FORMACIÓN DE UN BANCO DE ADN DE LA ESPECIE Cucurbita moschata (duchesne ex lam.) duchesne ex poir

Y EVALUACIÓN DE OCHO MARCADORES MOLECULARES COMO CÓDIGO DE BARRAS PARA SU AUTENTICACIÓN

DUBERT YAMIL CAÑAR SERNA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS COORDINACIÓN GENERAL DE POSTGRADOS

PALMIRA 2012

FORMACIÓN DE UN BANCO DE ADN DE LA ESPECIE Cucurbita moschata (duchesne ex lam.) duchesne ex poir

Y EVALUACIÓN DE OCHO MARCADORES MOLECULARES COMO CÓDIGO DE BARRAS PARA SU AUTENTICACIÓN

DUBERT YAMIL CAÑAR SERNA

Trabajo de grado para optar el título de magister en Ciencias Biológicas, línea de investigación en Recursos Fitogenéticos Neotropicales

Director FRANCO ALIRIO VALLEJO CABRERA.

I. A. M.Sc; Ph.D.

Codirectores ANA MARCELA FLOREZ RUEDA;

Bióloga M.Sc. JAIME EDUARDO MUÑOZ FLOREZ;

I. A. Esp. Ph.D

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

COORDINACIÓN GENERAL DE POSTGRADOS PALMIRA

2012

DEDICATORIA

Quiero dedicarle este trabajo a DIOS porque el todo lo puede, por permitirme terminar una nueva etapa, ser el manantial de vida y darme lo necesario para seguir adelante día a día para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y amor

A mis padres Graciliano Cañar Dorado y Gladis Serna Pérez, por darme la vida y ser mi infinito apoyo, por sus consejos, principios y valores enseñados que me ha

permitido ser una persona de bien, pero más que nada por enseñarme el arte de vivir.

A mi hermano John Antonio Cañar Jiménez, por enseñarme los primeros pasos de la vida y ser mi apoyo incondicional a seguir adelante

A mi novia Miryam Patricia Romero Mendoza, por ser mi centro de gravedad en todo mí ser, gracias por todo su amor, compresión, paciencia y dedicación en todo

este tiempo. Sin ti no estaría aquí!!!!

A mis maestros por su apoyo en la culminación del documento, por transmitirme sus conocimientos y haberme llevado paso a paso al mundo del conocimiento de las

Ciencias Biológicas.

¡AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer principalmente a Dios por ser simplemente el mejor!! Darme la sabiduría, fuerza y paciencia en el trascurso de mi escuela de posgrado.

A la naturaleza por ser el arte de Dios, nuestra madre amiga y por esforzarse al máximo por nuestro bien.

Agradezco al Departamento Administrativo de Ciencias, Tecnología e Innovación Colciencias por la financiación de esta investigación.

A los Doctores Franco Alirio Vallejo Cabrera y Jaime Eduardo Muñoz Flórez por su humildad, tiempo de dedicación y calidad humana. Por confiar en mí y apoyar mis ideas.

A la Dra Creuci Maria Caetano, por su apoyo incondicional en mis asuntos académicos, laborales y personales durante el desarrollo de mi pregrado y posgrado.

A los biólogos Ana Marcela Flórez, Claudia Lorena Sandoval, Andrés Mauricio Posso y Fabián Tobar por su apoyo durante el desarrollo de la investigación.

A la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, por su recurso humano e instalaciones.

Al grupo humano del Centro experimental de la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira CEUNP por la colaboración en campo, en especial al Dr Sanín Ortiz Grisales y a la Ing Magda Piedad Valdez.

Para terminar, a todos aquellos que apoyaron directa e indirectamente a realizar el documento.

La facultad y los jurados de tesis no se harán responsables de las ideas

emitidas por el autor. Artículo 24, resolución 04 de 1974

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 15

2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 18

Objetivo general ............................................................................................... 18

Objetivos específicos ....................................................................................... 18

3. MARCO REFERENCIAL .................................................................................... 19

Clasificación botánica del zapallo C. moschata ................................................ 19

Origen y distribución deC. moschata ................................................................ 20

Morfología de la planta ..................................................................................... 20

Importancia del Zapallo .................................................................................... 22

Usos y valor nutricional ................................................................................... 23

Principales productores .................................................................................... 24

Argumentos a favor de la conservación ........................................................... 26

Importancia de los Bancos de ADN en plantas terrestres ................................ 27

Bancos de ADN existentes en el mundo .......................................................... 27

3.10 Aislamientodel ADN………………………………………………………...……..29

Marcadores cloroplásticos ADNcp y nucleares ADNnr………………………..29

Código de barra de ADN en plantas(DNA barcoding) .................................... 30

Usos de los códigos de barras de ADN ......................................................... 30

4 DISEÑO METODOLOGICO……………...……………....………………….……. .. 32

Localización ..................................................................................................... 32

Material biológico ............................................................................................. 33

Preparación de las semillas………………………………………………………. ... 33

Selección de las muestras……………………………………………………….….33

Muestras depositadas en el herbario………………………………………. .........33

Extracción y visualización del ADN .................................................................. 34

Cuantificación del ADN .................................................................................... 34

Selección de los materiales para su amplificación………………………..……...34

4.9 Amplificación del ADN mediante PCR ............................................................. 35

4.10 Visualización y cuantificación de los productos PCR ..................................... 38

4.11 Secuenciamiento …………….……………………………………………..…….38

4.12 Análisis de datos ............................................................................................ 39

5 RESULTADOS .................................................................................................... 38

Establecimiento de la colecciòn en campo ...................................................... 41

Colección del material liofilizado ...................................................................... 41

Disposición de las muestras en el herbario ...................................................... 42

Cuantificación del ADN genómico .................................................................... 43

Establecimiento del banco de ADN .................................................................. 44

Distribución de los materiales…….……………………………………………. .... 44

Tasa de éxito en la amplificación por PCR ...................................................... 46

Total de secuencias para el estudio ................................................................. 46

Nivel de identidad de los marcadores…………………………………….……….47

Variación de las secuencias de ADN en los marcadores…………….… ......... 47

Divergencia promedio intraespecífica e inter específica…………………. ....... 48

Frecuencia a nivel de rangos cumulativos….……...…………………………...50

5.12.1 Loci ITS4-ITS5A………………………………………………………………. ... 50

5.12.2 Loci ndhF-rpl32………………………………………………………….……. .... 52

5.12.3 Loci 3’rps16 - 5’trnK(UUU)……………………………………. ……………. ... 53

5.12.4 Loci trnQ(UUG)-5’rps16…………………………………....…. ........................ 54

5.12.5 Loci psbA-trnH…………….…….……………………………………….……. ...56

5.13 Análisis descriptivo…………………………………….…………………………..57

6 DISCUSIÒN ........................................................................................................ 60

7 CONCLUSIONES ............................................................................................... 63

8 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................... 59

9 ANEXOS ............................................................................................................. 72

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. A: Sistema radicular; B: Morfología de la planta. .................................... 21

Figura 2. A: Flor estaminada; B: Flor pistilada; C: Grano de polen en microscopia

electrónica de barrido MEB; D Semillas; E: Fruto. ................................................. 22

Figura 3. 10 principales departamentos productores a nivel mundial ordenados de

mayor a menor ....................................................................................................... 25

Figura 4. 10 principales departamentos productores en Colombia ordenados de

mayor a menor ....................................................................................................... 25

Figura 5. 10 principales municipios productores en Colombia ordenados de mayor

a menor .................................................................................................................. 26

Figura 6. A: Preparación del terreno; B: Formación de semilleros; C: Traspaso de

los semilleros a campo; D: Colección de germoplasma establecida en el Centro

experimental de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira – CEUNP. ... 32

Figura 7. Diagrama resumido de la metodología utilizada en la investigación ....... 40

Figura 8. Introducciones de Cucurbita evaluadas e incluidas en el banco de ADN.

