mbn (2011.-2012.) - skripta za vjeÅ½be

PREHRAMBENO BIOTEHNOLOKI FAKULTET

SVEUILITA U ZAGREBU

"MIKROBIOLOGIJA NAMIRNICA" VJEBE

(interni materijal)

Zagreb, 2012. godine

STUDENT: STUDIJ: MATINI BROJ: SKUPINA: AKADEMSKA GODINA:

Mikrobiologija namirnica 1

VJEBA 1 Datum odravanja vjebe:

ZADATAK

1. Bakterioloka pretraga uzorka vode za pie 1.1. Odreivanje broja ivih bakterija u uzorku vode 1.2. Odreivanje bakterija u uzorku vode

1.2.1. Koliformne bakterije Prethodni test 1.2.2. Fekalni streptokoki 1.2.3. Sulfito redukcijski klostridiji 1.2.4. Bakterije iz roda Salmonella (u 25 mL uzorka vode) 1.2.5. Bakterije iz roda Proteus

UVOD

Voda kao namirnica mora zadovoljavati norme propisane Pravilnikom o zdravstvenoj ispravnosti vode za pie. Voda za pie mora biti bez boje, okusa i mirisa, te ne smije sadravati tetne kemikalije niti patogene mikroorganizme. U pretrazi uzorka vode za pie vano je odrediti broj ivih bakterija. Vodu za pie

moemo podijeliti na: a) vodu iz vodoopskrbnih sustava ne smije sadravati vie od 10 ivih bakterija u

1 mL b) vodu iz javnih izvorita zatvorenog tipa (pumpe), koja ne smije sadravati

vieod 100 ivih bakterija u 1 mL otvorenog tipa (bunari,cisterne, potoci ), koja ne smije sadravati vie od 300 ivih bakterija u 1 mL Broj decimalnih razrjeenja koja je, prije istraivanja, potrebno napraviti ovisi o tome da li je uzorak vode poznatog ili nepoznatog podrijetla. U prvom sluaju treba napraviti 3 do 5, a u drugom do 8 decimalnih razrjeenja.

Dalje slijedi odreivanje bakterija u istraivanom uzorku vode. Koliformne bakterije su primarno nepatogene i normalno obitavaju u donjem

intestinalnom traktu (debelom crijevu) ovjeka i toplokrvnih ivotinja, gdje su odgovorne za pravilnu probavu hrane. Koliformne bakterije se izluuju fekalijama, te dospijevaju u otpadne vode, a preko njih u prirodne vode - recipijente otpadnih voda. Ukoliko su u fekalijama prisutne i patogene bakterije, one e takoer dospjeti zajedno s koliformnim bakterijama u otpadne i/ili prirodne vode. Mnoge patogene bakterije prisutne su u okoliu u niskim koncentracijama, te je njihova detekcija oteana. Stoga se koriste tzv. indikatorske bakterije za detekciju vjerojatne prisutnosti patogenih bakterija. Indikatorske bakterije su primarno nepatogene i prirodno se izluuju u velikom broju iz ljudskog i ivotinjskog intestinalnog trakta. Koliformne bakterije su najpodobnija skupina indikatorskih bakterija za ocjenu higijenske kvalitete vode. One su gram-negativne, tapiaste, nesporogene, aerobne ili fakultativno anaerobne, koje imaju sposobnost cijepanja laktoze. Njihovo dokazivanje provodi se primjenom KOLIMETRIJE (sastoji se od 3 testa: prethodni, potvrdni i zavrni te od IMViC testa (biokemijski test)).


Fekalni streptokoki su gram-pozitivne bakterije za ije dokazivanje nam je potreban pozitivan prethodni test iz kolimetrije te ih stoga na ovoj vjebi jo ne odreujemo.

Sulfito-redukcijski klostridiji su gram-pozitivni sporogeni tapii koji kod sporulacije poprimaju oblik vretena. Obligatni su anaerobi, to znai da ive u podlogama bez otopljenog kisika. Imaju sposobnost da reduciraju sulfit do sulfida koji zatim reagira sa soli odreenog tekog metala u podlozi i nastaje crni talog koji se taloi na porasle kolonije bakterija i oboji ih u crno.

Bakterije iz rodova Salmonella i Proteus su patogene, gram-negativne bakterije. Uobiajeni izvori Salmonella su ivotinje koje se uzgajaju zbog mesa, perad, sirovo mlijeko, jaja i proizvodi od jaja i drugo. U istraivanom uzorku vode bakterije iz roda Salmonella odreivat ete u volumenu od 25 mL.

PRAKTIAN RAD

Odreivanje broja ivih bakterija u uzorku vode POTREBNO:

Serija epruveta s po 9 mL fizioloke otopine, Bunsenov plamenik, pipete od 1 mL, 3 prazne Petrijeve zdjelice, hranjivi agar, vibro mikser, marker

POSTUPAK: 1. Epruvete s fiziolokom otopinom oznaite brojevima (npr. 1 do 5). 2. Sterilnom pipetom otpipetirajte sterilno 1 mL uzorka vode u epruvetu br. 1 s

fiziolokom otopinom. Upotrijebljenu pipetu odloite u staklenu posudu s prljavim pipetama. Uzorak vode razrijedili ste 10 puta, odnosno razrjeenje je 10-1.

3. Promijeajte na vibro mikseru epruvetu br. 1 i novom sterilnom pipetom prenesite iz nje 1 mL uzorka u epruvetu br. 2. Odloite upotrijebljenu pipetu. Uzorak je sada razrijeen 100 puta odnosno razrjeenje je 10-2.

4. Na prethodno opisani nain napravite preostala potrebna decimalna razrjeenja. 5. Uzmite tri sterilne prazne Petrijeve zdjelice i na poklopcima napiite brojeve zadnja

tri razrjeenja (npr. -3, -4 i -5). 6. Homogenizirajte sadraj u epruveti br. 5 i iz nje sterilnom pipetom prenesite 1 mL

uzorka u praznu Petrijevu zdjelicu na kojoj pie -5. 7. Istom pipetom iz epruvete br. 4, iji ste sadraj prethodno homogenizirali, prenesite

1 mL uzorka u Petrijevu zdjelicu na kojoj pie -4, a na isti nain prenesite 1 mL uzorka iz epruvete br. 3 u Petrijevu zdjelicu na kojoj pie -3.

8. Odloite pipetu u staklenu posudu s prljavim pipetama. 9. Rastopljeni hranjivi agar sterilno izlijte u Petrijevu zdjelicu i krunim pokretima

dobro promijeajte podlogu i uzorak kako bi se stanice mikroorganizama pravilno rasporedile.

10. Nakon to se podloga skrutne inkubirajte Petrijeve zdjelice pri 37 oC tijekom 24 do 48 sati.


Odreivanje bakterija u uzorku vode

Koliformne bakterije Prethodni test POTREBNO:

Bunsenov plamenik, pipeta od 10 mL, serija od 5 epruveta s briljant zelenim laktoza unim bujonom (BZLB)

POSTUPAK: 1. U svaku od 5 epruveta, s briljant zelenim laktoza unim bujonom, sterilno

otpipetirajte po 10 mL uzorka vode. 2. Stalak s epruvetama stavite na inkubaciju pri 37 oC tijekom 48 sati.

Sulfito redukcijski klostridiji POTREBNO:

Bunsenov plamenik, pipeta od 1 mL, epruveta sa sulfitnim agarom, prazna sterilna epruveta, vodena kupelj zagrijana na 80 C

POSTUPAK: 1. Stavite sulfitni agar na rastapanje. 2. U praznu sterilnu epruvetu sterilno otpipetirajte 1 mL uzorka vode i ostavite ga u

vodenoj kupelji tijekom 10 minuta pri 80 C. 3. Izvadite termostatirani uzorak vode iz vodene kupelji i uzmite rastopljeni sulfitni

agar. 4. Rastopljeni sulfitni agar sterilno prelijte u epruvetu s uzorkom vode. 5. Krunim pokretima homogenizirajte uzorak i podlogu u epruveti te epruvetu

ohladite pod mlazom hladne vodovodne vode sve dok se agar ne skrutne. 6. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati.

