medios de fermentacion biorreactores
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2. Microorganismos de importancia industrial y
formulación de medios de cultivo
2.4. Medios para fermentaciones industriales
2.4.1. Conceptos Generales
Investigación detallada para determinar el medio más adecuado en un proceso de fermentación
Todos los microorganismos (m.o.) requieren de agua, fuentes de: energía, carbón, nitrógeno; elementos minerales y posiblemente vitaminas, así como oxígeno si son aerobios
Elementos principales requeridos por las células microbianas
ELEMENTO
FUENTEFUNCIÓN
METABÓLICA
C Compuestos orgánicos, CO2
Componente principal del material celular
O O2, H2O, compuestos orgánicos, CO2
Componente principal del material celular
H H2, H2O, compuestos orgánicos
Componente principal del material celular
N NH4+, NO3, N2,
compuestos orgánicosComponente principal del material celular
S SO4-2, S2O3, HS-, S,
compuestos orgánicosComponente de la cis, met, pirofosfato de tiamina, coenzima A, ác. -lipólico
(Cont.)
ELEMENTO FUENTE FUNCIÓN METABÓLICA
P HPO4-2 Componente de los ácidos nucléicos,
ATP y otros nucleótidos y fosfolípidos
K K+ Principal catión orgánico dentro de la célula, cofactor de algunas enzimas
Mg Mg+2 Cofactor de muchas enzimas (particularmente cinasas) presente en paredes y membranas celulares
Ca Ca+2 Cofactor de enzimas; presente en exoenzimas importantes ( amilasas, proteasas), componente de las endoesporas (cadipicolinato)
Fe Fe+2 , Fe+3 Componente de los citocromos, proteínas fierro-azufre (ferredoxinas) cofactor de enzimas (hidratasa)
Criterios para crear un medio
1. Máxima productividad2. Máxima concentración de producto o biomasa3. Máxima velocidad de formación del producto4. Productividad mínima de productos
indeseables5. Económico, calidad consistente, fácilmente
disponible6. Problemas mínimos en otros aspectos:
aereación y agitación, extracción, purificación y tratamiento de desechos
Ejemplos de medios que cumplen con dichos criterios
Fuentes de carbono: Mieles de caña, mieles de remolacha,
cereales, almidones, glucosa, sacarosa y lactosa
Fuentes de nitrógeno: Sales de amonio, ureas, nitratos, licor de
maíz, harina de soya, desechos de rastros y residuos de fermentación
2.4.2. Formulación del medio
Fuente de Fuente de Otros
Carbón y + nitrógeno + requeri-
Energía mientos
Biomasa + Productos + CO2 + H2O + Calor
celular
2.4.2. Formulación del medio
Cooney (1981): Demostró que algunos nutrientes
frecuente-mente están adicionados en exceso, ejem: P y K, y otros muy cerca de los valores límite (ejem: Zn y Cu)
Incrementos en P, incrementan la capacidad buffer del medio
Es necesario poner una atención considerable al diseño del medio
2.4.2. Formulación del medio
Algunos m.o. no pueden sintetizar nutrientes específicos, ejem: aminoácidos, vitaminas y nucleótidos
Se identifica un factor específico de crecimiento que deberá incorporarse al medio en cantidades adecuadas como un componente puro o como el componente de una mezcla compleja
2.4.2. Formulación del medio
El carbono tiene un papel importante en la biosíntesis y generación de energía
Los requerimientos de carbono bajo condiciones aeróbicas se pueden estimar a partir del coeficiente de productividad celular (Y, SoKo) definido como:
Cantidad de material celular seco producidoCantidad de carbono del sustrato utilizado
Valores de Y para bacterias (Abbot y Clamen, 1973)
SUSTRATO Y
Metano 0.62
N. Alcanos 1.03
Metanol 0.40
Etanol 0.68
Acetato 0.34
Maleato 0.36
Glucosa (mieles) 0.51
2.4.2. Formulación del medio
Cooney (1979): Calculó Y teóricas para la biosíntesis de
penicilina G sobre la base de balances de materia y energía, analizando la estequiometría de la reacción:
a2C6H12O6 + b2NH3 + c2O2 + d2H2SO4 + e2PAA
n2PenG + p2CO2 + q2H2O (1)
2.4.2. Formulación del medio
La solución a la ecuación (1) es:
10/6 C6H12O6 + 2NH3 + ½ O2 + H2SO4 + C8H8O2
C16H18O4 N2S + 2CO2 + 9H2O
Y teórica = 1 g de penicilina G por g de glucosa
2.4.2. Formulación del medio
USO DE LA GLUCOSA CONSUMIDA
FERMENTACIÓN INTERMITENTE
FERMENTACIÓN SEMICONTINUA
Producción celular 28% 26%
Mantenimiento 61% 70%
Producción de penicilina
11% 6%
• Valor máximo de Y experimental = 0.053 g/g
2.4.2.1. Agua
En los procesos fermentativos se requieren grandes cantidades de agua limpia y de composición consistente, ya que:
Es componente mayor de todos los medios de fermentación
Es necesaria en muchos servicios auxiliares Factores a considerar:
pH Sólidos disueltos Contaminación del efluente Contenido mineral
2.4.2.2. Fuentes de energía y carbono
La energía para el crecimiento proviene de:
Oxidación de los componentes del medio Luz
La mayoría de los m.o. industriales son quimiorganotrofos
La fuente más común de energía es la fuente de carbono: carbohidratos, lípidos y proteínas
Algunos m.o. utilizan metano o metanol como fuente de carbono y energía
Crecimiento fototrófico
TIPO Donador de e-
Fuente de
carbono
Organismo
Fotoliotrofía H2O
H2S,S,H2
CO2
H2O
Plantas, algas verde azulesChromatiaceae, Chlorobiaceae
Fotoorganotrofía
Orgánico Orgánico Rhodospirillaceae
Crecimiento quimiotrófico
Tipo Donador de
e-
Aceptor de e-
Fte. de carbon
o
Organismo
Quimioorganotrofía
Org.