.............................................................................................................................. 41

Figura 9. Muestra del material vegetal depositado en el herbario “José Cuatrecasas

Arumi ” ................................................................................................................... 42

Figura 10. Paralelo entre los protocolos propuestos. A: Pellet a partir del protocolo

(Dellaporta et al., 1983); B: Pellet a partir del protocolo (Doyle y Doyle, 1987); C:

Muestras en gel de agarosa al 0.8 % a partir del protocolo (Doyle y Doyle modificado

por CIMMYT, 2006) ................................................................................................ 43

Figura 11. A: Conservación del ADN en cadena de frio para su ubicación B: Información de trazabilidad de las introducciones C: Ubicación en las muestras en los rack divididos por colores D: Ubicación los rack con las muestras en las casillas E: Colección de ADN establecida en el laboratorio de Genética a -50 °C. ...............................................................................................................................44

Figura 12. Distribución del muestreo de las introducciones incluidas en el estudio. Se delimitaron tres poblaciones, mexicana, centroamericana y colombiana georeferenciadas mediante el programa Google Earth Plus 5.2.1.1547………… 45

Figura 13. Divergencia promedio intra e inter específica entre C. maxima, C. moschata sp y C. moschata para cada marcador evaluado………………………. 50

Figura 14. Distribución de los individuos entre rangos intermedios evaluados con

los loci ITS4-ITS5A ..

51

Figura 15. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos

intermedios para ndhF-rpl32 ..

53

Figura 16. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos

intermedios para 3’rps16 - 5’trnK(UUU). ..

54

Figura 17. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos intermedios para trnQ (UUG)-5’rps16………………………………………………... 55

Figura 18. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos intermedios para psbA-trnH…………………………………………………………… 57

Figura 19. Árbol de distancias basado en el modelo de Kimura-2-parameter entre las especies C. moschata, C. moschata sp y C. maxima utilizando el multilocus ITS4-ITS5A. Las líneas engrosadas representan valores de apoyo para la discriminación entre especies……………………………………………………… 58

Figura 20. Árbol de distancias, basado en el método de Kimura-2-parametros entre

C. moschata, C maxima y C pepo, utilizando el multilocus ITS4-ITS5. Las líneas

engrosadas representan valores de apoyo para la discriminación entre especies del

mismo géneroa ..

59

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación taxonómica del Zapallo C. moschata Duch. ........................ 19

Tabla 2. Valor nutricional del zapallo por 100 g de producto comestible en base

húmeda. ................................................................................................................. 24

Tabla 3 Procedencia de las 20 introducciones de zapallo, utilizados para el análisis

molecular y datos geográficos disponibles ............................................................. 34

Tabla 4 Marcadores explorados en el estudio........................................................ 35

Tabla 5. Volumen de los cocteles para PCR .......................................................... 36

Tabla 6 Programa utilizado para la amplificación ................................................... 37

Tabla 7 Programa utilizado para la amplificación ................................................... 38

Tabla 8 Programa utilizado para la amplificación ................................................... 38

Tabla 9 Extracción del contenido de humedad en hojas de C. moschata .............. 42

Tabla 10 Marcadores seleccionados por su tasa de éxito en la amplificación. ..... 46

Tabla 11 Número total de secuencias en el estudio ............................................... 47

Tabla 12 Lista de vecinos cercanos ....................................................................... 47

Tabla 13. Estadística descriptiva para los 5 marcadores evaluados en C. moschata

ordenados de mayor a menor ................................................................................ 48

Tabla 14. Promedio del nivel de divergencia intra e inter especifica entre los

marcadores explorados. ......................................................................................... 49

Tabla 15. Rangos acumulativos entre los individuos para ITS4-ITS5A .................. 51

Tabla 16. Rangos acumulativos entre los individuos para ndhF-rpl32 ................... 52

Tabla 17. Rangos acumulativos entre los individuos para 3’rps16 - 5’trnK(UUU) . 53

Tabla 18. Rangos acumulativos entre los individuos para trnQ(UUG)-5’rps16 ...... 55

Tabla 19. Rangos acumulativos entre los individuos para psbA-trnH .................... 24

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Colección conformada por 388 introducciones del género Cucurbita...... 72

Anexo 2 Protocolos de extracción probados en la investigación…………………..85

Anexo 3. Solicitud del servicio de secuenciación…………………………………….89

Anexo 4. Matrix de divergencia entre las secuencias problemas ........................... 90

RESUMEN

Se estableció un banco de ADN a partir de 320 introducciones de Cucurbita moschata, 45 Cucurbita moschata var bicolor, 22 de Cucurbita moschata sp y una de Cucurbita máxima provenientes de la colección del Grupo de Hortalizas de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Se seleccionó 20 muestras de ADN de introducciones procedentes de México, Honduras, El Salvador, Costa Rica, Guatemala y Colombia para evaluar ocho marcadores moleculares, siete de origen ADNcp (AdhC, G3pdh, rpl32-trnL, ndhF-rpl32, 3’rps16–5’trnK(UUU), trnQ(UUG)- 5’rps16, psbA-trnH) y uno ADNnr (ITS4-ITS5A) como candidatos a código de barras de ADN para la autenticación de la especie. Todos los marcadores moleculares, excepto AdhC, rpl32-trnl y G3pdh, fueron evaluados por su capacidad de amplificación a través de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se generaron 200 secuencias in silico para su edición, anclaje y alineamiento. Se midió su tasa de éxito en la amplificación y generación de secuencias, sitios polimórficos, divergencia intraespecífica e interespecífica y la capacidad de discriminación. El loci ITS4-ITS5A mostró un 100% de éxito en su amplificación, con 19 haplotipos siendo el más polimórfico entre los marcadores evaluados, su divergencia intraespecífica promedio fue de 0,020 y divergencia interespecífica del 0,077. Manifestó una identificación del 96% y 98% a nivel de género y especie respectivamente. El loci ITS4-ITS5A del cistròn 18S-5.8S-26S del ADN ribosomal, presentó la más alta eficiencia en la identificación a nivel de especies, postulando como un potente código de barras de ADN para C. moschata. Sin embargo, para validar la información se requiere información morfológica y taxonómica detallada que sustente la investigación, con el objetivo de no adoptar decisiones definitivas.

Palabras claves: C. moschata, código de barras de ADN, marcador molecular

SUMMARY

It was established a DNA bank from 320 introductions of Cucurbita moschata, 45 Cucurbita moschata var. bicolor, 22 Cucurbita moschata sp. and Cucurbita maxima from collection of Hortalizas group from Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Was selected 20 samples of introductions from Mexico, Honduras, El Salvador, Costa Rica, Guatemala and Colombia to evaluate eight molecular markers, seven from cpDNA origin (AdhC, G3pdh, rpl32-trnL, ndhF-rpl32, 3’rps16– 5’trnK(UUU), trnQ(UUG)-5’rps16, psbA-trnH) and one DNAnr (ITS4-ITS5A) as candidates to DNA barcoding for authentication of the species. All molecular markers, except AdhC, rpl32-trnl and G3pdh, were evaluated for its amplification capacity through the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR). 200 sequences were generated in silico for its editing, anchoring and alignment. It was measured the rate of success in amplification and sequence generation, polymorphic sites, intraspecific and interspecific divergence, and discrimination ability. The ITS4-ITS5A loci showed 100% success in its amplification, being the most polymorphic between markers evaluated with 19 haplotypes, its average intraspecific divergence was 0.020 and 0.077 of interspecific divergence. Was manifested an identification of 96% and 98% to genus and species levels, respectively. The loci ITS4-ITS5A of cistron 18S-5.8S-26S from ribosomal DNA, showed the highest efficiency in the identification to species level, postulating as a potent DNA barcode for C. moschata. However, to validate the information, it required detailed morphological and taxonomic information that supports the research, in order to not adopt final decisions.

Key words: C. moschata, DNA barcoding, molecular markers

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1 INTRODUCCION

La diversidad de las especies es muy alta en Colombia al ser un país mega diverso. Sin embargo, es preocupante las altas tasas de extinción, la destrucción de habita, y erosión de los recursos fitogenéticos RFG (Romero et al., 2008). Esta situación ha alertado a la mayoría de los países del mundo para conservar esta diversidad natural. (Chase et al., 2005).

Las Cucurbitáceas son una de las más grandes y diversas familias de plantas que se cultivan en diferentes condiciones ambientales en todo el mundo. Están asociados con el origen de la agricultura y las civilizaciones humanas y son también entre las primeras plantas en ser domesticadas tanto en él antiguo y nuevo Mundo (Bisognin, 2002).

Al llegar los españoles a América, encontraron que las plantas del género Cucurbita figuraban entre los cultivos más importantes, siendo solo seguidas por Zea mays y Phaseolus vulgaris (Casseres, 1966). Actualmente, se encuentran ampliamente aceptada dentro de la dieta de los campesinos y citadinos del mundo, adquiriendo importancia como alimento con potencial de exportación, especialmente a los países Europeos (Hernández, 2001).

