practica biorreactores

8/11/2019 Practica Biorreactores

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE

ZACATEPEC

Practica 1:

PARAMETRO CINETICO DE LA INVERTAZA

Materia: BIORREACTORES

Alumnos:

Castillo Serrano Samantha

Gonzlez Mondragn Elizabeth G.

Ocampo Caldern Ana Cecilia

Palacios Talavera Aurelio Alejandro

Palomares Torres Silvia Guadalupe

Salgado Acosta Itzel

Grupo: WA

Ing.Bioqumica

Profesor:Dr. Francisco J. Hernndez Campos

11 de abril del 2014


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INTRODUCCION:

Los azcares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo

hemiacetal que le confiere la caracterstica de poder reaccionar con otros

compuestos. La determinacin de estos azcares se realiz con el objeto deobtener una curva de calibracin aplicando la tcnica de Miller o DNS (cido

dinitrosaliclico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azcares

reductores dando resultados colorimtricos que se pueden medir con una longitud

de onda de 575nm.

Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse

de forma inespecfica a otras molculas; los que no lo hacen, azucares no

reductores. El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cidodinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra,

seguido de la determinacin espectrofotomtrica a 540nm de los azcares

reductores. Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos

durante una fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin

enzimtica. Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la

capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cpricos (Cu2+).

Este mtodo prueba la presencia de un grupo carbonilo libre (C=O) el cual es

llamado azcar reductor. Esto implica la oxidacin del grupo funcional aldehdico

presente, por ejemplo la glucosa y el grupo funcional cetonico en la fructosa.

Simultneamente el acido 3,5 Dinitrosalicilico (DNS) es reducido a acido 3-

amino,5- nitrosalicilico, bajo condiciones alcalinas.

Oxidacin:

Grupo Aldehdo ------Grupo Carboxilo

Reduccin:

Acido 3,5 Dinitrosalicilico ------Acido 3- amino, 5-nitrosalicilico.


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MARCO TEORICO:

La capacidad enzimtica es en realidad la funcin de la enzima, es decir, la

capacidad que presenta sta para acelera una reaccin qumica, la cual se puede

determinar midiendo la cantidad de sustrato que desaparece o la cantidad de

producto formado por unidad de tiempo, lo cual nos lleva a conocer la velocidad de

reaccin. Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudindose tomar

la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos ms largos, el

progreso de la reaccin se aparta de la linealidad. Esta cada de la velocidad de

reaccin se debe a la disminucin significativa de la concentracin de sustrato.

Todas las reacciones qumicas son afectadas por diversos factores como el

aumento de concentracin del producto, cambios de pH, inactivacin del enzima,

fuerza inica y temperatura.

Efecto de las concentraciones de sustrato sobre la actividad enzimtica: La

velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin del sustrato

mientras la enzima no se encuentre saturada. A mayor concentracin del sustrato,

a una concentracin fija de la enzima se obtiene la velocidad mxima. Despus de

que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentracin del sustrato no

tiene efecto en la velocidad de la reaccin.

La actividad cataltica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de

reaccin, que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado

sustrato transformado frente al tiempo) en el tiempo cero. Inicialmente, las

reacciones transcurren linealmente, pudindose tomar la pendiente de esta recta

como velocidad inicial. A tiempos ms largos, el progreso de la reaccin se aparta

de la linealidad. Esta cada de la velocidad de reaccin se debe a la disminucinsignificativa de la concentracin de sustrato, aunque tambin pueden influir otros

factores como el aumento de la concentracin de producto, cambios de pH,

inactivacin del enzima, etc. La mxima fiabilidad en la determinacin de la

actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad

durante el tramo inicial de progreso lineal de la reaccin.


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EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

De forma general, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente es

proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo, segn:

v = Vmax[S] / (Km + [S]) = k'[E0] Vmax = kcat [E0]

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la

reaccin. La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Fig.

2). En el caso ms general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual

la actividad es mxima se denomina pH ptimo; dicho pH no tiene porqu coincidir

con el pH intracelular. La relacin entre el pH y la actividad depende del

comportamiento cido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima

(centro activo) pueden contener grupos funcionales cidos y bsicos, siendo su

grado de disociacin dependiente del pH, lo que determinar, entre otros

aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de unin del sustrato al

centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformacin del sustrato (kcat).

Los estudios cinticos a diferentes valores de pH nos proporcionan informacin

sobre el mecanismo cataltico de los enzimas y la naturaleza de los aminocidos

ms directamente implicados en la catlisis.


