the 4-(p-benzoquinone-

63

monoimino)phenazone concentration was measured spectrophotometrically (Roche/Hitachi

system).

Liver mitochondria preparations. The liver was removed, weighed and immediately placed

in an ice-cold isolation medium consisting of 250 mM sucrose, 1 mM EGTA and 10 mM

Tris/HCl, pH 7.4. Liver mitochondria were prepared as previously described (3). Protein

concentration was determined using the Bicinchoninic acid Assay kit (Interchim, Montluçon,

France) with bovine serum albumin (BSA) as a standard.

Mitochondrial respiration. Oxygen was measured with a Clark oxygen electrode (oxygraph

Oroboros, Innsbruck, Austria), in a glass cell 2 ml in volume, thermostatically controlled at

30°C, with constant stirring. Liver mitochondria (0.5 mg protein/ml) were incubated in a

respiratory reaction medium, consisting of 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA, 2

mM MgCl2, 3 mM Hepes (pH 7.4) supplemented with 0.3% (w/v) bovine serum albumin

(BSA), and saturated with room air. Substrate concentrations were 5 mM pyruvate + 2.5 mM

malate, 40 µM palmitoyl-l-carnitine + 2.5 mM malate. The active state of respiration (state 3)

was initiated by the addition of 150 µM ADP. The basal non-phosphorylating respiration rate

(state 4-oligomycin) was obtained by addition of 3 ng/µl of oligomycin. The uncoupled state

of respiration was initiated by the addition of 2 µM of carbonyl cyanide p-

trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP). Other separate respiration were conducted as

follows: one was started by adding 1.5 mM ADP + 5 mM glutamate, then 5 mM succinate

and finally 3 µM myxothiazole + 5 mM ascorbate + 0.5 mM N,N,N',N'-tetramethyl-p-

phenylenediamine (TMPD). Finally, another was started by adding 3 ng/µl of oligomycin + 5

mM glutamate, then 5 mM succinate and finally 3 mM myxothiazole + 5 mM ascorbate + 0.5

mM TMPD. RCR was the ratio of oxygen consumed after addition of ADP to that consumed

in the presence of oligomycin.

Calculation of thermodynamic coupling of oxidative phosphorylation. Parameters were

calculated using the methodology of Cairns et al.(Cairns et al. 1998) as previously described

(25).

Mitochondrial membrane potential. The mitochondrial membrane potential was determined

as that previously described by Dumas et al (3) in the same respiratory reaction medium with

64

5 mM succinate + 5 µM rotenone supplemented by 80 ng/ml nigericin to cancel out the

difference in pH across the inner membrane. The TPMP electrode was calibrated by

sequential 0.5 µM additions up to 2.5 µM TPMP+.

Mitochondrial ATP synthesis. ADP-stimulated mitochondria ATP production rate was

measured by exploiting a coupled-enzyme system linked to NADPH production as previously

used by Cairns et al (26). The coupled enzyme detection system (1 mM glucose, 0.5 mM

NADP, 1 IU/ml glucose-6-phosphate dehydrogenase and 0.9 IU/ml hexokinase) were then

combined with 5 mM pyruvate + 2.5 mM malate, 40 µM palmitoyl-l-carnitine + 2.5 mM

malate, 5 mM glutamate, 5 mM glutamate + 5 mM succinate and 3 mM myxothiazole + 5

mM ascorbate + 0.5 mM TMPD. After the addition of 0.2 mg/ml of liver isolated

mitochondria, the rate of NADPH formation in response to 0.3 mM ADP is measured at 340

nm using a spectrophotometer. Parallel measurements were made with 3 ng/µl of oligomycin.

The rate of ATP synthesis specifically from oxidative phosphorylation is then determined by

subtracting the oligomycin-insensitive rate from the total rate. ATP/O was the ratio of ATP

synthesis rate after addition of ADP to the oxygen consumption rate in the same condition.

Mitochondrial enzyme activities. Activities of citrate synthase (CS), succinate

dehydrogenase (SD) and complexes I, III and IV were measured spectrophotometrically at

37°C in the liver isolated mitochondria through modified procedures of Malgat et al. (27) as

previously described (3), except that isolated mitochondria protein concentrations were 10 µg

for CS, 3 µg for SD, 10 µg for complex I, 10 µg for complex III and 5 µg for complex IV.

Cytochrome content. Cytochrome concentrations in liver isolated mitochondria (4 mg

protein/ml) were measured in parallel experiments at 25 °C by comparing the spectra of fully

oxidized (2 µl of H2O2) and fully reduced (few crystals of sodium dithionite) cytochrome. The

wavelength pairs and absorptivity coefficients used were: cytochrome c+c1: 550-540 nm = 18

mM-1

cm-1

; cytochrome b: 563-575 nm = 18 mM-1

cm-1

; and cytochrome a+a3: 605-630

nm=24 mM-1

cm-1

(28, 29).

Plasma concentrations. Plasma total T3 concentrations were determined by

radioimmunoassay (Beckman Coulter, Fullerton, California, USA). Plasma rT3

concentrations were determined by radioimmunoassay (Beckman Coulter, Fullerton,

65

California, USA). Plasma leptin levels were determined by radioimmunoassay (Linco

Research, St. Charles, MO, USA).

Total RNA isolation and cDNA synthesis. The total RNA from liver was isolated by means

of the Trizol Reagent (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) according to the

manufacturer’s recommendations. Quantification, degradation, and DNA contamination of

RNA were assessed using an RNA 6000 nano Assay (Agilent Technologies, Palo Alto, CA,

USA) on the BioAnalyzer 2100 (Agilent technologies, Waldbronn, Germany).

To generate cDNA, 1 µg of total RNA was denatured at 70°C with 1 µM of oligo(dT)

(Promega, Madison, WI, USA) for 5 min before quenching on ice. Then, 0.5 mM of each of

the 4 dNTPs, 10 mM dithiothreitol, 10 U RNase inhibitor, and 200 U Superscript II (Life

Technologies, Gaithersburg, MD, USA) were added to a final volume of 20 µl. The reaction

mix was incubated for 1 h at 42°C. The reverse transcriptase was inactivated at 70°C for 15

min.

Quantitative PCR. A Roche LightCycler apparatus was used to determine cDNA copy

number using the Faststart DNA master SYBR Green kit (Roche, Mannheim, Germany).

The expression levels of four nuclear genes (COX IV, SOD and PGC-1), one mitochondrial-

encoded gene (COX I), and one reference gene (β-actin) were explored. The amount of cDNA

from the different genes was normalized by the quantification of β-actin as described

elsewhere (30).

For quantification, 2 µl of either cDNA, DNA or a standard with a known copy number were

mixed with a buffer containing 4 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.5 M of forward and reverse

primers (Table 1), SYBR green I dye, and 0.25 U hot start Taq DNA polymerase made up to a

final volume of 20 µl. The reactions were performed as follows: initial denaturing at 95°C for

7 min and 40 cycles at 95°C for 10 s, from 58 to 60°C for 5 s depending on primers used, and

72°C for 15 s. For each run, a standard curve was generated using four 10-fold serial dilutions

of an external standard prepared as described below. This curve allowed the determination of

the starting copy number of cDNA in each sample. All samples were tested twice. A melting

curve was systematically analyzed in order to check the specificity of the PCR product.

Statistical analysis. Results were expressed as mean ± SD. The relation between FR intensity

and all determined parameters were studied by testing linear regressions for significance. A P

66

value of < 0.05 was considered significant in all cases. All analyses were performed using

StatView version 5.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

RESULTS

Effect of FR on mass change. FR rats and control rats did not differ with respect to body

weight at the beginning of the experimental procedure (398 ± 68 g). The weight loss was

proportional to the intensity of FR (r = -0.97; P < 0.0001; Figure 1).

Liver mass and the liver-to-body weight ratio decreased with the intensity of FR (r = -0.71

and -0.87, respectively; P < 0.0001).

Total liver protein mass was decreased with the intensity of FR (r = -0.45; P = 0.028).

However, when expressed per gram of liver, total protein mass was positively correlated with

the intensity of FR (r = 0.41; P = 0.045). Liver mitochondrial mass, determined by the citrate

synthase activity, was marginally affected by FR (r = -0.33; P = 0.134). Per gram of liver,

mitochondrial mass was increased with the intensity of FR (r = 0.44; P = 0.027).

Glycogen content per gram of liver was decreased with FR intensity (r = -0.90; P < 0.0001).

Effect of FR intensity on mitochondrial respiratory parameters. Table 2 display the

changes in state 3, state 4-oligomycin and uncoupled state of respiration rates as a function of

the intensity of FR. In state 3, respiration significantly decreased for all respiratory substrates

used except for ascorbate + TMPD. Uncoupled respiration decreased with FR. Only with

glutamate was state 4-oligomycin respiration decreased with intensity of FR. Whatever the

respiratory substrate, there was no correlation between RCR and q and the intensity of FR.

Effect of FR intensity on mitochondrial ATP synthesis. Table 3 shows the correlations

between ATP synthesis rate, ATP/O ratio and the intensity of FR. ATP synthesis rate was

unchanged by the intensity of FR except with glutamate and pyruvate + malate. ATP/O was

also unchanged except with glutamate.

Effect of FR intensity on basal proton leak kinetics. FR resulted in a shift to the right of the

curve, except for rats restricted 75% where the ohmic part (linear) of the curve was shifted to

higher values of oxygen consumption (Figure 2).

67

This result suggests a decrease in the basal proton leak activity. Hence, for the highest

membrane potential, which was identical in all group, the oxygen consumption was lower in

FR rats than in control rats. Hence at 186 mV, respiration rates were significantly decreased

by 34% in 25% FR rats (18 ± 2 natomes O/min per mg of protein), by 42% in 50% FR rats

(16 ± 2 natomes O/min per mg of protein) and by 18% in 75% FR rats (22 ± 2 natomes O/min

per mg of protein) as compared with CON rats (27 ± 3 natomes O/min per mg of protein).

Effect of FR intensity on mitochondrial enzyme activities. Activity of complex IV was

marginally increased by the intensity of FR (r = 0.37; P = 0.072). Activities of citrate synthase

and of complexes I, II, and III were not correlated with the FR intensity.

Effect of FR intensity on mitochondrial cytochrome content. Cytochrome c + c1

concentration was increased by FR intensity (r = 0.43; P = 0.045), while cytochrome a + a3, b

and total cytochrome concentrations were not correlated.

Effect of FR intensity on plasma hormone concentrations. Table 4 displays correlations

between plasma hormone concentrations and the intensity of FR. Leptin and T3 concentration

were decreased by FR intensity. FR did not affect plasma rT3 concentration.

Effect of FR intensity on gene expression. Table 5 displays correlations between gene

transcripts copy number and the intensity of FR. The expression of COX I, IV and SOD genes

were increased by the intensity of FR. PGC-1 gene expression was not affected by FR (P =

0.126). Expression of COX I and IV genes were positively correlated with the PGC-1 gene

expression (r = 0.58, and 0.64; P = 0.0075 and 0.0021).

Relations between mitochondrial parameters, gene expression and plasma hormone

concentrations. As shown in Table 6, leptin and T3 concentrations correlated significantly

with several mitochondrial parameters and gene transcripts copy number. By stepwise

regression analysis, however, all parameters were found to be predicted only by the plasma

leptin level. Leptin independent variable explained between 16 and 40% of the variance in the

state 3 oxygen consumption rates in FR rats.

DISCUSSION

68

The present study shows that 1) state 3 liver mitochondrial oxygen consumption is decreased

in proportion to the intensity of FR, and is already present after 3 days, 2) this does not result

in an increased efficiency of oxidative phosphorylation, and 3) plasma leptin concentration

may be a key determinant of these changes.

FR is used both for weight management and to study increased longevity in various

animal models. In studies dealing with weight management, an adaptation of resting energy

expenditure is suggested to result from FR (2). This adaptation, which leads to a decrease in

energy expenditure that goes beyond what can be expected from loss of mass, is observed

after 10 days of FR (31). We have shown (3) that 3 days of 50% FR resulted in an adaptation

by which 1) liver mass is decreased by 17%, much more than total body mass (-5%), and 2) a

modification in mitochondrial oxygen consumption. Bevilacqua et al (32) have shown that 2

weeks of 40% FR resulted in a reduction in whole-body oxygen consumption, a decline in

muscle mitochondrial respiration (both state 3 and 4 respiration) with a mild decrease in

protonmotive force. These authors have also shown that changes in mitochondrial oxygen

consumption did not affect ATP synthesis in skeletal muscle mitochondria. The present study

adds to previous knowledge in that it confirms that adaptive mechanisms that decrease whole-

body energy expenditure appear very early (3 days), are a combination of decreased liver

mass (which normally accounts for 20% of energy expenditure in rat; (33)) and decreased

mitochondrial oxygen consumption. Furthermore, it shows that all these changes are

proportional to the degree of FR from 25 to 75% reduction of habitual food intake. These

proportional changes are important because they suggest that the more restricted the animal is,

the more efficient will be adaptation, leading certainly to important weight loss but also to

reduced energy expenditure. These results can be put in perspective of maintaining 40% FR

for a longer time. Indeed, Bevilacqua et al (32) have shown that mitochondrial respiration

keep on decreasing after 2 and 6 months FR. This adaptation may be an explanation to the

plateau in weight experienced by patients after about 6 months of FR (34).

The decrease in oxygen consumption in phosphorylating condition can be due to either

a decreased in substrate oxidation activity, or a decrease in energy wastage (i.e. decreased

proton leak or decrease in redox slipping), or a change in ATP-synthase activity. In this study,

we confirm previous results (3) that FR results in a decrease in the substrate oxidation

activity, as uncoupled state respiration decrease significantly with the intensity of FR.

Moreover, our results show that FR decreases the respiratory chain activity mainly for

complex II, to a lesser extend for complex I, but not for complex IV. A decrease in respiratory

chain activity could be due to a decrease in the activities of the substrate translocases, the

69

dehydrogenases and/or the respiratory chain complexes. Since oxidation of pyruvate and

glutamate are decreased to an equal extent, it seems unlikely that limitations in substrate entry

and/or activity of pyruvate and glutamate dehydrogenase explain the reduced oxygen

consumption induced by FR. Similarly, a change in succinate dehydrogenase and β-oxidation

activity can probably be excluded as rates of respiration with glutamate + succinate and

palmitoyl-l-carnitine were decreased to the same extend. Finally, as the mitochondrial enzyme

activities were not affected by FR, it appears that the decrease of uncoupled state respiration

could be the consequence of a decreased of the quantity of electron acceptor along the

respiratory chain. Actually, we found no difference in cytochromes a + a3, b and total

cytochrome concentrations and an increase in that of c + c1 with the intensity of FR.

Moreover, FR has been reported to increase coenzyme Q (CoQ) content in rat liver (35).

However, we cannot totally excluded this possibility since we have not measured all the

components of the electron-transport chain. Further experiments are necessary to specify the

exact mechanisms involved in short-term FR.

A decrease in oxygen consumption in phosphorylating condition can also be explained by a

decrease in energy wastage i.e. a better coupling between oxygen consumption and ATP

synthesis rate. Effectively, we observed a decrease in proton leak as reported in long-term FR

(9). Nevertheless, in our study, the decrease in the kinetic of proton leak was moderate and

not proportional to the intensity of FR. It may suggest that the decrease in proton leak was not

central to the action of FR. According to this view, Ramsey et al (36) did not found a

significant reduction in proton leak in liver mitochondria of 6 months FR rats. In no

circumstances, the decrease in proton leak we observed was apparently sufficient to improve

the oxidative phosphorylation efficiency in FR rats. Indeed, we found neither difference in q,

nor in ATP/O ratio in relation to the intensity of FR except for glutamate as respiratory

substrate where ATP/O was decreased. Our results agree with data obtained from medium-

term (2-9 weeks) FR studies, which reported no difference in ADP/O ratio (37, 38).

One of the theories of aging, and of the beneficial effect of FR on longevity involves a

lower production of ROS (7, 8). This was shown for long-term (9, 39, 40) and for short-term

FR (2 veeks; (32)). ROS production is very sensitive to mitochondrial membrane potential.

Indeed, a 10% drop in membrane potential can result in a 75% decrease in ROS production

rate in rat heart mitochondria (41). Our results, therefore may represent the initiation of the

mechanims that occurred latter with more long-term FR, as the decrease in respiratory chain

activity (present study) tends to decrease the membrane potential. Interestingly, we also

reported an increase in the Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) gene expression that was

70

positively correlated to the FR intensity. Such an increase expression of SOD (i.e. activities or

mRNA levels) in liver has already been reported with long-term FR (10, 11). SOD is one of

the main detoxifying enzymes with catalase and glutathione peroxidase in cells. Although we

have not determined the activity of Cu-Zn SOD, it is interesting to note that with long-term

FR the increase of antioxidant enzyme (Cu-Zn SOD and catalase) activities arise as the result

of a change in the levels of mRNA coding for these enzymes (10, 11). It is therefore likely

that the present increase in SOD gene expression corresponds to an elevated detoxification of

ROS in liver and could contribute to a decrease in ROS quantity by FR. During FR, even in

the short-term, the major energy source is stored triglycerides that derive from lipolysis in

adipose tissue (42). It was shown that in vitro the oxidation of palmitoyl-carnitine by

mitochondria leads to the generation of ROS (43, 44). It is therefore tempting to speculate that

ROS production would be increased in the early time of the FR and that SOD gene expression

increase to counteract it. Interestingly, it has been recently shown that ROS production with

succinate way increased with FR at 1 month (36). In addition, we observed that in relation to

the intensity of FR, COX gene expression derived from the nuclear (COX IV subunit) and

mitochondrial (COX I subunit) genome was increased. Interestingly, COX gene expression

correlate with the complex IV enzyme activity (data not shown). COX is the final electron

acceptor along the respiratory chain, reducing oxygen to water. However, 1-2% of oxygen

reduced in mitochondria is in fact converted to the toxic superoxide radicals (45). Currently,

the molecular mechanism of superoxide radical generation in mitochondria is not fully

understood. It was proposed that activation of ROS production in state 4, when protonic

potential is high and respiration rate is limited by lack of ADP, is due to the fact that some

transients of the respiratory chain electron transport, capable of reducing O2 to O2-., such as

CoQH., become long-lived (46, 47). It could therefore be attempt that in a situation where

activity of respiratory chain is lower for complex II and I (present study), an increase in the

complex IV activity would increase the flow for electron, so limiting the concentration and

life-time of one-electron O2 reductants such as CoQH.. Conversely, COX deficiency is often

associated with a ROS overproduction (48, 49). Therefore, the increase in COX gene

expression could also represent a mechanism of ROS detoxification in co-ordinate manner to

the decrease in respiratory chain activity and in addition to the increase in SOD gene

expression.

Collectively, our results therefore suggest that adaptation of mitochondrial respiration during

3 days of FR could be aimed at reducing ROS production, more than making the ATP

synthesis more efficient. Indeed, FFA oxidation leads to increased ROS production.

71

Therefore, the adaptation could be a mechanism by which oxygen consumption is reduced,

which in turn tends to decrease the membrane potential, SOD and COX gene expression is

increased, both to limit ROS production and induced damages. However, in the mean time,

efficiency of ATP synthesis is not improved.

Little is known about factors that may regulate the mitochondria in short-term

adaptation. Among the factors susceptible to affect mitochondrial metabolism is leptin.

Indeed, in ob/ob mice, naturally KO for leptin gene, treatment with the hormone induce an

increase in muscle mitochondria (22, 23). On the other hand, leptin increases whole-body

oxygen consumption in rat, and this effect is not dependent on the thyroid status, but additive

to it (21). Furthermore, leptin was shown to increase whole-body energy expenditure in ob/ob

mice (22, 23). These consistent arguments suggest that leptin regulates energy expenditure on

top of its effect on food intake. In our study, it appears that most of mitochondrial changes

(oxygen consumption, COX gene expression) are predicted by changes in plasma leptin levels

with coefficient of correlation ranging from 0.49 to 0.77. Moreover, by stepwise regression

analysis, we found that leptin may act independently of T3 and override T3 effect during FR.

Interestingly, low T3 concentrations that are usually observed during hypothyroidism induce

an improvement in ATP synthesis efficiency which parallels decreased respiration in liver

mitochondria (5). Conversely, in the present study we have shown that lower mitochondrial

oxygen consumption was not associated with an increase in oxidative phosphorylation

efficiency. Although further studies are necessary, our observations therefore may suggest

that leptin could affect energy metabolism at the level of the mitochondria.

In conclusion, the present study suggests that adaptation of energy metabolism to FR

takes place in the liver. Adaptation in respiration is proportional to the intensity of FR and

probably participates to the plateau level of weight achieved after week of FR in humans.

Moreover, this adaptation is already present after 3 days of FR. The decrease in oxygen

consumption is likely aimed at reducing ROS production in the context of fat oxidation

priority, but does not affect the efficiency of ATP synthesis. Leptin could be the key regulator

involved in this adaptation.

ACKNOWLEDGEMENTS

Authors thank Pierre Legras, Jérôme Roux and Dominique Gilbert for animal care, Anne

Minisini, Marie-Jo Bellanger and Florent Favreau for technical assistance and Miriam Ryan

72

for reviewing the English manuscript. This work was supported by grants from Contrat de

Plan Etat Region 2000-2004.

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76

DEXAMETHASONE ET METABOLISME ENERGETIQUE

MITOCHONDRIAL

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Articles 3, 4 et 5:

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Malthièry Y, Simard G, Ritz P. Sous presse dans Diabetologia.

Le rat traité par dexaméthasone est un modèle qui associe une diminution des apports

alimentaires, un hypercatabolisme, une insulino-résistance et une augmentation de la dépense

énergétique du corps entier. Ainsi, l'utilisation de fortes doses de glucocorticoïdes induit une

perte de poids qui se caractérise par une diminution de la masse maigre et une diminution ou

une augmentation de la masse grasse (Kochakian et Robertson, 1951; Hausberger et

Hausberger, 1958; Kekwick et Pawan, 1965; Woodward et Emery, 1989). Cette perte de poids

peut s'expliquer en partie par une diminution des apports alimentaires puisque, chez le rat, le

traitement par dexaméthasone induit une anorexie passagère qui semble persister plus

longtemps avec l'âge (Kaur et al., 1989; Minet-Quinard et al., 1999). En revanche, il est

improbable que cette perte de poids s’explique par une perte d’énergie due à une moins bonne

absorption des aliments. En effet, le traitement par glucocorticoïdes s’accompagne d’une

meilleure activité d’absorption et de digestion des sucres et des lipides au niveau de l’intestin

chez le rat (Scott et al., 1981; Batt et Scott, 1982; Thiesen et al., 2003; Thiesen et al., 2003).

Bien que le traitement par dexaméthasone augmente la glycosurie, cet effet aigu est cependant

trop faible pour induire une perte significative d'énergie (Yamanouchi et al., 1998). Cette

perte de poids peut aussi s'expliquer par une augmentation de la dépense d'énergie du corps

entier. Lors de traitements par glucocorticoïdes, les études rapportent une augmentation, qui

semble dépendre de la dose de l’hormone, du métabolisme de base et/ou de la dépense

d'énergie totale (Coyer et al., 1985; Woodward et Emery, 1989; Chong et al., 1994; Brillon et

al., 1995; Tataranni et al., 1996). Parmi les mécanismes qui peuvent expliquer cet état

d'hypermétabolisme, il apparaît que certaines voies métaboliques qui consomment de l'énergie

sont activées. Ainsi, les glucocorticoïdes sont capables de stimuler la néoglucogenèse dans le

foie et les reins (Kamiya et al., 1983; Souba et al., 1985), la protéolyse ubiquitine-

78

protéasome-dépendante dans le muscle (Tiao et al., 1996; Mitch et al., 1999) et l'activité de la

glutamine synthéthase dans le muscle (Max et al., 1988; Minet-Quinard et al., 2000). Une

augmentation de la demande en énergie dans ces tissus est en retour capable d'entraîner une

augmentation de la dépense d'énergie du corps entier. Quoiqu’il en soit, la perte de poids

induite par les glucocorticoïdes se caractérise par une perte de masse musculaire qui à moyen

terme (> 2 semaines) se distingue principalement par une diminution de la surface des fibres

de type glycolytique (Gardiner et al., 1980; Wilcox et al., 1989; Lewis et al., 1992; Prezant et

al., 1998). Il apparaît que cette atrophie musculaire s’explique essentiellement par une

diminution de la synthèse protéique puisque l’augmentation de la protéolyse ne semble que

transitoire (Odedra et al., 1983; Bowes et al., 1996). Cet état d’hypercatabolisme

s’accompagne aussi d’une augmentation de la lipolyse adipocytaire, résultant en une

augmentation du flux d'acides gras vers les autres tissus dont le foie (Devenport et al., 1989;

Horber et al., 1991).

L'administration de glucocorticoïdes induit une hyperglycémie et une

hyperinsulinémie associée à une insulino-résistance au niveau du foie et des tissus

périphériques (Nosadini et al., 1983; Pagano et al., 1983; Lenzen et al., 1985). Ces effets

impliquent une augmentation de la néoglucogenèse hépatique limitant ainsi la suppression de

la production du glucose stimulée par l'insuline, et une diminution de l'absorption du glucose

(basale et stimulée par l'insuline) au niveau du muscle squelettique (McMahon et al., 1988;

Guillaume-Gentil et al., 1993; Tappy et al., 1994).

Le traitement par glucocorticoïdes s'accompagne également d'une augmentation du

taux circulant de leptine, secondaire à une surexpression du gène ob (De Vos et al., 1995).

De la même façon que les hormones stéroïdiennes et thyroïdiennes, les

glucocorticoïdes sont capables d'agir sur la transcription des gènes en interagissant avec des

récepteurs nucléaires et des polypeptides (Scheller et al., 2003). Les études rapportent 2 voies

différentes par lesquelles les glucocorticoïdes agissent sur le métabolisme énergétique

mitochondrial. Le principal effet semble être l’activation de gènes mitochondriaux et

nucléaires codant pour des enzymes de la chaîne respiratoire, induisant ainsi une biogenèse et

une augmentation de la masse mitochondriale et de la respiration. Ainsi, le traitement par

dexaméthasone induit la surexpression des sous-unités I, II, III et IV de la COX (Weber et al.,

2002); (Rachamim et al., 1995). Enfin, les glucocorticoïdes sont capables d’induire une

réponse plus rapide et indépendante de la synthèse protéique (Allan et al., 1983). Les

mécanismes de cette dernière voie sont encore très peu connus.

79

Par ailleurs, les glucocorticoïdes, à plus faibles doses ou en « bolus thérapeutiques »,

sont couramment utilisés pour stopper l’inflammation lors de maladies chroniques

inflammatoires telles que l’asthme, l’arthrite rhumatoïde et certaines maladies auto-immunes.

Les mécanismes, encore très discutés, impliqueraient des effets génomiques, non-génomiques

spécifiques et non-spécifiques (Buttgereit et al., 1998). Parmi les effets génomiques, les

glucocorticoïdes sont capables de stimuler la transcription de gènes codant pour des protéines

anti-inflammatoires (interleukine-10, lipocortine-1…). Cependant, l’effet le plus important

des glucocorticoïdes semble être leur action inhibitrice sur l’expression de multiples gènes

codant pour des protéines inflammatoires (IL-1β, TNF-α…) (Barnes, 1998; Adcock, 2001).

Ces effets anti-inflammatoires, différents de ceux induits par de hautes doses de

glucocorticoïdes, impliquent l’existence de plus d’un seul mode d’action des hormones, tout

dépendant de leur concentration tissulaire.

Quoiqu’il en soit, toutes ces caractéristiques font du rat traité par dexaméthasone, un

modèle d’étude très intéressant pour les situations cliniques de perte de poids en cas

d’agression où les taux plasmatiques en glucocorticoïdes sont élevés. En effet, ces cas de

perte pondérale involontaire associent souvent un état d’hypercatabolisme musculaire, des

altérations hormonales, une diminution des apports alimentaires (imposée ou secondaire à

l’anorexie) et une augmentation de la dépense d’énergie de repos. Si l’aspect anti-

inflammatoire peut paraître divergeant des situations cliniques, il rend le modèle plus

discrimant pour l’étude des effets propres à l’état d’hypermétabolisme. En effet, bien que la

perte de poids involontaire de quelques jours soit une pathologie qui se rencontre

fréquemment en médecine, les mécanismes biochimiques impliqués dans l’état

d’hypermétabolisme restent très peu connus.