En Colombia, Cucurbita moschata es la especie domesticada de importancia teniendo en cuenta su área de siembra, producción, versatilidad en consumo directo, materia prima para la agroindustria, artesanías, decoración y buena calidad nutricional. Se utilizan cultivares locales con variabilidad en cuanto a tamaño, forma y color del fruto, grosor y textura de pulpa, color y tamaño de la semilla (Vallejo y Estrada, 2004). Por otro lado, existe un amplio intervalo geográfico latitudinal para el cultivo de C. moschata, la notable diversidad morfológica, así como los numerosos cultivares desarrollados en otras partes del mundo y las variantes con características agronómicas sobresalientes, indican que la variación genética de esta especie es amplia haciéndolo de interés para su conservación y el uso sostenible (Caicedo, 1993).

Actualmente, el gran desarrollo que ha tenido la biotecnología en el acceso al ADN y a los análisis moleculares en los últimos años, ha permitido conservar la información genética de las especies de forma efectiva a partir de la implementación de herramienta biológicas estandarizada potencialmente importante (Mattick et al., 1992)

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La Universidad Nacional de Colombia sede Palmira ha venido realizando trabajos en la especie C. moschata a nivel molecular. Montes et al., (2004), realizó un análisis de diversidad genética con datos morfológicos de introducciones colombianas de C. moschata. Restrepo et al., (2008), efectuó el único análisis molecular y calculó la diversidad genética de las introducciones exclusivamente colombianas mediante marcadores AFLP y Flórez et al., (2010), realizó el análisis poblacional y filogeográfico usando introducciones del sur y centro americanas de C. moschata. Sin embargo, no se contaba con un banco de ADN de la especie que abarcara la información genética de los bancos de germoplasma.

Los bancos de ADN de plantas hacen parte de las formas de conservación ex situ. Son centros de servicio técnico optimizado para el almacenamiento de una gran cantidad de alícuotas de ADN genómico siendo la base de las investigaciones realizadas en los laboratorios de sistemática molecular y genómica (NYBG, 2012). Constituyen un archivo histórico natural de utilidad múltiple donde la preservación de especímenes y su información genética asociada son la base de estudios taxonómicos, sistemáticos, ecológicos, filogenéticos, biogeográficos, de genética de poblaciones y de conservación (Tobar, 2002).

Actualmente, para la autenticación de las especies conservadas se han venido utilizando métodos químicos y microscópicos. Los procesos químicos son variables de acuerdo a las condiciones ambientales y las técnicas en microscopia electrónica consumen tiempo y son laboriosas que depende en gran medida de la experiencia de los técnicos. Además, algunas limitaciones en la taxonomía tradicional hace de esta técnica, no satisfaga las demandas complejas en la autenticación de las especies (Maddison et al., 2007). Además, en el mundo se tiene descriptas hasta el presente 1.7 millones de especies por medio de métodos taxonómicos tradicionales, que representan menos del 15 % de las especies de la diversidad global (Smith, 2005; Crisci, 2006). En consecuencia, un método preciso, sensible y sencillo es una necesidad urgente e indispensable.

A consecuencia de esta problemática, nacieron los códigos de barras de ADN (DNA barcoding) en plantas. Son una nueva herramienta biológica para la autenticación e identificación de especies; es una forma precisa, rápida y automatizada que utiliza un fragmento corto del ADN genómico, que ha sido ampliamente utilizado especialmente en la identificación de especies de plantas terrestres (Hebert et al., 2003).

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Mattick et al., (1992), indica que los bancos de ADN y su autenticación mediante código de barra de ADN es una manera sencilla y rápida de lograr una gran cobertura de la diversidad y proveen datos para su análisis y monitoreo. Sin embargo, se hacen un llamado al establecimiento de bancos de ADN de calidad donde los amplificados de las regiones sugeridas para barcoding sean estudiados y guardados como patrimonio único para las siguientes generaciones. (Savolainen y Reeves, 2004).

De esta manera, los Grupos de investigación “Mejoramiento Genético, Agronomía y Producción de Semilla de Hortalizas” y “Diversidad biológica” contribuirá con el establecimiento de un banco de ADN para C. moschata y su autenticación a partir de un código de barra de ADN, protegiendo la biodiversidad y suministrando material para estudios futuros en diversidad genética y estructura poblacional.

El trabajo tiene como objetivo formar un banco de ADN a partir de la colección de Cucurbita moschata y evaluar ocho marcadores moleculares como código de barra de ADN para su autenticación.

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2 OBJETIVOS

Objetivo principal

Formar un banco de ADN de la colección de Cucurbita moschata y evaluar

ocho marcadores moleculares como código de barra de ADN para su autenticación.

Objetivos específicos

Conservar la información genética de C. moschata proveniente de la colección del Grupo de Hortalizas mediante el establecimiento de un banco de ADN.

Determinar el nivel de identificación y precisión de los marcadores evaluados

como código de barras de ADN.

Identificar un marcador molecular como código de barra de ADN para la

autenticación en la especie C moschata.

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3 MARCO REFERENCIAL

Clasificación botánica del zapallo C. moschata

El zapallo Cucurbita moschata, pertenece a la familia Cucurbitaceae y al género Cucurbita, compuesto entre 12 a 14 especies. Al menos cinco de estas especies fueron domesticadas antes del descubrimiento de América; C. moschata, C. maxima, C. pepo, C. ficifolia, C. argyrosperma (Vallejo y Estrada, 2004).

Tabla 1. Clasificación taxonómica del Zapallo C. moschata Duch. Tomados de (Ortiz, 2006)

Descriptor Epíteto Observación

Reino Plantae Seres orgánicos multicelulares con “habilidad” para generar sus propios ntrientes mediante la fotosíntesis.

Subreino Tracheobionta Plantas con sistema vascular

Clase Magnoliopsida Semillas con dos cotiledones

Subclase Dilleniidae Fruto bacciforme 1

Orden Cucurbitales Fruto en forma de baya en cápsula raramente seco e indehiscente.

Familia Cucurbitaceae Frutos provenientes de un ovario ínfero, por lo general tricalpelar y trilocular, con placentas marginales, que se prolonga hacia la pared carpelar. No comprende más que ésta familia2.

Genero Cucurbita Grupo de las dicoltiledoneas metaclamideas que constituyen por sí sola la orden de las cucurbitales3.

Especie Cucurbita moschata Duchesne Ex. Poir

La designación de Cucúrbita moschata por parte de A. N. Duchesne (Duchesne, 1786) no fue aceptado inicialmente por Lamarck, a la sazón editor de Encyclopédie Méthodique Botanique. De Candolle (1805) y Poiret (1818) agregan confusión aplicando la nomenclatura binomial de Linneo al trabajo de Duchesne. Más tarde se acepta C. moschata como separada de C. Pepo y por eso se antepone “Ex” o pasado,

para referir que ya no se da crédito al trabajo de Poiret.4

1 Véase Font Quer P. Diccionario de Botánica. Labor. Barcelona. 1982. P. 128. “Se refiere a frutos en forma de baya. Del

latin bacca, nombre común de diversos frutos carnosos y jugosos, que se ha de nominado baya, baia, baie, en castellano,

italiano y francés respectivamente. Llámese baya cualesquier fruto, monocárpico o sincárpico, con el epicarpio

generalmente muy delgado y el mesocarpio y el endocarpio carnoso y más o menos jugoso. En sentido restringido se reserva

el nombre de baya a los frutos que, con los caracteres mencionados, procedente de un gineceo monocalpelar”. 2 Cit. P. 293. 3 Op. Cit. P. 293. “Compuesto de plantas herbáceas anuales raramente subfruticosas o arbustivas, a menudo trepadoras

mediante zarcillos que son de naturaleza caulinofoliar; flores por lo común unisexuales, con los 5 estambres libres o concrescentes de dos en dos y uno suelto o soldados los 5 en un sinandro axial, incluso la región anterífera; ovario con un

estilo trífido, de ramitas estigmatíferas bifurcadas, y de frutos generalmente indehiscentes, abayado, a veces de considerable tamaño. Esta familia comprende unas 760 especies de los paises tropicales y subtropicales”. 4 Véase: PARIS, H.S. Paintings (1769±1774) by A. N. Duchesne and the History of Cucurbita pepo. Annals of Botany 85: 815±830, 2000

20

Origen y distribución de C. moschata

El área precisa de domesticación de C. moschata aún no es claro (Ferriol et al., 2004). Mesoamérica ha sido considerada inicialmente como el centro de domesticación para C. moschata (Whitaker y Davis, 1962), (Ferriol et al., 2004), debido a la gran antigüedad del registro arqueológico (fitolitos, fósiles, entre otros) encontrados en Tamaulipas - México que datan de 4900 a 3500 A.C. y en Guatemala entre 2000 a 800 A.C (FAO., 2002).

