1

INSTRUMENTACIJA I SENZORI ZA KLINIČKE LABORATORIJE

Kliničke laboratorije

Utvrđuju ućešće i koncentraciju pojedinih materija u:

TkivimaKrviGasovima

Instrumentacija najčešće zasnovana na elektrohemijskim pretvaračima

2

Pomoć u dijagnostici

Utvrđene su i statistički standardizovane fiziološke granice koncentracija pojedinih materijaU mnogim slučajevima utvrđeni su i uzroci koji dovode do odstupanja koncentracija od standardnih fizioloških vrednosti

Parcijalni pritisak gasa

Velik broj laboratorijskih analiza svodi se na određivanje parcijalnih pritisaka gasova u rastvorima (pO2, pCO2, pH, pN)Daltonov zakon, ukupan pritisak gasa p u zapremini V pri apsolutnoj temperaturi T je:

RTVnp =

R – univerzalna gasna konstanta

n – broj molova gasa

3

Parcijalni pritisak gasa

Parcijalni pritisak jednog gasa u smesi gasova je:

Ukupan pritisak smese gasova jednak je zbiru parcijalnih gasova

RTVnp G

G =

Rastvorljivost gasova

Količina gasa rastvorenog u tečnosti jednaka je proizvodu parcijalnog pritiska tog gasa i njegova rastvorljivosti u posmatranoj tečnosti (Henrijev zakon)Rastvorljivost je koeficijant koji se definiše za određenu kombinaciju gas-tečnost i predstavlja količinu gasa sa parcijalnim pritiskom od 760mmHg rastvorenog u tečnosti.Rastvorljivost opada sa porastom temperature

4

Primer metaboličkog procesa

Metabolizam svih ćelija u organizmu zahteva kiseonik O2 i energetske substrateU metaboličkom procesu oksidacijom glukoze oslobađa se energija, a kao nusprodukti generišu se ugljendioksid (CO2) i niz drugih bioprodukataPluća su organ u kome dolazi do kontakta atmosfere sa krvlju, preciznije do oslobađanja CO2 i rastvaranja (vezivanja) O2 u krvi

Parcijalni pritisci u krvipO2 u alveolama tipično 104 mmHgpO2 u kapilarima venskog sistema koji ulazi u alveole je 40 mmHgRazlika pritisaka od 64 mmHg daje energiju za difuziju kiseonika iz atmosfere u kapilareHemoglobin lako vezuje O2 pa je pO2 u kapilarima koje izlaza iz pluća oko 104 mmHgOvako kiseonikom obogaćena krv se delimično meša sa venskom krvlju pa je pO2 na izlasku iz leve ventrikule 95 mmHg

5

Parcijalni pritisci u krviU intersticijalnom fluidu je pO2 oko 40 mmHgU periferijskom sistemu kapilara kiseonik difunduje u intersticijalni fluid, time smanjuje zasićenost krvi kiseonikom u venama na vrednost pO2 oko 40 mmHg

Kiseonik u krvi

Od ukupnog kiseonika približno 97% krvi je vezano za hemoglobin, a 3% je rastvorene u krvnoj plazmiTe je pO2 raspoređen na 92.8 mmHg (oksihemoglobin –HbO2), i 2.8 mmHg (plazma) U slučaju mirovanja (bazalni metabolizam) venska krv sadrži oko 75 % HbO2, a u slučaju jakog napora (vežbanje) HbO2može da padne na vrednosti ispod 20%, i tada je intersticijalni parcijalni pritisak pO2 reda 15 mmHgSvaki poremećaj u alveolama koji remeti difuziju iz atmosfere u kapilare, ili u sistemskom krvotoku koji remeti difuziju kiseonika iz krvi u intersticijalni prostor uzrokuje hipoksiju (nedostatka kiseonika) ili acidoze (prisustvo kiselih, toksičnihmaterija u krvi) Obe promene vode velikim smetnjama u funkcionisanju organizma, i moguć je i tragičan ishod.