Résultats

Le traitement par dexaméthasone (1,5 mg/kg/jour pendant 5 jours) entraîne une perte

de poids (-16%) supérieure à celle induite par une simple restriction calorique (-9% chez les

rats appariés pour la prise alimentaire: PF). Cette perte de poids s’explique en partie par une

diminution de la masse musculaire puisque la masse du gastrocnemius, en particulier, est

inférieure de 19% à celles des rats témoins et PF. A l’inverse, la masse relative du foie (g/100

g poids animal) est fortement augmentée (+59% et +80% ) en comparaison des rats témoins et

PF. L’hydratation hépatique (g d’eau/g foie) n’est pas modifiée entre les groupes.

Au niveau des mitochondries de foie, le traitement par dexaméthasone entraîne

spécifiquement (effets différents des rats appariés pour la prise alimentaire) une augmentation

80

(+40%) de la consommation d’oxygène basale (état 4-oligomycine), pour l’ensemble des

substrats utilisés (complexe I, II et IV). Le degré de couplage (q) et l’efficacité (ηopt)

thermodynamique de la phosphorylation oxydative sont diminués chez les rats traités par

dexaméthasone. Il n’y a pas de modification de la respiration à l’état 3 et de l’activité

enzymatique des différents complexes de la chaîne respiratoire.

L’étude de la cinétique du potentiel de membrane en fonction de la consommation d’oxygène

en condition non-phosphorylante (état 4-oligomycine) montre un décalage de la courbe vers la

gauche chez les rats traités par dexaméthasone en comparaison de celles des rats témoins et

PF. Ainsi l’ensemble des potentiels de membrane est maintenu avec une consommation

d’oxygène supérieure chez les rats traités par dexaméthasone. Pour le plus haut potentiel de

membrane commun, par exemple, la consommation d’oxygène correspondante est augmentée

de 40% par le traitement par dexaméthasone.

A l’inverse, au niveau des mitochondries de gastrocnemius, aucun des paramètres

respiratoires ou enzymatiques n’est affecté par le traitement par dexaméthasone.

Notre étude in vivo (RMN du phosphore 31) montre que le traitement par

dexaméthasone entraîne spécifiquement une diminution du rapport PCr/ATP (-16% par

rapport aux rats témoins et PF) dans le gastrocnemius des animaux nourris. A l’inverse, cette

diminution est semblable chez les rats PF et chez les rats traités par dexaméthasone quand les

animaux sont mis à jeun la veille de l’exploration. Cette diminution s’explique par une baisse

de la concentration de PCr et une augmentation de celle en ATP. Quel que soit l’état

nutritionnel des rats, la concentration en ADP et le flux d’échange PCr vers ATP sont

augmentés avec le traitement par dexaméthasone. Le flux d’échange de l’ATP vers l’ADP

n’est pas différent entre les groupes de rats et ceci qu’ils soient nourris ou mis à jeun la veille

des mesures.

Discussion

Nos études confirment que le traitement par dexaméthasone (1,5 mg/kg/jour pendant 5

jours) induit une perte de poids supérieure à celle de rats appariés pour la prise alimentaire

(Minet-Quinard et al., 1999; Minet-Quinard et al., 2000). Ce résultat montre indirectement

une augmentation de la dépense énergétique du corps entier (Woodward et Emery, 1989;

Brillon et al., 1995; Tataranni et al., 1996). En effet, il semble improbable que cette

diminution du poids s’explique par une perte d’énergie due à une moins bonne absorption

alimentaire. Les études rapportent plutôt une meilleure activité d’absorption et de digestion

des sucres et des lipides au niveau de l’intestin chez le rat traité par glucocorticoïdes (Scott et

81

al., 1981; Batt et Scott, 1982; Thiesen et al., 2003; Thiesen et al., 2003). De même, bien que

le traitement par dexaméthasone augmente la glycosurie, cet effet aigu est cependant trop

faible pour induire une perte d’énergie significative (Yamanouchi et al., 1998; et données

personnelles).

L’augmentation de la masse relative du foie (g/100 g) est susceptible d’expliquer une

partie de l’augmentation de la dépense énergétique. En effet, le foie participe entre 17 et 25%

à la dépense d’énergie de repos chez le rat (Rolfe et Brown, 1997; Ramsey et al., 2000). Nos

résultats montrent que cette hausse n’est pas due à une augmentation de la proportion d’eau

dans le tissu. Il a été montré que les glucocorticoïdes stimulent la synthèse de glycogène dans

le foie (Weber et Kletzien, 1982; Michaels et Cardell, 1997; Bollen et al., 1998). Cependant

chaque gramme de glycogène stocké nécéssite aussi la fixation de 3 g d’eau. Il semble donc

que si le contenu en glycogène est augmenté dans notre étude, cela n’est en tout cas pas

suffisant pour modifier significativement l’hydratation et la masse relative du foie. De même,

bien que le traitement par dexaméthasone entraîne une augmentation de la concentration en

lipides hépatiques, ce phénomène ne semble pas suffisant pour expliquer entièrement

l’augmentation de la masse du foie (Kaur et al., 1989; Palacios et al., 1995; Franco-Colin et

al., 2000). Finalement, il est probable que l’augmentation de la masse relative du foie soit

aussi due, en partie, à une augmentation de la concentration en protéines dont le taux de

synthèse est stimulé par le traitement par glucocorticoïdes (Odedra et al., 1983; Savary et al.,

2001). Par conséquent cette augmentation de la masse hépatique métabolique doit

s’accompagner d’une augmentation de la consommation d’oxygène tissulaire et donc d’une

augmentation de la dépense énergétique au niveau du corps entier. Ce phénomène peut être

encore plus important si la contribution du foie dans la consommation d'oxygène totale est

augmentée. Ainsi, Yu et al. (1999) rapportent chez des patients gravement brûlés, une

augmentation de 63% de la contribution du foie dans la consommation d'oxygène totale

(passant de 17% chez un individu sain à 27,8% chez un patient brûlé). Quoiqu’il en soit, nos

résultats suggèrent que le foie est capable d’expliquer, au moins en partie, l’augmentation de

la dépense d’énergie induite par le traitement par dexaméthasone, et ceci par des mécanismes

passifs (augmentation de la masse).

Au niveau du métabolisme énergétique mitochondrial, nos résultats montrent une

augmentation de la consommation d’oxygène en condition basale (respiration à l’état 4-

oligomycine) mais pas en condition phosphorylante (respiration à l’état 3). Ces résultats

confirment et complètent ceux d’études précédentes qui montrent que la respiration à l’état 3

est diminuée avec un substrat du complexe I et inchangée avec les substrats du complexe II et

82

IV après plusieurs jours de traitement par glucocorticoïdes (Kerppola, 1960; Kimberg et al.,

1968; Kimura et Rasmussen, 1977; Jani et al., 1991). Seul Jani et al. (1991) rapportent l’effet

de la corticostérone sur la consommation d’oxygène en condition non-phosphorylante et

montrent que les taux de respiration sont, soit augmentés, soit non modifiés, selon le substrat

et l’âge des rats utilisés.

En condition non-phosphorylante, la force proton-motrice est uniquement consommée

par les réactions de fuite de protons, qu’elles soient basales et dues à la non-parfaite

imperméabilité de la membrane interne mitochondriale ou qu’elles soient induites par des

protéines (UCP1, UCP2, UCP3…). La consommation d’oxygène est dans ce cas

proportionnelle à l’intensité de la fuite de protons, mais aussi à l’activité et à l’efficacité de la

chaîne respiratoire à maintenir la force proton-motrice (stœchiométrie H+/e

-). Dans nos

études, l’activité de la chaîne respiratoire ne semble pas augmentée chez les rats traités par

dexaméthasone, puisque l’activité de chaque complexe enzymatique est semblable entre les

différents groupes de rats. Nos résultats suggèrent donc que, soit la fuite de protons est

augmentée, soit l’efficacité de la chaîne respiratoire à former le potentiel électrochimique est

diminuée (augmentation du « slip redox ») ou les deux, chez les rats traités par

dexaméthasone. La construction de la cinétique du potentiel de membrane en fonction de la

consommation d’oxygène à l’état 4-oligomycine nous a permis une analyse plus complète de

la relation entre la respiration et le potentiel de membrane et ce pour la première fois (à notre

connaissance) dans une étude portant sur les effets de la dexaméthasone. Nos résultats

montrent un décalage vers la gauche de la courbe des rats traites par dexaméthasone par

rapport à celles des rats témoins et PF. Ceci traduit habituellement une perte d’énergie qui

peut-être due à une augmentation, soit de la fuite de protons, soit du « slip redox ». De façon

surprenante, la partie non-linéaire de la courbe, bien que moins prononcée, ne correpond pas à

des consommations d’oxygène plus élevées. En effet clasiquement, l’addition d’agents

découplants (induction d’une fuite de protons artificielle) réduit cette partie non-linéaire de la

courbe et s’accompagne aussi d’une augmentation de la consommation d’oxygène

concomitante à une diminution du potentiel de membrane (Brand et al., 1994; Luvisetto et al.,

1994). Toutefois, la diminution du potentiel de membrane que nous observons nous conforte

plus dans l’idée d’une augmentation de la fuite de protons chez les rats traités par

dexaméthasone (Luvisetto et al., 1987). Par ailleurs, seule la stœchiométrie H+/e

- de la COX a

été montrée comme étant variable et susceptible d’induire une diminution de l’efficacité de la

chaîne respiratoire à maintenir un potentiel de membrane (augmentation du « slip redox »;

(Capitanio et al., 1991; Papa et al., 1991). De plus, l’activité de la chaîne respiratoire peut être

83

analysée en mesurant la respiration mitochondriale en condition non-phosphorylante sous

l’effet d’un découplant (par exemple le FCCP). Or, nos résultats ne montrent pas de

différence de la consommation d’oxygène à l’état découplé avec un substrat de la COX

(ascorbate + TMPD). Ceci exclut un possible « slip redox » au niveau de la chaîne

respiratoire, en tout cas au sein de la COX, et renforce l’idée d’une augmentation de la fuite

de protons.

D’après nos conditions de mesure (utilisation de Sérum Albumine Bovine (SAB) à 0,3

%) il est improbable que cette fuite de protons soit induite par des protéines découplantes

et/ou des acides gras. De plus, il n’existe pas encore de preuve qu’il y ait une activité

découplante induite par les UCPs dans les mitochondries de foie (Echtay et al, 2002). Il

apparaît donc que l’augmentation de la fuite de protons chez les rats traités par

dexaméthasone est due à une plus grande perméabilité de la membrane interne de la

mitochondrie aux protons. Un changement de la surface membranaire est un des paramètres

susceptibles de modifier la fuite basale de protons (Brand et al., 1992; Porter et al., 1996).

Ainsi Brand et al. (1992) montrent que l’augmentation de la fuite de protons dans les

mitochondries de foie de rats hyperthyroïdiens en comparaison de rats témoins et

hypothyroïdiens s’expliquent en partie par une augmentation de la surface membranaire (mg

phospholipides totaux/mg protéines mitochondriales). De même, il apparaît que la

perméabilité membranaire aux protons dépend de la composition en acides gras de la

membrane interne. Globalement, la fuite de protons mitochondriale hépatique corrèle

positivement avec la concentration d'acides gras polyinsaturés, avec l’index d’insaturation des

acides gras composant les phospholipides et avec le taux en acides linolénique (20:3 n-6). A

l’inverse, elle corrèle négativement avec le taux d’acides gras monoinsaturés et le taux

d’acide linoléique (18:2 n-6) (Brand et al., 1992; Fontaine et al., 1996; Porter et al., 1996;

Brand et al., 2003). Parmi les phospholipides de la membrane interne, les cardiolipines qui

représente 13 à 15% des phospholipides totaux semblent jouer également jouer un rôle dans la

fuite de protons, puisque l’ajout in vitro de ces molécules dans des mitochondries isolées de

foie entraîne une augmentation de la perméabilité membranaire aux protons (Bobyleva et al.,

1997). A notre connaissance, seul Kaur et al (1989) ont rapporté les effets d’un traitement par

dexaméthasone sur la composition membranaire de mitochondries de foie. Ces auteurs

montrent que chez les rats traités par dexaméthasone (10 mg/kg/jour pendant 8 jours) les taux

(mg/g protéines) en phospholipides totaux et en cardiolipines ne sont pas différents de ceux

des rats témoins. Cependant il n’y a pas dans cette étude d’information sur la composition en

acides gras des différents phospholipides.

84

Chez nos rats traités par dexaméthasone le taux plasmatique de T3 est augmenté

(Roussel et al, en soumission). Or, des études précédentes montrent que dans les

mitochondries de foie de rats hyperthyroïdiens, la surface et la composition en phospholipides

de la membrane interne sont modifiées et que cela participe à l’augmentation de la fuite de

protons (Joste et Meijer, 1989; Brand et al., 1992; Brand et al., 1994). Ceci renforce l’intérêt

de prochaines études dans le but de préciser les mécanismes pouvant expliquer cette

augmentation de la fuite de protons chez les rats traités par dexaméthasone. Ainsi pour

vérifier ces hypothèses, il sera intéressant d’étudier la composition et la distribution des

phospholipides de la membrane interne des mitochondries de foie.

Quels que soient les mécanismes impliqués dans cette augmentation de la fuite basale

de protons, cette dernière est capable d’induire une diminution du couplage de la

phosphorylation oxydative. Dans nos travaux, nous avons choisi d’aborder le rendement de la

conversion d’énergie en déterminant le degré de couplage (q) et l’efficacité (ηopt)

thermodynamique de la phosphorylation oxydative (Cairns et al., 1998). Ces deux paramètres

sont fonction de l’intensité de la respiration sous oligomycine (respiration liée à la fuite de

protons et à l'activité de la chaîne respiratoire) et de la respiration sous FCCP (respiration

maximale indépendante de la synthèse d’ATP et limitée par l’activité de la chaîne

respiratoire). A la différence du rapport ATP/O, cette analyse permet une description

quantitative de l’efficacité de la phosphorylation oxydative. Stucki (1980) a ainsi défini quatre

états physiologiques correspondant chacun à une valeur de q : la valeur maximale (q > 0,972)

correspond à la formation économique d’un potentiel phosphate (ATP/ADP) avec une

efficacité optimale; q = 0,953 correspond à un taux de synthèse d’ATP économique; q = 0,910

est la valeur pour la génération d’un potentiel phosphate maximal et q = 0,786 correspond à

une synthèse d’ATP maximale à une efficacité optimale. Nos résultats montrent que le

traitement par dexaméthasone diminue le degré de couplage de la phosphorylation oxydative.

De tels résultats sont à rapprocher de ceux de précédentes études qui rapportent une

diminution de la phosphorylation oxydative (diminution du rapport P/O ou ADP/O) chez des

rats traités par glucocorticoïdes depuis plusieurs jours (Kimberg et al., 1968; Jani et al.,

1991). Cependant, ils divergent de ceux de Kerpolla (Kerppola 1960) et de Kimura et

Rasmussen (Kimura et Rasmussen, 1977) qui ne montrent pas de différence dans les rapports

ATP/O ou P/O. Une des explications possibles à cette divergence dans les résultats est d’ordre

méthodologique. En effet, dans ces études, la phosphorylation oxydative est stimulée avec des

concentrations saturantes d’ADP (respiration à l’état 3). Dans ces conditions, la

consommation d’oxygène et la synthèse d’ATP se déroulent à un taux maximum mais avec

85

des potentiels phosphate et redox non-physiologiques. De précédents travaux ont montré

qu’une manière plus physiologique de déterminer le rapport ATP/O était d’utiliser un système

générant des concentrations non-saturantes d’ADP (Fontaine et al., 1996; Piquet et al., 1996;

Rigoulet et al., 1998). Ainsi, ces études montrent que dans des mitochondries de foie de rats

restreints en acides gras polyinsaturés, le rapport ATP/O, bien qu’inchangé en condition

saturante d’ADP, était diminué avec la technique générant des concentrations non-saturantes

d’ADP, ce qui allait dans le même sens que la diminution du rapport ATP/ADP déterminé

dans les cellules entières. De plus, cette technique, qui repose sur le principe de générer de

l’ADP à partir d’ATP et de glucose en présence d’hexokinase, permet de faire varier les

concentrations d’ADP (il suffit de faire varier la quantité d’hexokinase; cf. fiche technique

n°10) et donc d’obtenir une cinétique d’états de phosphorylation oxydative intermédiaires

entre une respiration à l’état 4 et l’état 3 (état existant dans une cellule). Or, l’utilisation de ce

modèle a été proposé pour discerner une fuite de protons d’une diminution de l’efficacité

intrinsèque de pompage de protons au sein de la chaîne respiratoire (Van Dam et al., 1980;

Westerhoff et Van Damm, 1987; Groen et al., 1990). Ceci renforce l’intérêt de prochaines

études dans le but de confirmer et surtout de préciser les mécanismes pouvant expliquer la

diminution de l’efficacité de la phosphorylation oxydative chez les rats traités par

dexaméthasone. En effet, il a été montré que dans les mitochondries de foie de rats restreints

en acides gras polyinsaturés, il y avait une augmentation de la fuite de protons en condition

non-phosphorylante mais que l’efficacité de la phosphorylation oxydative était diminuée à

cause d’une augmentation du slip redox (Fontaine et al., 1996).

Nos résultats de couplage thermodynamique de la phosphorylation oxydative

suggèrent que si l’efficacité de synthèse d’ATP est diminuée, c’est dans le but de satisfaire

une production d’ATP maximale sans regard du coût énergétique et ce afin de fournir de

l’énergie pour des voies métaboliques qui seraient stimulées telles que la néoglucogenèse et

l’ureogenèse (Souba et al., 1985; Wolthers et al., 2000). Une adaptation semblable a été

montré au sein de mitochondries de foie de rats hyperthyroïdiens (Nogueira et al., 2002).

D’un autre côté, il n’est pas exclut que la mitochondrie de foie de rats traités par

dexaméthasone ne soit que la victime de l’état d’hypercatabolisme. Il serait donc intéressant

d’étudier la relation entre le métabolisme cellulaire et l’efficacité de la conversion énergétique

mitochondriale hépatique, soit en mesurant le contrôle de différentes voies métaboliques

cellulaires sur la phosphorylation oxydative de mitochondries de foie, soit en analysant

l’impact d’une modification du rendement de la conversion d’énergie mitochondriale sur

l’intensité des métabolismes cellulaires.

86

Au niveau des mitochondries du muscle squelettique, nos résultats montrent, d’une

part, que le rapport PCr/ATP est diminué (ceci s’explique par une diminution de la

concentration en PCr et une augmentation de celle en ATP) et d’autre part que la

concentration en ADP est augmentée. De telles modifications se rencontrent ou peuvent

s’expliquer soit 1) après un effort physique (Dawson et al., 1980), 2) par un changement de

fibres musculaires (diminution de la proportion de fibres de type II par rapport aux fibres de

type I; Kushmerick et al., 1992), 3) par une diminution de la concentration en créatine totale

(PCr + créatine libre) et dans ce cas l’échange ATP + Cr vers PCr + ADP est diminué, et 4)

parce que l’ATP est maintenu au détriment de la PCr. Cependant les mesures étaient

effectuées sur des rats au repos (anesthésie). Les études rapportent que l’atrophie musculaire

induite par les traitements par glucocorticoïdes s’explique par une plus grande perte des fibres

de type II par rapport à celles de type I mais uniquement après 3 semaines de traitement

(Gardiner et al., 1980; Wilcox et al., 1989; Lewis et al., 1992; Prezant et al., 1997; Prezant et

al., 1998). Enfin, nos résultats ne montrent pas de différence dans les concentrations de

créatine totale entre les différents groupes de rats. Collectivement, nos résultats suggèrent

donc que les concentrations d’ATP sont maintenues au dépens de la PCr. Le fait que le flux

d’échange de la PCr vers l’ATP soit augmenté renforce cette idée. Dans la cellule, l’ATP

provient soit de la phosphorylation oxydative de l’ADP, soit de la phosphorylation de l’ADP

au cours de la glycolyse, soit de l’hydrolyse de la PCr. Par conséquent, si l’échange entre la

PCr et l’ATP est augmenté, cela signifie que, soit la production d’ATP par la voie de la

phosphorylation oxydative et/ou glycolytique est altérée, soit que la demande en ATP est

augmentée. Il semble exclu que le turnover en ATP soit augmenté puisque nos résultats ne

montrent pas d’augmentation du flux de l’ATP vers l’ADP. En revanche, il n’est pas

totalement exclu que la production d’ATP par la glycolyse soit diminuée. En effet, il a été

montré que le traitement par dexaméthasone diminue la sensibilité à l’insuline de la glycolyse

dans des muscles de rats (Leighton et al., 1987). Cependant, l’augmentation de la

concentration en ADP, qui est un activateur allostérique de la glycolyse, devrait plutôt

entraîner une stimulation du métabolisme du glucose. Finalement, comme l’ADP est aussi un

fort régulateur de la respiration (Chance et Williams, 1955), il est attendu que l’augmentation

de la concentration en ADP induise une forte stimulation de la phosphorylation oxydative et

donc une synthèse d’ATP suffisante. Comme ce n’est pas le cas dans notre étude, cela est plus

en faveur d’une anomalie de la phosphorylation oxydative. Nos résultats in vivo (les premiers

à notre connaissance) confirment des résultats in vitro qui montrent que l’ajout de

methylprednisolone dans des mitochondries de muscles squelettiques diminue le rapport

87

ADP/O (Martens et al., 1991). De même, nos résultats sont en accord avec ceux de Koerts-de

Lang et al (2000) qui montrent, dans une étude ex vivo, que 14 jours de traitement par

triamcinolone entraînent une diminution des composés phosphates riche en énergie (ATP et

PCr) dans le muscle de rats.

Nos résultats complètent ceux de nos études ex vivo (article 3 et 4) qui ne montrent pas

d’altération du métabolisme énergétique dans les mitochondries de gastrocnemius. En effet,

une diminution de l’efficacité de la phosphorylation oxydative peut-être due soit à une

augmentation de la fuite de protons, soit à une diminution de l’efficacité des pompes à protons

(diminution de la stœchiométrie H+/e

- ou augmentation du rapport H

+/ATP). Une

augmentation de la fuite de protons peut s’expliquer par une augmentation de la perméabilité

membranaire ou une augmentation de l’activité des protéines découplantes. Or, les mesures

effectuées dans nos travaux ex vivo (article 4) sont réalisées en présence de SAB et sans

cofacteurs connus pour stimuler la fuite de protons UCP dépendante. Par conséquent, bien que

ces résultats excluent une augmentation de la perméabilité membranaire, ils ne permettent pas

en revanche d’écarter totalement l’hypothèse d’une fuite de protons induite par les acides gras

ou UCP3 dépendante et initié in vivo par des activateurs. Récemment, il a ainsi été montré que

les radicaux libres oxygénés (ROS) et leur accumulation dans la matrice mitochondriale

étaient des coactivateurs obligatoires des UCPs (Echtay et al., 2002; Echtay et al., 2002;

Talbot et al., 2004). Or Ohtsuka et al. (1998) rapportent que 4 jours de traitement par

corticosterone induisent un stress oxydatif dans le gastrocnemius de rat. Il n’est donc pas

impossible que l’anomalie in vivo de la phosphorylation oxydative chez les rats traités par

dexaméthasone s’explique par une augmentation de l’activité de fuite de protons de UCP3,

même si 28 heures après l’injection de corticostérone (Weigle et al., 1998) ou après 3 (Weber

et al., 2002) et 5 jours (Roussel et al, en soumission) de traitement par dexaméthasone, il n’y

a pas de différence dans la quantité d’ARNm ou de protéines UCP3. De futures recherches, en

particulier des mesures de respiration en présence de cofacteurs, devraient nous permettre

d’éclaircir ce point.

Le fait que nous ne trouvions pas de différence dans la relation entre le potentiel de

membrane et la consommation d’oxygène des mitochondries musculaires exclut également la

possibilité d’une diminution de l’efficacité intrinsèque de pompage des protons au sein de la

chaîne respiratoire (stœchiométrie H+/e

- au sein des complexes; cf. paragraphe I.B.1 de

l’introduction bibliographique). Par contre, il est possible que l’efficacité globale de la chaîne

respiratoire à pomper les protons (variation de la proportion d'électrons délivrés au premier

site de couplage par rapport au deuxième site de couplage) soit diminuée. En effet, nos

88

résultats confirment que le traitement par dexaméthasone induit un état d’insulino-resistance

résultant en une augmentation des concentrations circulantes en acides gras libres, insuline et

leptine. Or, il a été montré qu’un tel état pathologique perturbe l’équilibre pour l’utilisation

des glucides et des acides gras comme source d’énergie, et favorise l’oxydation des acides

gras dans le muscle (Venkatesan et al., 1987). A l’inverse de l’oxydation des glucides, celle

des acides gras produit une plus grande proportion d’équivalents réduits FADH2. L’oxydation

de ces derniers qui se déroule au niveau du complexe II ne met en jeu que deux sites de

pompage des protons (complexes III et IV). Par conséquent, par rapport à l’oxydation du

NADH + H+ (qui met aussi en jeu le premier site de couplage), le nombre de protons pompés

par électron transféré sera diminué. Il est donc possible que la diminution de l’efficacité de la

phosphorylation oxydative s’explique par une diminution globale de la stœchiométrie H+/e

- au

sein de la chaîne respiratoire. De même, il est possible que l’oxydation des acides gras

s’accompagne d’une augmentation de la production des ROS (Boveris et al., 1972; Boveris et

Chance, 1973). Or, les acides gras et les ROS sont des coactivateurs de l’activité des UCPs.

Dans ce cas la diminution de l’efficacité de la phosphorylation oxydative n’est peut être

qu’une conséquence de l’augmentation de la fuite de protons, dont le rôle premier serait de

protéger la mitochondrie contre les ROS (Echtay et al., 2002). Enfin, il n’est pas exclu que le

découplage de la phosphorylation oxydative s’explique aussi par une diminution de

l’efficacité de synthèse de l’ATP au sein de l’ATP synthéthase. Cependant bien qu’il n’existe

pas encore de situations physiologiques pour prouver l’existence d’un tel phénomène, cela

mérite de plus amples investigations.

De manière très intéressante, nos résultats in vivo suggèrent que l’effet de la

dexaméthasone sur le métabolisme mitochondrial musculaire n’est pas (totalement) dépendant

de la perte de poids qui accompagne le traitement. En effet, que les rats traités par

dexaméthasone soient nourris ou mis à jeun la veille (ce qui induit une perte de poids

supplémentaire), les effets sur les composés phosphates riches en énergie ne sont pas

différents si l’on excepte la diminution de la concentration en ATP. Ces résultats confirment

ceux de Koerts-de Lang et al. (2000) qui montrent ex vivo une altération des concentrations en

ATP et PCr plus importante chez les rats traités par triamcinolone que chez ceux appariés

pour la perte de poids. Il est donc très probable que l’ensemble des modifications du

métabolisme mitochondrial musculaire et hépatique mises en évidence dans nos études soit

spécifique des glucocorticoïdes.

De la même façon que les hormones thyroïdiennes, les glucocorticoïdes sont capables

de réguler le métabolisme mitochondrial énergétique selon deux voies (Goffart et Wiesner,

89

2003; Scheller et al., 2003). La voie principale implique l’induction de la transcription de

gènes mitochondriaux par des facteurs de transciption venant du noyau en réponse à une

action première des hormones sur les gènes nucléaires et par une action directe des hormones

sur les gènes mitochondriaux par la voie de récepteurs aux hormones. Cet effet qui peut

induire une augmentation de la biogenèse mitochondriale, de la masse mitochondriale et de la

respiration semble être spécifique du muscle squelettique (Weber et al., 2002). La deuxième

voie, plus rapide et indépendante des événements de transcription et de traduction, résulte en

une augmentation de la respiration mitochondriale quelques minutes après le traitement. Il

n’est toujours pas connu si ces derniers effets sont médiés par les même récepteurs qui

agissent sur les gènes ou s’ils impliquent une interaction directe des hormones avec d’autres

constituants mitochondriaux.