Org.Org.
Org.
O2
NO3-
SO4-2
Org.
Org.
Org.Org.
Org.
Pseudomonas, Bacilli, levadurasBacillus licheniformisBacterias reductoras de sulfatoClostridia, bacilos del ácido láctico, E. Coli, levaduras
Crecimiento quimiotrófico (cont.)
Tipo Donador de
e-
Aceptor de e-
Fte. de carbon
o
Organismo
Quimiolitotrofía H2
H2 S
H2 S
Fe+2
NH4+
NH2-
H2
H2
O2
O2
NO3-
O2
O2
O2
CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
Bacterias oxidantes de hidrógenoTiobacilosTh. DenitrificansTh. FerrooxidansNitrosomasNitrobacterMetanógenosAcetobacterium
Ejemplos de fuentes de carbón normalmente utilizadas
Carbohidratos: almidón de maíz, de cereales o de papas maíz y cereales parcialmente molidos preparaciones de glucosa a partir de
almidones hidrolizados malta (granos de cebada germinados
parcialmente y tratados térmicamente) sacarosa de caña o remolacha como melazas
(forma impura)
Composición de malta de cebada (carbohidratos) (Haris, 1962)
CARBOHIDRATO % b.s.
Almidón 58 – 60
Sacarosa 3 – 5
Azúcares reductores
3 – 4
Otros azúcares 2
Hemicelulosa 6 – 8
Celulosa 5
Análisis de melazas de caña y remolacha (Rhodes y Fletcher, 1966)
CARBOHIDRATO REMOLACHA
(% w/v)
CAÑA(% w/v)
Sacarosa 48.5 33.4
Rafinosa 1.0 0
Azúcar invertida 1.0 21.2
Ejemplos de fuentes de carbón normalmente utilizadas
Aceites vegetales comerciales
Oliva, maíz, semilla de algodón, linaza, soya, etc.
Son fuentes de carbono fundamentalmente como ácido oleico, linoleico y linolénico
Actúa como antiespumante en asociación con un agente surfactante
Ejemplos de fuentes de carbón normalmente utilizadas
Licor de maíz Subproducto en la extracción del almidón de
maíz Se utiliza principalmente como fuente de
nitrógeno, pero además contiene ácido láctico, azúcares reductores y polisacáridos complejos
Proteínas Albúmina bovina y harina de carne Se utilizan en la formulación de medios para la
producción de vacunas
Factores que influyen sobre la selección de la fuente de carbono
El producto principal que se desea obtener
La eliminación de impurezas de la fuente de carbohidratos
Legislaciones El método de preparación del medio,
particularmente la esterilización
Influencia de la fuente de carbono sobre la formación del producto
La velocidad a la cual la fuente de carbono es metabolizada puede influenciar la formación de biomasa o la producción de metabolitos primarios o secundarios
Crecimiento rápido por la presencia de altas concentraciones de azúcares rápidamente metabolizables genera baja productividad de metabolitos secundarios (Griseofulvina, Penicilina, Bacitracina, Estreptomicina y Actinomicina)
El problema se resuelve usando azúcares metabolizables más lentamente (lactosa) o con sistemas continuos y semicontinuos
2.4.2.3. Fuentes de nitrógeno
La mayoría de los m.o. industriales pueden utilizar fuentes orgánicas e inorgánicas de nitrógeno
Nitrógeno inorgánico: amoniaco (gas) o nitratos: condiciones
alcalinas sales de amonio: condiciones ácidas
Nitrógeno orgánico: Aminoácidos Proteína urea
Ejemplos de fuentes de nitrógeno
Licor de maíz Harina de soya Harina de cacahuate Harina de semillas de algodón Hidrolizado de caseína Desechos de rastro Harina de pescado Extracto de levadura
Factores que influyen sobre la selección de fuentes de nitrógeno
El amoniaco o ión amonio se prefiere como fuente de nitrógeno, pues la enzima nitrato reductasa es inhibida en presencia del mismo.