6

Glukoza u krvi

Osnovni energent u metabolizmu je glukozaKoncentracija glukoze direktno utiče na mogućnost ishrane ćelijaNormalne vrednosti glukoze u krvi su u intervalu od 4 do 6.5 mmol/litru (70-110 mg/100 ml)Glukoza iz krvi u metaboličkom procesu ulazi u ćeliju i u procesu oksidacije daje potrebnu energiju za elektro hemijske procese koji rezultuju aktivacijom ćelijeSvaki poremećaj koncentracije (hipoglikemija i hiperglikemija) može da dovede do kratkotrajnih ili dugotrajnih posledica

Opseg normalnih vrednostinajvažnijih sastojaka krvi

Pored O2, CO2 i glukoze niz drugih minerala je neophodan za funkcionisanje organizma (Fe, Ca, Mg, itd.), naravno tu su prisutni i Na+ i K+. Većina svih minerala je u jonskom obliku. Takođe, od značaja je i koncetracija, tj. parcijalni pritisak drugih gasova (npr. pH - parcijalni pritisak vodonika) 3-7Laktati [mg/100 ml]

8-26Urea [mg/100 ml]

0.9-1.4Kreatinin [mg/100 ml]

70-110Glukoza [mg/100 ml]

METABOLITI98-109Cl- [mmol/l]

1.14-1.31Ca2+[mmol/l]

3.6-5.5K+ [mmol/l]

135-155Na+ [mmol/l]

ELEKTROLITI95-100Zasićenje O2 [%]

13-18Ukupni hemoglobin [g/100 ml]

40-54Hematokriti [%]

7.31-7.45pH

33-78pCO2 [mmHg]

80-104pO2[mmHg]

GASOVI U KRVI

7

Princip rada elektrohemijskih pretvarača

a)b)

Princip rada elektrohemijskih pretvarača

Odabirom i konstrukcijom elektroda potrebno je postići da mereni napon zavisi isključivo od koncentracije određene vrste jonaE1+E2+E4+E5=constE3=f(koncentracije)

8

Merenje parcijalnog pritiska kiseonika (pO2)

Zapremina kiseonika u nekoj tečnosti zavisi samo od rastvorljivosti kiseonika u toj tečnosti, ali je u prisustvu drugih sastojaka u krvi određivanje znatno složenije. Osnovni sastojak odgovoran za prisustvo kiseonika u krvi je hemoglobin (Hb), pigment gvožđa, koji lako oksidiše, i postaje oksihemoglobin (HbO2). Jedan gram hemoglobina se kombinuje sa 1.34 mlkiseonika, a tipično 100 ml krvi sadrži 15 grama hemoglobina, tako da 100 ml krvi sadrži oko 20.1 mlkiseonika. U realnosti i drugi sastojci utiču na količinu kiseonika kao što je koncentracija jona vodonika, tj. kiselost rastvora, zasićenost hematokritima itd.

Elektroda za merenje parcijalnog pritiska kiseonika (pO2)

Elektroda za merenje parcijalnog pritiska kiseonika radi kao pretvarač u struju pod dejstvom polarizacionog napona od 0.6 do 0.8 Volti.Elektroda je napravljena od Pt žice koja je zatopljena u staklo i čiji je vrh u direktnom kontaktu sa merenim rastvoromStrujni krug se zatvara preko referentne Ag/AgCl elektrode i slanog mosta od KClPt elektroda predstavlja katodu koja predstavlja ponor jona kiseonika, pošto je zatvoreno strujno kolo stavra se difuziona struja jona kiseonika koja je proporcionalna pO2Nedostatak starenje Pt elektrode

9

Klarkov tip kiseonične elektrode

Princip rada isti kao kod obične pO2 elekt.Membrana od polietilena ili teflona propušta jone kiseonika, a blokira prolaz svih ostalih česticaKontakt između katode i referentne elektrode u samoj kompaktnoj sondiJoni koseonika prolaze kroz membranu i odlaze ka katodi usled čega dolazi do gradijenta koncentracije i struje difuzije

10

Upotreba O2 elektrode

Poprečni presek i elektronika za Klarkovu O2 elektrodu. Pojačavač sa leve strane daje referentni napon od 0.7 V. Pojačavač sa desne strane radi kao pretvarač struje u napon. Otpor Rb odredjuje jednosmernu struju Ib koja poništava struju koja odgovara koncentraciji kiseonika 0.