Au niveau du foie, nos résultats montrent une augmentation de la fuite basale de

protons. Quel que soit le mécanisme potentiellement responsable (augmentation de la surface

membranaire, variation de la composition en acides gras des phospholipides membranaires,

augmentation du taux de cardiolipines), il implique la régulation de l’activité ou de la quantité

des enzymes contrôlant le métabolisme des lipides membranaires. Il a été montré que les

glucocorticoïdes induisent l’activité d’enzymes clefs de la synthèse des acides gras et du

cholestérol, et que ceci pouvait être rapide (2 heures; Lin et Snodgrass 1982; Shafrir, 1996).

Cette action pourrait correspondre avec les effets mis en évidence par Jani et al. (1991) sur la

respiration mitochondriale, présents dès 2 heures de traitement par triamcinolone. Cependant,

il n’est pas exclu que la dexaméthasone induise aussi une augmentation de la quantité des

enzymes du métabolisme des phospholipides membranaires, soit en stimulant l’expression des

gènes, soit en stabilisant les transcrits correspondants (cf. figure 6).

Au niveau musculaire, de manière intéressante, Martens et al. (1991) ne trouvent pas

d’effet in vitro (le produit est injecté directement dans le milieu de respiration) de la

dexaméthasone sur la respiration de mitochondries isolées. Ceci exclut un effet direct et

rapide de la molécule sur la chaîne respiratoire. En revanche, il n’est pas exclu que la

dexaméthasone agisse directement sur l’activité d’enzymes ou l’expression des gènes

mitochondriaux, ou indirectement soit sur l’activité soit sur l’expression d’enzymes non

synthétisées dans la mitochondrie mais capables d’affecter son métabolisme. Nos résultats

suggèrent, soit une stimulation de la fuite de protons induite par UCP3, soit une diminution

globale de la stœchiométrie H+/e

- au sein de la chaîne respiratoire induite par une

prépondérance de l’oxydation des lipides par rapport à celle des glucides. Dans ces

conditions, il est possible que la dexaméthasone stimule l’expression ou l’activité d’enzymes

90

intervenant dans l’oxydation des acides gras (cf. figure 7). Il a été montré que l’injection de

dexaméthasone dans des hépatocytes isolés entraîne une augmentation de la transcription du

gène Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPAR)-α (Lemberger et al., 1994).

PPAR-α est connu pour réguler, entre autres, le catabolisme des acides gras (Lee et al., 2003;

Ferre, 2004). Les résultats de Lemberger et al. (1994) suggèrent donc que la dexaméthasone

puisse contrôler l’oxydation des acides gras de la façon suivante 1) activation du récepteur

aux glucocorticoïdes (GR) par la dexaméthasone, 2) induction du gène PPAR-α par le GR

activé, 3) activation de PPAR-α par ses ligands et 4) induction de l’expression des gènes

cibles de PPAR-α.

Evidemment, toutes ces hypothèses sont autant de questions qui méritent de plus amples

recherches.

Actuellement, la T3 reste encore le principal régulateur du métabolisme énergétique

mitochondrial connu. Nos résultats sont de nature à remettre en cause cette idée et suggèrent

que les glucocorticoïdes semblent bien être un autre régulateur de l’énergétique

mitochondrial. Toutefois, il est intéressant de constater une certaine similitude entre nos

résultats sur les effets de la dexaméthasone et ceux des hormones thyroïdiennes sur le

métabolisme énergétique de mitochondries de foie (augmentation de la fuite basale de protons

et diminution de l’efficacité de la phosphorylation oxydative; Harper et Brand, 1993;

Nogueira et al., 2002) et de muscle squelettique (augmentation de la fuite de protons UCP3

dépendante; Lanni et al., 1999); Lombardi et al., 2002). Ceci est d’autant plus intriguant que

le taux de T3 est augmenté chez les rats traités par dexaméthasone (Roussel et al., en

soumission), certes à des taux inférieurs à ceux rencontrés chez des rats rendus

hyperthyroïdiens. Il sera donc très intéressant de savoir si les effets rencontrés chez le rat

traité par dexaméthasone sont spécifiques de l’hormone ou s’ils sont aussi médiés par la T3.

91

ARTICLE 3

Mitochondrial energy metabolism in dexamethasone-induced undernutrition model.

Dumas JF, Simard G, Roussel D, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Ritz P. Br J Nutr. 2003

Nov;90(5):969-77.

92

Mitochondrial energy metabolism in a model of undernutritioninduced by dexamethasone

Jean-Francois Dumas, Gilles Simard, Damien Roussel, Olivier Douay, Francoise Foussard,Yves Malthiery and Patrick Ritz*

Medecine B, CHU, F-49033 ANGERS Cedex 01, France

(Received 20 February 2003 – Revised 18 June 2003 – Accepted 21 July 2003)

The present investigation was undertaken to evaluate whether mitochondrial energy metabolism is altered in a model of malnutrition

induced by dexamethasone (DEX) treatment (1·5mg/kg per d for 5 d). The gastrocnemius and liver mitochondria were isolated from

DEX-treated, pair-fed (PF) and control (CON) rats. Body weight was reduced significantly more in the DEX-treated group (216%)

than in the PF group (29%). DEX treatment increased liver mass (þ59% v. PF, þ23% v. CON) and decreased gastrocnemius mass.

Moreover, in DEX-treated rats, liver mitochondria had an increased rate of non-phosphorylative O2 consumption with all substrates

(approximately þ42%). There was no difference in enzymatic complex activities in liver mitochondria between rat groups. Collectively,

these results suggest an increased proton leak and/or redox slipping in the liver mitochondria of DEX-treated rats. In addition, DEX

decreased the thermodynamic coupling and efficiency of oxidative phosphorylation. We therefore suggest that this increase in the

proton leak and/or redox slip in the liver is responsible for the decrease in the thermodynamic efficiency of energy conversion. In contrast,

none of the variables of energy metabolism determined in gastrocnemius mitochondria was altered by DEX treatment. Therefore, it

appears that DEX specifically affects mitochondrial energy metabolism in the liver.

Glucocorticoid: Mitochondrion: Oxidative phosphorylation: Respiratory chain complexes

Malnutrition is prevalent in many patients, especially inthose who are elderly. It causes increased mortality, signifi-cant hospital expenditure, reduced muscle and immunefunction, and decreased quality of life (Wallace et al.1995; Tucker & Miguel, 1996; Chima et al. 1997; Lesourd& Mazzari, 1997; Landi et al. 2000). Malnutrition resultsfrom a negative energy balance, a situation where energyintake fails to meet energy requirements. Although anor-exia and a reduced energy intake are always associatedwith malnutrition, in some clinical circumstances, anincreased resting O2 consumption rate (referred to asincreased energy requirements) can be shown (Nguyenet al. 1999). In contrast, most studies with human subjectsand animals show that energy restriction decreases energyexpenditure (Ramsey et al. 2000). Therefore, it appearsthat in these clinical states, adaptive mechanisms thatlead to a reduction of energy requirements fail to operate.However, the biochemical nature of this negative energybalance phenomenon, i.e. the increased energy expendi-ture, is poorly understood at the present time. A wastingof energy may be a possible explanation. In other words,the mitochondrial oxidative phosphorylation yield maybe less efficient, and in turn O2 consumption may beincreased, for a same ATP synthesis rate.

High-dose glucocorticoid treatment affects body weightand body composition (Kochakian & Robertson, 1951;Hausberger & Hausberger, 1958). It has also been foundto induce a hypercatabolic state that leads to a reducedmuscle mass (Marone et al. 1994; Minet-Quinard et al.1999), suppressed protein synthesis, a transient increasein protein degradation and a negative N balance (Odedraet al. 1983; Max et al. 1988; Bowes et al. 1996). Moreover,it is a model of hypercortisolism, which occurs duringmetabolic stress in human subjects and which is associatedwith increased energy expenditure (Woodward & Emery,1989; Brillon et al. 1995; Tataranni et al. 1996). On theother hand, acute high-dose treatment (,1 week) withdexamethasone (DEX) decreases food intake in rats(Kaur et al. 1989; Minet-Quinard et al. 1999). Therefore,a negative energy balance ensues, because of both anincrease in energy expenditure and a decrease in energyintake. The mechanisms leading to this increased energyexpenditure are not fully understood. There are argumentsto suggest that mitochondrial energy production may beaffected. However, the effects of glucocorticoids on cellu-lar energy metabolism depend on the tissues being investi-gated and on the duration of treatment. In the liver forexample, short-term administration (,24 h) of DEX

*Corresponding author: Professor Patrick Ritz, fax þ33 241354969, email paritz@chu-angers.fr

Abbreviations: CON, control; DEX, dexamethasone; PF, pair-fed; TMPD, N,N,N0,N0-tetramethyl-p-phenylenediamine.

British Journal of Nutrition (2003), 90, 969–977 DOI: 10.1079/BJN2003980q The Authors 2003

appears to increase oxidative phosphorylation, whilehaving no effect on non-phosphorylative respiration(Wakat & Haynes, 1977; Allan et al. 1983). In contrast,longer administration of glucocorticoids (,1 week) resultsin decreased liver oxidative phosphorylation and ATP syn-thesis when fuelled through complex I, remainingunchanged, however, when fuelled through complex II orIV (Kerppola 1960; Kimura & Rasmussen, 1977; Janiet al. 1991). In isolated skeletal muscle mitochondria,studies have shown no change, a decrease or an increasein oxidative capacity (cytochrome c oxidase activity) orin oxidative phosphorylation (Vignos & Greene, 1973;Koski et al. 1974; Capaccio et al. 1985; Marone et al.1994; Weber et al. 2002).Since liver and muscle contribute approximately 50% of

body O2 consumption (Rolfe & Brown, 1997), most of itbeing coupled with ATP synthesis, we undertook the pre-sent study to investigate the effect of 5 d of a high doseof DEX (1·5mg/kg per d) on energy metabolism, particu-larly in muscle and liver mitochondria. Comparison withenergy restriction helps in the understanding of theincreased energy expenditure observed at the whole-bodylevel.

Materials and methods

Animals

The present investigation was performed in accordancewith the French guiding principles in the care and use ofanimals. Thirty-two male Sprague–Dawley rats, born andbred in our animal facility, were housed in individualcages at 9 weeks of age (30–50 g). Animals were providedwith water ad libitum and a standard diet (UAR A04; Ifa-credo, L’Arbresle, France) consisting of (g/kg): protein160, fat 30, carbohydrate 600, water, fibre, vitamins andminerals 210. The metabolizable energy content was12 kJ/g. Rats were divided into four groups of eight ani-mals as follows: DEX-treated rats received a daily intraper-itoneal injection of 1·5mg DEX/kg for 5 d. Due to the factthat DEX treatment induces a reduced food intake, pair-fed(PF) rats were used to discriminate between the effect of areduced food intake and the effect of DEX itself on thevariables measured. PF rats were pair-fed with DEX-trea-ted animals (rats received the same quantity of food as con-sumed by DEX-treated rats the previous day) and wereinjected daily with an isovolumetric solution of NaCl(9 g/l). Rats from the control group (CON) were healthy,received no treatment and were fed ad libitum. Animalsin the control injected group were fed ad libitum andwere injected with an isovolumetric solution of NaCl(9 g/l). This group was used to study the effects of NaClinjection. As results were similar between the two controlgroups, the control injected group was omitted in the pres-entation of the results. Experiments were conducted over a5 d period. The dose and duration of the DEX treatmentwas chosen to induce a reproducible maximum hypercata-bolic state with reference to current literature (Minet-Qui-nard et al. 2000). On the sixth day, following an overnightfast, the animals were killed by decapitation. Gastrocne-mius (a mixed muscle, which consists of approximately

20% fast-twitch oxidative glycolytic fibres, 74% fast-twitch glycolytic fibres and 6% slow-twitch oxidativefibres), liver and interscapular brown adipose tissue wereremoved rapidly and weighed. Some tissue samples wereimmediately used for respiratory measurements and theremainder were frozen in liquid N2 and stored at 2808Cin order to measure enzyme activity levels. Energy balancewas estimated by the ratio body weight loss:total foodintake over the 5 d experiment.

Liver water content determination

A portion of liver (1–2 g) was weighed and placed in anoven at 858C to dry for 24 h. Dry weights were measured,and the ratio wet weight:dry weight was calculated for thedetermination of liver water content.

Mitochondrial enzyme activities

Frozen liver and gastrocnemius (10–30mg) were thawedand homogenized with a Potter-Elvehjem homogenizer(seven strokes; Wheaton Science Products, Millville, NJ,USA) in an isolation medium consisting of 220mM-manni-tol, 75mM-sucrose, 10mM-Tris and 1mm-ethylene glycol-O,O0-bis(2-amino-ethyl)-N,N,N0,N0-tetraacetic acid, pH 7·2.Each homogenate was centrifuged at 600 g for 10min andthe resulting supernatant fraction was filtered through chee-secloth. All procedures were performed at 48C. The activi-ties of citrate synthase, succinate dehydrogenase andcomplexes I, III and IV were measured spectrophotometri-cally at 378C in the supernatant fraction (citrate synthaseactivity was also determined in isolated mitochondria)via an adaptation of the method described by Malgatet al. (1999), and in agreement with the Mitochondrial Dis-eases Group of the Association Francaise de Myopathie.Protein concentration was determined using the bicinchoni-nic acid assay kit (Interchim, Montlucon, France) withbovine serum albumin used as a control.

The activity of citrate synthase was measured in a reac-tion medium consisting of 100mM-Tris–HCl, 40mg 5,50-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)/ml, 1mM-oxaloacetate,0·3mM-acetyl CoA and Triton X 100 (40ml/l), pH 8·1.After 3min of incubation, the reaction was initiated byadding the supernatant fraction (20–50mg protein) or iso-lated mitochondria (9–11mg protein) and the change inoptical density at 412 nm was recorded for 3min.

The activity of succinate dehydrogenase was measuredby following the reduction of 2,6-dichlorophenolindophe-nol in the presence of phenazine methosulfate at600 nm. The supernatant fraction (20–50mg protein) waspreincubated in a buffer containing 50mM-KH2PO4,16mM-succinate, 1·5mM-KCN, 100mM-phenazine metho-sulfate, pH 7·5 for 5min. The reaction began by theaddition of 103mM-2,6-dichlorophenolindophenol and theoptical density was recorded for 3min.

The activity of complex I was determined by monitoringthe oxidation of NADH at 340 nm. The supernatant frac-tion (40–100mg protein) was preincubated for 3min in820ml distilled water. Following this, 10mM-KH2PO4,2mM-KCN, 5mg antimycin A/ml, 100mM-decylubiqui-none, 1·3mg bovine serum albumin/ml, 5mM-MgCl2, pH

J.-F. Dumas et al.970

7·5, were added. The reaction was initiated by the additionof 200mM-NADH and the change in the optical densitywas analysed for 3min. The NADH decylubiquinonereductase activity was also measured in the presence of12·7mM-rotenone. The specific activity of complex I rep-resented the difference between NADH oxidation activity,both with and without the rotenone.

The activity of complex III was determined by monitor-ing the reduction of cytochrome c at 550 nm. The super-natant fraction (20–50mg protein) was incubated for 30 sin a reaction medium consisting of 35mM-KH2PO4,5mM-MgCl2, 2·5mg bovine serum albumin/ml, 1·8mM-KCN, 125mM-oxidized cytochrome c, 12·5mM-rotenoneand 62·5mm-EDTA, pH 7·5. The reaction was initiatedby adding 80mM-decylubiquinol and the optical densitywas measured for 3min. The non-enzymatic reduction ofcytochrome c was measured under identical conditionsafter the addition of 10mg antimycin A/ml. The specificactivity of complex III was calculated by subtracting theactivity of the non-enzymatic reaction from that of thetotal activity of complex III.

The activity of complex IV was measured by monitoringthe oxidation of reduced cytochrome c at 550 nm. A 50mM

solution of reduced cytochrome c (92–97% reduced usingdithionite) in 10mM-KH2PO4, pH 7·0, was preincubatedfor 5min. The reaction was initiated by adding the super-natant fraction (20–50mg protein) and the change inoptical density was measured for 1·5min.

Mitochondrial isolations

Gastrocnemius muscle, in its entirety, and liver wereremoved,weighed and immediately placed in an ice-cold iso-lationmedium consisting of 250mM-sucrose, 1mM-ethyleneglycol-O,O0-bis(2-amino-ethyl)-N,N,N0,N0-tetraacetic acidand 10mM-Tris–HCl, pH 7·4.Muscle mitochondria (subsar-colemmal subpopulation) were isolated from gastrocnemiusvia an adaptation of the differential centrifugation procedure,as used previously by Roussel et al. (2000). All steps wereperformed at 48C.

The muscle (2·0–2·5 g) was cut with scissors, mincedusing a Polytron mincer (4–5 s; Kinematica, Cincinnati,OH, USA) in an isolation medium (20ml/g tissue) thenhomogenized using a Potter-Elvehjem homogenizer(seven strokes; Wheaton Science Products). The homogen-ate was centrifuged at 600 g for 10min. The resultingsupernatant fraction was filtered through cheesecloth andcentrifuged at 10 000 g for 10min. The pellet was resus-pended in the isolation medium and centrifuged at10 000 g for 10min. Finally, the pellet was resuspendedin a minimal volume of respiratory medium consisting of120mM-KCl, 5mM-KH2PO4, 3mM-4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid, 1mM-ethylene glycol-O,O0-bis(2-amino-ethyl)-N,N,N0,N0-tetraacetic acid, 2mM-MgCl2 and bovine serum albumin (3 g/l), pH 7·4. Livermitochondria were isolated by using a modification ofthe differential centrifugation procedure of Krahenbuhlet al. (1994). The liver (6–7 g) was cut with scissors andhomogenized using a Potter-Elvehjem homogenizer(seven strokes; Wheaton Science Products) in the isolationmedium (8ml/g tissue). The homogenate was centrifuged

at 600 g for 10min. The resulting supernatant fractionwas filtered through cheesecloth and centrifuged at 7000 gfor 10min. The pellet was resuspended in the isolationmedium (10ml/g tissue) and centrifuged at 3500 g for10min. The resulting pellet was resuspended in a minutevolume of respiratory medium.

Mitochondrial respiration

O2 was measured using a Clark O2 electrode (oxygraphHansatech, Cergy Pontoise, France) in a 2ml glass cellwith continuous stirring at a constant temperature of308C. Mitochondria (0·4–0·6mg protein/ml) were incu-bated in the respiratory reaction medium as described ear-lier and saturated with room air. Mitochondrial respirationwas conducted in two different experiments (one with glu-tamate, and the other for succinate and ascorbate–N,N,N0,N0-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)). Sub-strate concentrations from liver measurements were5mM-glutamate, 5mM-succinate and 5mM-ascorbate þ 0·5mM-TMPD. With regard to gastrocnemiusmeasurements, 5mM-pyruvate þ 5mM-malate, 5mM-suc-cinate and 2mM-ascorbate þ 0·5mM-TMPD were used.Inhibitor concentrations included 5mM-rotenone (to inhibitcomplex I of the respiratory chain) and 3mM-myxothiazole(to inhibit complex III). The active state of respiration(state 3) was initiated by the addition of ADP (150mM tothe liver mitochondria or 200mM to the gastrocnemiusmitochondria). The basal non-phosphorylating respirationrate (state 4) was obtained by the addition of 3mg oligomy-cin/ml. The respiratory control ratio was the ratio O2 con-sumed after the addition of ADP:O2 consumed in thepresence of oligomycin. The uncoupled state of respirationwas initiated by the addition of 2mM-carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone. The respiratory vari-ables measured in isolated mitochondria (state 3, state 4and the uncoupled state of respiration) were normalizedin relation to the specific activity of citrate synthase.Indeed, while the citrate synthase activity was not modifiedin the 600 g supernatant fraction, it was decreased in iso-lated liver mitochondria of DEX-treated rats. Moreover,we found a lower percentage of intact mitochondria in iso-lated liver mitochondria of DEX-treated rats (91 v. 96 and94% in CON and PF groups respectively). Therefore, forthe measurement of respiratory variables in isolated mito-chondria preparations, we used the specific citrate synthaseactivity as a mitochondrial marker enzyme. The ratios ofthe respiratory variables:citrate synthase may reflect achange originating from the mitochondria themselves,rather than from the homogenization.

Calculation of thermodynamic coupling and efficiency ofoxidative phosphorylation

Variables were calculated using the methodology of Cairnset al. (1998). The thermodynamic coupling of the energyconversion is designated by the dimensionless variableq, known as the degree of coupling of oxidative phos-phorylation:

q ¼ ð12 ðJsh=JuncÞÞ1=2;

Mitochondrial energetics in DEX-treated rats 971

where Jsh is the net O2 consumption of state 4-oligomycinrespiration in the presence of oligomycin that inhibits ATPsynthase and Junc is the uncoupled rate of O2 uptakeinduced by the addition of carbonyl cyanide p-trifluoro-methoxyphenlyhydrazone, which dissipates the transmito-chondrial proton gradient and as a result ATP productionbecomes nil.Kedem & Caplan (1965) have defined the efficiency of

the energy conversion for oxidative phosphorylation (h).Between state 4-oligomycin and state 3-uncoupledrespiration, which represent two steady states, an optimalthermodynamic efficiency of the energy conversion (hopt)can be discerned for any value of q (Stucki, 1980):

hopt ¼ tan2ða=2Þ;

where a ¼ arcsin q. Oxidative phosphorylation shouldoperate at a steady state for optimal efficiency for anygiven degree of coupling. In addition, q can represent sev-eral well–defined values depending on the energetic needsof the cell (Stucki, 1980). This theory is based on the ther-modynamic trade-off of reducing efficiency to produce themaximum phosphate potential or increasing the efficiencyto economize phosphate potential. Stucki (1980) hasdefined some physiological meanings for the degrees ofmitochondrial oxidative coupling. The specific thermody-namic degrees of coupling correspond to the followingset points with an unique maximal value of q:qecpð0·972Þ;which is the economic net output power (phosphate poten-tial) at optimal efficiency, q:qecfð0·953Þ; being the econ-omic net output flow (ATP), qp (0·910) the maximal netoutput power and qf (0·786) the maximal net output flowat optimal efficiency.In comparison with conventional measurements (respir-

atory control ratio, ATP/O2), non-equilibrium thermody-namics analysis provides a quantitative description and abetter estimation of stoichiometry and the efficiency ofenergy conversion.

Statistical analysis

Results were expressed as mean values and standard devi-ations. Mean values were compared by ANOVA using aFisher post hoc test. A P value ,0·05 was considered sig-nificant in all cases. All analyses were performed usingStatView, version 5.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

Results

DEX treatment induced a significant reduction in foodintake from day 2 (Fig. 1). Animals in the three groupsdid not differ in body weight at the beginning of the experi-mental procedure. Body weight decreased in DEX-treatedrats from day 1 and in PF animals from day 2 (Fig. 2).This decrease was significantly greater (P,0·01) in DEX-treated rats than in PF animals, corresponding to 16%(DEX-treated) and 9% (PF) of initial body mass on thefourth day of treatment. At the same time, CON ratsincreased their body mass by 3·2% (Fig. 2). The body-weight loss in relation to total food intake was higher inDEX-treated than in PF rats (þ57%) (Table 1).

The overnight fasting decreased body weight in the threegroups of rats (Table 1). Liver weight was increased inDEX-treated animals by 23% v. CON (P,0·01) and by59% v. PF (P,0·01) (Table 1). Conversely, food restric-tion significantly decreased liver mass (PF v. CON rats;P,0·01). This difference in liver mass was not related toa change in hydration, as the DEX treatment or the foodrestriction did not affect relative water contents (62·0 (SD3·0), 66·0 (SD 8·4) and 62·1 (SD 4·3) % per liver in DEX-treated, PF and CON rats respectively). In DEX-treatedrats, gastrocnemius mass was significantly decreased(P,0·01) in comparison with PF rats (219%) and CONanimals (219%) (Table 1). There was a significantincrease (P,0·01) in interscapular brown adipose tissuemass in the DEX-treated group (þ117% compared withPF and þ90% compared with CON; Table 1).

In the liver, complex I activity was significantly higher(P,0·01) in the DEX-treated group than in the PF group(þ120%), but it was not different in comparison to theCON group (Table 2). DEX treatment significantlydecreased (P,0·01) the specific activity of complex IV(228% compared with PF rats), although it was not differ-ent when compared with CON. There was no significantdifference in the specific activities of citrate synthase,

Fig. 1. Effect of dexamethasone treatment on food intake per dover the last 4 d of treatment. O, Control; V, dexamethasone-trea-ted. For details of procedures, see p. 970. Values are means withstandard deviations shown by vertical bars (eight rats per group).Mean values were significantly different from those of the controlgroup: ††P,0·01.

Fig. 2. Effect of dexamethasone treatment on body weight changesover the first 4 d of treatment in rats. O, Control; V, dexametha-sone-treated; B, pair-fed. For details of procedures, see p. 970.Values are means with standard deviations shown by vertical bars(eight rats per group). Mean values were significantly different fromthose of the pair-fed group: *P,0·05. Mean values were signifi-cantly different from those of the control group: ††P,0·01.

J.-F. Dumas et al.972

succinate dehydrogenase and complex III between theDEX-treated and other groups (Table 2).

In the gastrocnemius, none of the enzymatic activitieswas significantly affected by glucocorticoid treatment(complex I 85–111, complex IV 166–213, complex III363–409, succinate dehydrogenase 125–147 nmol/minper mg protein). There was no difference in the citratesynthase activity across the rat groups (538–602 nmol/min per mg protein).

In the isolated liver mitochondria, the specific citratesynthase activity was significantly lower (P,0·01) in theDEX-treated group than in the CON and PF groups(Table 3). Basal non-phosphorylative, phosphorylativeand uncoupled respiration rates, normalized by the specificcitrate synthase activity, are shown in Table 3. With succi-nate and TMPD–ascorbate used as substrates, state 4-oli-gomycin respiration was significantly increased (þ46%;P,0·05) in isolated liver mitochondria of DEX-treatedrats compared with other groups. In the glutamate-respiringmitochondria of the liver, DEX treatment significantlyincreased (þ33%; P,0·05) the state 4-oligomycin O2

consumption in comparison with PF rats, but not whencompared with CON rats. The respiratory variables in the

liver (state 3, state 4 and uncoupled state respiration)expressed per mg mitochondrial protein were similaracross groups regardless of the respiratory substrate used(results not shown).In the gastrocnemius, whatever the normalization of

results (per mg mitochondria protein or by the specificcitrate synthase activity), none of the respiratory variableswas affected by DEX treatment whatever the substrateused (state 3 and state 4-oligomycin respiration rateswere in relation to the specific activity synthase ((natonesof O2/nmol) £ 1023): pyruvate þ malate 84–121 and 7–10,succinate 106–137 and 29–40, ascorbate-TMPD 263–312and 178–207).In liver succinate-respiring mitochondria, q was signifi-

cantly decreased by DEX treatment (P,0·05). With gluta-mate, q was slightly (P¼0·12) lower in DEX-treated andPF than in CON rats (Table 4). Similar results wereobtained for the determined thermodynamic optimal effi-ciency of oxidative phosphorylation (hopt).In gastrocnemius, q (pyruvate þ malate 0·970, succinate

0·885, ascorbate–TMPD 0·745) and hopt (pyruvate þmalate 0·619, succinate 0·384, ascorbate–TMPD 0·619)were similar in the three groups of rats.

Table 1. Body weight and organ mass: liver, gastrocnemius muscle and interscapular brown adipose tissue in pair-fed (PF), control (CON)and dexamethasone (DEX)-treated rats‡

(Mean values and standard deviations for eight rats per group)

DEX-treated PF CONStatistical significanceof effect (ANOVA)Mean SD Mean SD Mean SD

Body weight (g)Initial 310 28 329 38 329 32 NSAt killing 242**†† 19 285 37 315 33 P¼0·0006

Liverg 13·38**†† 2·30 8·58† 1·12 10·84 1·47 P,0·0001g/kg body weight 54·9**†† 6·6 30·4 2·8 34·4 2·4 P,0·0001

Gastrocnemiusg 3·27**†† 0·21 4·04 0·50 4·25 0·27 P,0·0001g/kg body weight 13·6 0·7 14·1 0·6 13·6 0·9 NS

Brown adipose tissueg 0·76**†† 0·20 0·35 0·10 0·40 0·14 P,0·0001g/kg body weight 3·1**†† 0·8 1·2 0·4 1·2 0·4 P,0·0001

Body weight change/total intake (g/g) 20·88**†† 0·31 20·56† 0·27 0·09 0·08 P,0·0001

Mean values were significantly different from those of the PF group: **P,0·01.Mean values were significantly different from those of the CON group: ††P,0·01.‡ For details of procedures, see p. 970.