Bakterije iz roda Salmonella (u 25 mL uzorka vode) POTREBNO:

Bunsenov plamenik, pipeta od 10 mL, Erlenmeyer tikvica s 225 mL selenit bujona POSTUPAK:

1. Sterilnom pipetom otpipetirajte 25 mL uzorka vode u selenit bujon i dobro ga homogenizirajte.

2. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati. Bakterije iz roda Proteus POTREBNO:

Bunsenov plamenik, pipeta od 1 mL, epruveta s hranjivim bujonom POSTUPAK:

1. Sterilnom pipetom prenesite 1 mL uzorka vode u hranjivi bujon i dobro ga homogenizirajte.

2. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 24 sata.


REZULTATI I ZAPAANJA

Potpis voditelja vjebi:



ZADATAK

1. Pregled materijala s prole vjebe 1.1. Odreivanje broja ivih bakterija u uzorku vode (CFU vrijednost) 1.2. Odreivanje bakterija u uzorku vode

1.2.1. Koliformne bakterije Prethodni test (MPN indeks) 1.2.2. Fekalni streptokoki 1.2.3. Sulfito redukcijski klostridiji 1.2.4. Bakterije iz roda Salmonella 1.2.5. Bakterije iz roda Proteus

2. Bakterioloka pretraga uzorka vode za pie - nastavak 2.1. Koliformne bakterije Potvrdni test 2.2. Fekalni streptokoki 2.3. Bakterije iz roda Salmonella 2.4. Bakterije iz roda Proteus

UVOD

Jedan od produkata koji nastaje prilikom cijepanja laktoze pod djelovanjem koliformnih bakterija je CO2 koji se, ako je stvoren, nakuplja u Durchamovim epruveticama. Kako bismo prethodni test smatrali pozitivnim i nastavili sa slijedeim testom u kolimetriji dovoljno je da u samo jednoj epruveti doe do pojave plina CO2. Prema broju pozitivnih epruveta iz prethodnog testa, a iz tablice po Swaroopu, odreujemo MPN-indeks tj. najvjerojatniji broj koliformnih bakterija u 100 mL vode.

Budui da su sulfito-redukcijski klostridiji sporogene bakterije one su, ako su prisutne u uzorku, preivjele tretman u vodenoj kupelji, te su tijekom inkubacije porasle i reducirale sulfit prisutan u podlozi. Reakcijom nastalog sulfida i soli tekog metala, nastali crni talog istaloi se na porasle kolonije, pa ovisno o tome da li je dolo do pojave crno obojanih kolonija u podlozi moemo procijeniti da li je test pozitivan ili ne.


Selenit bujon je podloga za namnoavanje koja slui za dokazivanje bakterija iz roda Salmonella i Shigella u fekalno kontaminiranim uzorcima. Ova podloga djeluje na principu zadravanja normalne crijevne mikroflore u lag-fazi rasta dok neinhibirana Salmonella i Shigella ulaze u log-fazu rasta. Ukoliko je nakon inkubacije uzorka u selenit bujonu dolo do zamuenja i promjene boje, test je pozitivan i postupak odreivanja bakterija iz roda Salmonella se nastavlja.

Zamuenje hranjivog bujona, u koji ste u prvom koraku odreivanja bakterija iz roda Proteus, otpipetirali 1 mL uzorka vode, znak je porasta mikroorganizama u njemu. To je pozitivan test.

PRAKTIAN RAD

Odreivanje broja ivih bakterija u uzorku vode (CFU vrijednost) POTREBNO:

Broja kolonija (Colony counter), marker za pisanje po staklu POSTUPAK:

1. Uzmite 3 Petrijeve zdjelice s poraslim kolonijama bakterija i procijenite na kojem je od decimalnih razrjeenja poraslo priblino 30-300 kolonija.

2. Na odabranom decimalnom razrjeenju izbrojite porasle kolonije pomou brojaa kolonija (tokanjem markerom s donje strane Petrijeve zdjelice).

3. Iz izbrojenog broja kolonija, poraslih na hranjivoj podlozi, a prema donjem izrazu, izraunajte CFU vrijednost.

CFU => Colony-Forming Units ( jedinice koje tvore kolonije)

Odreivanje bakterija u uzorku vode

Koliformne bakterije Potvrdni test POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica, Petrijeva zdjelica s ljubiasto-crvenim unim agarom (LJCA)

POSTUPAK: 1. Pogledajte u koliko je, u seriji od 5 epruveta iz prethodnog testa, prisutan plin CO2

u Durchamovoj epruvetici te iz tablice po Swaroop-u oitajte MPN-indeks i zapiite ga u dnevnik rada.

2. Uzmite jednu od pozitivnih epruveta iz prethodnog testa. 3. Mikrobiolokom uicom sterilno iz epruvete uzmite malo uzorka i precijepite ga u

cik-cak potezima na ljubiasto-crveni uni agar u Petrijevoj zdjelici. 4. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati.


Tablica po Swaroop-u

Broj pozitivnih epruveta s laktoza bujonom

(s 10 mL uzorka vode)

MPN (Most Probable Number) indeks (najvjerojatniji broj koliformnih

bakterija u 100 mL vode) 0 -- 1 2 2 4 3 8 4 13 5 23

Fekalni streptokoki POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica, epruveta s Hanny-Norton bujonom POSTUPAK:

1. Uzmite jednu od pozitivnih epruveta iz prethodnog testa (iz kolimetrije). 2. Mikrobiolokom uicom sterilno iz epruvete uzmite malo uzorka i precijepite ga u

epruvetu s Hanny-Norton bujonom. 3. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati.

Bakterije iz roda Salmonella POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica, Petrijeva zdjelica s Willson-Blaire (bizmut-sulfitni) agar (WB-agar), Petrijeva zdjelica s Salmonella-Shigella agar (SS-agar)

POSTUPAK: 1. Uzmite Erlenmeyer tikvicu sa zamuenim selenit bujonom. 2. Mikrobiolokom uicom, sterilno iz tikvice uzmite malo uzorka i precijepite ga u

cik-cak potezima na Willson-Blaire agar u Petrijevoj zdjelici. 3. Na isti nain precijepite malo uzorka na podlogu Salmonella-Shigella agar. 4. Obje podloge inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati.

Bakterije iz roda Proteus POTREBNO:

Bunsenov plamenik, pipeta od 1 mL, tapi po Drigalskom, Petrijeva zdjelica s briljant zelenim agarom (BZA)

POSTUPAK: 1. Uzmite epruvetu sa zamuenim hranjivim bujonom 2. Sterilno otpipetirajte 0,1 mL uzorka hranjivog bujona na briljant zeleni agar u

Petrijevoj zdjelici. 3. tapi po Drigalskom umoite u alkohol i provucite ga kroz plamen te priekajte da

plamen na tapiu nestane. 4. tapiem razvucite otpipetirani uzorak u tankom sloju po cijeloj podlozi. 5. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati.



ZADATAK

1. Pregled materijala s prole vjebe 1.1. Odreivanje bakterija u uzorku vode

1.1.1. Koliformne bakterije Potvrdni test 1.1.2. Fekalni streptokoki 1.1.3. Bakterije iz roda Salmonella 1.1.4. Bakterije iz roda Proteus

2. Bakterioloka pretraga uzorka vode za pie - nastavak 2.1. Koliformne bakterije Zavrni test 2.2. Fekalni streptokoki 2.3. Bakterije iz roda Salmonella 2.4. Bakterije iz roda Proteus

UVOD

Ljubiasto-crveni uni agar je podloga koja inhibira rast gram-pozitivnih bakterija pa e prema tome koliformne bakterije, koje su gram-negativne, moi na njoj rasti. Kao pozitivan rezultat smatra se porast sitnih ljubiastih kolonija metalnog sjaja.

Nakon perioda inkubacije, a u sluaju pozitivnog rezultata na fekalne streptokoke, Hanny-Norton bujon e promijeniti boju iz ljubiaste u utu.

U drugom koraku pri odreivanju bakterija iz roda Salmonella nacijepili ste dvije podloge. Tipian pozitivan rezultat je porast crnih kolonija sa smeim rubom na Willson-Blaire agaru, a na Salmonella-Shigella agaru porast svijetlo smeih kolonija.