Merenje pH - kiselosti

pH je recipročno vrednost koncentracije jona vodonika (od 0 do 14; 7 je neutralan rastvor)Povećanje pH je smanjenje koncentracije jona vodonika i povećanje baznosti rastvoraSmanjenje pH je povećanje koncentracije jona vodonika i povećanje kiselosti rastvora

11

Merenje pH staklenom elektrodom

Pufer smesa slabe baze ili kiseline i njene soliOdržava stabilnu pH vrednost i pri prodiranju jakih baza ili kiselina tako što so formira kiselinu ili bazu i neutrališe primesu u puferu, a pH ostaje konstantanAko je koncentracija H+ jona u merenom rastvoru drugaćija no u puferu oni difunduju kroz membranu stavrajući membranski potencijal koji je srazmeran razlici koncentracije H+ jona sa dve strane staklene membrane

Staklena pH elektroda i kalomel elektroda za merenje pH. Kalomel je referentna elektroda (V=0)

12

Referentna kalomel elektroda

Merenje pCO2

Princip se bazira na modifikaciji merenja pHElektroda za merenje pH se obavije slojem koji je propustan za molekule CO2

Između membrane i elektrode je tanak sloj vode koji sa CO2 formira ugljenu kiselinu H2CO3

Merenjem pH vrednosti dobija se informacija o koncentraciji CO2

13

Elektroda za pCO2

Merenje pCO2

14

Novi tip kombinovane elektrode pO2 i pCO2. OA2 izlaz daje napon proporcionalan koncentraciji kiseonika, a elektrometarski pojačavač daje napon koji je:

VCO2 ≈ log10 (pCO2) + A

Kombinovana elektroda pO2 i pCO2

Intravaskularni senzori za merenje parcijalnih pritisaka

Neprekidno posmatranje parcijalnih pritisaka gasova u krvi je osnovni zahtev u tretmanu pacijenata sa poremećajima metabolizma ventilacijeRazvijeni su minijaturni senzori koji se mogu intravaskularno koristiti u dužem perioduPrincip rada senzora je zasnovan na promeni oblika i zapremine crvenih krvnih zrnaca usled promene pH, pO2 ili pCO2Različiti oblici i zapremina eritrocita različito utiču na promenu refleksije u zavisnosti od dužine optičkog puta i ta veličina jekorelisana sa parcijalnim pritiscimaOptička vlakna se koriste za prenos incidentnog zračenja, i vraćanje reflektovanog zračenja da bi se optičkom metodom odredile hemijske karakteristike posmatranog substrataOptička vlakna su pogodna zbog dimenzija, a i sa njima se jednostavno vrši odabiranje samo određene frekvencije (filtar), tako da se relativno lako mogu izdvojiti karakteristike od interesa

15

Principijelna šema optičkog intravaskularnog senzora

Fluorescentni optički senzori parcijalnog pritiska gasova

Nastaje fluorescencija usled interakcije upadnog monohromatskog zračenja sa obojenim zrncimaTrajanje fluorescencije je obrnuto srazmerno pO2

Omotač se pravi od poroznog polipropilena

16

Intravaskularni sistem za monitoring gasova u krvi

Merenje glukoze

Klasične metode merenja glukoze se svode na uzimanje uzorka krvi, odvajanje plazme od ćelije, dodavanje odgovarajućeg reagensa plazmi i procesiranje dobijenog substrata radi primene kolorimetrijske metode merenjaOd posebnog je interesa pri tretmanu osoba sa poremećenom regulacijom insulina meriti u realnom vremenu koncentraciju glukoze, da bi se na osnovu te informacije dozirala količina insulina