Table 2. Mitochondrial enzyme activities in liver 600g supernatant fractions from pair-fed (PF), control (CON) and dexamethasone(DEX)-treated rats‡

(Mean values and standard deviations for eight rats per group)

DEX-treated PF CONStatistical significanceof effect (ANOVA)Enzymatic activity (nmol/min per mg protein) Mean SD Mean SD Mean SD

Citrate synthase 151 27 158 23 152 26 NSSuccinate dehydrogenase 101 26 107 30 109 26 NSNADH-ubiquinone reductase (complex I) 44** 11 20†† 8 44 20 P,0·01Ubiquinol-cytochrome c reductase (complex III) 88 57 86 52 101 81 NSCytochrome c oxidase (complex IV) 91* 31 126 29 100 21 P,0·05

Mean values were significantly different from those of the PF group: *P,0·05, **P,0·01.Mean value was significantly different from that of the CON group: ††P,0·01.‡ For details of procedures, see p. 970.

Mitochondrial energetics in DEX-treated rats 973

Discussion

The present study shows that the induction of a catabolicstate by DEX results in an increased liver mass andincreased non-phosphorylative O2 consumption in livermitochondria. In addition, we found a decreased thermo-dynamic coupling and efficiency of oxidative phosphoryl-ation in the complex II respiratory pathway in the livermitochondria of DEX-treated rats. In contrast, there wasno change in gastrocnemius mitochondrial energymetabolism.Of particular interest is the finding that DEX treatment

significantly increased liver non-phosphorylative O2 con-sumption using succinate (þ46%) and ascorbate as sub-strates (þ46% v. CON and PF). With regard toglutamate, state 4-oligomycin respiration was not differentfrom that of CON, but it was higher (þ33%) in DEX-trea-ted relative to PF animals. Our present results agree withresults obtained from the long-term administration of

high-dose glucocorticoids, which are reported to decreaseliver oxidative phosphorylation (state 3 respiration) viacomplex I respiratory substrates, while remainingunchanged when fuelled through complex II or IV (Ker-ppola, 1960; Kimura & Rasmussen 1977; Jani et al.1991). Our present finding that state 4 respiration isincreased is therefore complementary to those studies,since it has never been studied in DEX-treated rats,although inconsistencies were shown in corticosterone-treated rats (Jani et al. 1991). Therefore, it appears thatthere is a specific catabolic state-related increase(þ42%) in the non-phosphorylative O2 consumption ofliver mitochondria. Indeed, state 4-oligomycin respirationwas increased in DEX-treated rats compared with CONrats, except in complex I (effect of food restriction and/or hypercatabolism), and consistent increases were foundwhen DEX-treated animals were compared with PFanimals (effect of hypercatabolism). On the other hand,food restriction appears to reduce state 4-oligomycin O2

Table 3. Respiratory variables and citrate synthase specific activity of liver isolated mitochondria from pair-fed (PF), control (CON) anddexamethasone (DEX)-treated rats‡

(Mean values and standard deviations for eight rats per group)

DEX-treated PF CON

Respiratory variables Variables Mean SD Mean SD Mean SD Statistical significant of effect (ANOVA)

First experiment (glutamate)Citrate synthase specific activity 264*† 45 311 37 374 41 P,0·01Glutamate State 3§ 114 51 71 28 110 44 NS

State 4§ 18* 3·5 13 2 15 3 P,0·05RCR 6·4 3·1 5·6 3·1 7·2 3·2 NSUncoupled state§ 95 55 64 28 118 57 NS

Second experiment (succinate and ascorbate–TMPD)Citrate synthase specific activity 306*† 11 359 46 358 36 P,0·05Succinate State 3§ 285 98 255 71 267 46 NS

State 4§ 70*† 22 46 4 50 7 P,0·05RCR 4·1 1·4 5·6 1·4 5·4 0·8 NSUncoupled state§ 354 93 331 82 341 67 NS

TMPD–ascorbate State 3§ 511 168 398 49 409 91 NSState 4§ 382*† 126 261 34 261 57 P,0·05RCR 1·3 0·1 1·5 0·2 1·6 0·1 NSUncoupled state§ 645 186 525 64 529 141 NS

RCR, respiratory control ratio; TMPD, N,N,N 0,N 0-tetramethyl-p-phenylenediamine.Mean values were significantly different from those of the PF group: *P,0·05.Mean values were significantly different from those of the CON group: †P,0·05.‡For details of procedures, see p. 970.§States 3 and 4 and uncoupled state respiration were expressed as (natom O2/nmol) £ 1023.

Table 4. Thermodynamic degree of coupling (q) and optimal efficiency (hopt) of the oxidative phosphorylation in liver isolated mitochondriafrom pair-fed (PF), control (CON) and dexamethasone (DEX)-treated rats‡

(Mean values and standard deviations for eight rats per group)

DEX-treated PF CON

Respiratory variables Variables Mean SD Mean SD Mean SD Statistical significance of effect (ANOVA)

Glutamate q 0·903 0·044 0·896 0·040 0·942 0·013 NShopt 0·413 0·092 0·396 0·080 0·500 0·039 NS

Succinate q 0·896*† 0·019 0·923 0·022 0·922 0·011 P,0·05hopt 0·387*† 0·038 0·451 0·052 0·439 0·028 P,0·05

Ascorbate–TMPD q 0·656**†† 0·028 0·708 0·024 0·706 0·028 P,0·005hopt 0·140**†† 0·016 0·173 0·016 0·173 0·018 P,0·005

Mean values were significantly different from those of the PF group: *P,0·05, **P,0·01.Mean values were significantly different from those of the CON group: †P,0·05, ††P,0·01.‡For details of procedures, see p. 970.

J.-F. Dumas et al.974

consumption (via complex I) in PF compared with CONrats. The PF group was chosen to discriminate betweenthe effect of a reduced food intake and the effect ofDEX itself on the variables measured, in spite of theeffect of undernutrition on the thyroid hormone axis thatcan in turn regulate thermogenesis (Dauncey, 1990).Indeed plasma triiodothyronine concentration, the mostmetabolically active thyroid hormone, appears to respondto food restriction more slowly than does thyroxineconcentration (Cassar-Malek et al. 2001). Moreover,Cassar-Malek et al. (2001) found that liver and muscletype I 50-deiodinase activity was not affected by foodrestriction. Consequently, it is unclear whether energyexpenditure would have been affected by food restrictionin relation to the thyroid hormone axis. Alternatively,DEX treatment has been found to inhibit or increase theconversion of thyroxine to triiodothyronine (Chopra et al.1975; Balsam & Ingbar, 1978; Kaplan & Utiger, 1978;Sato et al. 1984; Song & Oka, 2003).

Such a change under these non-phosphorylative con-ditions is not due to modifications in respiratory chaincomplex activities (Table 2), but it could be explained byan increased basal proton conductance (Roussel et al.2003). Nevertheless, the results reported by Roussel et al.(2003) could also be explained by a change in the intrinsiccoupling of the respiratory chain (Hþ/2e2). Therefore, wecannot completely rule out the possibility that DEX mayaffect the efficiency of the respiratory chain activity. Inthis case, we can speculate an effect on cytochromeoxidase, as state 4-oligomycin respiration was increasedby using ascorbate–TMPD as substrate. Moreover, it hasbeen demonstrated that cytochrome oxidase Hþ/2e2

stoichiometry is variable and represents a possible locationfor intrinsic uncoupling at the level of the respiratory chain(Capitanio et al. 1991; Papa et al. 1991). However, furtherexperiments are necessary to confirm such possibilities:whatever the mechanism involved, proton leak and redoxslipping would both represent a substantial increase instate 4 energy wastage and would in turn decrease the oxi-dative phosphorylation yield. This is further highlighted bythe decreased value of the thermodynamic coupling ofoxidative phosphorylation reported in Table 4. Accordingto Stucki (1980), values observed (Table 4) thereforesuggest that in DEX-treated rats, liver mitochondria adapttheir function for maximum ATP production and also tomaintain cellular phosphate potential at the expense ofthe energy conversion efficiency. Interesting adaptivereductions in the efficiency of oxidative phosphorylationhave already been noted by Nogueira et al. (2001), whoshowed that cellular respiratory rate increases in livermitochondria of hyperthyroid rats or rats fed on a poly-unsatured fatty acid-deficient diet.

Our present study demonstrated that a DEX-inducedhypercatabolic state has no effect on mitochondrialenergy metabolism in the gastrocnemius muscle. Indeed,none of the respiratory complex activities, O2 consumptionrates or the thermodynamic degree of coupling of oxidativephosphorylation were altered in the mitochondria ofDEX-treated rats. The experiment was conducted in thegastrocnemius subsarcolemmal mitochondria, whichexhibit different biochemical and functional features than

intermyofibrillar mitochondria. However, in a recentstudy, Roussel et al. (2003) found no difference inproton conductance in DEX-treated rats whatever the mito-chondrial subpopulation used. The present results regard-ing the gastrocnemius are in agreement with previouslyreported effects of glucocorticoid treatment in othermuscles (Vignos & Greene, 1973; Capaccio et al. 1985;Marone et al. 1994), but differ from the observations ofWeber et al. (2002), who found DEX treatment (6mg/kgper d) increased cytochrome c oxidase activity levels inquadriceps. This might be due to the lower dose of DEXused in our present study. Collectively, these resultssuggest that the mitochondrial metabolism of skeletalmuscle produces enough ATP to fulfil either the cellularenergy requirement and/or the energy-dependentpathways induced by glucocorticoids: these include theenergy-ubiquitin-dependent proteolytic pathway (Tiaoet al. 1996; Mitch et al. 1999) and the energy-dependentglutamine synthase activity pathway (Max et al. 1988;Minet-Quinard et al. 1999, 2000).The main thermogenic tissue in rats is brown adipose

tissue, the weight of which is largely increased (þ100%,present study) by glucocorticoid injection. Previous studieshave clearly demonstrated that such an increase in thebrown adipose tissue mass was due to increased lipid storagerather than an increased thermogenic capacity of this tissue(Mazzuccheli et al. 1960; Strack et al. 1995). Furthermore,glucocorticoids are known to reduce both the activity andthe gene expression of uncoupling protein 1 (Tokuyama &Himms-Hagen, 1989; Moriscot et al. 1993; Strack et al.1995). Moreover, in our study we found no effect of DEXon mitochondrial oxidative capacity (cytochrome c oxidaseactivity; results not shown). Therefore, it is unlikely thatinterscapular brown adipose tissue increases energy expen-diture in DEX-treated rats.A reduction in body size (16% weight loss in the present

study) generally results in the lowering of energy expendi-ture per whole rat, because of the reduced maintenancerequirement (Ramsey et al. 2000). In the present study,the DEX-related decrease in body weight was greaterthan that observed in the PF rats, highlighting an increasein whole-body energy expenditure. This is paradoxical inview of the reducing effect of food restriction on energyexpenditure (Ramsey et al. 2000). Furthermore, in ourpresent study, DEX treatment increased the ratio liverweight:body weight, while the relative skeletal musclemass remained unchanged. Such an increase in livermass could have resulted from an increase in glycogencontent (Weber & Kletzien, 1982; Michaels & Cardell,1997; Bollen et al. 1998). Alternatively, hepatic lipid con-tent is increased in DEX-treated rats, but the increase isinsufficient to fully explain an increase in liver mass(Kaur et al. 1989; Palacios et al. 1995; Franco-Colinet al. 2000). Finally, DEX treatment increases liver proteinsynthesis and therefore metabolic tissue (Odedra et al.1983; Savary et al. 2001). Since liver contributes 20% tothe metabolic rate in the rat (Rolfe & Brown, 1997), it islikely that the liver would effectively contribute to the10–20% increase in glucocorticoid-related energy expen-diture seen in human subjects and rats (Woodward &Emery, 1989; Brillon et al. 1995; Tataranni et al. 1996)

Mitochondrial energetics in DEX-treated rats 975

despite the body-weight loss (Table 1). Obviously, wecannot rule out the influence of other biochemical mechan-isms or possible determinants of energy balance, whichmay also have accounted for the weight loss.In conclusion, 5 d of high-dose DEX treatment induced a

significant increase in liver mass, an increase in liver mito-chondrial non-phosphorylative O2 consumption rate fromall substrates used and a decrease in the thermodynamiccoupling of oxidative phosphorylation in liver respiratorypathways. We suggest, therefore, that a DEX-inducedproton leak and/or redox slipping in liver mitochondria isprobably responsible for the decrease in the thermodyn-amic efficiency of energy conversion. Thus, in turn, ratscould adapt their mitochondrial energy functions to aDEX-induced hypermetabolic state by maximizing ATPproduction in addition to maintaining their cellularenergy state, regardless of the cost. This treatment has noeffect on energy metabolism in the gastrocnemiusmuscle. Together with a decreased food intake, theincrease in energy expenditure induced by high-doseDEX results in a negative energy balance and thus inweight loss.

Acknowledgements

The authors thank Pierre Legras, Jerome Roux andDominique Gilbert for animal care, Antoine Augeraudfor technical assistance and Miriam Ryan for her assistancein correcting the English. This work was supported bygrants from Contrat de Plan Etat Region 2002–2004.

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Mitochondrial energetics in DEX-treated rats 977

ARTICLE 4

Dexamethasone treatment specifically increases the basal proton conductance of rat

liver mitochondria.

Roussel D, Dumas JF, Augeraud A, Douay O, Foussard F, Malthièry Y, Simard G, Ritz P.

FEBS Lett. 2003 Apr 24;541(1-3):75-9.

102

Dexamethasone treatment speci¢cally increases the basal proton

conductance of rat liver mitochondria

Damien Roussel, Jean-Franc�ois Dumas, Antoine Augeraud, Olivier Douay,Franc�oise Foussard, Yves Malthie¤ry, Gilles Simard, Patrick Ritz�

Laboratoire de biochimie et de biologie mole¤culaire, INSERM EMI-U 00.18, 4 rue Larrey, F-49033 Angers Cedex, France

Received 19 February 2003; accepted 28 February 2003

First published online 1 April 2003

Edited by Stuart Ferguson

Abstract We investigated the role that mitochondrial protonleak may play in the glucocorticoid-induced hypermetabolicstate. Sprague^Dawley rats were injected with dexamethasoneover a period of 5 days. Liver mitochondria and gastrocnemiussubsarcolemmal and intermyo¢brillar mitochondria were iso-lated from dexamethasone-treated, pair-fed and control rats.Respiration and membrane potential were measured simulta-neously using electrodes sensitive to oxygen and to the poten-tial-dependent probe triphenylmethylphosphonium, respectively.Five days of dexamethasone injection resulted in a marked in-crease in the basal proton conductance of liver mitochondria,but not in the muscle mitochondrial populations. This e¡ectwould have a modest impact on energy expenditure in rats.( 2003 Federation of European Biochemical Societies. Pub-lished by Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Key words: Glucocorticoid; Mitochondrion;Membrane potential ; Liver; Skeletal muscle

1. Introduction

The development of the hypermetabolic state that is ob-

served following traumatic injury, sepsis or during surgical

stress may arise from increased plasma glucocorticoid hor-

mone levels [1]. This state is characterized by increased resting

energy expenditure, accelerated net protein breakdown, a neg-

ative nitrogen balance, increased gluconeogenesis, hyperglyce-

mia and insulin resistance [2]. Although the mechanisms in-

volved are incompletely understood, it is likely that several

cellular energy-demanding processes are responsible for the

raised resting energy expenditure. Indeed, glucocorticoids

have been well characterized to stimulate energy-demanding

pathways such as gluconeogenesis in the liver and kidney [3,4],

energy-ubiquitin-dependent muscle proteolysis [5,6] and en-

ergy-dependent glutamine synthetase activity in skeletal

muscle [7,8]. Collectively, these energy-dependent pathways

are likely to enhance ATP turnover in organs such as liver,

kidney and skeletal muscle, which would in turn contribute to

an increased whole body energy expenditure. However, not all

of the mammalian oxygen consumption is coupled to mito-

chondrial ATP synthesis, and the best estimates from all avail-

able data suggest that 20% of resting metabolic rate is due to

futile proton cycling across the the inner mitochondrial mem-

brane via endogenous proton conductance pathways [9].

These ‘proton leak’ reactions have been shown to account

for a high proportion of cellular resting metabolic rates in

hepatocytes (25% [10]) and in skeletal muscle (52% [11]),

two organs which together contribute nearly half of the oxy-

gen consumption of an adult rat. The early investigation of

Buttgereit et al. [12] on isolated rat thymocytes is the only

study which has provided evidence that glucocorticoids could

increase the rate of mitochondrial proton leak within cells.

However, the e¡ect of chronic infusion of glucocorticoids on

mitochondrial proton leak kinetics has not been addressed so

far.

In light of these observations, we wondered whether treat-

ment with dexamethasone a¡ects the cellular energy expendi-

ture of these organs, focusing on the mitochondrial proton

leak, which is the largest single contributor to cellular meta-

bolic rate in rats [9]. In the present study the e¡ect of dexa-

methasone administered to rats over 5 days on mitochondrial

proton leak kinetics was investigated in mitochondria isolated

from the liver and gastrocnemius muscle. One feature of skel-

etal muscle is that two mitochondrial populations (subsarco-

lemmal and intermyo¢brillar mitochondria) have been de¢ned

which di¡er in terms of their location, function, and response

to physiological stimuli [13^17]. Therefore, we also evaluated

the e¡ect of dexamethasone on the kinetics of proton leak of

these two mitochondrial populations isolated from rat gas-

trocnemius muscle.

2. Materials and methods

2.1. Animals and experimental designThe present investigation was performed in accordance with the

guiding principles in the care and use of animals. Male Sprague^Dawley rats were caged individually in a temperature-controlledroom (22‡C) with a dark/light cycle of 12:12 h. They were maintainedon a standard rat chow diet consisting of 16% protein, 3% fat, 60%carbohydrate, and 21% water, ¢ber, vitamins, and minerals (A04,UAR, Ifacredo, L’Arbresle, France) and were allowed to drink waterad libitum. Dexamethasone-treated rats were injected intraperito-neally once daily with dexamethasone (1.5 mg/kg body weight) for5 days and were allowed to feed ad libitum. The dexamethasone dose(1.5 mg/kg/day) and the duration of treatment (5 days) were speci¢-cally chosen as this treatment induced a reproducible and markedcatabolic state [8]. Control rats received no treatment and were fedad libitum. In order to take into account the decrease in food intakeinduced by dexamethasone treatment, a third group of pair-fed ratswere used. These rats were provided with the same amount of food asdexamethasone-injected rats and were treated with a daily isovolumic

0014-5793 / 03 / $22.00 L 2003 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier Science B.V. All rights reserved.

doi:10.1016/S0014-5793(03)00307-7

*Corresponding author. Fax: (33)-2-41 35 49 69.E-mail address: paritz@chu-angers.fr (P. Ritz).

Abbreviations: IFM, intermyo¢brillar mitochondria; SSM, subsarco-lemmal mitochondria; TPMP, triphenylmethylphosphonium

FEBS 27151 FEBS Letters 541 (2003) 75^79

intraperitoneal injection of NaCl (0.9%) for 5 days. After the ¢nalinjection of dexamethasone or NaCl, the animals were fasted over-night prior to being killed by decapitation.

2.2. Isolation of liver and skeletal muscle mitochondriaThe liver and the gastrocnemius muscle were immediately dissected,

weighed and placed in ice-cold isolation medium containing 100 mMsucrose, 50 mM KCl, 50 mM Tris^HCl, 5 mM EGTA, pH 7.4. Gas-trocnemius muscle was chosen as this mixed ¢ber muscle is suitablyrepresentative of the composition of all skeletal muscle ¢ber typesfound in the adult Sprague^Dawley rat hindlimb [18]. Liver mitochon-dria and gastrocnemius muscle intermyo¢brillar (IFM) and subsarco-lemmal (SSM) mitochondria were isolated from two rats, the prepa-rations of which are described by Krahenbuhl et al. [19] and Rousselet al. [17] respectively, with all steps carried out at 4‡C. Liver andmuscles were chopped ¢nely with sharp scissors and homogenizedwith a Potter-Elvehjem homogenizer (¢ve passages).The liver homogenate was centrifuged at 600Ug for 10 min, and the

resulting supernatant was then ¢ltered through cheesecloth and cen-trifuged at 7000Ug for 10 min. The pellet was resuspended in isola-tion medium and centrifuged at 3500Ug for 10 min, and resuspendedin a minimal volume of isolation medium.The muscle homogenate was centrifuged at 600Ug for 10 min. The

supernatant containing the SSM was centrifuged at 1000Ug for 10min. The pellet containing the IFM was resuspended in 40 ml ofisolation medium and then treated with nagarse (1 mg/g muscle wetweight) for 5 min in an ice bath. The mixture was diluted 1:2, ho-mogenized and then centrifuged at 1000Ug for 10 min. The IFM andSSM supernatants were ¢ltered through cheesecloth and centrifugedat 10 000Ug for 10 min. IFM and SSM pellets were resuspended inisolation medium and centrifuged at 10 000Ug for 10 min, and resus-pended in the isolation medium. Protein concentration was deter-mined using the bicinchoninic acid assay kit (Interchim, Montluc�on,France) with bovine serum albumin as standard.Mitochondrial integrity was evaluated using fresh mitochondria by

measuring citrate synthase activity in the presence and absence ofdetergent, following the method of Malgat et al. [20].

2.3. Measurement of proton conductanceRespiration rate and membrane potential were measured simulta-

neously using electrodes sensitive to oxygen and to the potential-de-pendent probe triphenylmethylphosphonium (TPMPþ). Liver mito-chondria (1 mg of protein/ml), IFM and SSM (0.5 mg of protein/ml) were suspended in assay medium containing 120 mM KCl,5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 0.3% bovine serumalbumin (w/v) and 3 mM HEPES, pH 7.4, and supplemented with5 WM rotenone, 1 Wg/ml oligomycin, and 80 ng/ml nigericin. TheTPMP electrode was calibrated by sequential 1 WM additions up to4 WM TPMPþ, then 4 mM succinate was added to start the reaction.Respiration and membrane potential were progressively inhibitedthrough successive steady states induced by additions of malonate.After each run, 2 WM carbonyl cyanide-p-tri£uoromethoxyphenylhy-drazone was added to dissipate the membrane potential and release allTPMP back into the medium for baseline correction. Membrane po-tentials were calculated as previously described by Brand [21], assum-ing a TPMP binding correction of 0.42 (Wl/mg protein)31 for liver

mitochondria and 0.35 (Wl/mg protein)31 for skeletal muscle mito-chondria [22]. For the interpretation of our results, we will assumethat there was no redox slip in the mitochondrial electron transportchain under any of the experimental conditions that we have exam-ined, keeping in mind that if a slip in the proton pumps did occur,then our results remain valid but their underlying mechanism mightcontain an element due to slip.

2.4. Statistical analysisValues are presented as meansSS.E.M. The statistical signi¢cance

of observed variations were assessed using one-way analysis of var-iance. Di¡erences between means were subsequently tested bySche¡e¤’s F-test. Statistical signi¢cance was recognized at P6 0.05.

3. Results

3.1. Body weight, food intake and tissue mass (Table 1)

Rats treated with dexamethasone consumed less food and

weighed less than control rats. Treated rats also weighed less

than pair-fed animals though their food intake was similar.

Five days of dexamethasone injection resulted in a signi¢cant

increase in both the liver mass (+42%) and the liver to body

weight ratio (+65%). The wet weight of gastrocnemius muscle

decreased 20% after 5 days of treatment, but it remained un-

a¡ected relative to body weight (g/100 g body weight), indi-

cating that muscle weight loss paralleled body weight loss

(Table 1).

3.2. Proton leak kinetics

Fig. 1 shows the dependence of proton leak rate on mito-

chondrial membrane potential for liver and gastrocnemius

muscle mitochondrial preparations from dexamethasone-

treated, pair-fed and control rats. Liver mitochondria from

dexamethasone-treated rats displayed a higher rate of proton

leak than control and pair-fed mitochondria at any membrane

potential greater than 150 mV approximately (Fig. 1A). The

basal proton conductance of liver mitochondria calculated at

177 mV, the highest common membrane potential, was sig-

ni¢cantly increased by 40 and 37% in dexamethasone-treated

rats (124S 3 nmol Hþ/min/mg protein/mV) as compared with

control (89S 3 nmol Hþ/min/mg protein/mV) and pair-fed

(91S 8 nmol Hþ/min/mg protein/mV) animals, respectively.

To assess whether the aforementioned di¡erences were due

to damage in dexamethasone liver mitochondria, the percent-

age of broken mitochondria from each experimental group

was evaluated using fresh mitochondria. From the ratio of

the citrate synthase activities with or without Triton

(Table 2), we calculated that there was 3^4% more damage

Table 1E¡ect of dexamethasone administration on body weight, food intake, liver and gastrocnemius masses

Control Pair-fed Dexamethasone

Body weight g 356S 12 337S 8 295S7*2

Food intake g/day 39.4S 1.5 28.1S 1.4* 29.0S 1.4*g/100 g/day 10.6S 0.2 7.7 S 0.4* 8.3S 0.3*

Liver mass g 10.4S 0.4 9.4 S 0.2* 14.0S 0.5*2

g/100 g 2.93S 0.06 2.80S 0.03 4.74S0.12*2

Gastrocnemius mass g 4.1 S 0.1 3.9 S 0.1 3.2S 0.1*2

g/100 g 1.14S 0.02 1.15S 0.02 1.10S0.02

Rats were injected with dexamethasone i.p. (for 5 days) at a dose of 1.5 mg/kg/day. Control rats were fed ad libitum and received no treat-ment. Pair-fed rats were provided with the same amount of food as dexamethasone-injected rats and were given an equal volume of saline. Re-sults are the meanSS.E.M. of 12 rats. Symbols indicate signi¢cant di¡erences (P6 0.05) as follows: *di¡erence from control group; 2di¡erencefrom pair-fed group.

D. Roussel et al./FEBS Letters 541 (2003) 75^7976

to the mitochondria in the dexamethasone group than in the

two control groups. We concluded that this slight di¡erence in

mitochondrial breakage cannot be responsible for the large

di¡erences in proton conductance described herein.

Contrary to liver, IFM isolated from dexamethasone gas-

trocnemius muscle had proton leak kinetics that may have

di¡ered from control mitochondria (Fig. 1B), whereas none

of the SSM proton leak kinetics were distinguishable between

the experimental groups (Fig. 1C). Table 3 shows the proton

conductance calculated in each experimental condition at 162

mV, the highest common membrane potential in all of the

mitochondrial preparations. In control rats, muscle mitochon-

dria exhibited a basal proton conductance four times greater

than that of liver mitochondria, with no di¡erence observed

between IFM and SSM populations. In the liver, the e¡ect of

dexamethasone on the basal proton conductance was less pro-

nounced (+30%) at 162 mV, but it is still considered statisti-

cally signi¢cant. In the muscle, there was a tendency for pro-

ton conductance to decrease following dexamethasone

treatment in IFM (P=0.095 vs. control group), whereas it

remained unchanged in SSM. Interestingly, as a result of

this non-signi¢cant decrease in IFM proton conductance,

SSM proton conductance became signi¢cantly higher than

that of IFM within the dexamethasone group.

4. Discussion

The observation that dexamethasone decreases food intake

is in line with the previously reported anorexic e¡ect of glu-

cocorticoid infusion in rats [8,23]. As far as our experimental

design is concerned, it has been found that a daily injection of

dexamethasone at 1.50 mg/kg body weight induced a transi-

tory anorexia in adult rat from day 2 to day 6, with food

intake returning to the pre-treatment values by day 7 [8].