Pozitivan rezultat na briljant zelenom agaru, pri odreivanju bakterija iz roda Proteus, je porast u tankom sloju crveno obojanih kolonija uz promjenu boje podloge (iz ruiaste u zeleno utu).


PRAKTIAN RAD Odreivanje bakterija

Koliformne bakterije Zavrni test POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica, epruveta s briljant zelenim laktoza unim bujonom (BZLB), epruveta s kosim hranjivim agarom

POSTUPAK: 1. Uzmite Petrijevu zdjelicu s poraslim kolonijama na ljubiasto crvenom unom

agaru i sterilno, mikrobiolokom uicom, uzmite malo uzorka kolonije. 2. Precijepite uzorak (stresanjem uice) u podlogu briljant zeleni laktoza uni bujon. 3. Potom na opisani nain ponovno uzmite malo uzorka kolonije i precijepite u cik-

cak potezima po kosom djelu hranjivog agara u epruveti. 4. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati.

Fekalni streptokoki POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica, Petrijeva zdjelica s telurit agarom POSTUPAK:

1. Uzmite epruvetu s pozitivnim rezultatom u Hanny-Norton bujonu. 2. Mikrobiolokom uicom sterilno iz epruvete uzmite malo uzorka i precijepite ga u

cik-cak potezima na telurit agar u Petrijevoj zdjelici. 3. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 48 sati.

Bakterije iz roda Salmonella POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica bez petlje, 2 epruvete s Kligler-ovim eljeznim agarom (KA)

POSTUPAK: 1. Uzmite Petrijevu zdjelicu s poraslim kolonijama na Willson-Blaire agaru te sterilno

mikrobiolokom uicom bez petlje uzmite malo uzorka kolonije. 2. Uzorak precijepite u jednu epruvetu s Kligler-ovim eljeznim agarom tako da prvo

ubodete u donji dio podloge (stupi), a potom u cik-cak potezima nacijepite jo i po kosom dijelu podloge.

3. Uzmite malo uzorka kolonije porasle na Salmonella-Shigella agaru te ga na isti nain precijepite u drugu epruvetu s Kligler-ovim eljeznim agarom.

4. Inkubirajte obje podloge pri 37 oC tijekom 48 sati.


Bakterije iz roda Proteus POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica bez petlje, epruveta s Kligler-ovim eljeznim agarom (KA), epruveta s urea agarom

POSTUPAK: 1. Iz Petrijeve zdjelice s briljant zelenim agarom sterilno, mikrobiolokom uicom bez

petlje, uzmite malo uzorka porasle kolonije. 2. Precijepite uzorak u epruvetu s Kligler-ovim eljeznim agarom kao to je to

opisano kod odreivanja bakterija iz roda Salmonella. 3. Ponovno uzmite malo uzorka kolonije s briljant zelenog agara i precijepite ga u

epruvetu s urea agarom na isti nain kao i na Kligler-ov eljezni agar. 4. Inkubirajte obje podloge pri 37 oC tijekom 48 sati.





ZADATAK


1.1.1. Koliformne bakterije Zavrni test 1.1.2. Fekalni streptokoki 1.1.3. Bakterije iz roda Salmonella 1.1.4. Bakterije iz roda Proteus

2. Bakterioloka pretraga uzorka vode za pie - nastavak 2.1. Koliformne bakterije

2.1.1. IMViC test 2.1.2. Bojanje po Gramu

3. Upoznavanje s Pravilnikom o mikrobiolokoj ispravnosti namirnica 3.1. Priprema plana rada za mikrobioloku analizu

__________________________________________________

UVOD

U zavrnom testu kolimetrije oitava se da li je dolo do porasta kolonija mikroorganizama na kosom hranjivom agaru i da li je dolo do pojave plina u Durchamovoj epruvetici u briljant zelenom laktoza unom bujonu.

Ako je na telurit agaru dolo do porasta sitnih crnih kolonija, test na fekalne streptokoke smatra se pozitivnim.

Pozitivna reakcija na Kliglerovom eljeznom agaru (Salmonella) je pojava crvene kosine, zbog nastanka lunatih uvjeta prilikom oksidativne dekarboksilacije proteina u amine, i crne dubine (stupia), zbog nastanka plina H2S i stvaranja kiselina (kiseli pH).

Ista karakteristina reakcija na Kliglerovom eljeznom agaru moe se pojaviti i kod odreivanja bakterija iz roda Proteus, ali uz mogunost da dubina (stupi) bude crne boje zbog pojave plina H2S (H2S-pozitivan Proteus) ili ute boje ako nije dolo do stvaranja H2S pa je zbog nastanka kiselina indikator u podlozi promijenio boju u utu (H2S-negativan Proteus). Kod urea agara pozitivan rezultat je promijena boje podloge iz blijede u slabo crvenu (roza).

Pri odreivanju bakterija iz roda Salmonella i bakterija iz roda Proteus za nastavak njihove analize mogu se upotrijebiti razliiti biokemijski testovi pomou kojih se, na osnovi rezultata, moe potvrditi njihova prisutnost ili odsutnost u istraivanom uzorku vode. IMViC test je serija biokemijskih testova na osnovu kojih moemo razlikovati da li je u

istraivanom uzorku vode prisutna bakterija Escherichia coli ili bakterija Enterobacter aerogenes. Oitavanje rezultata svakog testa temelji se zapravo na vidljivoj promijeni boje indikatora kojega ili dodajemo u podlogu ili se on ve nalazi kao sastavni dio podloge.


Test na indol: Sve bakterije iz roda Escherichia stvaraju, prilikom rasta u tekuoj podlozi s triptofanom, uz pomo enzima triptofanaze, indol. Test na indol upravo se temelji na dokazivanju prisutnosti eventualno nastalog indola u podlozi s nacijepljenom bakterijom. Test metilnim crvenilom: Osniva se na injenici da neki mikroorganizmi pri fermentiranju glukoze stvaraju velike koliine kiseline i snizuju pH podloge sve do 4.5. Indikator metilno crvenilo slui za odreivanje pH vrijednosti podloge. Voges-Proskauer-ov test: Mnoge bakterije mogu previrati iste ugljikohidrate, ali konani proizvod moe biti razliit. Neki mikroorganizmi previru glukozu do konanog produkta acetilmetilkarbinola koji podlogu ini lunatom. Test na citrat: Utvrivanje sposobnosti bakterija da pri rastu na podlozi koja sadri citrat, isti koriste kao jedini izvor ugljika. Taj izvor ugljika u citratnom agaru jest natrijev citrat. Bromtimol modrilo, koji je sastavni dio podloge, slui kao indikator.

Osim IMViC testa potrebno je nainiti preparat obojan po Gram-u kako bi se i na taj nain tj. mikroskopski (vizualno) moglo vidjeti da li se radi o koliformnim bakterijama ili su u uzorku prisutne neke druge bakterije koje su izazvale pozitivne reakcije u kolimetriji (lane kolimetrijske reakcije). Na ovoj vjebi zapoinjete analizu odreene namirnice. Nju ete analizirati u nekoliko

koraka. Kao i za vodu tako i za namirnice postoje Pravilnici (Pravilnik o uvjetima u pogledu mikrobioloke ispravnosti kojima moraju udovoljavati ivene namirnice u prometu i Pravilnik o metodama obavljanja mikrobiolokih analiza i superanaliza ivenih namirnica) koji definiraju zahtjeve koje one moraju zadovoljavati da bi bile pogodne za konzumaciju. Prvo ete se dakle upoznati s tim Pravilnicima i na temelju njih nainiti plan za mikrobioloku analizu odreene namirnice (prethodni test, 1. korak).

PRAKTIAN RAD

Odreivanje bakterija

Koliformne bakterije IMViC test POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica s petljom i bez petlje, triptofan bujon, MR/VP bujon, Simons-ov citratni agar

POSTUPAK: 1. Uzmite epruvetu s kosim hranjivim agarom iz zavrnog testa na kojoj je dolo do

porasta kolonija mikroorganizama. 2. Mikrobiolokom uicom sterilno s kosog hranjivog agara uzmite malo uzorka

kolonije i precijepite ga u epruvetu s triptofan bujonom. 3. Na isti nain, prethodno uzevi ponovno malo uzorka s kosog hranjivog agara,

nacijepite ga u MR/VP bujon. 4. Jo jednom uzmite malo uzorka, ali sada mikrobiolokom uicom koja nema petlju,

te nacijepite na Simons-ov citratni agar tako da prvo ubodete u donji dio podloge (stupi), a potom jo u cik-cak potezima i na kosi dio te podloge.