17

Hemijski senzori za merenje koncentracije glukoze u krvi

Glukoza u procesu oksidacije daje glukoničnu kiselinu i peroksidU prisustvu enzima glukoza oksidaze, ova reakcija se vrši veoma brzo, a enzim se ne troši već je samo katalizatorS obzirom da je ovo proces oksidacije, i da postoji potrošnja kiseonika, jasno je da možemo meriti potrošnju kiseonika, oslobođenu toplotu, ili količine glukoničnu kiseline i peroksidaU postojećim tehničkim realizacijama mere se sve supstance osim glukonične kiseline

Poluprovodnički senzori za hemijska merenja

18

Spektrofotometrija

Spektrofotometrija je osnova za merenje niza sastojaka gasova i tečnostiPrincip rada spektrofotometra je da materijali koji su od interesa selektivno absorbuju, propuštaju ili reflektuju elektromagnetske talase različitih talasnih dužinaKoristi se opseg između ultraljubičastih i infracrvenih talasa, tj. između 200 i 800 nm

Birač talasne dužine

Za odabiranje jedne talasne dužine svetlosti pri merenjima koriste se optički filtri i monohromatori Filtri se realizuju primenom posebnih vrsta silikatnog stakla sa raznim primesama, i one u velikoj meri atenuiraju određene talasne dužine, dok su druge talasne dužine manje oslabljeneMonohromatori koriste efekte prelamanja (prizma) i difrakcije (difrakciona rešetka)Monohromatori imaju mali propusni opseg (≈0.5 nm) u zavisnosti od proreza koji se postavlja iza monohromatora prema uzorku, i odličnu propustljivost (90%) Posebna prednost monohromatora je što možemo lako menjati propusni opseg i talasnu dužinuPrizme se prave od stakla ili kvarca, a kvarc mora da se koristiza talasne dužine iznad 350 nm

19

Spektrofotometar

Šema dvo-zračnog spektrofotometra. Jednostruki monohromator raspršava svetlo pre fotodetektora. Otvori nisu prikazani.

Merenja sastava tečnosti -Disperzivna spektrofotometrija

20

Plameni fotometri

a)

b)

Uzorak se nalazi u posudi, pomešan sasupstancom koja omogućava sagorevanje i posebnom pumpom dovodi do gorionika gdese po potrebi raspršuje u sitne kapljice

Emisioni plameni fotometri a)

Rade na principu emisije zračenja koja nastaje pri vraćanju pobuđenog elektrona u ravnotežno stanjeEnergija potrebna da pobudi elektrone je toplota koja se razvija u plamenuKoličina zračenja je proporcionalna koncentraciji materijala, a talasna dužina je karakteristika materijalaMereći spektralnu karakteristiku saznajemo sastav i koncentraciju datog materijala u supstanci

21

Šematski prikaz plamenog emisionog fotometra.

Dva kanala se koriste u cilju kompenzacije «šuma».

Absorpcioni plameni fotometri b)

Svetlosni snop se propušta kroz plamen, deo energije će biti absorbovan usled interakcija sa materijalom, pa u zračenju koje dolazi na detektor nedostaju pojedini delovi spektraNepostojanje pojedine talasne dužine pri snimanju je indikator postojanja određene materije, a stepen absorpcije, tj. smanjenja intenziteta zračenja na pojedinoj talasnoj dužni indikator koncentracije date supstance

22

Šematski prikaz plamenog absorpcionog fotometra. Dva kanala se koriste u cilju kompenzacije «šuma».