Además, el ión amonio controla la acción de ciertos sistemas enzimáticos en hongos para la incorporación de aminoácidos al m.o. (aminoácido permeasas)
Factores que influyen sobre la selección de fuentes de nitrógeno
En Aspergillus nidulans el amoniaco regula la producción de proteasas alcalinas y neutrales
La fuente de nitrógeno influye el patrón de fermentación. La producción de antibióticos puede ser inhibida por una utilización rápida del nitrógeno. Ejemplo: en la producción de polienantibióticos, la harina de soya es buena fuente de N.
Factores que influyen sobre la selección de fuentes de nitrógeno
Rhodes (1963) Demostró que la concentración óptima
de la fuente de nitrógeno disponible para la producción de griseofulvina varían en función de la forma del inóculo y del tipo de fermentador
Mejores fuentes de nitrógeno seleccio-nadas mediante planes de desarrollo
PRODUCTO PRINCIPAL FUENTE DE N
Penicilina Licor de maíz
Bacitracina Cacahuate granulado
Rivoflavina Digerido pancreático de gelatina
Novobiocina Solubles de destilería
Rifamicina Pharmamedia, Harina de soya, (NH4)2SO4
Giberalinas Sales de amonio y ftes. nats. de N vegetal
Butirosina Sangre seca o hemoglobina con (NH4)2SO4
Polienos Harina de soya
2.4.2.4. Minerales y vitaminas
a. Minerales En muchos medios Mg, P, K, S, Ca y Cl
son componentes esenciales en concentraciones tales que es necesario adicionarlos
Otros elementos como Co, Cu, Fe, Mn, Mo y Zn son esenciales pero están presentes como impurezas en otros ingredientes
Elementos traza requeridos por las células microbianas
Elemento
Función metabólica
Zn
Mn
NaClMo
Componente de la alcohol deshidrogenasa, fosfa-tasa alcalina, aldolasa, RNA y DNA polimerasaComponente de la superóxido dismutasa bacteria-na, PEP, carboxicinasa, citrato sintetasaRequerido por bacterias halofílicasRequerido por bacterias halofílicasComponente de la nitrato reductasa, nitrogenasa, formato deshidrogenasa
Elementos traza requeridos por las células microbianas (cont.)
Elemento
Función metabólica
Se
Co
CuCrNi
Componente de la glicina reductasa, formato deshidrogenasaComponente de la vitamina B12 y enzimas con
vitamina B12 (glutamato mutasa, metilmalonil CoA mutasa)Componente de la citocromo oxidasa y oxigenasasComponente de algunas formato deshidrogenasasComponente de la ureasa y del crecimiento autótrofo de bacterias que oxidan hidrógeno
Intervalos de concentraciones típicas de componentes minerales (g/dm3)
COMPONENTE INTERVALO
KH2PO4 1.0 – 4.0
MgSO4-7H2O 0.25 – 3.0
KCl 0.5 – 12.0
CACO3 5.0 – 17.0
FeSO4-4H2O 0.01 – 0.1
ZnSO4-8H2O 0.1 – 1.0
MnSO4-H2O 0.01 – 0.1
CuSO4-5H2O 0.003 – 0.01
NaMoO4-2H2O 0.01 – 0.1
Minerales
La concentración de los minerales puede ser muy crítica en ciertos procesos (metabolitos secundarios)
La concentración de fosfato inorgánico influye sobre la producción de bacitracinas, ácido cítrico, monomicina, novobiocina, oxitetraciclina, polienos, ristomiocina, rifamicina Y, estreptomicina y vancomicina
Minerales
Garner y col. (1950) sugirieron que una función importante del calcio en el medio de fermentación era precipitar el exceso de fosfatos inorgánicos y sugirieron que el calcio mejora indirectamente la productividad de estreptomicina
Minerales
Weinberg (1970): Mn, Fe y Zn son los minerales más críticos en
el metabolismo secundario La productividad del producto varía
linealmente con el logaritmo de la concentración del metal “clave” (No. atómico. 23-30, 42)
La relación lineal no se aplica a concentraciones insuficientes o tóxicas para el crecimiento
Elementos trazas requeridos en la obtención de metabolitos
PRODUCTO ELEMENTOS TRAZA
Bacitracina Mn
Riboflavina Fe, Co
Proteasa Mn
Actinomicina Fe, Zn
Cloramfenicol Fe, Zn
Elementos trazas requeridos en la obtención de metabolitos (cont.)