5. Inkubirajte sve 3 podloge pri 37 oC tijekom 24 sata.


Bojanje po Gram-u POTREBNO:

Bunsenov plamenik, mikrobioloka uica, predmetno stakalce, kristal violet, lugol, etanol, safranin, destilirana voda, komadii filtar papira

POSTUPAK: 1. Predmetnicu dobro operite i osuite. 2. Upalite plamenik i predmetnicu odmastite provlaei ju par puta sa svake strane

kroz plamen, a potom ju pustite da se malo ohladi. 3. Na sredinu predmetnice kapnite kap destilirane vode. 4. Uzmite epruvetu s kosim hranjivim agarom iz zavrnog testa na kojem je dolo do

porasta mikroorganizama. 5. Sterilizirajte mikrobioloku uicu i vrh epruvete te uzmite malo uzorka poraslog

mikroorganizama (sa kosog hranjivog agara). 6. Mikrobioloku uicu s uzorkom uronite u kapljicu i razvucite po predmetnici u to

tanjem sloju te predmetnicu ostavite na zraku da se preparat osui. 7. Preparat fiksirajte drei predmetnicu par sekundi iznad plamena (iznad plamena

treba biti ona strana predmetnice na kojoj se ne nalazi preparat). 8. Predmetnicu stavite u posudicu za bojanje i pustite da se malo ohladi. 9. Nanesite prvo bojilo, kristal violet. Bojilo nanesite po itavom preparatu i ostavite

da stoji 1 minutu. 10. Nakon toga nanesite preko svega preparata lugolovu otopinu te ostavite da stoji 1

minutu. 11. Predmetnicu uhvatite s drvenom tipaljkom, ukosite ju i preparat isperite s

95%-tnim etanolom gotovo do istog ispirka (dok boja ne prestane kapati s preparata).

12. Operite preparat pod mlazom vodovodne vode. 13. Na vlani preparat dodajte safranin i ostavite da bojilo izreagira 3-5 minuta. 14. Nakon toga preparat operite pod mlazom vodovodne vode i posuite pomou filtar

papira. 15. Mikroskopirajte imerzionim objektivom (poveanja 100) uz primjenu imerzionog

sredstva.

Escherichia coli Enterobacter aerogenes Obojano po Gram-u (P=1000)


Upoznavanje s Pravilnikom o mikrobiolokoj ispravnosti namirnica

Pomou Pravilnika napravite plan za 1. korak u analizi vae namirnice.



ad 2.1.2. Mikroskopska slika pripravka bakterijske kulture obojanog po Gram-u

P=




ZADATAK


1.1.1. Koliformne bakterije Oitavanje rezultata IMViC testa 2. Analiza mikrobioloke ispravnosti istraivanog uzorka namirnice

2.1. Dokazivanje broja ivih bakterija u istraivanom uzorku namirnice 2.2. Odreivanje bakterija u istraivanom uzorku namirnice

UVOD

Jedna od prvih serija testova za odreivanje bakterija koje obitavaju u probavnom sustavu jesu IMViC reakcije.

Budui da na podlozi za primarnu izolaciju Enterobacter aerogenes stvara kolonije gotovo jednake kolonijama bakterije Escherichia coli, razlikovanje se u kontroli uzorka vode i namirnice provodi pomou serije biokemijskih testova (IMViC test). Test na indol: Test je pozitivan ako se dodatkom Kovaeva reagensa na povrini triptofan bujona pojavi crveni prsten. Test metilnim crvenilom: Nastanak crvene boje u podlozi nakon dodatka metilnog crvenila ukazuje na prisutnost dovoljne koliine kiseline da pH snizi do 4.4. Test je pozitivan. Voges-Proskauer-ov test: Pojava stabilne crvene boje u podlozi nakon dodatka reagensa (5% -naftola i 40% KOH) dokazuje prisutnost diacetila kao produkta oksidacije acetoina. Test je pozitivan. Test na citrat: Stvaranje modre boje u podlozi dokazuje prisutnost lunatih produkata. Test je pozitivan.

Ukoliko su rezultati pozitivni u prva dva testa, a negativni u druga dva tada je u istraivanom uzorku prisutna bakterija Escherichia coli. Ako su pak prva dva testa negativna, a druga dva pozitivna tada je prisutna bakterija Enterobacter aerogenes. Ukoliko nije prisutan niti jedan od navedena dva sluaja, tada se radi o prisutnosti lanih kolimetrijskih reakcija.

Lane kolimetrijske reakcije mogu uzrokovati: a) KVASCI: Candida pseudotropicalis i Saccharomyces fragilis b) Odreene gram-pozitivne tapiaste sporogene bakterije c) BAKTERIJA: Serratia plymouthica d) 2 bakterije u sinergistikoj zajednici


PRAKTIAN RAD

Oitavanje rezultata IMViC testa

Test na indol POTREBNO:

p-ksilen, Kovaev reagens, pipete od 1 mL, propipeta POSTUPAK:

1. Uzmite epruvetu s prole vjebe u kojoj je triptofan bujon i na kojoj pie I (za test na indol).

2. Pipetom oprezno, koristei propipetu, dodajte 1 mL p-ksilena, snano promukajte i malo priekajte da se vidi da li je na povrinu isplivao masni prsten indola (ekstrakcija indola iz vodene faze).

3. Zatim novom pipetom (pomou propipete) dodajte 1 mL Kovaeva reagensa. Ne mukati!

4. Pogledajte da li je dolo do pojave crvene boje prstena (pozitivan test) i rezultat zapiite u tablicu.

Test metilnim crvenilom POTREBNO:

Otopina metilnog crvenila, pipeta od 1 mL POSTUPAK:

1. Uzmite epruvetu s prole vjebe u kojoj je MR/VP bujon (za test metilnim crvenilom i Voges-Proskauer test).

2. Otprilike pola sadraja epruvete prelijte u praznu epruvetu jednu polovicu koristit ete za test metilnim crvenilom, a drugu za Voges-Proskauer test

3. U prvu epruvetu, s pola volumena podloge, pipetom dodajte 5 kapi metilnog crvenila.

4. Pogledajte da li je dolo do pojave stabilne crvene boje podloge (pozitivan test) i rezultat zapiite u tablicu.

Voges-Proskauer test POTREBNO:

5%-tni -naftol, 40%-tni KOH, pipete od 1 mL, propipeta POSTUPAK:

1. Uzmite drugu epruvetu (s drugom polovicom MR/VP bujona) i pipetom, pomou propipete, dodajte 0,6 mL (12 kapi) 5%-tnog -naftola te protresite.

2. Malo priekajte, a potom novom pipetom (pomou propipete) dodajte 0,2 mL 40%-tnog KOH i lagano protresite.

3. Provjerite nakon otprilike 10-15 minuta da li je dolo do pojave crvene boje podloge (pozitivan test) i rezultat zapiite u tablicu.

Test na citrat POSTUPAK:

1. Uzmite epruvetu s prole vjebe na kojoj pie C (test na citrat). 2. Pogledajte da li je dolo do promjene boje podloge u plavu (pozitivan test) i

rezultat zapiite u tablicu.


Dokazivanje broja ivih bakterija u istraivanom uzorku namirnice (samo za namirnice kod kojih je to Pravilnikom definirano) POTREBNO:

Serija epruveta s po 9 mL fizioloke otopine, Bunsenov plamenik, pipete od 1 mL, 3 prazne Petrijeve zdjelice, hranjivi agar, vibro mikser

POSTUPAK: 1. Pogledajte u vjebi 1 kako se rade decimalna razrjeenja pa sukladno tome nainite

potreban broj decimalnih razrjeenja za vau namirnicu (prvo razrjeenje tj. 10-1, ste ve prije napravili kao osnovno razrjeenje).

2. Prema postupku opisanom u istoj vjebi provedite odreivanje broja ivih bakterija u istraivanom uzorku namirnice.


Nacijepite potrebne hranjive podloge prema planu analize za vau namirnicu.