Se evidencia una gran diversidad de tipos, formas y tamaños, sin embargo la variación morfológica de C. moschata parece ser un factor que no permite sugerir alguna región en particular como centro de origen, pues se reporta como muy variable en cuanto a características de sus frutos y semillas para varias zonas dentro de su área de distribución (Flórez, 2009). Reportes recientes de poblaciones silvestres de Cucurbita en Bolivia y Colombia pueden estar relacionados con C. moschata, describen una importante diversidad morfológica en las zonas locales de esta especie para el norte de Colombia (Bukasov., 1981), lo que sugiere que esta área pueden ser el centro de origen (Lira S. y Montes H, 2001).

Comprende cerca de 27 especies silvestre y 5 cultivadas y se distribuyen principalmente desde Norte América hasta Argentina (Vallejo y Estrada, 2004). El género Cucurbita se ha dividido en dos grupos, especies mesòficas anuales o perennes de corta vida sin raíces almacenadoras, las especies domesticadas se originaron del grupo mesòfico, y las especies perennes de zona árida con raíces almacenadoras (Nee, 1990).

Morfología de la planta

La planta es una hierba rastrera, tallo angular, pubescencia más densa en los nudos. Sistema radicular son superficiales y externas, teniendo en cuenta que entre nudos de las ramas y el tallo se forman generalmente dos que sirven de soporte. El tallo principal sale de 3 a 10 ramas laterales, las cuales crecen varios metros, llegando la principal hasta 15 metros de longitud. Lamina foliar anchamente ovada, con 3 a 5 lóbulos de margen dentada, haz y envés densamente pubescente, con tricomas cortos y largos (Zaccari, 2005) (Figura 1)

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Figura 1. A: Sistema radicular; B: Morfología de la planta. Foto. Fernanda Z.

Sus flores son grandes y unisexuales y se forman en las axilas de las hojas; pueden presentarse solas o en inflorescencias (Robinson y Decker, 1997) Las flores estaminadas se localizan en el centro de la planta y nacen desde pedicelos largos y delgados. Las flores pistiladas, en cambio, se localizan en forma distal a las flores estaminadas y nacen desde pedicelos cortos y rígidos. La expresión sexual es relativamente estable. Todas las especies del género Cucurbita son monoicas, por lo tanto, es necesario de un agente polinizador para el transportar los granos de polen desde las flores estaminadas hacia el estigma de la flor femenina y lograr la fertilización (Whitaker y robinson, 1986).

Los frutos son de tamaño muy variable y formas diversas, su epicarpio son suaves y lisos o con costillas redondeadas, raramente verrucosos o granulosos, coloración muy variable, verde claro a verde oscuro uniforme o con manchas crema, pardo claras a oscuras, hasta completamente blancas. Su pulpa es anaranjada clara o brillante a verdosa, de ligera a muy dulce, suave y generalmente no fibrosa (Lira, 1995). Semillas elípticas, con margen definido, de color amarillo o café (Zaccari, 2005). Los granos de polen son grandes, pegajosos y pesados por lo que no pueden ser transportados por el viento, siendo necesaria la participación de insectos (vectores entomófilos) para su transporte (Ortiz, 2006) (Figura 2). Planta alógama, propagación por semilla (sexual), por lo que la reproducción vegetativa no se presenta (Montes Hernández, 1992; Lira, 1995). Número cromosómico 2n = 40 (Bisognin, 2002).

22

D

Figura 2. A: Flor estaminada; B: Flor pistilada; C: Grano de polen en microscopia electrónica de barrido MEB; D Semillas; E: Fruto. Foto. Autor

Importancia del Zapallo.

Las Cucurbitas han sido consumidas por los pueblos americanos desde hace varios miles de años. Según Whitaker, (1962), por ser una de las especies nativas de Colombia, se dan espontáneamente, aunque a veces se las siembra como monocultivo (Jaramillo, 1980). Los indígenas utilizaban calabazas comestibles como vasijas, hay evidencia en la cultura Quimbaya sobre las vasijas utilizadas en sus actividades caseras, ya que han sido interpretadas como formas de cerámicas de calabazas vegetales (Pérez, 1978).

El zapallo ha ido adquiriendo importancia a nivel mundial como alimento y como hortaliza con potencial de exportación, especialmente a los países Europeos (Hernández, 2001). Actualmente, es el cultivo entre las hortalizas que más han crecido en área sembrada en un periodo de siete años (1994–2001), según Le Buanec (2002) citado por Espitia (2004). Esto es debido a su gran volumen de producción (4-5 unidades por planta), diversidad de métodos para el consumo y alto contenido de vitaminas A, minerales como: fósforo y calcio; fácil digestión y de sabor agradable (Caicedo, 1993).

En Colombia, la importancia del zapallo ha sido reconocida por su área de siembra, producción, versatilidad en consumo directo, materia prima para la agroindustria, artesanías, decoración, buena calidad nutricional alto contenido de beta carotenos, ácido ascórbico, calcio, hierro, fósforo, tiamina y niacina (Caicedo, 1993; Vallejo y Mosquera, 1998), cultivo rústico con potencial de exportación (Hernández., 2001); y ligados a pequeños agricultores (Toro., 2001). No obstante la investigación en Colombia es escasa, siendo la más importante la que realiza la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, por el “Grupo de Mejoramiento Genético, Agronomía y Producción de Semilla de Hortalizas” desde hace 17 años (Vallejo y Mosquera, 1998; Espitia, 2004).

Las cinco especies cultivadas contienen una variación genética que abarca no solo variedad morfológica o contenido de las partes de mayor interés (fruto y semilla) sino también variaciones en el hábito de crecimiento, grado de resistencia a enfermedades y/o de adaptación de condiciones contrastantes, así como también ciclos fenológicos de duración variable. Las especies silvestres por su parte, poseen una importante variación de genes para el mejoramiento de los cultivos y algunos de ellos tienen potencial como generadores de productos de utilidad directa (Lira, 1995).

Existe un amplio intervalo geográfico latitudinal para el cultivo de C. moschata, la notable diversidad morfológica de sus frutos y semillas, la existencia de variantes de ciclos de vida de diferente duración, así como la de numerosos cultivares desarrollados en otras partes del mundo y las variantes con características agronómicas sobresalientes, indican que la variación genética de esta especie es amplia (Caicedo, 1993).

Usos y valor nutricional

El principal aprovechamiento del zapallo es su fruto, hace parte de la alimentación básica en varias regiones de América, Asia y Europa; y es materia prima para la agroindustria de harinas, almidones y concentrados para múltiples usos tanto en el consumo humano como animal e industrial (Lira, 1995; Robinson y Decker-Walters, 1997; Loy, 2004). Además, se aprovechan otras partes como flores, brotes tiernos y semillas como alimento (FAO, 2002).

En Colombia, el zapallo es un producto subutilizado que se cultiva en gran parte del país, especialmente en huertos caseros para el autoconsumo y para la venta en mercados locales, importante para la seguridad alimentaria, uso y la conservación de los ecosistemas. (Montes et al., 2004). A nivel medicinal es utilizado como laxante, emoliente, diurético expectorante, purgante y como tónico para personas nerviosas. También, en dolencias como la artritis hidropesía,

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tumores, hemorroides, estreñimiento, abscesos del hígado, anemias, fiebre, inflamaciones y quemaduras. (Bernal y Correa, 1991; García-Barriga, 1992).