Fluorometri

Fluorometrija ja zasnovana na činjenici da brojni molekuli emituju svetlo karakteristične talasne dužine neposredno posle absorbovanja energije zračenjaU ovom procesu eksitacija nastaje kao rezultat elektromagnetske energije dovedene iz svetlosnog izvora, tj. lampePrednost fluorometra u odnosu na plamene fotometre je u povećanoj osetljivostiDruga najvažnija prednost je što u ovoj metodi detektujemo fluorescenciju, tako da ne dolazi do registrovanja zračenja drugih supstanci koje nisu od interesa, i koje su zapravo artefakti

23

Fluorometri

Fluorometri

U ovoj metodi se koriste dva filtra, jedan na optičkom putu ozračavanja, i drugi na optičkom putu emisije U principu se koriste različiti filtri, jer su energije eksitacije i emisije različite, pa samim tim i treba koristiti filtre sa različitim propusnim opsezima. U fluorometrima se koriste različiti izvori svetla, ali je najčešća primena živine lampe. U tom slučaju se javljaju osnovne linije na 365, 405 436 i 546 nm. Za razliku od prikazanih šema spektrofotometara u ovom slučaju su izvor svetla i detektor postavljeni u međusobno ortogonalnim pravcima da bi se onemogućilo eventualno direktno prostiranje svetlosti do detektora.Fluorescencija je osetljiva na temperaturu i pH bez obzira o kom se materijalu radi, a s obzirom da je cilj merenja koncentracija određene supstance, moguća je greška.

24

FotometriFotometri mere difuznu refleksiju od "nepoliranih" površina. Za difuznu refleksiju je karakteristično da su neke energije absorbovane, dok su druge reflektovane, Uređaj za merenje se naziva reflektometar ili refleksioni denzitometar. U ovom uređaju kolimisani snop svetla dolazi do uzorka (nepolirane površine) pod pravim uglom, a meri se reflektovano zračenje pod uglom od 45o

Izvor zračenja je najčešće LED dioda. Nulti nivo refleksije se koristi za baždarenje. Taj nulti nivo je refleksija of vrlo čistog barijumsulfata ili magnezijumkarbonata. Oba materijala ne absorbuju talasne dužine koje se primenjuju, pa je reflektovano zračenje maksimalno u odnosu na inicijalno zračenje iz izvora.Kada se umesto pomenutih materijala postavi uzorak koji posmatramo smanjuje se reflektovano zračenje što registrujemo detektorom. Uzorak se formira korišćenjem različitih reagensnih materijala i fiziološke tečnosti koju analiziramo (npr. urin, krv, cerebrovaskularna tečnost). Pri kontaktu fiziološke tečnosti i reagensa dolazi do "bojenja" reagensa, boja zavisi od koncentracije supstance na koju je reagens osetljivZadatak fotometra je precizno određivanje boje reagensa što direktno ukazuje na koncentraciju supstance

Primer trake sa reagensima

Traka za registrovanje prisustva i merenje koncentracije 9 raznih supstanci u urinu (Boehringer Manheim Diganostics CHEMSTRIP). Komenzaciona zona jenamenjena za automatsko baždarenje reflektometra.

25

Slide format reagensa za fotometre

Za merenje u kliničkim i kućnim uslovima, i vrlo brzu dijagnostiku koriste se trake na kojima uzorak dolazi u kontakt sa reagensom koristeći takozvani "slide" formatPrincip rada ovog senzora je identičan kao i opisanih traka, ali je metod posebno pogodan za analizu koncentracije pojedinih supstanci u krvi (npr. glukoza) U slučaju merenja u krvi je mnogo pogodnije uzorak krvi, kapljicu, staviti na centralno polje "slide" senzora, a zatim snimati refleksiju i iz rezultata "pročitati" koncentraciju.

Osnovni sastojci krvi

Krv je vrlo kompleksan rastvor čvrstotelnih čestica u tečnosti plazmiČestice od interesa su eritrociti, leukociti i plateleteEritrociti su sfernog oblika i imaju prečnik između 6.8 i 7.5 µm, sa srednjom vrednošću od 7.2 µm, i zauzimaju zapreminu od približno 90 x 10-18 m3. Broj eritrocita u normalnom organizmu se kreće između 4.2 i5.8 x 1012 po litru kod muškaraca, i 3.7 do 5.2 x 1012 po litru kod žena.Leukociti su veći od eritrocita i njihov prečnik je između 6 i 18 µm, a razlikujemo nekoliko vrsta ćelija (štapičasti, segmentirani, eozinofilni, bazofilni, monociti, limfociti). U proseku u zdravom organizmu ima između 4 i 10 x 109 po litru belih krvnih zrnaca.Platelete, ili trombociti su najmanje od tri pomenute čestice i njihov prečnik je 2 do 4 µm, a ima ih u proseku između 1.5 i 3.5 x 1011 po litru u zdravom organizmu. Uobičajeno imaju oblik diska. Osnovni zadataktrombocita je da zaustave krvarenje u slučajevima povrede krvnihsudova.