Tablica s tipinim rezultatima IMViC testa za Escherichia coli i Enterobacter aerogenes i za upisivanje rezultata vaeg oitavanja IMViC testa

Mikro- Test organizam

I MC VP C

Escherichia coli + + - -

Enterobacter aerogenes - - + +

Legenda: + pozitivan rezultat ; - negativan rezultat

Zakljuak: Na osnovi rezultata IMViC testa, u istraivanom uzorku vode za pie, prisutna je _______________________________________.




ZADATAK

1. Pregled materijala s prole vjebe 1.1. Dokazivanje broja ivih bakterija u istraivanom uzorku namirnice

(CFU vrijednost) 1.2. Odreivanje bakterija u istraivanom uzorku namirnice

2. Analiza mikrobioloke ispravnosti istraivanog uzorka namirnice 2.1. Odreivanje bakterija u istraivanom uzorku namirnice

3. Odreivanje bakterioloke istoe 3.1. Radne povrine - "Metoda brisa" 3.2. Posuda za opremanje namirnica - "Metoda ispirka"

UVOD

Pozitivan rezultat kod odreivanja koagulaza pozitivnih stafilokoka predstavlja porast crnih kolonija na ETGP agaru po Baird-Parkeru, a kod odreivanja bakterije Listeria monocytogenes pojava crne boje u podlozi Fraser 1 bujon.

Vrlo vaan podatak je i odreivanje bakterioloke istoe. U ovoj vjebi odredit ete koliko je bakterija prisutno po cm2 radne povrine (metoda brisa) i po cm3 posude za opremanje namirnica (metoda ispirka).


PRAKTIAN RAD

Dokazivanje broja ivih bakterija u uzorku namirnice (CFU vrijednost) (samo za namirnice kod kojih je to Pravilnikom definirano!) POTREBNO:

Broja kolonija, marker za pisanje po staklu POSTUPAK:

1. Uzmite Petrijeve zdjelice s poraslim kolonijama bakterija i procijenite na kojem od decimalnih razrjeenja je poraslo izmeu 30-300 kolonija.

2. Na podlozi s odabranim decimalnim razrjeenjem izbrojite porasle kolonije tokanjem markerom s donje strane Petrijeve zdjelice na brojau kolonija.

3. Iz izbrojanog broja kolonija, a prema donjem izrazu, izraunajte CFU vrijednost.

CFU => Colony-Forming Units (jedinice koje tvore kolonije )



Odreivanje bakterioloke istoe Radne povrine - "Metoda brisa" POTREBNO:

Sterilni aluminijski okvir (ablona), epruveta s 10 mL fizioloke otopine i tapiem na kraju kojega je namotana vata, sterilne Petrijeve zdjelice, pipete od 1 i 2 mL, Bunsenov plamenik, hranjivi agar

POSTUPAK: 1. Odmotajte pripremljeni sterilni aluminijski okvir (P = 45 = 20 cm2). 2. Odaberite slobodni dio povrine stola i prislonite okvir na stol. 3. Uzmite epruvetu u kojoj se nalazi fizioloka otopina i na vrhu koje se nalazi tapi

s vatom, gurnite tapi i uronite ga u otopinu 4. Izvadite tapi iz epruvete i s tako namoenim tapiem obriite povrinu stola koju

ste zatvorili aluminijskim okvirom. 5. tapi ponovno vratite u epruvetu, uronite ga u fizioloku otopinu i

homogenizirajte sadraj. 6. Iz tuljca izvadite 3 prazne sterilne Petrijeve zdjelice. 7. U dvije otpipetirajte po 2 mL suspenzije iz epruvete, a u treu 1 mL (ukupno pola

volumena suspenzije iz epruvete), te na poklopcima Petrijevih zdjelica oznaite volumene koje ste u njih otpipetirali.

8. Dodajte rastopljeni i na otprilike 45 C ohlaeni hranjivi agar u Petrijeve zdjelice, krunim pokretima homogenizirajte i priekajte da se podloga skrutne.

9. Inkubirajte na 37 C tijekom 24 do 48 sati.


Posuda za opremanje namirnica - "Metoda ispirka" POTREBNO:

20 mL sterilne fizioloke otopine, pipete od 10 mL, sterilne Petrijeve zdjelice, posuda za opremanje namirnica, Bunsenov plamenik, hranjivi agar

POSTUPAK: 1. U pripremljenu posudu ulijte 20 mL fizioloke otopine te krunim pokretima dobro

isperite njenu unutranjost. 2. Iz tuljca izvadite 3 prazne sterilne Petrijeve zdjelice. 3. U dvije otpipetirajte po 3 mL suspenzije iz posude, a u treu 4 mL (ukupno pola

volumena suspenzije iz epruvete), te na poklopcima Petrijevih zdjelica oznaite volumene koje ste u njih otpipetirali.

4. Dodajte rastopljeni i na otprilike 45 C ohlaeni hranjivi agar u Petrijeve zdjelice, krunim pokretima homogenizirajte i priekajte da se podloga skrutne.

5. Inkubirajte na 37 C tijekom 24 do 48 sati.





ZADATAK

1. Pregled materijala s prole vjebe 1.1. Odreivanje bakterija u istraivanom uzorku namirnice 1.2. Oitavanje rezultata bakterioloke istoe

1.2.1. Radne povrine - "Metoda brisa" 1.2.2. Posuda za opremanje namirnica - "Metoda ispirka"


UVOD

Kod odreivanja bakterije Listeria monocytogenes pozitivan rezultat je pojava crne boje u podlozi Fraser 2 bujon.

Metoda brisa i metoda ispirka jednostavne su metode za odreivanje bakterioloke istoe radnih povrina odnosno posuda za opremanje namirnica. Po Pravilniku o normativima mikrobioloke istoe i metodi njenog odreivanja ne smije biti vie od 1 ive bakterijske stanice po cm2 (radna povrina) odnosno ne vie od 1 ive bakterijske stanice u cm3 (posuda za opremanje namirnica).


PRAKTIAN RAD

Odreivanje bakterioloke istoe

Radne povrine - "Metoda brisa" Posuda za opremanje namirnica - "Metoda ispirka" POTREBNO:

Broja kolonija, marker za pisanje po staklu POSTUPAK:

1. Izbrojite porasle kolonije na podlozi u sve 3 Petrijeve zdjelice. Dobiva se broj bakterija u 5 mL (metoda brisa) odnosno u 10 mL (metoda ispirka) fizioloke otopine.

2. Taj broj pomnoite s 2 kako bi dobili broj bakterija u cijelom volumenu upotrijebljene fizioloke otopine tj. u 10 mL (metoda brisa) odnosno u 20 mL (metoda ispirka).

3. Konano, broj kolonija podijelite s povrinom stola koja je bila zatvorena aluminijskim okvirom (20 cm2), odnosno s volumenom upotrijebljene fizioloke otopine (20 mL). Tako e te dobiti broj bakterija po cm2 radne povrine (metoda brisa) i broj bakterija po cm3 (metoda ispirka).







ZADATAK

1. Pregled materijala s prole vjebe 1.1. Odreivanje bakterija u istraivanom uzorku namirnice


3. Mikotoksini 3.1. Izolacija iste kulture plijesni i uzgoj na podlozi za sporulaciju 3.2. Priprema supstrata (kukuruz u zrnu) 3.3. Priprema suspenzije spora plijesni Aspergillus parasiticus NRRL 2999 3.4. Brojenje spora u Thoma-ovoj komorici i priprema decimalnih razrjeenja 3.5. Nacjepljivanje suspenzije spora na supstrat (kukuruz u zrnu)

UVOD

Kod odreivanja bakterije Listeria monocytogenes pozitivan rezultat je porast crnih kolonija na podlozi Palcam agar.