A nivel nutricional, el zapallo provee de carbohidratos, β-caroteno (provitamina A), ácido ascórbico (vitamina C), minerales (calcio, hierro, fósforo) y aminoácidos como tiamina y niacina (Caicedo, 1993; Vallejo y Mosquera, 1998); se consume en forma directa (sopas, cremas, dulces, purés, jugos, pastelería y compotas) y de forma indirecta como materia prima para la agroindustria (harinas y deshidratados) (Espitia, 2004; Acevedo et al, 2007) analizaron que una compota de zapallo contiene 3.47% de proteínas y 4.98% en minerales, en comparación con 0.4% y 0.8%, respectivamente, de una compota comercial de durazno haciéndolo ideal para la alimentación de niños (Tabla 2)

Tabla 2. Valor nutricional del zapallo por 100g de producto comestible en base húmeda.

Especie Componente Cantidad

C. moschata Agua 88.72g

Proteínas 1.45 g

Carbohidratos 8.80 g

Fosforo 32.0 mg

Calorias 37 kcal

Vitamina A 108 ug/g

Tiamina 0.097 mg

Rivoflavina 0.027 mg

Niacina 0.800 mg

Ácido ascórbico 12.3 mg

Fuente. (Pérez, 2000)

Principales productores

La producción a nivel mundial alcanzó una cifra de 17`798,835 toneladas (Ton) en el año 2008 y una participación del 2% del total de la producción hortícola mundial. El zapallo se cultiva en más de 50 países tanto individual como industria. Entre los 10 principales países productores se encuentra: China 6`666.978 Ton, India 4`424.200 Ton, Rusia 988.580 Ton, EE.UU 792.700 Ton, Irán 695.600 Ton, Egipto 658.234 Ton, México 522.388 Ton, Italia 508.075 Ton, Turquía 430.402 Ton e Indonesia con 369.846 Ton (Faostat, 2011).

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China y Estados Unidos son los países que marcan las tendencias de precios y consumo mundiales, el rasgo más importante que define cada zona es la gran exportación de China y la autorregulación de producción-consumo de Estados Unidos (Faostat, 2011) (Figura 3).

Figura 3. 10 principales países productores a nivel mundial ordenados de mayor a menor

En Colombia se estima una disminución del 69,97% en área de siembra, al pasar de 3.470 has en 2000 a 2.428 has en el 2010, con una producción de 31.541 Ton y rendimientos promedios de 13 ton/has. Entre los departamentos productores se encuentran: Cesar con 5.902 Ton, Magdalena 4.420 Ton, Cundinamarca 3.934 Ton, Valle del Cauca 3.859 Ton, Cauca 2.144 Ton, Tolima 2.128 Ton, Santander 1.818 Ton, Quindío 1.717 Ton, Atlántico 1.379 Ton y Huila 930 Ton (Agronet, 2012) (Figura 4).

Figura 4. 10 principales departamentos productores en Colombia ordenados de mayor a menor

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En el Valle del cauca para el 2011, se reportó 3.844 Ton, con un rendimiento promedio 15.5 Ton/has. Entre los municipios productores se encuentran: Calima Darién con 700 Ton, Dagua 480 Ton, Restrepo 468 Ton, Tuluá 340 Ton, Palmira 308 Ton, Bolívar 285 Ton, La Cumbre 236 Ton, Yotoco 160 Ton, La Unión 98 Ton, Candelaria 91 Ton, Cali 72 Ton, Roldanillo 71 Ton, Vijes 60 Ton, El Águila 27 Ton, Buga 16 Ton y Versalles 14 Ton (URPA, 2011) (Figura 5)

Figura 5. 10 principales municipios productores en Colombia ordenados de mayor a menor

Argumentos a favor de la conservación

El Convenio sobre Diversidad Biológica (CDB, 1992) firmado por 188 países, es indicativo del creciente compromiso internacional para mantener y proteger la biodiversidad. El CDB reclama la conservación y uso sostenible de todos los componentes de la diversidad biológica con inclusión de los utilizados en la agricultura. Reconociendo la importancia de la diversidad a nivel genético, aconsejan la conservación de los recursos genéticos para la alimentación y la agricultura. El Artículo 2, reconoce específicamente a las «especies domesticadas y cultivadas» como componente importante de la diversidad biológica mundial.

La FAO argumenta, que se puede llegar a situaciones imprevistas debido a cambios en el ecosistema, las exigencias del mercado y las reglamentaciones asociadas, a cambios en la disponibilidad de insumos externos, por nuevas enfermedades, o por una combinación de dichos factores. El cambio climático mundial y la evolución de la resistencia de patógenos y parásitos al control químico afectarán casi sin duda alguna los sistemas futuros de producción agropecuaria, aunque la naturaleza de dichos cambios no está totalmente clara. La incertidumbre respecto a las necesidades futuras, en combinación con la naturaleza irreversible de

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acontecimientos como la extinción de una raza o especie, subrayan la necesidad de proteger el valor de opción (FAO, 1996).

Importancia de los Bancos de ADN de plantas

Los bancos de ADN en plantas terrestres son el equivalente a las bibliotecas, sino que en vez de tener libros son colecciones de alícuotas vegetales viables, con el propósito de mantener vivo este material y preservar sus características para el beneficio futuro de la humanidad y el medio ambiente (Painting et al., 1995). Según Mattick et al., (1992), indica, que los bancos de ADN tienen un enorme potencial de colectar y conservar de forma óptima y tecnificada una gran cantidad de información acerca de la diversidad genética global de las plantas. Es bien conocido como el acceso al ADN de las especies y los análisis moleculares pueden mejorar la conservación de las especies y la caracterización genética entre poblaciones de plantas, esto ha hecho contribuciones valiosas a la conservación de las mismas. La conservación ex situ, a través de los bancos de ADN hace parte de la estrategia de mantenimiento de los recursos biológicos como complemento a los métodos naturales. Sin embargo, no pueden remplazar los métodos tradicionales de conservación ex situ de los RFG (Mattick et al., 1992).

Básicamente los bancos de ADN tienen cuatro propósitos:

1 Recopilación de las nuevas accesiones

2 Conservación y documentación

3 Suministro de material vegetal

4 Investigación

Bancos de ADN existentes en el Mundo

Entre las instituciones que conservan y documentan las colecciones más importantes de ADN genómico en el mundo, se encuentran:

1. The Royal Botanic Gardens, Kew, UK. Actualmente, tiene el banco de ADN de

RFG mas grande con más de 40.000 accesiones representativas de todas las familias de plantas <http://www.kew.org/data/dnaBank/homepage.html>

2. The Plant DNA Bank in Korea (PDBK) ubicado en Corea, tiene el segundo banco

más grande de ADN en RFG con más de 36000 alícuotas de ADN. <http://pdbk.korea.ac.kr>

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3. The US Missouri Botanical Garden de EE.UU, tiene una colección de 20.000 muestras con el objetivo de proveer a los investigadores de material para su uso subsecuente en investigación en la conservación <http://www.mobot.org/MOBOT/research/applied_research>

4. The Australian Plant DNA Bank de la Universidad Southern Cross, conserva

información genética representativa de toda la Flora Australiana <http://www. dnabank.com.au>

5. The DNA bank at the Leslie Hill Molecular Systematics Laboratory of the

National Botanical Institute (NBI) de Kirstenbosch - South Africa, en colaboración con el Royal Botanic Gardens Kew, preserva material genético de la flora Sur Africana <http://www.nbi.ac.za/research/dnabank.htm>

6. The DNA bank at the National Institute of Agrobiological Sciences

(NIAS),Ibaraki, Japón, junto con el Ministerio de Agricultura, Silvicultura y Pesca (MAFF) en Tokio, es el responsable de la conservación del ADN y la información molecular de los organismos agrícolas. Actualmente, conserva muestras de arroz y ganado <http://www.dna.affrc.go.jp/bank/index.html>

7. The DNA Bank Brazilian Flora Species. de Río de Janeiro – Brasil. tiene como

objetivo preservar la información genética representada de su alta diversidad de su flora y fauna brasileña, siendo la base para la conservación y estudios en biotecnología <http://www.jbrj.gov.br>

8. DNA bank at the Nationaal Herbarium Nederland de Holanda estudia la

sistemática molecular, Filogenia y Biogeografía de plantas de los países bajos. Estableció un banco de ADN que comprende muestras de angiospermas, algas y hongos, que se encuentran actualmente en proceso de revisión <http://www.nhn.leidenuniv.nl/index.php>

9. El Instituto Alexander von Humboldt de Colombia, es el ente público más

importante en la conservación de especies en el país. Actualmente alberga más de 11.000 muestras entre tejido y ADN que representan un amplio rango de especies de la biodiversidad colombiana <http://www.humboldt.org.co/iavh/index.php >

10. La Universidad Nacional de Colombia de Palmira – Valle del cauca contribuye

con más de 1200 muestras de ADN entre plantas y mamíferos. Su objetivo es la conservación de la biodiversidad colombiana y proveer de material para estudios en diversidad biológica <www.palmira.unal.edu.co>

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Aislamiento del ADN

En el mercado existe gran variedad de protocolos eficientes y convencionales que permiten el aislamiento de ADN de manera fácil y en poco tiempo (Brusés et al., 2000). Muchas de estas han sido útiles en muchas especies; por mencionar algunos métodos “clásicos”, se encuentran los descritos por Doyle y Doyle (1987) útiles en hojas maduras, independientemente de las condiciones de crecimiento y edad.