The fact that dexamethasone-treated animals had the same

average food intake (g/day or g/100 g body weight/day) as

pair-fed animals but weighed less (Table 1) clearly indicates

that a negative energy balance was more pronounced in rats

given glucocorticoid. Since chronic injection of dexametha-

sone upregulates intestinal nutrient transport [24], it is sug-

gested that the whole body energy expenditure of the dexa-

methasone-injected rats was increased. Although we did not

measure energy expenditure, there is evidence that the admin-

istration of glucocorticoids is indeed associated with an in-

crease in resting energy expenditure in rats [23,25], as well

as in humans [26,27]. Considering the various organs that

contribute to oxygen consumption in the adult rat, liver and

skeletal muscle contribute a much larger fraction of the total

resting metabolic rate than others. Therefore, although liver

mass represents less than 5% of body weight, its metabolic

activity has been estimated to account for 20% of energy ex-

penditure in the rat. In contrast, skeletal muscles do make a

signi¢cant 30% contribution by virtue of their size, even

though their speci¢c metabolic rate is relatively low during

resting metabolism. Five days of dexamethasone injections

resulted in a signi¢cant 65% increase in the liver to body

weight ratio, and no alteration in the gastrocnemius to body

weight ratio. Such e¡ects of glucocorticoids on these organs

are consistent with previously published data [8,28,29]. Ac-

A

0

20

40

60

80

100

120

140

B

0

50

100

150

200

250

300

350

400

C

0

50

100

150

200

250

300

50 70 90 110 130 150 170 190

Pro

ton

le

ak

ra

te (

nm

ol H

+/m

in.m

g p

rote

in)

Membrane potential (mV)

Fig. 1. Kinetics of proton leak of liver and skeletal muscle mito-chondria from dexamethasone-treated (¢lled symbols), pair-fed (graysymbols) and control rats (open symbols). A: Liver mitochondria.B: IFM. C: SSM. Values are meansSS.E.M. of ¢ve to six di¡erentmitochondrial preparations.

Table 2Citrate synthase activity of liver mitochondria measured in the absence (intact) and presence (broken) of Triton

Control Pair-fed Dexamethasone

Intact 0.027S 0.004 0.020S 0.002 0.030S 0.008Broken 0.511S 0.037 0.460S 0.026 0.357S 0.034*2

Breakage (%) 5.7 S 1.1 4.2S 0.2 8.6S 1.9

Citrate synthase activity is expressed in U/mg protein. Values are meanSS.E.M. of seven di¡erent mitochondrial preparations in each group.Symbols indicate signi¢cant di¡erences (P6 0.05) as follows: *di¡erence from control group; 2di¡erence from pair-fed group.

D. Roussel et al./FEBS Letters 541 (2003) 75^79 77

cording to the relative tissue contributions to the standard

metabolic rate as given above, the liver weight gain elicited

by the chronic injection of dexamethasone will therefore result

in up to a 13% increase in whole body energy expenditure in

treated rats as compared with control animals of the same

body weight.

The contribution of cellular energy processes to the stan-

dard metabolic rate can be quanti¢ed in terms of coupling to

ATP turnover or uncoupling. On the one hand, chronic in-

jection of glucocorticoid hormones has been well character-

ized to induce several ATP-demanding pathways, such as the

ubiquitin-proteasome proteolysis [5,6] and glutamine synthesis

[7,8] in skeletal muscles, and gluconeogenesis in the liver and

kidney [3,4], which may play an important role in increasing

whole body energy expenditure. On the other hand, the mi-

tochondrial proton leak is an important contributor to skel-

etal muscle and liver metabolic rates, even under conditions in

which ATP-consuming pathways have been stimulated [30].

Therefore, it is worth asking whether mitochondrial proton

leak may play a role in the hypermetabolic state that is seen

with increased levels of circulating glucocorticoid hormones.

On the whole, it appears that dexamethasone treatment spe-

ci¢cally a¡ects liver mitochondrial proton conductance, which

was increased by 30^40% in the present study. If we assume

that the energy consumed by proton leak represents approx-

imately 22% of the energy budget of stimulated liver cells

[30], and given the value of the contribution of the liver to

the standard metabolic rate in rats given dexamethasone

(V33%), we can thus estimate that dexamethasone-enhanced

mitochondrial proton leak in this organ can induce up to a

3% increase in whole body energy expenditure in treated ani-

mals. This stimulation of proton leak rate by dexamethasone

could in turn account for approximately 15% of the aug-

mented whole body oxygen consumption of rats given gluco-

corticoids [23,25]. Finally, it must be stressed that glucocorti-

coids have been previously shown to enhance mitochondrial

proton conductance in thymocytes [12]. With this in mind, we

cannot completely disregard the fact that other organs such as

the gastrointestinal tract, kidney or brain, which have similar

mitochondrial proton leak characteristics to those found in

liver mitochondria [22], could also be a¡ected by glucocorti-

coids. Although the e¡ect of glucocorticoid treatment on the

kinetics of mitochondrial proton leak of those organs is cur-

rently not known, this hypothesis deserves further attention.

In conclusion, although dexamethasone treatment speci¢-

cally increased the rate of proton leak in liver mitochondria

by 40%, this energy-consuming mechanism would only have a

modest impact on whole body energy expenditure in the rat.

Our results therefore suggest that a glucocorticoid-induced

hypermetabolic state would be mainly achieved by increasing

the rates of several cellular ATP-demanding processes in con-

cert. However, it is likely that the substantial increase in the

rate of proton leak in liver mitochondria following glucocor-

ticoid injection might serve other functions in this organ, such

as a reduction in harmful free radical production [31], control

of the e¡ective P/O ratio of oxidative phosphorylation [32] or

regulation of carbon £uxes by keeping the mitochondrial

NADþ/NADH ratio su⁄ciently high to allow the £ow of

carbon to continue [33]. In light of the above results, the latter

hypothesis is of particular interest. Indeed, there is evidence to

suggest that glucocorticoids did cause the liver mitochondrial

NADþ/NADH redox couple to rise [34,35]. Therefore, it is

tempting to propose that the observed increase in the rate of

proton leak in liver mitochondria could be responsible for the

more oxidized mitochondrial redox state seen with glucocorti-

coids. However, this hypothesis needs further experimental

testing in order to be clearly demonstrated.

Acknowledgements: This work and D.R. were supported by a grantfrom ‘contrat de re¤gion Pays de Loire et Bretagne’. The authors aregrateful to Ms. Myriam Ryan for reviewing the English manuscript.The authors thank Pierre Legras, Je¤ro“me Roux and Dominique Gil-bert for animal care.

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Table 3E¡ect of dexamethasone administration on proton conductance ofliver and gastrocnemius mitochondrial populations

Mitochondria Control Pair-fed Dexamethasone

Liver 0.36S 0.02 0.38S 0.03 0.47S 0.05*IFM 1.36S 0.23 1.17S 0.18 0.93S 0.08SSM 1.51S 0.13 1.33S 0.08 1.46S 0.07V

Values are meanSS.E.M. of ¢ve to six di¡erent mitochondrial prep-arations. IFM and SSM were isolated from gastrocnemius muscleas described in Section 2. Proton conductance was measured at 162mV and is expressed in nmol Hþ/min/mg protein/mV. Symbols indi-cate signi¢cant di¡erences (P6 0.05) as follows: *di¡erence fromcontrol group; Vdi¡erence from IFM.

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D. Roussel et al./FEBS Letters 541 (2003) 75^79 79

ARTICLE 5

Impaired muscle energetics in dexamethasone-induced insulin resistance model, studied

by 31

P NMR, in rats.

Dumas JF, Bielicki G, Renou JP, Roussel D, Ducluzeau PH, Malthièry Y, Simard G, Ritz P.

Sous presse dans Diabetologia.

108

Dexamethasone impairs muscle energetics, studied by 31

P NMR, in rats.

J-F. Dumas1, G. Bielicki

2, J-P. Renou

2, D. Roussel

1, P-H. Ducluzeau

1, Y. Malthièry

1, G.

Simard1, P. Ritz

1

1Inserm EMI-U 00.18, Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, CHU, 4 rue

Larrey, 49033 Angers Cedex, France

²Inra-Stim, Site de Theix, 63122 Saint-Genès-Champanelle, France

Corresponding author:

Pr P. Ritz, Medicine B-CHU, 4 rue Larrey, 49033 ANGERS Cedex, France.

Tel ++ 33 241 354 499

Fax ++ 33 241 35 969

paritz@chu-angers.fr

Short title: J-F Dumas et al.: Muscle energetics and glucocorticoids

Word count: 4090 words

109

Abstract

Aims/hypothesis. Glucocorticoid treatments are associated with increased whole-body oxygen

consumption. We hypothesised that an impairment of muscle energy metabolism can

participate in this increased energy expenditure.

Methods. To investigate this possibility, we have studied muscle energetics of

dexamethasone-treated rats (1.5 mg.kg-1

.d-1

for 6 days), in vivo by 31

P NMR spectroscopy.

Results were compared with control and paired-fed (PF) rats before and after overnight

fasting.

Results. Dexamethasone treatment resulted in decreased phosphocreatine (PCr) concentration

and PCr:ATP ratio, increased ADP concentration and higher PCr to γ-ATP flux but no change

in β-ATP to β-ADP flux in gastrocnemius muscle. Neither 4 days of food restriction (PF rats)

nor 24-hours fasting affected high-energy phosphate metabolism. In dexamethasone-treated

rat, there was an increase in plasma insulin and non-esterified fatty acid concentration.

Conclusion/interpretation. We conclude that dexamethasone treatment altered resting in vivo

skeletal muscle energy metabolism, by decreasing oxidative phosphorylation, producing ATP

at the expense of PCr.

Keywords: ATP, food restriction, glucocorticoid, oxidative phosphorylation, phosphocreatine

Abbreviations: β-OHB, β-hydroxybutyrate; CON, control; DEX, dexamethasone; GCTC,

glucocorticoid; NEFA, non-esterified fatty acid; NMR, nuclear magnetic resonance; PF, pair-

fed; PCr, phosphocreatine

110

Type 2 diabetes mellitus is a chronic metabolic disorder characterised by insulin resistance,

hyperglycaemia, hyperinsulinaemia and elevated non-esterified fatty acids (NEFA). Energy

metabolism is altered in Type 2 diabetes mellitus. In the diabetic heart, glucose and lactate

oxidation are decreased while fatty acid oxidation is increased, raising the oxygen

requirement per ATP molecule produced [1]. 31

P nuclear magnetic resonance spectroscopy

(NMR) studies performed in Type 2 diabetic patients, whose cardiac morphology, mass and

function appeared to be normal, showed significantly lower phosphocreatine (PCr):ATP ratios

(as compared to normal subjects). The cardiac PCr:ATP ratio negatively correlated with

fasting plasma NEFA concentrations [2]. Furthermore, patients with Type 2 diabetes mellitus

have limited exercise tolerance which is associated with significantly faster muscle PCr loss

and pH decrease during exercise, while PCr recovery after exercise is slower [2].

Insulin stimulates oxidative phosphorylation capacity [3] while insulin resistance appears to

inhibit respiration and decrease the efficiency of ATP production. Indeed, non-alcoholic

steatohepatitis elicits mitochondrial dysfunction leading to a reduction of 30–60 % in the

activities of the 5 respiratory chain complexes in the liver. Activities of these complexes

thereby negatively correlate with HOMA, an indicator of insulin-sensitivity [4]. Furthermore,

Petersen et al [5] have shown an increased fat accumulation in the muscle and liver of healthy

elderly subjects which is associated with a 40 % reduction in mitochondrial oxidative and

phosphorylative activity. These authors suggest that an age-associated decline in

mitochondrial function contributes to insulin resistance in the elderly [5].

Increased glucocorticoid (GCTC) plasma concentration induces an insulin resistant state,

which affects energy metabolism. GCTC-induced insulin resistance results in decreased

insulin-stimulated glucose uptake in muscle [6], and increased plasma concentrations of

NEFA, insulin and leptin [7, 8], with troglitazone antagonising this effect [7]. At the whole

body level, increased GCTC concentrations are known to increase oxygen consumption [9,

10, 11], and decrease food intake [12, 13] resulting in a more negative energy balance than in

pair-fed animals. We have shown that there is a decreased efficiency of oxidative

phosphorylation in the liver mitochondria of dexamethasone treated rats [13]. We failed to

show similar abnormalities in vitro within skeletal muscle mitochondria. GCTC secretion is

increased and plays a pivotal role in metabolic adaptation to stress [14, 15]. 31

P NMR studies

performed in septic rats (which display corticosterone concentrations 2-fold greater than

controls) show that PCr breakdown rates and Na-K ATPase activities were higher than those

of control animals. These changes were antagonised by mifepristone, a GCTC receptor

antagonist [15].

111

Therefore, in all these insulin resistant states, there are arguments to suggest that muscle

energy metabolism is impaired. We hypothetise that in dexamethasone (DEX)-treated rats, in

vivo skeletal muscle energy metabolism is directed toward the production of ATP from PCr

because of a relative failure of mitochondrial oxidative phosphorylation. Muscle energetics of

DEX-treated rats were therefore studied using 31

P NMR both under fasting and fed

conditions.

Materials and Methods

Animals. The present investigation was performed in accordance with the French guiding

principles in the care and use of animals. Eighty male Sprague-Dawley rats (10 weeks old;

300-350g) were supplied by IFFA CREDO (L'Arbresle, France). After arrival in our animal

facilities, animals were provided with water ad libitum and a standard diet (U.A.R A04, IFFA

CREDO, L'Arbresle, France) consisting (by weight) of 16% protein, 3% fat, 60%

carbohydrate and 21% water, fiber, vitamins and minerals. The metabolisable energy content

was 2.9 kcal/g. They were kept in a controlled environment (constant temperature 22°C, and a

12/12 h light-dark cycle). They were acclimatised in individual cages for 8 days. Rats were

divided into 3 groups of 6 as follows: dexamethasone (DEX)-treated rats received a daily

intraperitoneal injection of 1.5 mg.kg-1

.d-1

of dexamethasone for 6 days. Given the fact that

dexamethasone treatment induces anorexia, pair-fed (PF) rats were used to differentiate

between the effect of anorexia and the effect of dexamethasone itself on the parameters tested.

PF rats received the same quantity of food as was consumed by DEX-treated rats the previous

day, and were injected daily with an isovolumic solution of 0.9% NaCl. Rats from the control

group (CON) were healthy, received no treatment, and were fed ad libitum. Experiments were

conducted over a 6-day period. The dose and duration of the dexamethasone treatment was

chosen with reference to the literature from what is known to induce a reproducible maximum

hypercatabolic state [16]. NMR measurements were performed for the first time on the 5th

day, when animals were fed. On the 6th

day, NMR measurements were conducted among the

same animals although that they had been fasted for 24 hours.

Furthermore, dexamethasone being a highly reproducible model of hypermetabolic stress [12,

13, 17], a similar experiment was conducted in a parallel group of rats to test plasma substrate

and hormone concentrations. In a third experiment, rats were anaesthetised with isoflurane,

112

the skin over the leg was dissected away and the gastrocnemius was rapidly freeze-clamped,

removed, frozen in liquid nitrogen and subsequently stored at – 80 °C until analysis of PCr

and creatine concentration.

In vivo 31

P NMR spectroscopy. On the day of the NMR experiment, rats were anaesthetised

with 1.8 ml/h isoflurane throughout the duration of the measurement. The rat was wrapped in

a blanket to preserve core body temperature. The 31

P NMR experiments were performed at

81.07 MHz using the Bruker Biospec (Karlsruhe, Germany) 4.7 T system (horizontal/40-cm-

diameter bore magnet). The 1H/

31P Bruker surface coil (50 mm) was positioned over the rat’s

hind limb. Shimming was performed by optimizing the proton signal from water. Usually, a

half-height line width of the water signal of 70 Hz was achieved. Spectra were acquired with a

hard pulse of 55 µs length to perform 90° at the coil center. Each spectrum represented an

average of 128 scans with a recycle time of 25 s, accumulated over a total period of 60 min. A

sweep width of 5000 Hz and 16 k data points were used.

Free induction decay was multiplied by 20 Hz line broadening constant before Fourier

transformation.

Magnetisation transfer. In the saturation transfer experiment, a gaussian selective pulse was

applied for 6 s on the signal. In the spectrum without γ-ATP saturation, the same pulse was

applied symmetrically to γ-ATP/β-ADP at high-field side of β-ATP.

A saturation transfer experiment has been fully developed previously [18, 19]. In our

experiment, the rate constants ka and kb between PCr and γ-ATP and between β-ATP and β-

ADP respectively, were determined as to: ki = (1/T1)((M0-M)/M)

where T1 is intrinsic longitudinal relaxation of PCr or β-ATP, M0 is the signal intensity of PCr

or β-ATP without saturation and M is the signal intensity of PCr or β-ATP with γ-ATP/β-

ADP saturation.

The flux from PCr to ATP was calculated as ka x [PCr] while that from β-ATP to β-ADP was

kb x [β-ATP].

Ex vivo 1H NMR spectroscopy. Muscle energetics calculated from

31P NMR spectroscopy

parameters rely on hypotheses, one a which is that total creatine (PCr + creatine) content in

muscle is strictly proportional to the NMR signal, regardless the circumstances. To make sure

that total creatine content was constant in DEX-treated, PF and CON rats, we have measured

113

this content in perchloric acid extracts with 1H NMR spectroscopy, which is the reference

technique [20, 21].

Frozen muscle was pulverized using a mortar and pestle precooled in liquid nitrogen and

homogenized and deproteinized in ice-cold 1 mol/l perchloric acid (1:5). The supernatant was

neutralized with 2 mol/l potassium bicarbonate and then lyophilized. 1H spectra from

perchloric acid extracts prepared immediately after excision were obtained from 128

accumulations with trimethylsilylpropionic -2,2,3,3d4-acid as reference (2 mmol/l). A 90° flip

angle; 10 s repetition time, 2000 Hz sweep width/16K and 0.3 Hz exponential broadening

were used.

This shows that total creatine did not differ in the three groups: DEX-treated rats (44.7 ± 5

mmol/g), PF rats (49.2 ± 7 mmol/g) and CON rats (44.8 ± 2 mmol/g); p = NS.

Calculations. Intracellular pH was determined from the chemical shift of Pi (h) according to

the following formula [19, 22]:

pH = 6.73 + log (h-3.37) / (5.66- h)

NMR spectra were fitted by using Peakfit® software to determine the area of peaks of Pi, PCr

and ATP.

Ratios of PCr:ATP and Pi:PCr were calculated from the respective areas.

Assuming that the total level of phosphorylated metabolites detected by 31

P NMR is visible

[23] and remains constant as a function of diet and the PCr level is 35.8 mmol/l at rest for the

fed control rats [24], we can calculate the dependence of the concentration for each metabolite

versus diet.

The values of ATP and Pi used for the final analysis were calculated from the ratios of

PCr:ATP and Pi:PCr. Thus ATP = PCr:ATP / [PCr], and Pi = Pi:PCr x [PCr].

ADP level was calculated from the creatine kinase reaction, according to Lawson and Veech

[22], taking into account intracellular pH changes and assuming a free Mg2+

concentration of

0.86 mmol/l. The equilibrium constants of the creatine kinase reaction (Keq) were calculated

from the intracellular pH:

log Keq = 8.31 – (0.87 x pH)

ADP was then calculated using the formula:

ADP (mmol/l) = [ATP] x [creatine] / [PCr] x Keq

pH and Keq calculations are sensitive to Mg2+

concentration. Free Mg2+

concentration affects

the distance between the alpha and the beta ATP peaks. In the present experiment the

114

chemical shift separation between the alpha and the beta ATP peaks did not change ruling out

the possibility of changes in Mg2+

concentration (data not shown).

The free-energy change of ATP hydrolysis can be calculated as follows:

∆GATP (kJ / mol) = ∆G° + 2.58 ln [ADP][Pi] / [ATP]

Plasma concentrations. Non-esterified fatty acids plasma concentrations were determined

using a COBAS analyser (Roche Diagnostics, Grenoble, France) by using commercially

available kits from Boeringher (Grenoble, France).

Plasma levels of ß-hydroxybutyrate (β-OHB) were determined by standard colorimetric and

enzymatic methods adapted for the COBAS analyzer (Roche Diagnostics).

Plasma insulin concentrations were determined using a commercially available enzyme

immunoassay (Biotrak (EIA) System, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Plasma

leptin levels were determined by radioimmunoassay (Linco Research, St. Charles, MO, USA).

Statistical analysis. Results were expressed as mean ± SD. Repeated measurements were

compared by ANOVA with the Bonferroni/Dunn test as a post-hoc test. For the other

parameters measured, means were compared by ANOVA and using the Fisher post-hoc test.

A P value < 0.05 was considered significant.

Results

Dexamethasone induced a significant reduction in food intake from day 2 (Fig. 1). Animals in

the 3 groups did not differ with respect to body weight at the beginning of the experimental

procedure (325 ± 29 vs. 334 ± 13 vs. 322 ± 12 g in DEX-treated, PF and CON rats). Body

weight decreased in DEX-treated rats from day 1 and PF animals from day 2 (Fig. 2). This

decrease was significantly (P<0.0001) greater in DEX-treated rats than in PF animals,

corresponding to 18% (DEX-treated) and 4% (PF) of initial body mass on the 5th day of

treatment. At the same time, CON rats increased their body mass by 8% (Fig. 2). The 24-hour

fast, between days 5 and 6, decreased body weight by 6% (P<0.0001) in the 3 rat groups and

there was no interaction with treatment (Fig. 2).

Phosphoryl compounds.

115

(i) fed rats.

PCr concentration was significantly decreased (-9%; P<0.0001) by dexamethasone in

comparison to CON and PF rats, while ADP (+57%; P<0.0001) and ATP (+13%; P<0.0005)

concentrations were increased (Table 1). PCr:ATP ratio and free energy change of ATP

hydrolysis (∆GATP) was lower in DEX-treated rats than in CON and PF rats. There was no

difference in pH, Pi concentration or Pi:PCr ratio between the 3 rat groups (Table 1).

(ii) fasted rats.

PCr was significantly lower in DEX-treated rats than in CON (-10%; P<0.0001) and PF rats (-

6%; P<0.005). PCr was also lower in PF rats than in CON rats (-5%; P<0.005). ADP was

higher in DEX-treated rats than in CON (+55%; P<0.0001) and PF rats (+27%; P<0.001).

ADP was also higher in PF rats than in CON rats (+22%; P<0.05). Pi concentration was

significantly increased by dexamethasone (Table 1). ATP content was higher in PF and DEX-

treated rats than in CON rats (+8%; P<0.05 and +6%; P<0.05). ∆GATP was lower in DEX-

treated rats than in PF and CON rats. PCr:ATP ratio was lower in DEX-treated and PF rats

than in CON rats (Table 1). Pi:PCr ratio was significantly increased by dexamethasone (Table

1). There was no difference in pH across the 3 rats groups (Table 1).

(iii) the effect of a 24-hour fast (animals were fasted for the final 24 hours of the experiments

allowing the paired comparison of muscle energetics between these two states).

Twenty-four hours fasting decreased ATP content in DEX-treated rats (-7%; P<0.05) and

increased it in PF rats (+5%; P<0.05). Fasting significantly increased Pi concentration and

Pi:PCr ratio in DEX-treated rats (Table 1). ∆GATP was decreased by the 24-hour fast in the

single DEX-treated rat group (Table 1). In PF rats, fasting significantly decreased PCr:ATP

ratio and increased (P<0.05) free ADP concentration by 16% (Table 1).

Magnetisation transfer.

(i) fed rats.

In DEX-treated rats, the pseudo-first order rate constant of γ-ATP synthesis from PCr (ka) and

the PCr to γ-ATP flux were significantly higher than in CON and PF rats (Table 2). The

pseudo-first order rate constant of β-ADP synthesis from β-ATP (kb) and the β-ATP to β-

ADP flux were not affected by dexamethasone (Table 2).

116

(ii) fasted rats.

ka and the PCr to γ-ATP flux were significantly higher in DEX-treated rats than in CON and

PF rats (Table 2). Regardless of the rat group, kb and the β-ATP to β-ADP flux did not differ

(Table 2).

(iii) the effects of a 24-hour fast.

Fasting did not affect all parameters tested (Table 2).

Hormones and metabolites.

(i) fed rats.

NEFA (+115%) and insulin (+204%) concentrations were significantly increased by

dexamethasone in comparison to CON and PF rats, while there was no difference in

concentrations between CON and PF rats (Table 3). Leptin was higher in DEX-treated rats

than in CON (+46%; P<0.05) and PF rats (+590%; P<0.0005). Leptin concentration was

decreased by 80% by food restriction. Whatever the rat group, β-OHB did not differ (Table

3).

(ii) fasted rats.

NEFA (+92%) insulin (+186%) and leptin (+830%) concentrations were significantly

increased by dexamethasone in comparison to CON and PF rats, while there was no

difference in these concentrations between CON and PF rats (Table 3). β-OHB was lower in

DEX-treated rats than in CON (-57%; P<0.01) and PF rats (-67%; P<0.0005) (Table 3).

(iii) the effect of a 24-hour fast.

Fasting increased NEFA concentration in all rat groups (Table 3). Whatever the rat group, β-

OHB was significantly increased by the 24-hour fast. Leptin levels were significantly

decreased (-75%) in the only CON rat group (Table 3). There was no effect of fasting on

insulin concentration (Table 3).

Discussion

The present study shows that dexamethasone-induced insulin resistance (as shown by

increased insulin and NEFA concentrations), affects muscle energetics at rest.

117

Dexamethasone induced a decreased PCr concentration and PCr:ATP ratio, increased ADP

concentration and led to higher PCr to γ-ATP flux but no change in β-ATP to β-ADP flux in

gastrocnemius muscle. In contrast, neither 4 days of food restriction (PF rats) nor 24-hours

fasting affected high-energy phosphate metabolism. This suggests that insulin resistance

affects muscle energetics by impairing in vivo oxidative phosphorylation, and partially

redirecting ATP synthesis from PCr flux.

31P NMR calculation of muscle energetics rely in a constant total creatine (PCr + creatine)

content in the three groups. 1H NMR of perchloric acid extracts shows that this is the case.

Furthermore it had been shown that total creatine is proportional to creatine content in other

circumstances [21, 25]. Therefore, the conclusion drawn with 31

P NMR on muscle energetics

(PCr, PCr:ATP ratio and PCr to γ-ATP flux) appear to be valid.

The finding that PCr content was decreased in DEX-treated rats is of particular

interest. In fasted DEX-treated rats, the resulting decrease in PCr:ATP ratio was mainly due

to a decrease in PCr levels, as ATP levels remained unchanged. On the contrary, during the

fed state, ATP concentration was increased, thereby further decreasing the ratio. Such a

decrease in PCr and an increase in ADP levels have also been noted with fatigue [26].

However, there are major differences between those and the present results. In fatigue, there is

a significant fall in pH and a rise in Pi, which was not the case here, not surprisingly as the

present animals were studied at rest. The decrease in PCr and increase in ADP could also be

due to a change in fibre type i.e. a decreased proportion of type II fibres in comparison to an

increased proportion of type I fibres. NMR studies in rat skeletal muscle have shown that type

II fibres display higher ATP and PCr concentrations and lower Pi and ADP concentrations

when compared with type I fibres [27]. In general, animal studies show that long-term

treatment (2-10 weeks) with glucocorticoids results in skeletal muscle atrophy, with a greater

decline in type II fibre than in type I fibre area, appearing in the last 7 weeks of treatment [28,

29, 30, 31, 32]. Therefore, it is unlikely that 5 days of dexamethasone would be sufficient to

decrease type II fibre proportion in comparison to type I fibre. Equally, in accordance with

previous in vitro and in vivo results [27, 33, 34], the spectra of the gastrocnemius in all rat

groups in our study showed high PCr:Pi ratios, a characteristic feature of type II fibres.