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Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica

La velocidad de una reaccin enzimtica vara al aumentar la temperatura de

acuerdo a lo indicado en la Fig. 3, donde se representa una tpica curva de

actividad enzimtica/temperatura. Tal dependencia refleja un doble efecto de la

temperatura: positivo a bajos valores, debido al incremento general que

experimenta la velocidad de cualquier reaccin qumica al hacerlo la temperatura,

y negativo a valores altos, debido a la desnaturalizacin trmica del enzima. Esto

es, la velocidad de una reaccin enzimtica se incrementa al aumentar la

temperatura dentro de un determinado rango, alcanzando un valor mximo a la

denominada temperatura ptima. A valores superiores la actividad disminuye

debido a que el enzima, como cualquier otra protena, sufre procesos de

desnaturalizacin y, por lo tanto, de inactivacin. Durante la fase de incremento

dela velocidad, la relacin entre sta y la temperatura viene determinada por la

ecuacin de Arrhenius:

v = k e -Ea/RT

ln v = ln k - Ea/RT

Ea es la energa de activacin, R la constante de los gases (1,9872 cal K-1 mol-1;

8,3145 J K-1 mol-1) y T la temperatura absoluta (K). El valor de Ea se puede

calcular a partir de la representacin de Arrhenius (Fig. 4).

Otro parmetro que se utiliza para cuantificar el efecto de la temperatura es el

coeficiente de temperatura (Q10), que se define, para una temperatura dada (p. ej.


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25 C), como el factor de incremento de la velocidad de reaccin cuando la

temperatura se incrementa 10 oC.

(Q10)t = vt+10/vt

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica

En la Fig. 4 se representa el efecto de la concentracin de sustrato sobre la

velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente. Este comportamiento

cintico, conocido como curva de saturacin hiperblica por el sustrato, constituye

la norma seguida por la mayora de los enzimas, los denominados enzimas

michaelianos. Como principal desviacin, algunos enzimas muestran curvas

sigmoideas, en vez de hiperblicas, de saturacin por el sustrato (caso de algunos

enzimas cooperativos o alostricos).

El anterior modelo cintico se ajusta a la ecuacin:

v = Vmax [S] / (Km + [S])

Donde Km es la constante de Michaelis e indica la afinidad del enzima por su

sustrato, y Vmax es la velocidad mxima e indica la capacidad cataltica.


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La determinacin de los anteriores parmetros cinticos (Vmax y Km) se puede

realizar utilizando las representaciones de Lineweaver-Burk (1/v : 1/[S]) y de

Eadie-Hofstee (v : v/[S]), (Fig. 5).

Ecuacin de Linewever-Burk: 1/v = 1/Vmax + Km/Vmax 1/[S]

Ecuacin de Eadie-Hofstee: v= Vmax Km v/[S]


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OBJETIVOS:

Determinar que parmetro cintico es adecuado para la actividad de lainvertasa.

Elaborar una curva de calibrado y calcular el coeficiente de extincin molarpara la determinacin de azucares reductores por el mtodo de DNS.

METODOLOGIA:

MATERIAL

* Matraz Volumtrico 250 ml

* Tubos de ensayo con rosca (6)

* Pipeta, 5.0 ml

* Termmetro 0 - 100 C

* Bao Mara

* Espectrofotmetro

* Gradilla* Agitador Magntico

* Vasos de precipitados 50, 100 y 250 ml

* Parrilla Elctrica

REACTIVOS

* Enzima (invertasa 0.0375 g/l)

* Solucin de sacarosa (10 g / l)

* Buffer de Fosfatos pH 7* Tartrato de sodio y potasio (2 gr)

* Solucin DNS (para el anlisis de azcares reductores)


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Para la preparacin de 1000 ml de una solucin 0.05 M de fosfato de potasio

bsico se pesaron 8.709 g del reactivo, disolver en cierta cantidad de agua en un

vaso de precipitado por separado, una ves disuelto por completo, verter en un

matraz volumtrico de 1 L, enjuagar el vaso para recuperar lo que queda en las

paredes del vaso y aforar hasta obtener un volumen de 1000 ml.

Medir el pH del fosfato de potasio monobsico con un potencimetro e ir

agregando poco a poco el fosfato de potasio dibasico hasta ajustar una solucin

con un pH de 7.

Ivertasa (solucin madre).

Para la preparacin de una solucin madre de invertasa (250 ml) con una

concentracin de 0.4 g/L se pesaron 0.0375 g de invertasa y se diluyo en un vaso

de precipitado utilizando el buffer de pH 7, verter en un matraz volumtrico de 250ml y aforar con el buffer de pH 7 hasta tener el volumen deseado.

* Soluci n de la enzim a de Trabajo.:

Preparar una solucin de la invertasa de trabajo (0,15 g / l) por dilucin de la

solucin madre (0,4 g / L) con 0,05 M de buffer a pH 7.

C1V1=C2V2 V1=C2V2 V1= (0.15g/L)(0.05L) = 0.01897 L = 18.97 ml

C1 (0.4g/L)

Medir 18.75 ml de la solucin madre de invertasa y aforar a 50 mL con el buffer pH

7.

* Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de reaccin:

De acuerdo a la Tabla 1, se preparan diferentes tubos de ensayo

FIG 7: Preparacin

de invertasa.


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Tabla 1.- Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad dereaccin.