PRODUCTO ELEMENTOS TRAZA
Neomicina Fe, Zn
Acido cítrico Fe, M, Zn
Penicilina Fe, Zn, Cu
Griseofluvina Zn
Patulina Fe, Zn
Vitaminas
Muchas de las fuentes de carbono y nitrógeno contienen todas o algunas de las vitaminas necesarias
Para evitar una deficiencia de vitaminas es conveniente utilizar una mezcla cuidadosa de materiales
Cuando sólo se requiere de una vitamina, resulta más económico adicionarla en su forma pura
Ejemplos: uso de pantotenato de calcio en la formulación del medio destinado a la producción de vinagre y biotina para ácido glutámico
Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento
Compuesto Función metabólicaÁc. p-aminobenzóico
Biotina
Ac. fólico
Ac. nicotínicoAc. pantoténico
Precursor del tetrahidrofolato, utilizado en la transferencia de unidades de un carbonoCoenzima que participa en reacciones de carboxilaciónTetrahidrofolato necesario en la transferen-cia de unidades de un carbonoPrecursor de NAD y NADPPrecursor de coenzima A (portador de grupos de acilo)
Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento (cont.)
Compuesto Función metabólicaVitamina B2
Vitamina B6
Vitamina B1
Fosfato de piridoxal usado en reacciones de transminación y descarboxilaciónComponente de los grupos prostéticos FMN y FED de las flavoproteínasComponente del pirofosfato de tiamina en descarboxilasas, transaminasas y transcetolasas
Vitaminas y compuestos relacionado requeridos para el crecimiento (cont.)
Compuesto Función metabólica
Vitamina B12
Vitamina K
Coenzima M
Coenzima que intervine en reacciones de rearreglo (glutamato mutasa)Precursor de la menaqinona un portador de electrones (por ejemplo, fumarato reductasa)Interviene en la metanogénesis
Recirculación del nutriente
Los fermentadores continuos de gran escala, utilizados en la producción de SCP, se diseñan para operarse con recirculación de la alimentación líquida
Es necesario ajustar en forma adecuada los niveles de nutrientes
Buffers
El control de pH es extremadamente importante si se quiere alcanzar una productividad óptima
Se debe adicionar al medio de cultivo un compuesto que sirva como buffer
pH 7 Carbonato de calcio Los fosfatos juegan un papel importante
como buffers Uso balanceado de fuentes de carbono y
nitrógeno control de pH Control externo del pH: adición de amoniaco
o hidróxido de sodio y ácido sulfúrico
Adición de precursores y reguladores metabólicos al medio
Precursores
Inhibidores
Inductores
Manipulan el progreso de la
reacción
Regulan la generación
de producto en lugardel crecimiento de
m.o.
Precursores
Algunos compuestos químicos cuando se adicionan a ciertas fermentaciones se incorporan directamente dentro del producto deseado
Ejemplo: incremento de la productividad de penicilina (de 20 a 100 unidades/cm3) al adicionar licor de maíz
Precursores
Fenilmetilamina
contenida en el + Penicilina Bencil penicilina
licor de maíz (Penicilina G)
Precursores
Precursor Producto Microorganismo
Ac. Fenilacético
Ac. Fenoxiacético
Cloruro
Penicilina G
Penicilina V
Clorotetraciclina
Penicillium chrysogenumPenicilliumchrysogenumSrepomicesaureofaciens
Precursores (cont.)
Precursor Producto Microorganismo
D-treonina
Glicina
Ac. amino butírico
L-isoleuina
L-serina
L-isoleucina
Serratia MarscescensCorynebacteriumglycinophilumBacillus subtilis
Inhibidores
Al adicionar ciertos inhibidores a las fermentaciones se puede producir más de un producto específico o un producto metabólico intermedio
Ejemplo: producción de glicerolOH
CH3CH=O + Na+SO3- CH3CH
SO3-Na+
Inhibidores
Producto InhibidorEfecto
principalMicroorganis
moGlicerol
Tetraiclina
Ac. glutámico
Rifamicina B
Bisulfito de sodio
Bromuro
Penicilina
Di-etil barbiturato
Reprime la producción de acetaldehidoReprime la formación de ClorotetraciclinaPermeabilidad de la pared celularInhibe otras rifamicinas
S. cerevisiae
Streptomyces aureofaciens
Micrococcus glutamicusNocardia mediterranei
Inductores
La mayoría de la enzimas de interés industria son inducidas
Las enzimas inducidas son sintetizadas sólo en respuesta a la presencia en el medio de un inductor
El inductor normalmente es el sustrato para la enzima o un compuesto estructuralmente relacionado
Precursores
Enzima Inductor Microorganismo
-amilasa
Celulasa
Pectinasas
AlmidónMaltosa
Celulosa
Pectina
Aspergillus sppBacillus subtilis
Trichoderma virde
Aspergillus spp