Furthermore, since acute-treatment with dexamethasone (present study) was not associated

with a change in Pi or a decrease in ATP, an alteration in fibre type, if any, cannot entirely

explain the observed change in PCr and free ADP levels. These results suggest therefore that

either ATP was maintained at the expense of PCr or total creatine (PCr + Cr) content was

decreased in muscle [35]. A lower PCr:ATP ratio, has already been found during malnutrition

118

[35, 36, 37, 38]. In contrast, in calorie restricted rats (20% intake of control rats for 7 days),

where PCr:ATP was decreased, there was a rise in free ADP concentration in comparison

with control rats. It has been argued [35] that in 2-day food deprived rats, the lower PCr:ATP

ratio is related to a decrease in total creatine content of skeletal muscle, while in

hypocalorically fed rats, ATP levels are maintained at the expense of PCr. Here, we did not

find a decrease in total creatine. Taken together, these results suggest that dexamethasone

treatment was accompanied by a decrease in energy stores in order to maintain ATP levels of

resting muscle. The fact that PCr to γ-ATP flux was significantly higher in DEX-treated rats

reinforces such a notion.

A decrease in PCr can be the result of either an increased ATP turnover (which was not found

here) or a decrease in oxidative ATP production. However, we cannot totally rule out a

decrease in glycolytic ATP production since the rate of glycolysis has been found to be either

unchanged or decreased in the muscle of rats treated with dexamethasone [39, 40]. However,

increased ADP concentration is known to stimulate glycolysis. Finally, as ADP is a powerful

regulator of respiration [41], we would therefore expect that higher free ADP would result in

increased oxidative phosphorylation, hence sufficient ATP synthesis. As this is not the case

here, it suggests that oxidative phosphorylation is impaired. In support of this, a decreased

ADP/O ratio has been reported, suggesting an impairment of oxidative phosphorylation, in

isolated skeletal muscle mitochondria treated in vitro by GCTC [42].

GCTC induces an insulin resistant state resulting in decreased insulin-stimulated

glucose uptake in muscle [6], and increased plasma NEFA, insulin and leptin concentrations

[7]. This is consistent with the significant increase in plasma NEFA, insulin and leptin levels

in the DEX-treated rats in the present studies. Interestingly, dexamethasone-induced insulin

resistance was found to perturb the equilibrium between the use of fat and glucose as

energetic fuels, resulting in increased NEFA oxidation in muscle [43]. Therefore, the higher

proportion of FADH2 reducing equivalents arising from fatty acid oxidation than from

glucose metabolism results in a shift in electron supply toward a two coupling site system

instead of a three coupling site system. This in turn would lead to a decrease in intrinsic

respiratory coupling, and a decrease oxidative phosphorylation yield. Collectively, these

results suggest that ATP levels were maintained at the expense of lower PCr levels, and that

ATP production from oxidative, and possibly non-oxidative, metabolism in gastrocnemius

muscle of DEX-treated rats is impaired.

In the present study, in vivo muscle energetics are not affected by food restriction

(55% for 4 days or fasting for 24 hours), as there was no difference between PF and CON rats

119

or fasted and fed CON rats, regardless of the parameter tested. This result is in agreement

with the effect of long-term caloric restriction (30% for 10 months) on high-energy phosphate

metabolism in rat skeletal muscle [44]. However, our results are in contrast to the effect of

short-term caloric restriction [35]. Indeed, those authors observed that PCr:ATP ratio was

lower in restricted rats (80% for 7 days) and fasted rats (48 hours) than in control rats [35].

However, the food restriction protocol used in that study [35] resulted in a 20% weight loss in

restricted rats and 10% in 48-hour fasted rats. In the present study, the mean body weight loss

was 4% in food-restricted rats and 6% in 24-hour fasted rats. Collectively, these results

suggest that while food restriction results in a decrease in energy expenditure at the whole-

body level [45], this adaptation is not always accompanied by a modification of resting energy

state (PCr:ATP ratio) in skeletal muscle. Indeed, it appears that the PCr:ATP ratio is

decreased when the food restriction-related weight loss is relatively high i.e. more than 9%.

This notion is further reinforced by the fact that while we found that a 24-hour fast (which

resulted in a 6% relative mass loss) did not alter PCr:ATP ratio, the combination of 4 days of

food restriction and 24-hour fast (that resulted in a 11% loss of initial weight, PF rats in the

fasted state) decreased the PCr:ATP ratio (P < 0.05 Anova interaction between treatment and

fasting). Therefore, the decrease in bioenergetic reserves in resting skeletal muscle reported

elsewhere [35] could be the consequence of the intensity of weight loss rather than that of the

food restriction itself. Interestingly, DEX-treated rats (present study) lost 18% of their initial

weight. However, in DEX-treated rats ATP concentration was increased, unlike that reported

for food restricted rats [35]. Moreover, in our study, where the fasted DEX-treated rats had a

significantly greater weight loss than the DEX-treated rats in the fed state (24 in comparison

to 18%), energy status was no more affected (NS Anova interaction between treatment and

fasting). This result therefore clearly indicates that the decrease in PCr:ATP ratio was mainly

due to dexamethasone treatment per se. This agrees with a previous study [46] where it was

found that muscle energy status was more severely affected by triamcinolone treatment than

by food restriction.

In conclusion, insulin resistance induced by dexamethasone treatment altered resting

in vivo muscle energetics, by decreasing oxidative phosphorylation, orientating ATP synthesis

from PCr.

120

Acknoldgements.

This work was supported by grants from county council “Pays de Loire” grant 2000-2004.

Authors thank Marie-Jo Bellanger for technical assistance and Miriam Ryan for reviewing the

English manuscript.

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124

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

125

En cas de restriction calorique à court terme (3 jours), nos résultats montrent, au

niveau du foie, qu’il y a une adaptation passive (diminution de la masse métabolique de

l’organe) et une adaptation active (diminution de la consommation d’oxygène mitochondriale)

et que l’une et l’autre sont proportionnelles à l’intensité de la restriction calorique. Ces

résultats suggèrent que le foie est capable de participer à la diminution du métabolisme de

base en cas de restriction calorique et ce dès 3 jours. Cependant nous pouvions nous attendre à

une adaptation du métabolisme énergétique plus importante. En effet, nos résultats ne

montrent pas de modification de l’efficacité de la phosphorylation oxydative. Ces résultats

suggèrent que si la consommation d’oxygène mitochondriale diminue avec la restriction

calorique cela se fait sans compensation au niveau de la synthèse d’ATP. Par ailleurs, le but

d’une telle adaptation ne semble pas uniquement dirigée vers une économie d’énergie. La

diminution de l’activité de la chaîne respiratoire, l’augmentation de l’activité et de

l’expression de la COX et de l’augmentation de l’expression de la SOD, suggèrent en effet

que la restriction calorique induit aussi des mécanismes capables de lutter ou de limiter la

production de ROS.

Quoiqu’il en soit le fait que ces adaptations soient proportionnelles à l’intensité de la

restriction calorique, tend à prouver l’existence et l’importance de tels phénomènes. Ainsi,

plus l’animal sera restreint et plus l’adaptation sera importante.

Finalement, il est très intéressant de constater que la leptine puisse apparaître comme un

déterminant, indépendant et plus important que la T3, des variations des divers paramètres

déterminés.

Paradoxalement, bien que le traitement par dexaméthasone s’accompagne aussi d’une

restriction calorique de 3 jours, il apparaît que le métabolisme énergétique hépatique ne soit

plus dirigé vers une économie d’énergie. En effet, au niveau du foie, nos résultats montrent

une augmentation de la masse tissulaire et une augmentation de la fuite de protons. Ces

adaptations passives et actives, qui sont spécifiques du traitement (effets différents par rapport

aux rats appariés pour la nourriture) sont donc capables d’expliquer, en partie, l’augmentation

du métabolisme de base caractéristique des situations d’hypercatabolisme. De plus, nos

résultats montrent que le traitement par dexaméthasone altère l’efficacité de la

phosphorylation oxydative dans les mitochondries de foie et que ceci pourrait aussi être le cas

au niveau du muscle squelettique.

126

Evidemment s’il peut paraître osé de transposer des résultats du métabolisme

énergétique de la mitochondrie au corps entier, il existe néanmoins des études qui montrent

des liens directs entre l’énergétique subcellulaire et la consommation d’oxygène du corps

entier. Ainsi, Harper et al. (2002) montrent une relation positive entre la fuite de protons de

mitochondries musculaires et le profil de perte de poids chez des patients obèses. Tonkonogi

et Sahlin (1997) montrent une corrélation positive entre la respiration à l’état 3, de

mitochondries musculaires et la consommation d’oxygène maximale du corps entier, chez des

personnes soumises à un exercice physique. Enfin, quand les hormones thyroïdiennes sont

utilisées pour stimuler la dépense d'énergie chez le rat, des corrélations sont observées entre

l’augmentation de la synthèse d’ATP, l’augmentation de la fuite de protons de mitochondries

musculaire et hépatique et l’augmentation de la dépense énergétique du corps entier (de Lange

et al., 2001; Short et al., 2001). De plus, dans certaines situations les modifications de la

dépense d’énergie du corps entier peuvent être trop faibles pour être mises en évidence, dans

ce cas il apparaît plus judicieux d’étudier plus précisément les mécanismes du métabolisme

énergétique au sein même des tissus ou organes et donc au niveau de la mitochondrie.

Quoiqu’il en soit nos résultats nous suggèrent un certain nombre de questions qui

méritent certainement autant de futurs travaux de recherche. Il sera ainsi très intéressant:

1) de confirmer le rôle de la leptine sur le métabolisme mitochondrial hépatique en cas

de restriction calorique, en traitant par exemple les rats restreints avec des injections de

leptine ou plus spécifiquement par l’administration d’adénovirus contentant l’ADNc de la

leptine.

2) de déterminer le but de l’activation des mécanismes de lutte contre la production de

ROS dès 3 jours. Une cinétique de dosage des ROS en fonction du temps (veille du 1er

jour de

restriction, 1er

, 2e et 3

e jour de restriction calorique) chez des rats restreints à 50% et des rats

témoins permettrait de savoir si c’est un mécanisme de prévention (phénomène rencontré à

plus long terme et proposé comme effet anti-vieillissement) ou un simple mécanisme de

défense contre une production accrue de ROS, induite par une oxydation prépondérante des

lipides.

3) de préciser les mécanismes responsables de la diminution de l’activité de la chaîne

respiratoire en cas de restriction calorique.

4) de déterminer le rôle précis de la diminution de l’efficacité de la phosphorylation

oxydative chez les rats traités par dexaméthasone. Ainsi, il apparaît que l’homéostasie de

l’énergie joue à la fois sur le flux et l’efficacité de la phosphorylation oxydative, et que par

127

conséquent le coût d’une forte production d’énergie est une efficacité diminuée. La

phosphorylation oxydative est-elle plus découplée dans le but de répondre à une demande

d’énergie augmentée par ailleurs, ou la mitochondrie n’est-elle qu’une simple victime du

traitement par dexaméthasone ? Il serait donc intéressant d’étudier la relation entre le

métabolisme cellulaire et l’efficacité de la conversion énergétique mitochondriale hépatique,

soit en mesurant le contrôle de différentes voies métaboliques cellulaires sur la

phosphorylation oxydative de mitochondries de foie, soit en analysant l’impact d’une

modification du rendement de la conversion d’énergie mitochondriale sur l’intensité des

métabolismes cellulaires.

5) de préciser les mécanismes responsables de l’augmentation de la fuite basale de

protons, en analysant par exemple la composition en acides gras de la membranaire interne

mitochondriale.

6) de rechercher le rôle potentiel de certaines hormones connues pour réguler le

métabolisme énergétique mitochondrial et dont les taux sont par ailleurs modifiés par le

traitement par dexaméthasone. Il est ainsi envisageable, par exemple, d’étudier l’impact du

statut thyroïdien sur l’effet de la dexaméthasone sur la fuite de protons dans les mitochondries

de foie.

7) de préciser les mécanismes impliqués dans l’altération in vivo du métabolisme

musculaire, en déterminant notamment la fuite de protons des mitochondries musculaires dans

des conditions de mesure permettant de mettre en évidence l’activité de UCP3 (pas de BSA et

présence de cofacteurs tels que les ROS).

128

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FICHES TECHNIQUES

159

Fiches techniques

1. Isolement de mitochondries de foie

2. Isolement des populations mitochondriales musculaires

3. Dosage protéique par spectrophotométrie

4. Dosage enzymatique des complexes de la chaîne respiratoire par spectrophotométrie

5. Détermination de la consommation d’oxygène mitochondriale par l’utilisation d’une

électrode sensible à l’oxygène

6. Détermination du potentiel de membrane par l’utilisation d’une électrode sensible au

TPMP

7. Détermination de la relation entre la consommation d’oxygène mitochondriale et le

potentiel de membrane en condition non-phosphorylante

8. Détermination de la relation entre la consommation d’oxygène mitochondriale et le

potentiel de membrane en condition phosphorylante

9. Détermination de la synthèse d’ATP par spectrophotométrie

10. Détermination du rapport ATP/O

11. Quantification des cytochromes par spectrophotométrie

12. Dosage de la concentration de glycogène par spectrophotométrie

160

FICHE TECHNIQUE N° 1

ISOLEMENT DE MITOCHONDRIES DE FOIE

Les mitochondries sont isolées selon des adaptions de la technique de Krahenbuhl et al.

(1994).

Toutes les étapes se font à +4°C.

Le principe de l'isolement des mitochondries est l'obtention d'organites de taille et de pureté

relativement homogènes selon les groupes de rats étudiés. Ainsi la vitesse de la dernière

centrifugation (3500 g) est inférieure à la précédente (7000 g) dans le but de bien nettoyer le

culot de mitochondries et ceci particulièrement pour les foies des rats traités par

dexaméthasone.

Technique

Après prélèvement, le foie est conservé dans 50 ml de tampon d’isolement et dans la glace.

- Hacher le foie en petits morceaux (ciseaux) dans le tampon d’isolement. Rincer 3 à 4 fois,

avec du tampon d'isolement froid (8 volumes), jusqu'à ce que le surnageant soit clair.

- Homogénéiser, dans 8 volumes de tampon d'isolement, au Potter (7 aller-retours, 1000

tours/min) jusqu’à l’obtention d’une pâte homogène.

- Centrifuger à 600 g pendant 10 min et à +4°C, pour éliminer les noyaux et débris cellulaires.

- Filtrer le surnageant, sur une couche de gaze, et le centrifuger à 7000 g pendant 10 min et à

+4°C.

- Eliminer un maximum de surnageant, sans perturber le culot, et suspendre celui-ci dans 10

volumes de milieu d'isolement froid.

- Centrifuger 10 min à 3500 g et à +4°C, pour bien nettoyer la strate blanchâtre entourant le

culot (lipides).

- Le culot est resuspendu dans un minimum de tampon d’isolement (1/4 volume) et conserver

dans la glace.

ENRICHISSEMENT EN MITOCHONDRIES DE FOIE (HOMOGENAT)

161

Travail sur les tissus prélevés, conservés dans l' azote liquide puis au congélateur (-80°C).

Toutes les étapes se font à +4°C.

Technique

- Découper puis peser entre 30 et 50 mg d'échantillon.

- Homogénéiser l'extrait au Potter, avec 40 volumes de tampon d’isolement (7 aller-retours,

1000g).

- Centrifuger 10 min à 600 g et à +4°C.

- Filtrer le surnageant sur une couche de gaze.

162

FICHE TECHNIQUE N° 2

ISOLEMENT DES POPULATIONS MITOCHONDRIALES

MUSCULAIRES

Au niveau du muscle squelettique, il existe 2 types de populations mitochondriales :

les mitochondries subsarcolemmales, qui se situent en périphérie des fibres

musculaires et sont facilement accessibles.

les mitochondries intermyofibrillaires, qui se situent en profondeur dans la fibre

musculaire et sont accessibles via l’utilisation de protéase.

Les mitochondries sont isolées selon des adaptions de la technique de Roussel et al. (2000).

Toutes les étapes se font à +4°C.

Technique

L’échantillon musculaire prélevé est directement immergé dans un volume minimum de

tampon d’isolement et conservé dans la glace.

- Nettoyer l’échantillon de tous les dépôts fibreux, nerveux, etc… qui se trouvent à sa surface.

- Disséquer finement l’échantillon (ciseaux) dans 10 volumes de tampon d’isolement.

- Homogénéiser dans 10 volumes de tampon d'isolement, au Potter (5 aller-retours, 1000 g).

- Centrifuger à 600 g pendant 10 min à + 4°C .

- Filtrer le surnageant (S) sur une couche de gaze (il contient les mitochondries

subsarcolemmales) et conserver dans la glace.

Le culot qui contient les mitochondries va subir une digestion avec la nagarase (1 mg/g de

tissu musculaire.

- Homogénéiser dans 40 ml de tampon d’isolement contenant la nagarase, au Potter (4 aller-

retour, 1000 g).

- Laisser incuber dans la glace pendant 5 min précisément.

- Rajouter 40 ml de tampon d’isolement (pour diluer la protéase) et homogénéiser au Potter (4

aller-retour, 1000 g).

- Centrifuger à 1000 g pendant 10 min et à + 4°C, faire de même pour S.

- Filtrer les surnageants sur une couche de gaze et les centrifuger, 10 min, à 10000 g et à

+4°C.

163

- Eliminer les surnageants, et reprendre les culots avec 10 ml de tampon d’isolement.

- Centrifuger à 10000 g pendant 10 min et à +4°C.

- Resuspendre les culots dans un minimum de tampon d’isolement (1/20e volume) et

conserver dans la glace.

ENRICHISSEMENT EN MITOCHONDRIES DE MUSCLE

(HOMOGENAT)

Travail sur les tissus prélevés, conservés dans l' azote liquide puis au congélateur (-80°C).

Toutes les étapes se font à +4°C.

Technique

- Découper puis peser entre 30 et 50 mg d'échantillon.

- Homogénéiser l'extrait au Potter, avec 10 volumes de tampon d’isolement (7 aller-retours,

1000 tours/min).

- Centrifuger 10 min à 600 g et à +4°C.

- Filtrer le surnageant sur une couche de gaze.

164

FICHE TECHNIQUE N° 3

DOSAGE PROTEIQUE PAR SPECTROPHOTOMETRIE

Dosage colorimétrique utilisant l'acide bicinchoninique (B. C. Assay.).

Le principe du dosage repose sur la réduction des ions Cu2+

en Cu+ par les liaisons

peptidiques des protéines. L’acide bicinchoninique chélate les ions Cu+ avec une très forte

spécificité et forme un complexe soluble coloré en violet. L’absorbance est directement

proportionnelle à la concentration protéique qui est calculée à l’aide d’une courbe référence

obtenue pour la sérum albumine.

Technique

- Préparer un Blanc (tampon d’isolement) :

30 µl

600 µl solution travail

- Préparer un point de gamme étalon 0,25 mg/ml :

30 µl sérum albumine 0,25 mg/ml

600 µl solution travail

- Préparer un point de gamme étalon 0,5 mg/ml :

30 µl sérum albumine 0,5 mg/ml

600 µl solution travail,

- Préparer l’échantillon :

30 µl échantillon (mitochondries isolées …) dilué pour être dans la gamme

étalon (faire 2 dilutions différentes)

600 µl solution travail

- Préparer la solution de travail :

1 volume de réactif B

49 volumes de réactif A

- Incuber 30 min à 37°C

- Lire l’absorbance à 562 nm.

165

FICHE TECHNIQUE N° 4

DOSAGE ENZYMATIQUE DES COMPLEXES DE LA CHAINE

RESPIRATOIRE PAR SPECTROPHOTOMETRIE

Adaptations de la technique de Malgat et al. (1999) et de la technique de consensus (réunion

AFM de novembre 2002).

Le principe des dosages repose sur le transfert d’électrons de donneurs (c’est à dire de

substrats) à un accepteur. Les dosages permettent la mesure par spectrophotométrie du taux

d’apparition de l’accepteur réduit ou du taux de disparition du donneur oxydé.

I. Dosage de la NADH Ubiquinone C Réductase (CI)

Ce dosage consiste à mesurer l’oxydation du NADH :

NADH → coenzyme Q

complexe I

e-

Le complexe I permet le transfert des électrons de NADH au coenzyme Q, remplacé dans le

dosage par un analogue : la décylubiquinone.

Cependant NADH peut aussi être oxydé par le cytochrome b5 réductase de la membrane

mitochondriale externe. Le dosage est donc aussi effectué en présence de roténone (inhibiteur

du complexe I) pour permettre la quantification de l’activité non sensible à la roténone et donc

indépendante du complexe I.

Technique

Dans un tube à hémolyse :

Volume (µl) Concentration finale (mM)

Tampon phosphate pH 7,5 500 50

Sérum albumine sans AGL 80 4 mg/ml

Mitochondries (homogénat) 20 µg (60-100µg)

Décylubiquinone 4 0,1

166

Eau ppi 400

- Incuber 3 minute à 37°C.

- Démarrer la réaction en ajoutant 10 µl de NADH.

- Suivre la variation d’absorbance à 340 nm et à 37°C.

Faire le même dosage avec 5 µl de roténone dans le milieu réactionnel.

Cinétique d’ordre 1. i NADH = 6220 M-1

. Cm-1

Réactifs

Tampon phosphate (pH 7,5 – 100 mM) :

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,5 avec du KOH 5N.

Sérum albumine sans AGL (50 mg/ml) :

- sérum albumine : 125 mg

- eau distillée : qsp 2,5 ml

Décylubiquinone (25 mM) :

- dissoudre 10 mg de Décylubiquinone dans 1,25 ml de DMSO.

Roténone : 1 mg/ml dans un mélange (volume/volume) éthanol/DMSO

NADH (20 mM):

- NADH : 6,6 mg

- eau distillée : qsp 0,5 ml

II. Dosage de la Succinate Déshydrogénase ( SD).

Ce dosage consiste à mesurer la réduction du dichlorophénol-indophénol (DCPIP):

succinate → phénazine méthosulfate → DCPIP

complexe II

e-e-

167

Technique

Dans un tube à hémolyse :

Volume (µl) Concentration finale (mM)

Tampon phosphate pH 7,5 500 50

Succinate 160 30

KCN 150 1,5

Phénazine méthosulfate 50 0,1

Mitochondries isolées 3 µg de protéines

(10-30 µg pour homogénat)

- Incuber 3 minutes à 37°C.

- Démarrer la réaction en ajoutant 200 µl de DCPIP.

- Suivre la variation d’absorbance à 600 nm et à 37°C.

Cinétique d’ordre 0. i DCPIP = 21000 M-1

. Cm-1

Réactifs

Tampon phosphate (pH 7,5 – 100 mM) :

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,5 avec du KOH 5N.

Succinate (200 mM) :

- acide succinique : 118 mg

- eau distillée : qsp 5 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

KCN (10 mM) :

- KCN : 6,4 mg

- eau distillée : qsp 10 ml

Neutraliser par de l'HCl 6N

Phénazine méthosulfate (20 mM) : à préparer extemporanément, très sensible à la lumière.

- phénazine méthosulfate : 6,1 mg

- eau distillée : qsp 1 ml

168

DCPIP (dichlorophénol-indophénol à 150 mg/l) : à préparer extemporanément.

- dichlorophénol-indophénol : 3,7 mg

- eau distillée : qsp 25 ml

Tiédir à 37°C avant usage.

III. Dosage de l'Ubiquinone Cytochrome C Réductase (CIII).

Ce dosage consiste à mesurer la réduction du cytochrome c :

ubiquinol → cytochrome c

complexe III

e-

Le complexe III permet le transfert des électrons du coenzyme Q réduit (ubiquinol), remplacé

dans le dosage par un analogue : le décylubiquinol, au cytochrome c.

Le dosage est aussi effectué en présence d’antimycine (inhibiteur du complexe III) pour

quantifier la réduction du cytochrome c indépendante du complexe III.

Technique

Dans un tube à hémolyse :

Volume (µl) Concentration finale (mM)

Tampon phosphate pH 7,5 500 50

Sérum albumine sans AGL 20 1 mg

KCN 100 1

Cytochrome C oxydé 100 0,100

Roténone 5 0,0125

EDTA 50 0,625

Eau ppi 230

Mitochondries isolées 10 µg de protéines

(30-50 µg protéines pour homogénat)

- Incuber 30 secondes à 37°C.

- Démarrer la réaction en ajoutant 100 µM de Décylubiquinol.

- Suivre la variation d’absorbance à 550 nm et à 37°C.

169

Faire le même dosage avec 10 µl Antimycine dans le milieu réactionnel.

Cinétique d’ordre 0. i cyt c = 18500 M-1

. Cm-1

Réactifs

Tampon phosphate (pH 7,5 – 100 mM) :

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,5 avec du KOH 5N.

Sérum albumine sans AGL (50 mg/ml) :

- sérum albumine :125 mg

- eau distillée : qsp 2,5 ml

KCN (10 mM) :

- KCN : 6,4 mg

- eau distillée : qsp 10 ml

Neutraliser par de l'HCl 6N

EDTA (12,5 mM)

- EDTA : 4,65 mg

- eau distillée : qsp 1 ml

Antimycine A : 1 mg/ml H2O

Cytochrome C oxydé (1 mM)

- cyt c : 13,0 mg

- eau distillée : qsp 1 ml

Roténone : 1 mg/ml dans un mélange (volume/volume) Ethanol/DMSO

Décylubiquinol : Solution préparée une ou deux fois par an et gardée au congélateur -80°C

Cette préparation se fait dans la mesure du possible à l’abris de la lumière (papier aluminium).

- Préparer une solution de décylubiquinone à 13 mM (20 mg dans 4.8 ml d’éthanol).

170

- Prendre le spectre de la solution oxydée (1 µl dans 1 ml d’éthanol) et noter le pic

d’absorbance à 275 nm.

- Ajouter quelques cristaux de borohydrure de sodium ou de dithionite de sodium et agiter.

- Acidifier avec HCl 3M (qq ml) jusqu’à décoloration de la solution en jaune pâle.

- Prendre le spectre de la solution réduite (1 µl dans 1 ml d’éthanol) et noter le pic

d’absorbance à 285 nm.

- Ajouter 4 ml de tampon (KH2PO4 0,1 M; Sorbitol 0,25 M; pH 7,4), puis 2 ml de

cyclohexane.

- Agiter fortement pendant 5 min (agitateur mécanique)

- Laisser décanter (qq secondes)

- Extraire la phase organique (pipette pasteur) et la récupérer dans un tube en verre. Faire

plusieurs extractions au cyclohexane (2 à 3 fois) et rassembler les phases organiques.

- Evaporer le cyclohexane sous courant d’azote (plus rapide que sous vide, évite donc la

réoxydation de la solution).

- Reprendre le résidu dans la même quantité d’éthanol mise au départ soit 4.8 ml.

- Faire des aliquots de 100 µl dans des tubes eppendorf (perforer les capuchons).

- Evaporer sous vide (speed-vaac) et conserver à –80°C.

Pour vérifier la concentration du décylubiquinol ajouter à un des aliquots 100 µl d’éthanol et

prendre le spectre d’absorption.

IV. Dosage de la Cytochrome C Oxydase – COX (CIV).

Ce dosage consiste à mesurer l’oxydation du cytochrome c :

cytochrome c + ½ O2 + 2 H+ → cytochrome c oxydé + H2O

complexe IV

e-

Le complexe IV permet le transfert des électrons du cytochrome c au dioxygène (O2).

Technique

- Incuber 990 µl de solution de cytochrome c réduit 2 minutes à 37°C.

- Démarrer la mesure par l’ajout de 5 µg de protéines mitochondriales isolées (10-50 µg

protéines homogénat).

- Suivre la variation d’absorbance à 550 nm et à 37°C.

Cinétique d’ordre 1. i cyt c = 18500 M-1

. Cm-1

171

Réactifs

Tampon phosphate (pH 7,0 – 50 mM) :

- phosphate monopotassique : 680 mg

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,0 avec du KOH 5N.

Cytochrome c réduit (80 µM) :

- Diluer la solution de Cytochrome C mM (13,0 mg/ml H2O) oxydé : 0,8 ml + 9,2

ml de tampon pH 7,0.

- Oxyder 1 ml de cette solution (O) par quelques cristaux de Ferricyanure de

Potassium.

- Réduire 1 ml de cette solution (R) par quelques cristaux de Dithionite de

Sodium.

- Mesurer le rapport de D.O. (550/560 nm) des différentes solutions.

Le rapport sera : proche de 1,1 pour le 0% de réduction et supérieur à 7 pour le 100% de

réduction.