El protocolo a base de CTAB (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio) es muy eficiente debido a que se pega fuertemente al ADN, desplaza las proteínas, previene la degradación y solubiliza muchos polisacáridos. Además, funciona como detergente que destruye las membranas al momento de moler el material vegetal (Csaikl et al., 1998) y se remueve mediante extracciones con cloroformo (Valadez y Kalh, 2000).

El método de Dellaporta et al., (1983) se ha usado en especies difíciles para el aislamiento de ADN, como es el caso de las especies boscosas entre otros. Debido a sus altos niveles de polisacáridos y muchos tipos de metabolitos secundarios.

El RNA es un contaminante, por lo que es necesaria la adición de RNAsa e incubación al final de la extracción, a diferente concentración y temperatura dependiendo del método a utilizar (Weir et al., 1996; Csaikl et al., 1998).

Marcadores cloroplásticos ADNcp y nucleares ADNnr

El ADN cloroplásticos es una molécula circular que se encuentra en múltiples copias en el cloroplasto y contiene secuencias codificantes (genes) y no codificantes (intrones y espaciadores intergénicos). La presencia de múltiples copias del genoma cloroplástico, junto con la presencia de múltiples cloroplastos por célula, significa que el ADNcp es muy abundante en una extracción típica de ADN. Lo anterior facilita la obtención de un alto número de copias en el análisis de fragmentos de restricción, así como las amplificaciones por PCR de regiones específicas del ADNcp (Flórez, 2009).

Las secuencias codificantes han sido usados exitosamente a nivel de familia y niveles superiores, mientras que las regiones no codificantes de ADNcp como intrones (p.ej. rpL16, rpoC, rpS16, trnL, trnK) y espaciadores intergénicos (trnT-trnL, trnL-trnF, atpB-rbcL, psbA-trnH) son usados a niveles taxonómicos inferiores a familia ofreciéndonos caracteres potencialmente informativos para los objetivos propuestos (Flórez, 2009).

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Los marcadores nucleares, que codifican por componentes ribosomales, (ADNnr) han sido adoptadas como una herramienta en sistemática de plantas y el marcador ITS perteneciente al ADNnr es usado tan comúnmente como el ADNcp. En los análisis intraespecífico, se necesitan regiones que evolucionen rápidamente, con el fin de obtener más caracteres filogenéticamente informativos (Kress et al., 2005). De acuerdo con Small et al., (1998), las secuencias ITS generalmente dan mayores valores de soporte y mayor resolución que una muestra equivalente de secuencia de ADNcp.

Código de barra de ADN en plantas (DNA barcoding)

La primera conferencia internacional sobre «Barcoding life» tuvo lugar en el «Natural History Museum» de Londres en el año 2005 y contó con la participación de 200 científicos de 50 países aproximadamente (Marshall, 2005). El objetivo fue proponer un sistema basado en secuencias del ADN para identificar organismos vivientes y así, brindar soporte a los programas de investigación sobre biodiversidad. Hebert et al., (2003) sostienen que ésta técnica automatizada facilitará la tarea de identificación de especies y contribuirá a revitalizar las colecciones biológicas, así como a acelerar el inventario de la biodiversidad.

La idea de emplear secuencias de ADN particulares para la identificación rápida de especímenes no es fundamentalmente nueva (Moritz y Cicero., 2004). Lo innovador de la iniciativa, es que ha propuesto usar información dentro de una misma región génica, en todos los taxones y con condiciones de secuenciación universalmente aceptadas y estandarizadas, y ha destacado la necesidad de relacionar esta información con ejemplares depositados en museos (Lanteri, et al., 2006).

Para que un código de barra de ADN funcioné, la variación debe ser lo suficientemente alta entre especies para discriminar entre ellas y debe ser lo suficientemente baja entre individuos de la misma especie para crear un límite claro entre las relaciones intraespecífica e interespecífica. Vences et al., (2005) han propuesto valores estimativos entre el 1 al 2% para su variación intraespecífica y para valores mayores separaría especies. En el caso de géneros serían del 9.93%, para familias del 15.46%, para órdenes del 22.18% y para clases del 23.27%.

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Usos de los códigos de barras de ADN

En los últimos años, los código de barras de ADN tienen una gran aceptación entre los especialistas en virus, bacterias, protistas y hongos, organismos cuya determinación sobre la base de la morfología resulta particularmente difícil (Holmes, 2004). También ha resultado de utilidad para la identificación de nematodos intersticiales de suelo y sedimentos (De Ley et al., 2005).

En el campo de la biología ha resultado de utilidad para la obtención de inventarios rápidos de estudios en impacto ambiental, la detección del tráfico de especies en vías de extinción o la identificación de especies plagas y sus parasitoides (Myers et al., 2000). Además, los expertos sostienen que ésta facilitará la tarea de identificación de especies y contribuirá a revitalizar las colecciones biológicas, así como a acelerar el inventario de la biodiversidad (Gregory, 2005).

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4 DISEÑO METODOLÓGICO

Localización

La producción de plántulas de la colección del genero Cucurbita, se realizó en el Centro Experimental de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira (CEUNP) (Figura 6), ubicado en el corregimiento El Carmelo, municipio de Candelaria, departamento del Valle del Cauca, (930 m.s.n.m.; 24°C, 75% humedad relativa; precipitación promedio anual de 1.056 mm). La caracterización molecular se realizó en el laboratorio de biología molecular de la misma sede (1.050 m.s.n.m.; 23.5°C; 77% de humedad relativa; precipitación promedio anual de 1604.4 mm) (POT, 2010).

Figura 6. A: Preparación del terreno; B: Formación de semilleros; C: Traspaso de los semilleros a campo; D: Colección de germoplasma establecida en el Centro experimental de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira – CEUNP.

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Material biológico

Se utilizaron las introducciones de la colección del Grupo de investigación “Mejoramiento Genético, Agronomía y Producción de Semillas de Hortalizas” de La Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Para el establecimiento del banco de ADN se tomaron 388 introducciones (Anexo 1) y a partir del banco, se seleccionó un total de 20 introducciones para su secuenciación y análisis en la autenticación por código de barras de ADN en C. moschata. Se eligieron en base a que representaban la mayor diversidad biológica, morfológica y geográfica posible con base en los resultados de agrupamiento moleculares de investigaciones realizadas con previa anterioridad por el Grupo de Investigación.

Preparación de las semillas

Para la preparación de las semillas, se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 2.7% por 30 minutos y se lavaron con abundante agua para su desinfección. A continuación, se ubicaron en papel servilleta en forma de triángulo y se aplicó Nitrato de potasio (KNO3) para aumentar el vigor de germinación de las semillas. Posteriormente, se trasladaron en bolsas con sustratos a base de tierra para su ubicación en el invernadero del centro experimental.

Selección y liofilización de las muestras

Para el análisis molecular, se tomaron laminas foliares primarias de 388 introducciones libres de daños mecánico y enfermedades. Se introdujeron en tubo estéril de microcentrífuga (1.5 ml) y se guardaron en nitrógeno líquido (N2) para su trasporte al laboratorio de biología molecular. Posteriormente, se liofilizaron cada una de las introducciones como método de conservación. Para el estudio se realizó pruebas del tiempo total de secado, humedad retirada y contenido de materia seca para cada una de las introducciones. Para estimar el contenido de materia seca (MS) se estimó mediante la fórmula:

% MS = 100 – [(PI – PS:) / PI] x 100

Dónde: %MS: Porcentaje de materia seca PI: peso inicial PS: peso en base seca

Por último, se molieron las muestras para disminuir el tamaño de partícula y se almacenaron a -50ºC.