TUBOSDE

ENSAYO

SOLUCION DEINVERTASA (0.15

g/L)

SOLUCIONBUFFER (PH 7

Y 0.05 M)

SOLUCION DESACAROSA (10 g/ L)

A 2 ml 0 2 mlB 2 ml 0.8 2 mlC 2 ml 0.6 2 mlD 2 ml 0.4 2 mlE 2 ml 0.2 2 mlF 2 ml 1 2 ml

1.-Preincubar los tubos de la A a la F a 55 C durante 5 minutos con la

invertasa y la sacarosa. Cada una deber contener 2 ml tanto de sacarosa e

invertasa y mezclar.

2.-Despus de que termin el tiempo de pre-incubacin, aadir 1 ml de solucin

de buffer de fosfatos pH 7. (Debido a que la tasa inicial se est midiendo, la

longitud de reaccin debe ser controlada con la mayor precisin posible).

3.-Al final del perodo de incubacin, agregar 4 ml de reactivo DNS se aaden a

cada uno de los tubos de ensayo en el mismo orden (condiciones alcalinas desolucin DNS deben detener la reaccin de hidrlisis de sacarosa).

4.-Una vez detenido la reaccin de hidrlisis, todos los tubos de ensayo se deben

sumergir en un bao de agua a 95 C durante 10 minutos. Medir la absorbancia

despus del enfriamiento.

FIG 8: Forma de llenar

los tubos.


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ANALISIS Y RESULTADOS:

DISCUSIN:Uno de los factores que afecto a la velocidad de la reaccin fue el tiempo, ya queal no tener todos nuestros tubos al mismo tiempo de incubacin, puede provocarvariaciones alta y no tener resultados seguros.

CONCLUCION:De acuerdo a nuestros resultados obtenidos podemos concluir que laconcentracin de sustrato se ajusto al parmetro cintico de lagmuir. Adems queen una reaccin enzimtica interviene de manera significativa diferentes factorescomo: pH, temperatura, tiempo y la concentracin de sustrato.

BIBLIOGRAFIA:http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdfhttp://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htmhttp://www.slideshare.net/nataliavvg/cinetica-25666624
http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdfhttp://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdfhttp://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htmhttp://www.slideshare.net/nataliavvg/cinetica-25666624http://www.slideshare.net/nataliavvg/cinetica-25666624http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htmhttp://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdfhttp://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdf


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Formula

t= ks ln (cs0/cs) + cs0-cs / max

Se toma el tiempo de 5, 10, 15, 20, 25 cada 5 minutos

Tiempo de 5 min

t= 14.4133 ln (20/ 18.97) + 20-18.97 / 0.3614 =4.4550

Tiempo de 10 min

t= 14.4133 ln (20/ 22.15) + 20-22.15/ 0.3614 =10.02

Tiempo de 15 min

t= 14.4133 ln (20/ 23.26) + 20-23.26 / 0.3614 =15.04

Tiempo de 20 min

t= 14.4133 ln (20/ 24.38) + 20-24.38 / 0.3614 =20.01

Tiempo de 25 min

t= 14.4133 ln (20/ 25.53) + 20-25.53 / 0.3614 =25.03


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LANWEVER

cs r Ycs Ya

0 0 0 0

4.1667 0.0372 0.2399 11.4678

8.333 0.1204 0.1200 8.3056

12.5 0.1713 0.08 5.8207

16.667 0.2165 0.0599 4.6189

b=ks / r max a= 2.9693 ks= 42.3521

ks= b (r max) b=36.6860 r max=0.3367

r max =Ya

LAGMUIR

Cs Cs / r

0 0

4.1667 47.2832

8.3333 69.213412.5 72.9713

16.667 76.9838

Ks= a (max)

max = Yb

a=39.882

b=2.7664

r2=0.7908

max= 0.3614

ks=14.4133


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EDDIE HOFFTIER

a= 0.3473 = ks

b= -12.8299 = r max

r2= 0.6856

Teorico

[sac] 0 [sac]

0 0

4.1667 3.73043

8.3333 7.7309

12.5 11.6407

16.667 15.5845

20.833 20.014325 24.8310

FORMULA: r= cso-cs / c

r= 0-0 /5 =0

r= 4.1667-3.7304 /5 =0.0872

r= 8.3333-7.7309 /5 =0.1204

r= 12.5-11.6407 /5 =0.1713

r= 16.667-15.5845/5 =0.2165

r= 20.833-20.0143 /5 =0.1637

r= 25-24.8310 /5 =0.0337

r/Cs r

0 0

0.0209 0.08720.0144 0.1204

0.0137 0.1713

0.0129 0.2165


16/16

y = 4.2879x + 0.1638

R = 0.7985

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

CONC / VALORES ABS

CONC / VALORES ABS

Linear (CONC /

VALORES ABS)

[C] ABS. 1 ABS. 2 PROMEDIO ABS.

0 0-000 0.000 0

0.2 0.031 0.035 0.036

0.4 0.051 0.050 0.050

0.6 0.071 0.071 0.071

0.8 0.088 0.089 0.08851 0.119 0.106 0.225

practica biorreactores

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