- Ajouter par fractions de 20 µl le Cytochrome C réduit obtenu précédemment

(solution R) aux 8 ml de Cytochrome C oxydé (C) restant et mesurer le rapport de façon à être

à 92-97% de réduction (D.O. 550 nm solution C - D.O. 550 nm solution O = 0.92 à 0.97 x

(D.O. 550 nm solution R - D.O. 550 nm solution O)).

V. Dosage de la Citrate Synthase (CS).

Ce dosage consiste à mesurer la formation du trinitrobenzène (TNB) :

2 acétyl CoA + 2 oxaloacétate → 2 citrate + 2 CoA-SH CS

2 CoA-SH + DTNB → 2 TNB + CoA-S-S-CoA

Technique

Dans un tube à hémolyse :

Volume (µl) Concentration finale (mM)

DTNB/tampon 100 100

172

Acide oxaloacétique 100 1

Acétyl Co A 30 0,03

Triton X 100 à 10% 400 4 %

Eau ppi 360

- Incuber 3 minutes à 37°C.

- Démarrer la réaction en ajoutant 10 µg de protéines de mitochondries isolées (10-50

µg pour homogénat).

- Suivre la variation d’absorbance à 412 nm et à 37°C.

Cinétique d’ordre 1. i TNB = 13600 M-1

. Cm-1

Réactifs

Tampon pour le DTNB :

- Tris M : 6,05 g

- eau distillée : qsp 50 ml

Ajuster à pH 8,1 avec de l'HCl 6N.

DTNB/tampon (1 mM) : à préparer extemporanément.

- dinitrobenzène (DTNB) : 1 mg

- tampon : qsp 2,5 ml

Acétyl Co A (10 mM) :

- acetyl-Co-A : 10 mg

- eau distillée : qsp 1,2 ml

Acide oxaloacétique (10 mM) : à préparer extemporanément.

- acide oxaloacétique : 3,3 mg

- eau distillée : qsp 2,5 ml

Ajuster à pH 7 avec KOH 5N.

173

FICHE TECHNIQUE N° 5

DETERMINATION DE LA CONSOMMATION D’OXYGENE

MITOCHONDRIALE PAR L’UTILISATION D’UNE ELECTRODE

SENSIBLE A L’OXYGENE

La consommation d’oxygène de mitochondries isolées est déterminée avec un oxygraphe

(Hansatech et Oroboros) à l’aide d’une électrode sensible à l’oxygène. Les mesures sont

effectuées à 30°C et indiquent des vitesses d’utilisation de l’oxygène par unité de temps et par

mg de protéines mitochondriales. Cette technique permet d’apprécier la fonctionnalité des

mitochondries. La consommation d’oxygène mitochondriale est donc déterminée avec

différents substrats (pour les différents complexes de la chaîne respiratoire) et sous différents

états (contrôle et stimulation de la respiration différentes). Ainsi, l’addition d’ADP induit une

forte consommation d’oxygène (respiration à l’état 3) dépendante de l’utilisation de la force

proton-motrice par l’ATP-synthéthase pour la phosphorylation de l’ADP, et contrôlée par le

système phosphorylant (activité de l’ATP-synthéthase, transport de l’ADP et de l’ATP…),

par le système d’oxydation (activité des complexes de la chaîne respiratoire, transport des

substrats, efficacité du pompage des protons …) et par la fuite de protons (perméabilité

membranaire, protéines découplantes…). L’ajout d’oligomycine (qui inhibe l’activité de

l’ATP-synthéthase) induit un ralentissement de la respiration (respiration à l’état 4-

oligomycine) qui est dépendante de l’utilisation de la force proton-motrice par la fuite de

protons et sous le contrôle du système de la fuite de protons et du système d’oxydation. Enfin,

l’ajout d’une concentration saturante de FCCP (molécule qui dissipe la force proton-motrice)

induit une consommation d’oxygène maximale (respiration à l’état découplé) contrôlée par le

système d’oxydation.

Le rapport des taux de consommation d’oxygène état 3 / état 4-oligomycine défini le contrôle

de la phosphorylation sur la consommation d’oxygène et est utilisé comme un indicateur de la

qualité de la préparation des mitochondries.

Technique

Dans la cuve de mesure :

Volume (µl) Concentration finale

Milieu respiration qsp 2000

174

Substrat

Inhibiteur

Les combinaisons de substrats et d’inhibiteurs possibles sont (concentration finale):

substrat du complexe I (et II) : malate (2,5 mM) + pyruvate (5 mM)

malate (2,5 mM) + glutamate (5 mM)

glutamate (5 mM)

malate (2,5 mM) + palmitoyl-l-carnitine (40 µM)

substrat du complexe II : succinate (5mM) + roténone (5 µM; inhibiteur cI)

substrat du complexe IV : ascorbate (5mM) + TMPD (0,5 mM) +

myxothiazole (5 µM; inhibiteur cIII)

- Démarrer la mesure par l’ajout de 1 mg de mitochondries isolées (état 2).

- Stimuler la respiration par l’ajout de 150 µM d’ADP (état 3).

- Inhiber par l’ajout de 2 µg/ml d’oligomycine (état 4-oligomycine).

- Stimuler la respiration par l’ajout de 2 µM de FCCP (état découplé).

Réactifs

Milieu de respiration (pH 7,4) :

- KCl : 0,895 g

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- HEPES : 0,0408 g

- EGTA : 0,038 g

- MgCl2 : 0,0407 g

- sérum albumine : 0,3 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,4.

Oligomycine (1 mg/ml éthanol)

Roténone (2,5 mM):

- roténone : 1 mg

- éthanol/DMSO (volume/volume) : 1 ml

175

ADP (30 mM) :

- ADP : 7,52 mg

- eau distillée : qsp 0,5 ml

Carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP; 8 mM) :

- FCCP : 2 mg

- éthanol : qsp 1 ml

Myxothiazole (3 mM) :

- myxothiazole : 1,46 mg

- éthanol : qsp 1 ml

Pyruvate (0,5 M) :

- acide pyruvique : 44,1 mg

- tampon respiration : qsp 1 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Malate (0,5 M) :

- acide malique : 67,1 mg

- tampon respiration : qsp 1 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Succinate (0,5 M) :

- acide succinique : 737 mg

- tampon respiration : qsp 5 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Ascorbate (0,4 M) :

- acide ascorbique : 79,2 mg

- tampon respiration : qsp 1 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Glutamate (0,5 M) :

- acide glutamique : 92,6 mg

176

- tampon respiration : qsp 1 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Palmitoyl-l-carnitine (4 mM) :

- palmitoyl-l-carnitine : 1,74 mg

- éthanol : qsp 1 ml

N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD; 100 mM) :

- TMPD : 8,21mg

- éthanol : 0,5 ml

177

FICHE TECHNIQUE N° 6

DETERMINATION DU POTENTIEL DE MEMBRANE PAR

L’UTILISATION D’UNE ELECTRODE SENSIBLE AU TPMP

Selon la technique de Brand (1995).

Le principe de la mesure repose sur l’équilibration, de part et d’autre de la membrane interne

mitochondriale, d’une molécule-sonde chargée positivement (TPMP+). Ainsi le TPMP

+ qui

est une molécule lipophile va diffuser (sans transport actif) dans la matrice en fonction du

potentiel électrique jusqu’à atteindre un équilibre comme décrit par l’équation de Nernst :

∆Ψ = 2,3 (RT/F) log ([TPMP+]in/([TPMP

+]out)

L’accumulation du TPMP+ est mesurée indirectement en déterminant sa concentration

extramitochondriale à l’aide d’une électrode sensible au TPMP.

Cependant la force proton-motrice (∆p) est l’addition du potentiel de membrane (∆Ψ;

différence de charge électrique de part et d’autre de la membrane interne) et du gradient de

protons (∆pH; différence de concentration en protons de part et d’autre de la membrane

interne) :

∆p = ∆Ψ - 2,3 RT ∆pH

L’ajout de nigéricine (catalyseur de l’antiport K+/H

+) dissipe le ∆pH et le transforme en

potentiel électrique.

Finalement la force proton-motrice est directement proportionnelle au potentiel de membrane.

Technique

Dans la cuve de mesure :

Volume (µl) Concentration finale

Milieu respiration qsp 2000

Nigéricine 2 80 ng/ml

Mitochondries isolées 1 mg

Roténone 4 5 µM

- Immerger l’électrode sensible au TPMP dans la cuve de mesure.

178

- Calibrer l’électrode par 4 additions successives de 0,5 µM de TPMP+ (attendre

stabilité entre chaque addition).

- Démarrer la mesure par l’ajout de 5 mM de succinate.

- Dissiper le potentiel électrique par l’ajout de 2 µM de FCCP

Réactifs

Milieu de respiration (pH 7,4) :

- KCl : 0,895 g

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- HEPES : 0,0408 g

- EGTA : 0,038 g

- MgCl2 : 0,0407 g

- sérum albumine : 0,3 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,4.

Triphenylmethylphosphonium (TPMP; 10 mM) :

- TPMP : 1,8 mg

- eau distillée : qsp 0,5 ml

Succinate (1,25 M):

- acide succinique : 737 mg

- eau distillée : qsp 5 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Nigéricine (80 µg/ml éthanol)

Roténone (2,5 mM):

- roténone : 1 mg

- éthanol/DMSO (volume/volume) : 1 ml

Carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP; 8 mM) :

- FCCP : 2 mg

179

- éthanol : qsp 1 ml

180

FICHE TECHNIQUE N° 7

DETERMINATION DE LA RELATION ENTRE LA CONSOMMATION

D’OXYGENE MITOCHONDRIALE ET LE POTENTIEL DE

MEMBRANE EN CONDITION NON-PHOSPHORYLANTE

La consommation d’oxygène et le potentiel de membrane sont déterminés en parallèle, dans la

même cuve de mesure, grâce à l’utilisation de deux électrodes (une sensible à l’oxygène et

l’autre au TPMP). Le potentiel de membrane et la consommation d’oxygène sont inhibés

progressivement par des concentrations croissantes et non-saturantes de malonate (inhibiteur

de l’utilisation du succinate par la chaîne respiratoire). Dans ces conditions (présence

d’oligomycine) la consommation d’oxygène est dépendante de l’utilisation de la force proton-

motrice par la fuite de protons et est contrôlée par la fuite de protons et le système

d’oxydation. Les différents points obtenus correspondent donc à la consommation d’oxygène

nécessaire pour le maintient d’un potentiel de membrane donné et décrivent ainsi une

cinétique indicative de l’efficacité de l’utilisation de l’énergie rédox (fuite de protons et

efficacité de pompage des protons) de la mitochondrie.

Technique

Dans la cuve de mesure :

Volume (µl) Concentration finale

Milieu respiration qsp 2000

Oligomycine 2 1 µg/ml

Nigéricine 2 80 ng/ml

Mitochondries isolées 1 mg

Roténone 4 5 µM

- Immerger l’électrode sensible au TPMP dans la cuve de mesure.

- Calibrer l’électrode par 4 additions successives de 0,5 µM de TPMP+ (attendre

stabilité entre chaque addition).

- Démarrer la mesure par l’ajout de 5 mM de succinate.

- Inhiber progressivement la respiration par l’ajout de concentration croissante et non-

saturantes de malonate (0-8 mM; inhibe l’utilisation du succinate par la chaîne respiratoire).

181

- Dissiper le potentiel électrique par l’ajout de 2 µM de FCCP

Réactifs

Milieu de respiration (pH 7,4) :

- KCl : 0,895 g

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- HEPES : 0,0408 g

- EGTA : 0,038 g

- MgCl2 : 0,0407 g

- sérum albumine : 0,3 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,4.

Triphenylmethylphosphonium (TPMP; 10 mM) :

- TPMP : 1,8 mg

- eau distillée : qsp 0,5 ml

Succinate (1,25 M):

- acide succinique : 737 mg

- tampon respiration : qsp 5 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Malonate (0,5 M):

- acide malonique : 52,1 mg

- tampon respiration : qsp 1 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Nigéricine (80 µg/ml éthanol)

Oligomycine (1 mg/ml éthanol)

Roténone (2,5 mM):

- roténone : 1 mg

- éthanol/DMSO (volume/volume) : 1 ml

182

Carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP; 8 mM) :

- FCCP : 2 mg

- éthanol : qsp 1 ml

183

FICHE TECHNIQUE N° 8

DETERMINATION DE LA RELATION ENTRE LA CONSOMMATION

D’OXYGENE MITOCHONDRIALE ET LE POTENTIEL DE

MEMBRANE EN CONDITION PHOSPHORYLANTE

La consommation d’oxygène et le potentiel de membrane sont déterminés en parallèle, dans la

même cuve de mesure, grâce à l’utilisation de deux électrodes (une sensible à l’oxygène et

l’autre au TPMP). Le potentiel de membrane et la consommation d’oxygène sont modulés

progressivement par des concentrations variables et non-saturantes d’ADP régénérées par la

synthèse de glucose 6-phosphate en présence d’hexokinase (HK):

glucose + ATP → ADP + glucose 6-phosphate HK

Technique

Dans la cuve de mesure :

Volume (µl) Concentration finale

Milieu respiration qsp 2000

Glucose 20 mM

Nigéricine 80 ng/ml

Mitochondries isolées 1 mg

Roténone 5 µM

- Immerger l’électrode sensible au TPMP dans la cuve de mesure.

- Calibrer l’électrode par 4 additions successives de 0,5 µM de TPMP+ (attendre

stabilité entre chaque addition).

- Démarrer la mesure par l’ajout de 5 mM de succinate.

- Ajouter 125 µM d’ATP.

- Stimuler progressivement la respiration par l’ajout de concentrations croissantes et

non-saturantes d’hexokinase (5 – 180 mUI/ml).

- Dissiper le potentiel électrique par l’ajout de 2 µM de FCCP

Réactifs

184

Milieu de respiration (pH 7,4) :

- KCl : 0,895 g

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- HEPES : 0,0408 g

- EGTA : 0,038 g

- MgCl2 : 0,0407 g

- sérum albumine : 0,3 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,4.

Triphenylmethylphosphonium (TPMP; 10 mM) :

- TPMP : 1,8 mg

- eau distillée : qsp 0,5 ml

Succinate (1,25 M):

- acide succinique : 737 mg

- tampon respiration : qsp 5 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

ATP (8,4 mM) :

- ATP : 5,07 mg

- eau distillée : qsp 1 ml

Glucose (0,5 M) :

- glucose : 90 mg

- eau distillée : qsp 1 ml

Nigéricine (80 µg/ml éthanol)

Roténone (2,5 mM):

- roténone : 1 mg

- éthanol/DMSO (volume/volume) : 1 ml

185

Carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP; 8 mM) :

- FCCP : 2 mg

- éthanol : qsp 1 ml

186

FICHE TECHNIQUE N° 9

DETERMINATION DE LA SYNTHESE D’ATP PAR

SPECTROPHOTOMETRIE

Selon la technique de Cairns et al. (1998).

Le principe du dosage repose sur la transformation de l’ATP produit par la mitochondrie en

NADPH par l’utilisation d’un système d’enzyme.

hexokinase

glucose + ATP → ADP + glucose 6-phosphate

glucose 6-phosphate + NADP → NADPH + gluconate-6-phosphate

G 6-PDH

Les variations d’absorbances du NADPH, mesurés au spectrophotomètre, sont directement

proportionnelles au taux de synthèse d’ATP.

Technique

Dans un tube à hémolyse :

Volume (µl) Concentration finale (mM)

Milieu respiration qsp 1000

Glucose 1

NADP 0,5

Mitochondries isolées 200 µg

Hexokinase 0,9 U

G 6-PDH 1 U

- Rajouter un substrat (malate + pyruvate, succinate … aux concentrations utilisées

pour l’oxygraphie).

- Incuber 1 minute à 37°C.

- Démarrer la réaction en ajoutant 300 µM d’ADP.

Faire le même dosage avec 3 µg/ml d’oligomycine dans le milieu réactionnel.

Cinétique d’ordre 1. i NADPH = 6220 M-1

. Cm-1

Réactifs

187

Milieu de respiration (pH 7,4) :

- KCl : 0,895 g

- Phosphate monopotassique : 1,36 g

- HEPES : 0,0408 g

- EGTA : 0,038 g

- MgCl2 : 0,0407 g

- Sérum albumine : 0,3 g

- Eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,4.

NADP (7 mM):

- NADP : 5 mg

- Eau distillée : qsp 1 ml

Glucose (500 mM):

- glucose : 90 mg

- Eau distillée : qsp 1 ml

ADP (30 mM):

- ADP : 7,52 mg

- Eau distillée : qsp 0,5 ml

Oligomycine (0,6 mg/ml éthanol)

Hexokinase (5 U/ml d’eau distillée)

Glucose 6-phosphate déshydrogénase (G 6-PDH; 10 U/ml d’eau distillée)

188

FICHE TECHNIQUE N° 10

DETERMINATION DU RAPPORT ATP/O

Le principe du dosage consiste à déterminer l’efficacité de la phosphorylation oxydative en

dosant sur un même échantillon de mitochondries, le taux de synthèse d’ATP et la

consommation d’oxygène correspondante. Les différentes concentrations d’hexokinase (HK)

utilisées permettent de faire varier la quantité d’ADP fournie aux mitochondries et donc le

taux de synthèse d’ATP mitochondriale.

glucose + ATP → ADP + glucose 6-phosphate

HK

En retour ceci fait varier la consommation d’oxygène qui est dépendante de l’utilisation de la

force proton-motrice par l’ATP-synthéthase pour la phosphorylation de l’ADP. On obtient

donc différents points de rapport ATP/O qui décrivent une droite. En comparaison d’une

détermination du rapport ATP/O dans une respiration à l’état 3 (quantité saturante d’ADP),

l’avantage de cette technique est d’obtenir des taux de phosphorylation oxydative plus

physiologiques (intermédiaires entre un état 4 et un état 3).

Technique

Dans la cuve de mesure (oxygraphe) :

Volume (µl) Concentration finale

Milieu respiration qsp 2000

Succinate 5 mM

Roténone 5 µM

Mitochondries isolées 1 mg

ATP 125 µM

Glucose 20 mM

- Démarrer la mesure par l’ajout d’hexokinase (5 – 180 mUI/ml).

- Attendre un taux de respiration stable et prélever 3 aliquots de 200 µl de la solution

réactionnelle à 3 temps différents.

189

- Précipiter la solution dans 200 µl d’acide perchlorique (centrifugation 8000 g, 10

min). Neutraliser le surnageant et congeler à – 80°C.

dosage de l’ATP :

Dans un tube à hémolyse :

Volume (µl) Concentration finale (mM)

Milieu respiration 600

NADP 0,5

Surnageant 200

- Démarrer la réaction en ajoutant 0,1 UI de G 6-PDH.

- Incuber 1 heure à 37°C.

Cinétique d’ordre 1. i NADPH = 6220 M-1

. Cm-1

Réactifs

Milieu de respiration (pH 7,4) :

- KCl : 0,895 g

- phosphate monopotassique : 1,36 g

- HEPES : 0,0408 g

- EGTA : 0,038 g

- MgCl2 : 0,0407 g

- sérum albumine : 0,3 g

- eau distillée : qsp 100 ml

Ajuster à pH 7,4.

Roténone (2,5 mM):

- roténone : 1 mg

- éthanol/DMSO (volume/volume) : 1 ml

ATP (8,4 mM) :

- ATP : 5,07 mg

190

- eau distillée : qsp 1 ml

Glucose (0,5 M) :

- glucose : 90 mg

- eau distillée : qsp 1 ml

Succinate (0,5 M) :

- acide succinique : 737 mg

- tampon respiration : qsp 5 ml

Ajuster à pH 7,4 avec du KOH 5N.

Acide perchlorique (7%)

Hexokinase (5 U/ml d’eau distillée)

Glucose 6-phosphate déshydrogénase (G 6-PDH; 0,1 U/ml d’eau distillée)

191

FICHE TECHNIQUE N° 11

QUANTIFICATION DES CYTOCHROMES PAR

SPECTROPHOTOMETRIE

Selon les techniques de Ohnishi et al. (1966) et de Vanneste (1966).

Les cytochromes constituant la chaîne respiratoire possèdent des noyaux hémiques qui

transportent les électrons. Les formes réduite et oxydée des ces hèmes se distinguent par leur

spectre d’absorption. Le principe du dosage consiste donc à comparer le spectre d’une

solution de mitochondries oxydée et à celui d’une solution réduite à différentes longueurs

d’ondes caractéristiques des différents cytochromes.

Technique

- Préparer une solution de mitochondries isolées à 4 mg/ml.

- Oxyder 0,7 ml de la solution avec 4 µl H2O2.

- Réduire 0,7 ml de la solution avec quelques cristaux de dithionite de sodium.

- Déterminer le spectre de la solution réduite contre celui de la solution oxydé (sert de blanc)

entre 500 et 700 nm à température ambiante (25°C).

- La concentration des cytochromes est estimée par la mesure de la différence d’absorbance à

deux longueurs d’ondes.

cytochromes a+a3: 605-630 nm = 24 mM-1

cm-1

cytochromes b: 563-575 nm = 18 mM-1

cm-1

cytochromes c+c1: 550-540 nm = 18 mM-1

cm-1

192

FICHE TECHNIQUE N° 12

DOSAGE DE LA CONCENTRATION DE GLYCOGENE PAR

SPECTROPHOTOMETRIE

Selon la technique de Good et al. (1933).

Le principe repose sur l’extraction du glycogène du tissu par une digestion potassique (KOH

40%) et son hydrolysation en glucose par l’acide chlorhydrique. Le glucose est ensuite

transformé en (mono-imino-p-benzoquinone)-4 phénazone dont l’intensité de la coloration est

directement proportionnelle à la quantité de glucose.

Technique

Dans un tube à essai en verre :

- tissu (foie …) : environ 100 mg

- KOH 40% : 1 ml/100 mg tissu

- Mettre au bain-marie à 100°C pendant 30 min.

- Rajouter 4 volumes d’éthanol 95% (4 ml/100 mg tissu).

- Agiter (précipitation du glycogène) et conserver 12 heures à 4°C.

- Centrifuger 10 min à 10000 tr/min et à 4°C.

- Eliminer le surnageant et rincer le culot 2 fois à l’éthanol 95%.

- Hydrolyser le culot par 1 volume d’acide chlorhydrique 2N (1 ml/100 mg tissu)

pendant 3 heures au bain-marie à 100°C.

- Neutraliser (pH 7,5) l’hydrolysat avec du KOH 2N.

Le glucose obtenu est ensuite dosé au spectrophotomètre à 505 nm (Kit Roche/système

Hitachi). glucose oxydase

Glucose + O2 + H2O → gluconolactone + H2O2

peroxydase

H2O2 + amino-4 phénazone + phénol → (mono-imino-p-benzoquinone)-4 phénazone + 4 H2O

193

RESUME en français

Une perte de poids est une situation fréquemment rencontrée en médecine. Paradoxalement

quand elle est involontaire (dénutrition, hypercatabolisme), la consommation d’oxygène du

corps entier est augmentée. Cependant, les mécanismes biochimiques restent discutés. Nos

résultats montrent que la restriction calorique s’accompagne d’une diminution de l’activité de

la chaîne respiratoire et de la respiration de mitochondries hépatiques, proportionnelle à

l’intensité de la restriction calorique et fortement corrélée au taux plasmatique de leptine. A

l’inverse, chez le rat traité par dexaméthasone (modèle de dénutrition) il y a une augmentation

de la fuite de protons des mitochondries hépatiques et une anomalie in vivo de la

phosphorylation oxydative du muscle squelettique. Si ces modifications peuvent expliquer les

variations du métabolisme de base, l’adaptation à la restriction calorique semble aussi capable

de limiter la production de radicaux libres oxygénés.

TITRE en anglais

Mitochondrial energy metabolism during weight loss.

RESUME en anglais

Weight loss is frequently observed in clinical practice. When weight loss is unwanted

(undernutrition, hypercatabolism), whole body oxygen consumption is often increased, which

is paradoxical in face of anorexia. Our results show that food restriction induces a decrease in

liver mitochondrial respiration and respiratory chain activity, which is proportional to the

intensity of the food restriction, and may be mediated by leptin concentrations. Conversely, an

increase in liver basal proton leak and an impairment of in vivo oxidative phosphorylation in

the skeletal muscle are observed in rats treated with dexamethasone, which is a model of

acute undernutrition. These changes are likely to impact on resting metabolic rate, while

adaptation to food restriction probably limits ROS production.

SPECIALITE DOCTORALE

Biologie cellulaire et moléculaire

MOTS CLES

Dexaméthasone, dénutrition, foie, métabolisme énergétique, muscle squelettique, rat,

restriction calorique

CoQ Cyt c

Cyt b

Cyt a3Cyt c1 Cyt a

+ + ++ ++

- - -- --e

-

e- e

-

H+H

+H

+

NADH + H+

NAD+

FADH2

FAD

O2H2O

II I IV IIIe-

e-

H+

force proton-motrice gradient H+

potentiel de membrane

F0

F1 ATP synthase

fuite de

protons

H+

H+

ATP ADP + Pi

eessppaaccee iinntteerrmmeemmbbrraannaaiirree

H+

mmaattrriiccee mmiittoocchhoonnddrriiaallee

Figure 1. Chaîne respiratoire mitochondriale.

La chaîne respiratoire est localisée dans la membrane interne mitochondriale. Cette chaîne de transport d'électrons (e-) est

constituée de quatre complexes protéiques : complexe I (NADH-coenzyme Q oxydoréductase), complexe II (succinate-

coenzyme Q oxydoréductase), complexe III (coenzyme Q-cytochrome c oxydoréductase) et complexe IV (cytochrome c

oxydase). Le coenzyme Q (ubiquinone) et le cytochrome c sont des transporteurs d’électrons mobiles de la chaîne respiratoire.

La dégradation des métabolites (glucose, acides gras et acides aminés) résulte en la formation de coenzymes réduits (NADH +

H+ et FADH2) dont l'énergie sera convertie en ATP dans la mitochondrie. En effet, les coenzymes réduits mitochondriaux

cèdent leurs électrons à un système de transporteurs qui, par une cascade de réactions d'oxydo-réduction, amène ces électrons

jusqu'à l'accepteur final, l'oxygène moléculaire (O2). Le NADH, formé dans la matrice, cède ses équivalents réducteurs au

complexe I, accessible par la face interne de la membrane interne. Ils sont ensuite transportés par le coenzyme Q (CoQ)

jusqu’au complexe III. Finalement les électrons sont pris en charge par le cytochrome c (Cyt c) puis libérés dans le complexe

IV, où ils sont utilisés pour la réduction de l’oxygène en eau (H2O). Le FADH2 produit dans la matrice mitochondriale cède,

quant à lui, ses électrons au complexe II. Ils sont ensuite transportés par le coenzyme Q jusqu’au complexe III. Le

cheminement des électrons est ensuite identique à celui suivi par les électrons fournis par le NADH (cytochrome c - complexe

IV).

Au cours de ce transfert, des protons sont expulsés de la matrice vers l'espace intermembranaire (au niveau des complexes I, III

et IV; la membrane interne est imperméable aux protons) pour former un gradient de protons. Ce couplage chimio-osmotique

aboutit à un gradient électrochimique ou force proton-motrice, qui contient l'énergie d'oxydation. Il est constitué d'un gradient

de pH (la matrice devient plus basique) et d'un gradient de charges (la face matricielle de la membrane interne est chargée

négativement). Ce gradient électrochimique fournit la force nécessaire aux protons pour retourner dans la matrice au travers du

complexe F0-F1 ATP-synthéthase et permet ainsi la phosphorylation de l’ADP en ATP. La respiration et la phosphorylation de

l'ADP sont donc couplées via cette force proton-motrice.