Plijesni su vrlo esti kontaminanti namirnica. Opasne su po ljude i ivotinje zbog svoje sposobnosti da sintetiziraju razne mikotoksine. Najjai poznati toksin do danas, aflatoksin, proizvodi plijesan Aspergillus flavus. U slijedeih nekoliko vjebi provest ete postupak kvalitativnog i kvantitativnog odreivanja aflatoksina. Budui da su plijesni najei kontaminanti itarica, kao supstrat je izabrano zrno kukuruza na koji ete nacijepiti suspenziju s odreenom koncentracijom spora plijesni Aspergillus parasiticus. Prije toga potrebno je podesiti uvjete koji e pogodovati rastu plijesni i biosintezi mikotoksina. Prvo treba odrediti sadraj vode u zrnu kukuruza kako biste, dodatkom odreenog volumena vode, podesili vlanost na onu koja je idealna za rast ove plijesni i biosintezu aflatoksina. Poznato je da je najbolji rast plijesni i biosinteza mikotoksina kada je sadraj vode u supstratu 38% i ako je poetna koncentracija spora plijesni izmeu 105 i 107 spora/g kukuruza. Da bismo odredili koji volumen nainjene suspenzije spora plijesni ili odreenog razrjeenja te suspenzije treba nacijepiti na supstrat, posluit emo se metodom brojanja u Thoma-ovoj komorici. Nakon to se ona prethodno pravilno pripremi za rad moe se pristupiti brojanju spora plijesni, a potom se izrauna koliko je to spora/mL. Zatim se prerauna koliki volumen te suspenzije ili odreenog razrjeenja treba nacijepiti na 50 g supstrata kako bi koncentracija spora bila izmeu 105 i 107 spora/g kukuruza.


PRAKTIAN RAD



Mikotoksini

Priprema supstrata (zrno kukuruza) 1. Gravimetrijski, nakon suenja pri 105 C do konstantna mase, odredi se koliko

vrsti supstrat, zrno kukuruza, kojeg ete koristiti u istraivanju sadri vode. Pomou pravila zvijezde (vidi str. 44) izraunajte koji volumen vode trebate dodati da bi se koncentracija vode povisila na potrebnih 38%. Masa kukuruza je 50 g.

2. U pripremljenu Erlenmeyer tikvicu odvaite 50 g kukuruza i dodajte izraunati volumen vode kako bi vlanost podesili na 38%. Dobro protresite.

3. Pripremljeni supstrat stavite na sterilizaciju pri 121 C/20 minuta, a potom naknadno dodajte 1-2 mL sterilne vode koja se izgubila tijekom sterilizacije.

Priprema suspenzije spora plijesni Aspergillus parasiticus NRRL 2999 (za vrijeme rada obavezno je noenje zatitnih kirurkih maski)

1. U epruvetu s poraslom plijesni ulijte 9 mL fizioloke otopine. 2. Sterilnom uicom dobro postruite plijesan s povrine podloge tako da to vie

spora prijee u otopinu i da dobijete osnovnu suspenziju spora plijesni. 3. Od te suspenzije napravite dva decimalna razrjeenja (10-1 i 10-2) koristite

propipetu. Ovo drugo razrjeenje (10-2) koristit ete za brojanje u Thoma-ovoj komorici.

Brojanje spora u Thoma-ovoj komorici i priprema decimalnih razrjeenja Thoma-ovu komoricu i njezinu pokrovnicu prije pripreme preparata dobro operite.

Namoite vatu u HCl i prebriite ih. Isperite destiliranom vodom, potom etanolom, a na kraju acetonom. Priprema preparata za brojanje:

a) Thoma-ovu komoricu stavite na stol pored upaljenog plamenika. b) Uzmite sterilnu pipetu te pomou nje kap prethodno homogeniziranog

(10-2) razrjeenja suspenzije spora kapnite tono na mreicu. c) Uzmite pokrovnicu i prislonite njezin rub na jedno od susjednih polja

od polja na kojem se nalazi mreica te ju spustite preko kapljice na drugo susjedno polje.

d) Komoricu primite s obje ruke tako da s kaiprstima pridravate komoricu, a palevima lagano utrljavajte pokrovnicu povlaei ju naprijed-nazad sve dok se na dodirnim povrinama na oba susjedna polja ne pojave Newtonovi kolobari (pokrovnica je vrsto priljubljena i vie se ne moe pomicati).


Pojava Newton-ovih kolobara znai da je preparat dobro pripravljen (ostvaren volumen od 0,1 mm3) te moete pristupiti mikroskopiranju i brojanju spora plijesni. Ako u preparatu primijetite mjehurie zraka, pomicanjem pokrovnice istjerajte ih u susjedne lijebove jer na dobro pripremljenom preparatu ne smije biti mjehuria zraka.

Kad je preparat pripremljen stavite ga na stoli mikroskopa i mikroskopirajte prvo pomou objektiva poveanja 10, a potom pomou objektiva poveanja 40 pri kojem brojite spore plijesni u jednom velikom kvadratu (svaki 5 mali kvadrati na desnom i donjem rubu podijeljen je linijom po pola, to oznaava granicu jednog velikog kvadrata). Zapiite rezultat u dnevnik rada.

Nakon to svi studenti za radnim stolom izbroje spore u jednom velikom kvadratu, izraunajte srednju vrijednost broja spora u tom velikom kvadratu, a zatim taj rezultat izrazite kao broj spora/mL u vaem decimalnom razrjeenju.

Nakon brojanja, komoricu i pokrovnicu isperite destiliranom vodom i odloite u kutijicu.

Izbrojani broj spora/mL preraunajte na broj spora/mL u osnovnoj suspenziji. Zatim odredite koji volumen osnovne suspenzije ili odreenog decimalnog razrjeenja trebate nacijepiti na 50 g supstrata kako bi koncentracija spora plijesni bila izmeu 105 i 107 spora/g kukuruza.

Izraunati volumen dodajte u supstrat i stavite na inkubaciju pri 27 C. Prilikom dodavanja suspenzije spora obavezno stavite zatitnu kirurku masku i koristite propipetu.


ad 3.1.1.2. Mikroskopska slika pripravka bakterijske kulture obojanog po Gram-u

P=



ZADATAK

1. Pregled materijala s prole vjebe 1.1. Odreivanje bakterija u istraivanom uzorku namirnice

2. Mikotoksini - nastavak 2.1. Ekstrakcija (kloroformom) 2.2. Filtracija 2.3. Uparavanje 2.4. Kromatografija u koloni 2.5. Uparavanje 2.6. Tankoslojna kromatografija (TLC)

2.6.1. Nanoenje standarda mikotoksina i istraivanog uzorka na plou za TLC 2.6.2. Razvijanje ploe u sustavu otapala kloroform:aceton = 9:1 2.6.3. Kvalitativno odreivanje AFB1 u istraivanom uzorku

UVOD

Na proloj vjebi nacijepili ste supstrat (zrno kukuruza) sporama plijesni Aspergillus parasiticus. Nakon perioda inkubacije u tikvicu se dodaje 100 mL kloroforma kako bi se provela ekstrakcija sintetiziranog mikotoksina. Kloroform se dodaje zato jer je mikotoksin u njemu topljiv. Ostavi se stajati preko noi (24 sata) kako bi se to vie mikotoksina iz podloge otopilo u kloroformu. Nakon toga slijedi filtracija preko lijevka po Bchneru (u kojem se nalazi filtar-papir) spojenog na vakuum sisaljku. Na filtar-papiru u lijevku zaostaje micelij plijesni i kukuruz, a u tikvici kao filtrat dobivamo kloroform u kojem je otopljen mikotoksin. Filtrat zatim uparavamo do suha te dobiveni mikotoksin ponovno otapamo u odreenom volumenu kloroforma (npr. 5 mL) tako da dobijemo koncentriraniju otopinu mikotoksina. U kloroformu su uz mikotoksin prisutne i neistoe i druge tvari koje su se nale u supstratu. Zbog toga je potrebno taj kloroformski ekstrakt proistiti. Za to nam slui kromatografija u koloni.

Kromatografija u koloni je adsorpcijska metoda kod koje se toksin vee na nosa-silikagel. Nakon to se kolona pravilno napuni i u nju doda uzorak kloroforma s otopljenim mikotoksinom, toksin se vee na nosa-silikagel. Masti, neistoe i druge tvari se uklanjaju iz kolone petroleterom. Zatim u kolonu dodajemo kloroform kako bi mikotoksin, koji je ostao vezan na vrstom nosau, skinuli s nosaa te da se on otopi u kloroformu. Kloroformski ekstrakt skupljamo u Erlenmeyer tikvicu na izlazu iz kolone.