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Muestras depositadas en el herbario

Los herbarios se fundamentan como una parte importante de la investigación, debido a que conservan materiales de forma indefinida, sobre todo aquella referida a la taxonomía. Para este estudio, se depositó en el herbario “José Cuatrecasas Arumi ” de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira plantas completas desecadas, preservadas y acompañadas de una información crítica sobre el sitio de colección, nombre común, nombre científico y usos, determinada por el curador Carlos Eduardo Gutiérrez.

Extracción y visualización del ADN

Para la extracción del material genómico, se probaron dos protocolos de extracción (Anexo 2). El primero de ellos fue propuesto por (Dellaporta et al., 1983 modificado por Posso, 2011); y el segundo propuesto por (Doyle y Doyle, 1990 modificado por CIMMYT, 2006) a base de CTAB 1% (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio o Bromuro de cetiltrimetilamonio). Las introducciones utilizadas en los protocolos fueron en base seca.

Cuantificación del ADN

Para la evaluación de la cantidad y calidad del ADN, se prepararon geles de agarosa al 0,8% corridos en tampón TBE 0.5X (Tris-borato 0045M; EDTA 0.001M) y teñidos con bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 ng/mL. Las concentraciones se determinaron por comparación de concentraciones de ADN del bacteriófago lambda a 30 60 y 90 ng/ul. Se efectuó una base de datos computarizada donde se registró la mayor cantidad de información disponible y se asignó un código único para cada material.

Selección de los materiales para su amplificación

Con la información disponible en el banco de ADN, se seleccionaron 20 introducciones distribuidas en los países de México, Honduras, El Salvador, Costa rica, Guatemala y Colombia para su amplificación (Tabla 3). Los materiales se ubicaron espacialmente en un mapa de América Latina mediante el programa Google Earth Plus 5.2.1.1547.

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Tabla 3. Procedencia de las 20 introducciones de zapallo, utilizados para el análisis molecular y datos geográficos disponibles

Especie País Introducción Longitud Latitud

C. moschata México 125 98°53'17" 18°57'07"

150 98°55'28" 18°39'26"

140 95°14'20" 16°19'28"

65 91°56'57" 16°20'17"

Honduras 133 87°42'12" 014°23'36"

El Salvador 126 88°09'03" 013°28'01"

Costa rica 137 83°17'10" 8°54'39"

148 83°43'22" 10°16'38"

Guatemala 132 90°44'06" 14°33'12"

Colombia 24 77°00'0.5" 2°33'14"

169 75°11'08" 10°46'25"

C1 77°00'15.7" 02°05'53.9"

C7 74°43'44" 09°15'28"

C9 76°42'31.3" 02°17'15.8"

C13 76°36'33.32" 02°26'04.73"

48 77°00'15.7" 02°05'53.9"

7 74°22'11" 9°17'33"

52 74°43'44" 9°15'28"

C máxima Colombia 62 - -

C.moschata sp México 265 104°22'02" 20°46'02"

Total 20

Amplificación del ADN mediante PCR

Para la amplificación de los ocho cebadores, siete de origen ADNcp (AdhC, G3pdh, rpl32-trnL, ndhF-rpl32, 3’rps16–5’trnK(UUU), trnQ(UUG)-5’rps16, psbA-trnH) y uno ADNnr (ITS4-ITS5A) descrita por (White et al., 1990; Strand et al., 1997, Small et al., 1998, Kress et al., 2005, Shaw et al., 2007), se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Tabla 4).

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Tabla 4. Marcadores explorados en el estudio

Marcador Secuencias de primer pb Referencia AdhC P1: CTGCKGTKGCATGGGARGCAGGGAAGCC

P2: GCA CAG CCA CAC CCC AAC CCT G >1000 Small et al.

(1998) G3pdh GPDX7F: 3 GATAGATTTGGAATTGAGG

GPDX9R: 3 AAGCAATTCCAGCCTTGG 850 Strand et al.

(1997) ITS4-ITS5A TCCTCCGCTTATTGATATGC

CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG 650 White et al.

(1990) rpl32-trnL trnL(UAG): CTG CTT CCT AAG AGC AGC GT

rpL32-F: CAG TTC CAA AA A AAC GTA >1000 Shaw et al.

(2007) ndhF-rpl32 rpL32-R: CCA ATA TCC CTT YYT TTT CCA A

ndhF: GAA AGG TAT KAT CCA YGM ATA TT 710 Shaw et al.

(2007) 3’rps16– 5’trnK(UUU)

rpS16x2F2: AAA GTG GGT TTT TAT GAT CC trnK(UUU)x1: TTA AAA GCC GAG TAC TCT ACC

900 Shaw et al. (2007)

trnQ(UUG)- 5’rps16

trnQ(UUG): GCG TGG CCA AGY GGT AAG GC rpS16x1: GTT GCT TTY TAC CAC ATC GTT T

800 Shaw et al. (2007)

psbA-trnH psbA3'f GTTATGCATGAACGTAATGCTC trnHf CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

<500 Kress et al. (2005)

En la Tabla 5, se observa la concentración del coctel base, descritas por (Pérez- Galindo et al., 2009). Para la estandarización de las condiciones de cada uno de los marcadores, se preparó una mezcla de reactivos en un tubo estéril de microcentrífuga (1.5 ml) para un volumen final de 25 μl. Se utilizaron 2 µl de ADN genómico a 60 ng/ul para la PCR con concentraciones finales de tampón taq 1X, dNTPs 0,2 mM, Cebador F Y R 0,1uM, MgCl2 de 3 mM, y 2,5 unidades de Taq polimerasa (Fermentas).

Tabla 5. Volumen de los cocteles para PCR

Reactivos [ ] inicial [ ] final

H20 - -

Buffer taq 10x 1x

dNTPs 1,mM 0,2 mM

Cebador F 10uM 0,1uM

Cebador R 10uM 0,1uM

MgCl2 25 mM 3 mM

Taq poli 5 u/ ul 2,5u

ADN 80 ng/ul 60 ng/ul

Taq = Thermus aquaticus (polimerasa Taq) dNTPs= desoxirribonucleótidos trifosfato

MgCl2= Cloruro de magnesio Cebador F: Forwards. R: reverse

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Los ocho primers o marcadores fueron ajustados conforme a lo sugerido por (Flórez, 2009). Cada uno de ellos se probó con los materiales extraídos y su amplificación se produjo en un termociclador PTC-100 Programmable Termal Controller de MJ Research, Inc. Para los marcadores AdhC, ITS4-ITS5A y psbA- trnH, se siguió el siguiente programa: Desnaturalización inicial fue de 80ºC durante 5 minutos; desnaturalización a 95 ºC por un minuto. Hibridación a una temperatura de 50ºC durante un minuto, rampa de incremento gradual de 0.3°C/s hasta 65°C, extensión de 65ºC por 4 minutos, 30 ciclos desde la desnaturalización a extensión, extensión a 65ºC durante 5 minutos y por último mantener a 16°C por 30 minutos (Tabla 6).

Tabla 6. `Programa utilizado para la amplificación

Marcadores: AdhC / ITS4-ITS5A / psbA-trnH

1. Desnaturalización a 80°C por cinco minutos.

2. Desnaturalización a 95°C por un minuto.

3. Alineamiento de los primers a 50°C por 1 minuto.

4. Rampa i. e. incremento gradual de 0.3°C/s hasta 65° C.

5. Extensión de primer a 65°C por 4 minutos.

6. ir al paso II y repetir 30 veces

7. Extensión final a 65°C por 5 minutos

8. Mantener a 16°C por 30 minutos

9. Finalizar

Para los Marcadores G3pdh, rpl32-trnL y ndhF-rpl32, inicio con una desnaturalización inicial de 95ºC durante 18 segundos; segunda desnaturalización a 95 ºC por un minuto. Hibridación a una temperatura de 50ºC durante un minuto, extensión de 72ºC por un minutos, 35 ciclos desde la desnaturalización a extensión, extensión a 65ºC durante 5 minutos y por último mantener a 16°C por 30 minutos (Tabla 7).