26

Dodatne analize krvi

Pri analizi krvi mere se koncentracija hemoglobina, sedimentacija, hematokritPostavljanjem epruvete u kojoj se nalazi krv stabilizovana antikoagulantom, odnosno rastvorom koji ne dozvoljava zgrušavanje, u centrifugu, i njenim uključenjem izdvajaju se čvrste čestice iz plazme na dnu epruveteS obzirom da je epruveta konstantnog poprečnog preseka odnos visine sloja koji popunjavaju čestice u odnosu na ukupnu visinu stuba uepruveti, tj. odnos zapremine čestica u odnosu na ukupnu zapreminu uzorka je broj između 0 i 1. Ovaj broj nazivamo hematokrit.Sedimentacija je proces izdvajanja čestica iz krvi na dno epruvete usled gravitacije. Pri tome se krv tretira antikoagulantom. Uobičajeno se posmatra količina koja se izdvoji za jedan odnosno dva sata, a kao rezultat daje njihov odnos.

Ručno brojanje krvnih zrnaca

Pre upotrebe automatizovanih brojača krvnih zrnaca merenje se vršilo primenom mikroskopa i usrednjavanjem vizuelno prebrojanih sastojaka krvi u vidnom polju mikroskopa Preparat za mikroskop se pravio razmazivanjem tankog sloja krvi po staklenoj pločici Posmatranje uzoraka koristeći mikroskop je i dalje aktuelno pre svega u analizi morfologija ćelija.

27

Automatizovani brojači krvnih zrnaca

Brojači krvnih zrnaca rade na principu merenja impedanse između dve tačke na milimetarskom rastojanju postavljene u tankoj cevi prečnika oko 100 µm Krvna zrnca imaju relativno veliku otpornost, pa ako se krv rastvori u tečnosti koja ima dobru provodnost onda s obzirom da su dimenzije različitih ćelija (eritrociti, leukociti, trombociti) različite možemo da detektujemo koja čestica je između mernih elektrodaBrojanjem ovih događaja, i merenjem ukupne količine tečnosti koja je prošla između elektroda dobijamo broj pojedinih ćelija u jedinici zapremineUobičajeno je da su elektrode od platine (Pt), a između elektroda je cev sužena, tako da praktično sve ćelije u nizu prolaze pored elektroda, a između elektroda se nalazi samo po jedna ćelija

Automatizovani brojači krvnih zrnaca

28

Optički brojači krvnih zrnaca

Optički sistem koristi osobine da je rasejanje svetlosti pri interakciji sa različitim elementima krvi različite, pa se brojanjem promena rasejanja u zadatoj zapremini određuje traženi parametarI u ovom slučaju se primenjuje rastvor krvi koji se propušta kroz tanku cev, ali se umesto elektroda kroz cev propušta svetlost i meri transmisijaSa izlazne strane se nalazi procep, tako da se samo jedan deo rasejanog zračenja detektujeU zavisnosti od ugla rasejanje, zavisi i koliki deo zračenja će proći kroz "prozor". Na taj način se razlikuju razne vrste ćelija. Često se za ove namene koriste laserski izvori svetla, a kao detektori fotodiode i fotomultiplikatoriSa izlazne strane se u nekim aparatima detektor postavlja pod uglom u odnosu na upadni pravac zračenja, tako da u trenucima u kojima se na optičkom putu ne nalazi ćelija krvi, senzor ne registruje zračenje, jer ne postoji rasejanje