Nakon to ste proistili kloroformski ekstrakt, pomou kromatografije u koloni, on u sljedeem koraku ide ponovo na uparavanje. Uparava se do suha te se opet doda odreeni volumen kloroforma (npr. 5 mL) kako bi se dobila koncentriranija otopina te ju spremamo u tamnu boicu i uvamo u hladioniku na -18 C do odreivanja toksina.


Sada se moe pristupiti kvalitativnom odreivanju kojim emo vidjeti da li u tom ekstraktu ima mikotoksina ili ne. Za to nam slui metoda tankoslojne kromatografije (TLC). Na ploe od silikagela nanese se po 20 L uzorka, a na poetak ploe (1. jaica) standard mikotoksina prema kojem se usporeuje ispitivani uzorak tj. vidi se da li je u uzorku, nakon razvijanja ploe u sustavu otapala (kloroform:aceton = 9:1), stvarno prisutan mikotoksin ili ne. Toksin se vee na nosa - silikagel. Mrlje ovisno o svom afinitetu prema otapalu, u kojem razvijamo plou, putuju vie ili manje po ploi. Ozraivanjem, UV-lampom, provodi se vizualna usporedba fluorescencije mrlje istraivanog uzorka s mrljom standarda. Aflatoksin na silikagelu, obasjan UV svijetlom, fluorescira plavo-ljubiastu boju to moemo iskoristiti za njegovu detekciju. Svakoj mrlji na ploi moemo izraunati njezinu Rf vrijednost. Ukoliko je ona u definiranim granicama za aflatoksin, moe se zakljuiti da je u uzorku prisutan aflatoksin. Dakle, na osnovi izraunate Rf vrijednosti za odreenu mrlju i njezine usporedbe sa standardom aflatoksina, te na osnovi intenziteta i boje fluorescencije i oblika mrlje, dokazuje se prisutnost mikotoksina u istraivanom uzorku.

Kvantitativno odreivanje toksina moe se provesti pomou: fluorodenzitometrije, IR-spektroskopije, UV-spektroskopije, HPLC-a i ELISA metodom. Na sljedeoj vjebi upravo pomou ELISA metode kvantitativno ete odreivati aflatoksin u istraivanom uzorku.

PRAKTIAN RAD

Oitavanje rezultata IMViC testa

Opisi postupaka nalaze se pod vjebom 5.

Mikotoksini

Kromatografija u koloni 1. Prvo u kolonu dodajte petroleter. 2. Pravilnim slijedom paljivo napunite kolonu kako je prikazano na slici. 3. Dodajte u kolonu pripremljeni uzorak kloroforma s otopljenim toksinom. 4. Podesite protok na otprilike 20-30 kapi u minuti. 5. Nakon to petroleter doe na otprilike 2 cm od gornjeg sloja natrijevog sulfata

zaustavite istjecanje, prelijte prikupljeni ekstrakt u za to predvienu posudu i ulijte kloroform (nosa ne smije ostati suh).

6. Ponovno podesite protok na 20-30 kapi u minuti i ostavite da kloroformska faza istee do kraja.

7. U Erlenmeyer tikvici skupljajte proieni kloroformski ekstrakt s otopljenim mikotoksinom.


Svaki stupni kromatogram je odreen svojom R-vrijednou koja se izraunava prema izrazu:

Tankoslojna kromatografija (TLC Thin Layer Chromatography) 1. Uzmite plou za tankoslojnu kromatografiju (2020 cm) i pripremite ju za

nanoenje uzoraka. 2. Obradite struganjem rubove ploe. 3. Oznaite na povrini silikagela liniju fronte otapala. 4. Oznaite na definiranoj startnoj liniji mjesta nanoenja standarda i uzoraka.

Nanoenje standarda mikotoksina i istraivanog uzorka na plou za TLC (za vrijeme rada obavezno je noenje zatitnih kirurkih maski i zatitnih rukavica)

Pomou mikropipete polagano na plou nanesite 20 L standarda i 20 L vaeg uzorka. Nanesena mrlja mora biti pravilnog oblika i otprilike promjera oko 1 cm.

Razvijanje ploe u sustavu otapala kloroform:aceton = 9:1 (za vrijeme rada obavezno je noenje zatitnih kirurkih maski i zatitnih rukavica)

1. Nakon to ste na plou nanijeli uzorke (i standard) okomito ju stavite u pripremljenu kadicu za razvijanje koja je, prethodno, zasiena parama smjese otapala kloroform:aceton = 9:1.

2. Ostavite plou u kadici kako bi se razvila (otprilike 2 sata uz povremeni nadzor). 3. Kad otapalo doe do fronte otapala izvadite plou i ostavite ju na zraku da se osui

kako biste pod UV-lampom, pri odreenoj valnoj duljini, pogledali vae rezultate.


Rf = a/b < 1

Oitavanje rezultata tankoslojne kromatografije

1. Zamraite prostoriju kako biste to bolje vidjeli rezultate. 2. Uzmite razvijenu plou s prole vjebe. 3. Ukljuite UV-lampu i podesite ju na valnu duljinu od 366 nm. 4. Osvijetlite vau plou i pogledajte gdje se javljaju plavo-ljubiasta obojenja tj.

mrlje (prisutnost toksina). 5. Izmjerite udaljenost mrlje od startne linije vrijednost a. 6. Izmjerite udaljenost od startne linije do fronte otapala vrijednost b. 7. Izraunajte Rf vrijednost za tu mrlju i u dnevniku rada navedite da li je u vaem

uzorku prisutan aflatoksin.

Rf = a/b < 1 (za AFB1 = 0,4 0,6 u ovisnosti o smjesi otapala u kojoj se razvija ploa za TLC)


Tablica s tipinim rezultatima IMViC testa za Escherichia coli i Enterobacter aerogenes i za upisivanje rezultata vaeg oitavanja IMViC testa

Mikro- Test organizam

I MC VP C

Escherichia coli + + - -

Enterobacter aerogenes - - + +

Legenda: + pozitivan rezultat ; - negativan rezultat Zakljuak: Na osnovi rezultata IMViC testa u istraivanoj namirnici ________________ prisutna je _______________________________________.



TIJEK ISTRAIVANJA UZORKA U SVRHU KVALITATIVNOG I KVANTITATIVNOG DOKAZIVANJA BIOSINTEZE AFLATOKSINA



ZADATAK

1. Mikotoksini nastavak 1.1. Kvantitativno odreivanje AFB1 u istraivanom uzorku-ELISA test

UVOD

U mikrotitarske jaice s antitijelima specifinim za odreeni mikotoksin dodan je uzorak i konjugat mikotoksin obiljeen peroksidazom. U sluaju da je mikotoksin prisutan u uzorku, vezati e se s antitijelom mikotoksina u jaici i nastat e kompleks (antitijelo) (antigen) (konjugat antitijela obiljeena enzimom-peroksidazom). Nakon ispiranja, dodatkom supstrata dolazi do nastajanja obojenog kompleksa. Intenzitet boje koja se razvija, je obrnuto proporcionalan koliini mikotoksina u uzorku. Reakcija se zaustavlja dodatkom kiseline te se konaan intenzitet boje oitava na spektrofotometru pri valnoj duljini od 450 nm.

ELISA-test: U mikrotitarske jaice u kojem se nalazi antigen (mikotoksin), dodaju se specifina antitijela za taj mikotoksin, (1), a zatim antiimunoglobulinska antitijela obiljeena enzimom (konjugat) (2). Nakon toga se doda supstrat, koji u nazonosti enzima mijenja boju.


PRAKTIAN RAD

ELISA test

1. Otpipetirati u odgovarajuu mikrotitarsku jaicu: 100 L svakog pojedinog standarda (odreene poznate koncentracije) i uzorka u zasebnu jaicu i odmah zatim 50 L antitijela aflatoksina B1 u svaku jaicu.

2. Njeno protresti mikrotitarsku ploicu, prekrit folijom i ostaviti 1 sat pri sobnoj temperaturi u mraku.

3. Istresti tekuinu iz mikrotitarske ploice. 4. Isprati mikrotitarske ploice 3 puta s razrijeenim puferom za ispiranje. 5. Otpipetirati 100 L konjugata u svaku jaicu 6. Njeno protresti mikrotitarsku ploicu, prekrit folijom i ostaviti 1 sat pri sobnoj

temperaturi u mraku. 7. Isprati mikrotitarske ploice 3 puta s razrijeenim puferom za ispiranje. 8. Otpipetirati 100 L supstrata u svaku jaicu. Njeno protresti i ostaviti 20 min na

sobnoj temperaturi u mraku. 9. Zaustaviti reakciju dodatkom 100 L STOP reagensa.