Cependant ce couplage n’est pas parfait. Ainsi certains protons retournent dans la matrice sans passer par le complexe ATP-

synthéthase et ne servent donc pas à la phosphorylation de l’ADP. Cette fuite de protons nécessite donc le pompage de plus de

protons par la chaîne respiratoire (augmentation de la consommation d’oxygène). On distingue la fuite de protons basale (cf.

paragraphe I-A-1) et celle inductible (cf. paragraphe I-A-2). De même, le pompage de protons par la chaîne respiratoire se fait

avec une stœchiométrie variable (nombre de protons pompés par électron transféré; cf. paragraphe I-B-1). Une diminution de

l’efficacité de ce pompage nécessite donc le transfert de plus d’électrons par la chaîne respiratoire (augmentation de la

consommation d’oxygène). A l’inverse, une augmentation de l’efficacité de ce pompage s’accompagnera d’une diminution de

la consommation d’oxygène. Enfin, le nombre de molécules d’ADP phosphorylées par proton passant dans le complexe ATP-

synthéthase n’est pas constant (stœchiométrie H+/ATP; cf. paragraphe I-B-2). Par conséquent si l’efficacité de cette étape de

phosphorylation est diminuée, pour une consommation d’oxygène donnée la quantité d’ATP synthétisée sera diminuée.

Figure 2. Tracé d’oxygraphie.

Les différents tracés représentent la consommation d’oxygène de mitochondries isolées de foie en fonction du temps. Tracés

faits d’après les données de Nogueira et al (2002).

Tracé bleu : rats rendus hyperthyroïdiens (10 jours de traitement par 15 µg de T3/100 g poids animal); tracé rouge : rats rendus

hypothyroïdiens (6 semaines de traitement par 0,05 g de 6-n-propyl-2-thiouracil/100 ml d’eau de boisson); tracé noir : rats

témoins, non traités.

L’ajout d’ADP stimule la respiration. Dans ce cas la force proton-motrice est utilisée par le complexe ATP-synthéthase

pour permettre la phosphorylation de l’ADP en ATP. Il y a donc une forte demande en protons, ce qui nécessite une

augmentation de la quantité de substrat utilisée (augmentation de la consommation d’oxygène) pour alimenter la force proton-

motrice. Quand tout l’ADP est consommé le taux de la respiration diminue.

L’ajout d’oligomycine diminue la respiration. En effet l’oligomycine est in inhibiteur compétitif du complexe ATP-

synthéthase. Dans ce cas le retour des protons n’est plus possible via ce complexe. Cependant le maintient de la force proton-

motrice coûte de l’énergie (oxydation de substrat) car une partie du gradient de protons est consommé (fuite de protons; cf.

paragraphe I-A). Moins la fuite de protons est forte et plus la respiration est faible.

L’ajout de FCCP (molécule découplante) stimule fortement la consommation d’oxygène. En effet, sa structure

(molécule lipophile) lui permet de passer facilement la membrane interne mitochondriale. Etant chargée négativement, son

retour dans la matrice s’accompagne de protons. Tout se passe donc comme si la membrane interne devenait perméable aux

protons (dans le sens de l’espace intermembranaire vers la matrice). Il y a donc une forte stimulation de l’oxydation du substrat

pour compenser cette dégradation de la force proton-motrice. Plus la concentration en FCCP est importante et plus la

respiration est stimulée, jusqu’à atteindre un point de saturation des capacités de la chaîne respiratoire à oxyder (consommation

d’oxygène maximale). La consommation d’oxygène est donc le reflet de l’activité maximale de la chaîne respiratoire.

Quelle que soit la consommation d’oxygène considérée (stimulée par l’ADP, avec oligomycine ou sous FCCP), elle est

plus importante chez les rats hyperthyroïdiens (pente plus forte), plus faible chez les rats hypothyroïdiens et intermédiaire chez

les rats témoins. Selon Nogueira et al (2002) ceci s’explique par une différence de l’efficacité des pompes à protons en

fonction du statut thyroïdien. Ainsi, plus la stœchiométrie H+/e- est faible (hyperthyroïdiens < témoins < hypothyroïdiens) et

plus le taux d’oxydation du substrat (consommation d’oxygène) devra être important pour permettre un pompage de protons

suffisant pour compenser la consommation de la force proton-motrice par le complexe ATP-synthétase (synthèse d’ATP), par

la fuite de protons (respiration sous oligomycine) ou par le FCCP. A l’inverse plus l’efficacité des pompes est grand et moins

l’entretien de la force proton-motrice nécessitera une forte activité de la chaîne respiratoire (diminution de la consommation

d’oxygène). Cependant pour certains auteurs cette différence de respiration s’expliquerait plutôt par une différence d’intensité

de la fuite de protons (Harper et Brand, 1993). Ainsi, plus la fuite de protons est importante (hyperthyroïdiens > témoins >

hypothyroïdiens) et plus la consommation de la force proton-motrice sera importante, et par conséquent plus le taux

d’oxydation de substrat devra être élevé (augmentation de la consommation d’oxygène stimulée par l’ADP et sous

oligomycine). Toutefois, une telle augmentation de la fuite de protons aura moins d’impact sur le taux de la respiration

stimulée par l’ADP qu’une diminution de la stœchiométrie H+/e- et n’aura aucun impact sur une respiration stimulée par une

concentration saturante de FCCP.

oligomycine FCCP

quantité d’oxygène

dans le milieu ADP

temps

consommation d’oxygène (natomes O/min

par mg protéines mitochondriales)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 40 80 120 160 200 240

potentiel de membrane (mV)

Figure 3. Consommation d’oxygène en fonction du potentiel de membrane.

Les différentes courbes représentent la consommation d’oxygène sous oligomycine de mitochondries isolées de foie en

fonction du potentiel de membrane correspondant. Tracés faits à partir des données de Nogueira et al (2002) et de données

personnelles.

Tracé bleu : rats rendus hyperthyroidiens (10 jours de traitement par 15 µg de T3/100 g poids animal); tracé rouge : rats rendus

hypothyroidiens (6 semaines de traitement par 0,05 g de 6-n-propyl-2-thiouracil/100 ml d’eau de boisson); tracé noir : rats

témoins, non traités; tracé vert : rats témoins, non traités, dans ce cas la respiration est stimulée par l’ajout d’une concentration

non saturante de FCCP.

Le taux de respiration est modulée par l’ajout de concentrations croissantes et non saturantes de malonate (cette molécule

inhibe l’utilisation du succinate par la chaîne respiratoire et va donc inhiber progressivement la consommation d’oxygène). Le

point le plus haut sur chaque courbe correspond à la consommation d’oxygène à l’état 4-oligomycine sans malonate. Dans ces

conditions la respiration sert à maintenir la force proton-motrice dégradée par la fuite de protons. Cette titration permet donc

d’analyser la variation de la respiration dévolue à la fuite de protons en réponse à une variation du potentiel de membrane. Il

est à noter que les courbes ne sont pas linéaires et qu’à partir d’une certaine valeur de potentiel de membrane (valeurs les plus

hautes), une faible variation du potentiel de membrane s’accompagne d’une plus grande variation de la respiration.

En comparaison de la courbe des rats témoins, la courbe des rats hyperthyroïdiens est décalée vers la gauche, à l’inverse

celle des rats hypothyroïdiens est décalée vers la droite. Autrement dit plus le statut thyroïdien est élevé (hyperthyroïdiens >

témoins > hypothyroïdiens) et plus le taux de respiration pour un même potentiel de membrane donné est élevé. Ce qui signifie

que plus le statut thyroïdien est élevé et plus la consommation du gradient de protons est importante (augmentation de la fuite

de protons) et/ou moins la formation du gradient de protons est efficace (diminution de la stœchiométrie H+/e-).

L’ajout de FCCP (molécule découplante; cf. figure 2), induit à peu près les mêmes effets que chez les rats hyperthyroïdiens. En

effet, la courbe est décalée vers la gauche en comparaison de la courbe des rats témoins. Autrement dit, là encore, il y a une

augmentation de la perte d’énergie rédox (augmentation du taux d’oxydation pour maintenir une force proton-motrice donnée).

4H+

+ O2

eessppaaccee iinntteerrmmeemmbbrraannaaiirree

4H+

a3 a

Cub

CuaCyt c e

-

2H2O

4H+

mmaattrriiccee mmiittoocchhoonnddrriiaallee

Figure 4. Complexe IV ou cytochrome c oxydase.

Noyau

gène SOD

?

mitochondrie

gène PGC-1

leptine

transcription, traduction

O2ROS

gène COX IV

gène COX I

?

transcription, traduction

transcription, traduction

voie de régulation envisageable

membrane cellulaire

récepteurs membranaires

ROS

Figure 5. Action de la restriction calorique sur le métabolisme énergétique de mitochondries de foie

récepteur membranaire

métabolisme lipidique

transcription, traduction

H+

mitochondrie

gènes métabolisme

lipides

GRE

dexaméthasone

Noyau GR

GR : récepteur aux glucocorticoïdes

GRE : élément de réponse aux glucocorticoides

Figure 6. Mode d’action de la dexaméthasone sur le métabolisme énergétique de mitochondries de foie

Figure 7. Mode d’action de la dexaméthasone sur le métabolisme énergétique de mitochondries de muscle squelettique

Noyau

gène PPAR-α

PPAR-αtranscription, traduction GRE

mitochondrie

?

β-oxydation

cII

gènes oxydation acides gras transcription, traduction

H+/e-UCP

H+

GR: récepteur aux glucocorticoïdes

GRE: élément de réponse aux glucocorticoïdes

PPAR-α: récepteur gamma activé par les

proliférateurs des peroxysomes

PPARE: élément de réponse aux proliférateurs

des peroxysomes

ROS

PPARE

gènes ?

GRE

dexaméthasone

GR

ligand

voie de régulation assez probable

voie de régulation envisageable

production

Tableau 1

Etudes incluses dans la méta-analyse de Astrup et al (1999). Ces études comparent, la dépense

d’énergie de repos, normalisée pour la masse maigre, de personnes anciennement obèses

(Indice de Masse Corporelle ≥ 30) après avoir perdu du poids (IMC ≤ 27) à celle de sujets

contrôles n’ayant jamais été obèses (C).

La différence entre la valeur du métabolisme de base chez les personnes anciennement obèses

(O) et celle des sujets contrôles est exprimée en pourcentage.

n.s. = différence statistiquement non significative

Nombre de sujets : O/C Différence (%) : obèses après perte de

poids (O) comparés à des sujets

contrôles (C)

Référence

4/6 -7,7 n.s. Jung et al, 1981

5/5 -2,5 n.s. Shetty et al, 1981

5/6 1 n.s. Bessard et al, 1983

9/9 -8,4 n.s. Dulloo et al, 1989

9/6 12,3 n.s. Tremblay et al, 1989

9/9 -3,7 n.s. Golberg et al, 1991

6/6 -8,4 n.s. Bukkens et al, 1991

8/8 -4,7 n.s. De Peuter et al, 1992

18/14 -4,5 n.s. Amatruda et al, 1993

7/6 -6,5 P < 0.05 Lean et al, 1988

16/16 -7,1 P < 0.05 Shah et al, 1988

28/28 -8,0 P < 0.02 Astrup et al, 1996

Tableau 2. Métabolisme énergétique mitochondrial hépatique.

Durée et molécule Respiration en condition non-

phosphorylante

Respiration en condition

phosphorylante

Synthèse d’ATP et activité

enzymatique complexes de la chaîne

respiratoire

Référence

2 heures, corticostérone, rats âgés de

20, 35 et 60 jours.

Diminution pour l’ensemble des

substrats.

Diminution pour l’ensemble des

substrats.

Pas d’effet sur le rapport ADP/O. Jani et al, 1991

3 heures, dexaméthasone, rats. Pas d’effet Augmentation avec succinate. De

même pour la consommation

d’oxygène à l’état découplé (FCCP).

Wakat et Haynes,

1977

3 heures, dexaméthasone, rats. Pas d’effet Augmentation avec pyruvate/malate,

glutamate/malate et succinate mais pas

pour ascorbate/TMPD. De même pour

la respiration à l’état découplé (FCCP).

Allan et al, 1983

3 jours, dexaméthasone, rats

rachitiques.

Pas d’effet (ni sur la respiration à l’état

découplé: DNP) avec succinate.

Pas d’effet sur le rapport P/O avec

succinate.

Kimura et

Rasmussen, 1977

3 jours, corticostérone, rats âgés de 20,

35 et 60 jours.

Augmentation avec l’ascorbate/TMPD

(+31%; rats 20 jours).

Diminution avec le glutamate (-40%;

rats 35 jours) et augmentation avec le

succinate (+49%; rats 35 jours).

L’efficacité de la phosphorylation

oxydative (ADP/O) était diminuée

pour l’ensemble des substrats et des

rats (exception faite de glutamate, rats

60 jours; succinate, rats 20 jours et

ascorbate/TMPD, rats 20 jours).

Jani et al, 1991

6 jours, cortisone, rats.

Diminution de la respiration avec α-

cétoglutarate, succinate et

TMPD/ascorbate.

Diminution du rapport P/O avec α-

cétoglutarate, succinate et

TMPD/ascorbate.

Kimberg et al, 1968

7 jours, acétate de cortisone, rats mâles

et femelles, âgés de 2 à 16 mois.

Augmentation avec le succinate

uniquement chez les animaux femelles.

Diminution de l’efficacité de la

phosphorylation oxydative (avec

succinate et pyruvate) chez les

femelles et les mâles (âgés de 12-16

mois).

Kerppola, 1960

Tableau 3. Métabolisme énergétique mitochondrial musculaire.

Durée et molécule Respiration en condition non-

phosphorylante

Respiration en condition

phosphorylante

Autres paramètres Référence

Injection in vitro de

methylprednisolone, prednisone,

dexaméthasone, hydrocortisone,

cortisone et testostérone,

mitochondries de muscle squelettique.

Pas d’effet. Diminution avec

pyruvate/malate et testostérone.

Diminution avec pyruvate/malate et

succinate mais pas ascorbate/TMPD

(methylprednisolone). De même pour

la respiration à l’état découplé.

Diminution avec pyruvate/malate

(prednisone, dexaméthasone,

hydrocortisone testostérone mais pas

cortisone).

Diminution du rapport ADP/O

pyruvate/malate et succinate mais pas

ascorbate.

Mesurant l’activité du NADH

oxydase, NADH – cytochrome c

réductase, NADH – ferricyanide

réductase, succinate oxydase, et

succinate – cytochrome c réductase et

le taux des cytochromes (a, a3, b et c +

c1), les auteurs concluent que l’effet de

la methylprednisolone peut se situer au

niveau du coenzyme Q et du transport

du succinate dans la

mitochondrie/TMPD.

Martens et al, 1991

11 jours, acétate d’hydrocortisone,

rats.

Pas d’effet sur l’activité spécifique de

la COX, quel que soit le muscle étudié

(quadriceps blanc, quadriceps rouge et

plantaris).

Marone et al, 1994

14 jours, acétate de corticostérone,

rats.

Pas d’effet (sur homogénat) avec

pyruvate et palmitate, ceci quel que

soit le muscle étudié (plantaris, soleus,

vastus rouge, vastus blanc et

ventriculaire).

Capaccio et al,

1985

21 jours, triamcinolone, lapins. Diminution (- 50% avec α-

cétoglutarate et glutamate) pour les

mitochondries isolées de gluteus

medius. Pas d’effet sur mitochondries

isolées de muscles de types de fibres

plus oxydatives (soleus et gluteus

minimus).

Pas d’effet sue le RCR ou sur

l’efficacité de la phosphorylation

oxydative. Incapacité des

mitochondries de gluteus medius à

oxyder le β-hydroxybutyrate.

Vignos et Greene,

1973

Table 1. Oligonucleotide pairs used for quantitative PCR.

Gene Sense primer (5’-3’) Antisense primer (5’-3’)

SOD GTTGTGGTGTCAGGACAGAT CGGCCAATGATGGAATGCTC

COX I CTACTTCTCTCACTGCCAGT CAGATGTAAAGTAGGCTCGG

COX IV GTGACTACCCCTTGCCTGAT GGTTGACCTTCATGTCCAGC

PGC-1 CAGCTTTCTGGGTGGATTGA GCTGCATTCATTGTAGCTGA

β-ACTIN TCCAGGGAGGAAGAGGATGC CACCCTGTGCTGCTCACCGA

-15

-10

-5

0

5

10

0 25 50 75

Wei

gh

t ch

ang

e (

%)

Food restriction intensity (%)

FIG. 1. Relation of weight change with intensity of FR for each rats (n=6 per group). There

was a significant correlation (y = -0.181x + 3.964; r = 0.97; P<0.0001).

0

5

10

15

20

25

30

120 130 140 150 160 170 180 190

Oxyg

en c

on

sum

pti

on

(n

ato

mes

O/m

in p

er m

g p

rote

in)

Membrane potential (mV)

FIG. 2. Relationship between oxygen consumption rate and membrane potential in non-

phosphorylating liver mitochondria from control and FR rat. Control (■); 25% FR (-); 50%

FR (●); 75% FR (○).

Table 2. Absolute values and correlation between state 3, state 4-oligomycin and uncoupled state of respiration and the intensity of food

restriction (FR).

Respiratory substrate CON 25% 50% 75% Correlation (r)

State 3

Pyruvate + malate 41 ± 12 33 ± 8 32 ± 5 25 ± 11 -0.52 *

Palmitoyl-l-carnitine + malate 68 ± 18 66 ± 9 59 ± 12 57 ± 7 -0.51 *

Glutamate 56 ± 12 55 ± 8 50 ± 9 43 ± 7 -0.51 *

Glutamate + succinate 119 ± 28 114 ± 17 108 ± 20 90 ± 13 -0.48 *

Ascorbate + TMPD 118 ± 31 121 ± 16 112 ± 18 103 ± 14 -0.29

State 4-oligomycin

Pyruvate + malate 9.5 ± 1.5 11.4 ± 3.8 11.4 ± 2.7 8.6 ± 3.1 -0.10

Palmitoyl-l-carnitine + malate 14.6 ± 4.6 12.2 ± 4.0 14.1 ± 2.9 13.2 ± 3.1 -0.22

Glutamate 12.7 ± 3.3 10.3 ± 3.8 10.3 ± 2.3 8.4 ± 1.3 -0.48 *

Glutamate + succinate 19.9 ± 8.6 15.9 ± 9.9 16.1 ± 5.8 13.2 ± 1.9 -0.31

Ascorbate + TMPD 101.6 ± 44.9 94.4 ± 20.2 87.0 ± 17.1 70.6 ± 7.3 -0.19

Uncoupled state

Pyruvate + malate 46 ± 9 39 ± 13 40 ± 8 31 ± 9 -0.46 *

Palmitoyl-l-carnitine + malate 107 ± 37 104 ± 31 88 ± 28 88 ± 12 -0.51 *

Rates of respiration are expressed in natomes O/min per mg mitochondrial protein in control (CON), 25% FR (25%), 50% FR (50%) and 75%

FR (75%) rats. Values are means ± SD ; n = 6 each. * P < 0.05.

Table 3. Absolute values and correlation between ATP synthesis rate and ATP/O ratio and the intensity of food restriction (FR).

Respiratory substrate CON 25% 50% 75% Correlation (r)

ATP synthesis

Pyruvate + malate 93 ± 22 65 ± 27 52 ± 25 58 ± 20 -0.48 *

Palmitoyl-l-carnitine + malate 118 ± 42 80 ± 30 100 ± 27 97 ± 28 -0.12

Glutamate 52 ± 16 47 ± 7 43 ± 10 30 ± 9 -0.47 *

Glutamate + succinate 103 ± 64 95 ± 15 114 ± 27 115 ± 32 -0.19

Ascorbate + TMPD 78 ± 19 66 ± 32 63 ± 25 72 ± 19 -0.10

ATP/O

Pyruvate + malate 2.2 ± 0.8 2.0 ± 1.1 1.6 ± 0.5 2.3 ± 1.2 -0.44

Palmitoyl-l-carnitine + malate 1.7 ± 0.4 1.2 ± 0.3 1.7 ± 0.7 1.7 ± 0.5 0.12

Glutamate 0.9 ± 0.3 0.8 ± 0.2 0.8 ± 0.5 0.7 ± 0.2 -0.48 *

Glutamate + succinate 0.9 ± 0.4 0.8 ± 0.3 1.1 ± 0.6 1.3 ± 0.6 0.30

Ascorbate + TMPD 0.7 ± 0.3 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.7 ± 0.3 0.04

Rates of ATP synthesis are expressed in nmoles/min per mg mitochondrial protein in control (CON), 25% FR (25%), 50% FR (50%)

and 75% FR (75%) rats. Values are means ± SD ; n = 6 each. * P < 0.05.

35

† †

†

†

30

25

20

Food

intake

(g)

15

10

5

0

1 2 3 4 5

Days

Fig. 1. Daily food intake over the first 5 days of treatment (mean ± SD; n = 6; † P < 0.01 vs.

control). ∆, control; ♦, dexamethasone-treated rats rats

115

‡ ‡ ‡ ‡

†‡

†‡ †‡

†‡

†‡

†‡

110

105

Relative

body

weight (%)

100 ‡ 95

90

85

80

75

70

1 2 3 4 5 0 6

Days

Fig. 2. Body weight changes over the 6 treatment days (mean ± SD; n = 6; † P < 0.0001 vs.

control rats; ‡ P < 0.0001 vs. pair-fed rats). ■, pair-fed; ∆, control; ♦, dexamethasone-treated

rats.

Table 1.

Phosphorylated compounds in skeletal muscle of dexamethasone (DEX)-treated, pair-fed (PF) and control (CON) rats in fed and fasted states.

DEX-treated PF CON

Fed Fasted Fed Fasted Fed Fasted

pH 7.15 ± 0.05 7.15 ± 0.02 7.15 ± 0.04 7.15 ± 0.04 7.15 ± 0.03 7.16 ± 0.02

PCr content (mmol/l) 32.7 ± 1.1 a

32.4 ± 0.8 a

35.5 ± 0.9 34.3 ± 0.5 b

35.8 ± 0.7 36.0 ± 0.9

ATP content 9.8 ± 0.4 a

9.0 ± 0.6 b c

8.7 ± 0.3 9.2 ± 0.6 b c

8.7 ± 0.3 8.5 ± 0.4

ADP (mmol/l) 0.029 ± 0.003 a

0.028 ± 0.004 a

0.019 ± 0.003 0.022 ± 0.003 b c

0.018 ± 0.003 0.018 ± 0.002

Pi (mmol/l) 3.6 ± 0.8 5.9 ± 1.5 a c

3.7 ± 0.3 3.4 ± 0.4 3.3 ± 0.6 3.9 ± 0.7

∆GATP (kJ/mol) -44.08 ± 0.64 a

-42.65 ± 0.7 a c

-44.80 ± 0.37 -44.71 ± 0.54 -45.22 ± 0.61 -44.67 ± 0.58

Values are mean ± SD; n = 6; a P < 0.05 compared with PF and CON rats of the identical nutritional status;

b P < 0.05 compared with CON rats

of the identical nutritional status; c P < 0.05 Anova interaction between treatment and fasting.

Table 2.

Magnetisation transfer measurements of γ-ATP synthesis from PCr (ka) and β-ADP synthesis from β-ATP (kb) in skeletal muscle of

dexamethasone (DEX)-treated, pair-fed (PF) and control (CON) rats in fed and fasted states.

DEX-treated PF CON

†

Fed Fasted Fed Fasted Fed Fasted

Rate constant ka (s-1

) 0.57 ± 0.03 a

0.61 ± 0.13 a 0.42 ± 0.04 0.40 ± 0.07 0.39 ± 0.04 0.38 ± 0.04

PCr to γ-ATP flux (mmol/l. s-1

) 18.7 ± 1.1 a

19.8 ± 4.3 a

14.8 ± 1.8 13.9 ± 2.4 14.1 ± 1.4 13.7 ± 1.2

Rate constant kb (s-1

) 0.79 ± 0.18 0.63 ± 0.22 0.77 ± 0.26 0.82 ± 0.02 0.87 ± 0.2 0.67 ± 0.16

β-ATP to β-ADP flux (mmol/l. s-1

) 7.6 ± 1.7 5.8 ± 3.1 6.6 ± 2.1 7.6 ± 0.7 7.6 ± 1.7 5.7 ± 1.4

Values are mean ± SD; n = 6; a P < 0.005 compared with PF and CON rats of the identical nutritional status.

Table 3.

Plasma hormone and metabolite concentration of dexamethasone (DEX)-treated, pair-fed (PF) and control (CON) rats in fed and fasted states.

DEX-treated PF CON

Fed Fasted Fed Fasted Fed Fasted

Non-esterified fatty acids (µM) 885 ± 199 a

1213 ± 196 a c

485 ± 146 615 ± 46 348 ± 80 646 ± 73 c

β-hydroxybutyrate (µM) 146 ± 42 250 ± 66 a c

126 ± 74 759 ± 263 c

116 ± 53 578 ± 158 c

Insulin (nM) 6.1 ± 3.5 a

5.9 ± 3.9 a

1.9 ± 0.5 2.2 ± 1.1 2.2 ± 1.6 1.9 ± 1.0

Leptin (ng/ml) 5.3 ± 1.3 a

6.7 ± 3.6 a

0.8 ± 0.6 b

0.5 ± 0.1 3.6 ± 1.2 0.9 ± 0.5 c

†

Values are mean ± SD; n = 6; a P < 0.05 compared with PF and CON rats of the identical nutritional status;

b P < 0.05 compared with CON rats

of the identical nutritional status. c P < 0.05 Anova interaction between treatment and fasting.

Table 4. Absolute values and correlation between plasma T3, rT3 and leptin

concentration and the intensity of food restriction (FR).

Hormone CON 25% 50% 75% Correlation (r)

Leptin 3.9 ± 1.2 1.6 ± 0.8 1.5 ± 0.7 0.6 ± 0.2 -0.82 †

T3 1.06 ± 0.22 0.85 ± 0.08 0.82 ± 0.05 0.79 ± 0.15 -0.56 *

rT3 0.11 ± 0.02 0.10 ± 0.02 0.12 ± 0.02 0.12 ± 0.04 -0.12

T3 and rT3 concentrations are expressed in nmol/l, leptin concentration is expressed in ng/ml

in control (CON), 25% FR (25%), 50% FR (50%) and 75% FR (75%) rats. Values are means

± SD ; n = 6 each. * P < 0.05 ; † P < 0.0001.

Table 5. Absolute values and correlation between SOD, PGC-1 and subunits I, IV and

VII of COX gene transcripts and the intensity of food restriction (FR).

Gene CON 25% 50% 75% Correlation (r)

COX I 123 ± 30 206 ± 69 185 ± 29 204 ± 33 0.49 *

COX IV 21 ± 8 33 ± 10 31 ± 6 34 ± 3 0.51 *

SOD 41 ± 16 59 ± 11 64 ± 14 68 ± 11 0.62 ‡

PGC-1 (x 100000) 5 ± 2 13 ± 8 7 ± 2 13 ± 5 0.35

Quantification of gene transcripts are expressed of the cDNA copy number vs the β-actin

cDNA copy number in control (CON), 25% FR (25%), 50% FR (50%) and 75% FR (75%)

rats. Values are means ± SD ; n = 6 each. * P < 0.05; ‡ P < 0.005.

Table 6. Correlation analysis of leptin and T3 plasma concentration with mitochondrial

parameters.

Leptin (ng/ml) T3 (nmol/l)

Simple regression, r

State 3 respiration – pyruvate/malate 0.63 ‡ 0.49 *

Uncoupled state respiration – pyruvate/malate 0.54 * 0.36

State 3 respiration – palmitoyl-l-carnitine/malate 0.49 * 0.45 *

State 3 respiration – glutamate 0.59 ** 0.33

State 3 respiration – glutamate + succinate 0.62 ‡ 0.24

State 3 respiration – ascorbate/TMPD 0.40 0.04

State 4 respiration – glutamate 0.67 ‡ 0.41

State 4 respiration – glutamate + succinate 0.57 ** 0.25

State 4 respiration – ascorbate/TMPD 0.58 ** 0.20

ATP synthesis – pyruvate/malate 0.69 ‡ 0.46 *

ATP synthesis – glutamate 0.59 ‡ 0.15

Complex IV enzymatic activity -0.50 * 0.24

SOD -0.76 ‡ -0.52 *

COX I -0.70 ‡ -0.64 ‡

COX IV -0.67 ‡ -0.58 *

PGC-1 -0.64 ‡ 0.22

Liver mass 0.90 † 0.58 **

Liver / body weight ratio 0.81 † 0.56 *

Animal weight 0.60 ‡ 0.33

Parameters that were not included in the Table 6 were not correlated with leptin and T3.

* P < 0.05; ** P < 0.01; ‡ P < 0.005; † P < 0.0001.