10. Mjeriti optiku gustou na 450 nm. 11. Iz oitanih optikih gustoa, nacrtati badareni dijagram, gdje e na y osi biti

podaci optike gustoe pri 450 nm, a na x osi poznate koncentracije standarda aflatoksina B1 (kojima smo sada oitali optiku gustou) izraene u ppb (pg/mL)

12. Iz badarnog dijagrama oitati nepoznatu koncentraciju aflatoksina B1 u uzorku (imamo dobivenu optiku gustou).

Ostali mikotoksini u namirnicama, takoer se odreuju ELISA-metodom, uz male izmjene, prema uputama kitova specifinih za te odreene mikotoksine.




Hrana Mikotoksin Najvie doputene koliine

mikotoksina (g/kg jestivog djela)

Kikiriki, ljenjak, sueno voe za direktno konzumiranje ili za ugradnju

u prehrambeni proizvod B1 Aflatoksini B1+B2+G1+G2

2,0 4,0

Kikiriki prije sortiranja ili fizikalne obrade

B1 Aflatoksini B1+B2+G1+G2

8,0 15,0

Ljenjak i sueno voe prije sortiranja ili fizikalne obrade


5,0 10,0

itarice i proizvodi od itarica za direktnu konzumaciju ili ugradnju u

proizvod


Okratoksin

2,0 4,0 3,0

itarice osim kukuruza ukljuujui heljdu i riu prije sortiranja ili

fizikalne obrade


Okratoksin

2,0 4,0 5,0

Kukuruz prije sortiranja ili fizikalne obrade


Okratoksin

5,0 10,0 5,0

Sueno voe od loze (groice) Okratoksin 10,0

Zelena prena kava i proizvodi od kave, vino, pivo, sok od grejpa, kakao

i proizvodi od kakaa Okratoksin

B1 Aflatoksin 5 5

Mlijeko (sirovo i za obradu) i proizvodi od mlijeka M1 Aflatoksin 0,05

Zaini, ajevi B1 Aflatoksini B1+B2+G1+G2 5,0 10,0

Voni sok, nektar i drugi napitci koji u svojem sastavu imaju jabuni ili

voni sok Patulin 50,0

Koncentrat vonog soka nakon pripreme prema uputama proizvoaa Patulin

50,0 Alkoholna pia, jabukovaa i ostala

fermentirana pia dobivena od jabuke ili sadre jabuni sok

Patulin 50,0

Proizvodi od jabuke ukljuujui kompot i pire za direktnu

konzumaciju Patulin 25,0

Jabuni sok, proizvodi od jabuke ukljuujui kompot i pire deklarirano

za dojenad i malu djecu Patulin 10,0

Djeja hrana i proizvodi na bazi itarica za dojenad i malu djecu (1 )

B1 Aflatoksin Okratoksin

0,1 0,5

Djeja hrana i proizvodi na bazi mlijeka ( 2 ) M1 Aflatoksin 0,025

Hrana za posebne medicinske namjene i dojenad ( 3 )

B1 Aflatoksini M1

Okratoksin

0,10 0,025 0,5

Kukuruz, kukuruzno brano, * proizvodi od kukuruza, ria

Fumonizini B1 + B2 + B3

4000

Kukuruz, kukuruzno brano, * proizvodi od itarica, ria , biljna ulja

i mlijeko Zearalenon 200

itarice, ria * Deoksinivalenol (DON) 2000 (1) Izraeno na originalni oblik ( kako se stavlja na trite ) (2) Izraeno na pripremljenu hranu prema uputama (3) Za hranu na bazi mlijeka izraeno na pripremljeni uzorak hrane, a ostale na originalni oblik ( kako se stavlja na trite ) * Do utvrivanja konanih vrijednosti u EU

NAJVIE DOPUTENE KOLIINE MIKOTOKSINA U HRANI (PREMA PRAVILNIKU O TOKSINIMA, METALIMA, METALOIDIMA TE DRUGIM TETNIM TVARIMA KOJE SE MOGU NALAZITI U

HRANI-NN 16/05)


DODATAK

PRAVILO ZVIJEZDE

Primjer:

Gravimetrijski je odreeno da istraivani supstrat sadri 15% vode. Koliko vode je potrebno dodati u supstrat da bi se sadraj vode povisio na 30%? Masa supstrata je 100 g.

Iz pravila zvijezde vidimo da je u 70 g supstrata potrebno dodati 15 mL vode kako bi se postotak vode povisio na potrebnih 30%. Sada izraunamo koliko je vode potrebno dodati u 100 g supstrata.

Zakljuak:

U 100 g supstrata potrebno je dodati 21,4 mL vode da bi se sadraj vode u supstratu povisio na potrebnih 30%.


KOLIFORMNE BAKTERIJE (KOLIMETRIJA)

PRETHODNI TEST: BRILJANT ZELENI LAKTOZA

UNI BUJON (BZLB)

NEGATIVNO: NEMA PLINA

CO2

POZITIVNO: IMA PLINA

CO2

POTVRDNI TEST: LJUBIASTO CRVENI UNI AGAR (LJCA)

POZITIVNO: SITNE LJUBIASTE

KOLONIJE METALNOG SJAJA

ZAVRNI TEST: KOSI BZLB HRANJIVI AGAR


CO2

POZITIVNO: PORAST

KOLONIJA

IMViC TEST: PODLOGE ZA IMViC

TEST PRIJE NACJEPLJIVANJA

TEST NA INDOL: POZITIVNO POJAVA CRVENO OBOJANOG

PRSTENA

NEGATIVNO POZITIVNO

TEST METILNIM CRVENILOM:

POZITIVNO CRVENO OBOJENJE PODLOGE

NEGATIVNO POZITIVNO

VOGES-PROSKAUER-OV TEST: POZITIVNO CRVENO OBOJENJE

PODLOGE

NEGATIVNO POZITIVNO

TEST NA CITRAT: POZITIVNO PLAVO OBOJENJE

PODLOGE

POZITIVNO NEGATIVNO

I MC/VP C


FEKALNI STREPTOKOKI

SULFITO REDUKCIJSKI KLOSTRIDIJI:

BRILJANT ZELENI LAKTOZA UNI BUJON (BZLB)


CO2

HANNY NORTON BUJON: POZITIVNO LJUBIASTO

OBOJENJE PODLOGE

NEGATIVNO POZITIVNO

TELURIT AGAR:

POZITIVNO: SITNE CRNE KOLONIJE

SULFITNI AGAR

POZITIVNO: CRNO OBOJENE

KOLONIJE


Proteus sp.

KOAGULAZA POZITIVNI STAFILOKOKI

HRANJIVI BUJON

POZITIVNO: ZAMUENJE

PODLOGE

POZITIVNO: PORAST TANKOG SLOJA

(FILMA) KOLONIJA

UREA AGAR I KLIGLEROV ELJEZNI AGAR (KA)

POZITIVNO: ROSKASTA BOJA

PODLOGE

POZITIVNO: CRVENA KOSINA I CRNA DUBINA (STUPI) (H2S POZITIVNE VRSTE)

ILI CRVENA KOSINA I UTA DUBINA (STUPI) (H2S NEGATIVNE VRSTE)

BRILJANT ZELENI AGAR (BZA)

ETGP agar po Baird-Parkeru

POZITIVNO: PORAST CRNIH KOLONIJA


Salmonella sp.

SELENIT BUJON

POZITIVNO: ZAMUENJE

PODLOGE

WILLSON BLAIRE (WB) AGAR I SALMONELLA SHIGELLA (SS) AGAR (BIZMUT SULFITNI AGAR)

POZITIVNO: PORAST CRNIH KOLONIJA SA

SMEIM RUBOM

POZITIVNO: PORAST SVIJETLO SMEIH KOLONIJA

KLIGLEROV ELJEZNI AGAR (KA)

POZITIVNO: CRVENA KOSINA I CRNA DUBINA (STUPI) (PLIN H2S)

mbn (2011.-2012.) - skripta za vjeÅ½be

Documents