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Tabla 7. Programa utilizado para la amplificación

Marcadores: G3pdh / rpl32-trnL / ndhF-rpl32

1. Desnaturalización a 95°C por 0,18 minutos.

2. Desnaturalización a 95°C por un minuto.

3. Alineamiento de los primers a 50°C por 1 minuto.

4. Extensión de primer a 72°C por 1 minutos.

5. ir al paso II y repetir 35 veces

6. Extensión final de 72°C por 0,30 minutos

7. Mantener a 16°C por 5 minutos

8. Finalizar

Por último, los marcadores trnQ(UUG)-5’rps16 y 3’rps16–5’trnK(UUU) iniciaron con una desnaturalización inicial a 80ºC durante 5 minutos; segunda desnaturalización a 95ºC por un minuto. Hibridación a una temperatura de 50ºC durante un minuto, extensión de 65ºC por 4 minutos, 30 ciclos desde la desnaturalización a extensión, extensión final a 65ºC durante 5 minutos y por último mantener a 16°C por 30 minutos (Tabla 8).

Tabla 8. Programa utilizado para la amplificación

Marcadores: trnQ(UUG)-5’rps16 / 3’rps16–5’trnK(UUU)

1. Desnaturalización a 80°C por cinco minutos.

2. Desnaturalización a 95°C por un minuto.

3. Alineamiento de los primers a 50°C por 1 minuto.

4. Extensión de primer a 65°C por 4 minutos.

5. ir al paso II y repetir 30 veces

6. Extensión final a 65°C por 5 minutos

7. Mantener a 16°C por 5 min

8. Finalizar

sualización y cuantificación de los productos PCR

Para la visualización de los productos PCR bajo luz ultravioleta, se utilizó gel de agarosa a una concentración de 1.2% teñido con bromuro de etidio, en una cámara de electroforesis para gel horizontal CBS Scientific SGE-020-02 y un equipo digital de captura de imagen marca UVITEC.

39

Se preparó el soporte del gel utilizando cinta adhesiva sellando los lados abiertos y reforzar los márgenes inferiores y las esquinas del soporte del gel. Se adicionó 1,2 g de agarosa por 150 de volumen de TBE 0,5X requerido. Se llevó al microondas hasta que la solución se disuelva completamente y agregamos el de bromuro de etidio (1ul) por cada 100ml de solución de agarosa preparada. Se dejó enfriar hasta que polimerizará en la cabina extractora de gases. Se adicionó la mezcla DNA+buffer de corrida dentro de los pozos del gel sumergidos en la cámara de electroforesis, usando la micropipeta. Se corrió la electroforesis por 40 minutos a 80 voltios. Finalmente, se observaron las bandas en un fotodocumentador con luz ultravioleta UV y se fotografió las bandas de ácidos nucleicos excitadas por el bromuro de etidio.

ecuenciación

Para solicitar el servicio de secuenciación a MACROGEN, La empresa dispone de una página Web que garantizara la trazabilidad de las muestras y permitirá el acceso on-line del usuario a los resultados. (Anexo 3)

nálisis de datos

Las secuencias fueron editadas y ensambladas con el programa Vector NTI 10.3.0, identificando errores en las secuencias bases, observados a partir de los electroferogramas adjuntos. Cada región de DNA evaluado fue alineado usando el programa ClustalW versión 1.81, con los parámetros estándar de Larkin et al., (2007) y los alineamientos modificados manualmente fueron realizados con EditPlus Text Editor versión 3.20. Para la identificación de bloques no informativos y regiones divergentes del alineamiento, se utilizó el programa Gblock 0.91b 8 (Castresana, J, 2000). Cada una de las secuencias fueron revisadas en la base de datos NCBI usando el algoritmo BLASTn para estimar el score (puntuación) y confirmar la especie en estudio.

Para la evaluación de los marcadores candidatos a código de barras de ADN, se usaron cinco criterios de identificación. Primero: Se identificó los marcadores con un grado de facilidad en su amplificación y la calidad de las secuencias evaluadas. Segundo: Se calculó para cada loci el número de haplotipos, número de sitios polimórficos y la diversidad haplotípica de Nei (Nei, M.1973), con el soporte del programa DNAsp (Rozas y Rozas, 1999). Tercero: Se analizó la divergencia intraespecífica e interespecífica promedio y su frecuencia acumulada entre las secuencias con el propósito de observar la cantidad de veces que se repite un determinado valor de la variable en cada rango de divergencia con el apoyo del programa STATSOFT™. 8.0.

40

Cuarto: El mejor marcador con la capacidad de discriminar a nivel de especie, se construyó un árbol de distancia genética con el método de Neighbor-joining (NJ) a partir del modelo de Kimura 2-parameter con el apoyo del programa MEGA versión 5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011). Quinto: Finalmente, el marcador seleccionado como código de barras de ADN se evaluó con secuencias estrechamente relacionadas a C. moschata descargadas de la base de datos del NCBI para observar su eficiencia en la discriminación a nivel de especies. La estrategia de muestreo óptima para la adjudicación del códigos de barras de ADN fue identificado a partir del agrupamiento a nivel de especies.

El valor de Bootstrap de apoyo (BS) para cada cladio individual se calculó mediante la ejecución de 500 replicaciones en el arranque de los datos. Todas las posiciones que contenían gaps o datos faltantes fueron eliminadas de la base de datos (Figura 7).

Figura 7. Diagrama resumido de la metodología utilizada en la investigación.

41

RESULTADOS

Establecimiento de la colecciòn en campo

Se estableciò la colección en campo con 320 introducciones de C. moschata, 1 C. máxima, 45 C. moschata var bicolor, 22 de C. moschata sp para un total de 388 introducciones a partir de la colección de hortalizas (Anexo 1), con un éxito de germinación del 80%. (Figura 8).

Figura 8. Introducciones de Cucurbita evaluadas e incluidas en el banco de ADN.

Colección del material liofilizado

El equipo de liofilización requirió un peso promedio de hoja de 1.85g en base humedad, presión de 6.105 kilopascal (kPa) y un tiempo de 48 horas, para retirar el 88,98 % de agua libre, obteniendo un total de 0,21 g de materia seca (MS). De acuerdo al protocolo de extracción se necesita 20 miligramos (mg) en base seca, es decir que se puede extraer 10.5 veces por cada introducción, material suficiente para futuros trabajos y mejorar los presentes en el área molecular (Tabla 9).

Tabla 9. Extracción del contenido de humedad en hojas de C. moschata

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Variables Introducción Media

132 258 255 268 251 253 133 83 254 265

Peso (g) 1,58 1,53 1,63 1,79 1,71 1,74 3,17 1,87 1,69 1,79 1,85

Agua libre 1,32 1,42 1,46 1,64 1,56 1,56 2,76 1,61 1,52 1,58 1,64

Materia seca (g) 0,26 0,11 0,17 0,15 0,15 0,18 0,41 0,26 0,17 0,21 0,21

% Base seca 16,46 7,19 10,43 8,38 8,77 10,34 12,93 13,90 10,06 11,73 11,02

% Base humedad 83,54 92,81 89,57 91,62 91,23 89,66 87,07 86,10 89,94 88,27 88,98

Disposición de las muestras en el herbario

En el Herbario “José Cuatrecasas Arumi” de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, se encuentra nueve materiales disponibles de las especies de trabajo, las cuales fueron desecadas, preservadas e identificadas con su información básica para su identificación (Figura 9).

.

Figura 9. Muestra del material vegetal depositado en el herbario “José Cuatrecasas Arumi ”.

43

Cuantificación del ADN genómico

Mediante el protocolo de (Dellaporta et al., 1983 modificado por Posso, 2011) permitió obtener concentración muy bajas entre 5 y 10 ng/µl. Además, la cantidad de proteínas y RNA era muy alto en el pellet haciéndolo inviable para su conservación y posiblemente allá interferencia con la amplificación por PCR. Por otro lado, el segundo protocolo de (Doyle y Doyle, 1987 a base de CTAB 1%, modificado por el CIMMYT,2006) permitió extraer ADN de manera adecuada con un volumen de 100µl a una concentración promedio entre 60 y 80 ng/µl, a partir de la comparación con concentraciones conocidas del bacteriófago Lambda, siendo una concentración suficiente para la amplificación por PCR de los marcadores a evaluar, además la cantidad de proteínas y RNA fue muy bajo en el pellet haciéndolo viable para su conservación (Figura 10).

Figura 10. Paralelo entre los protocolos propuestos. A: Pellet a partir del protocolo (Dellaporta et al., 1983 modificado por Posso, 2011); B: Pellet a partir del protocolo (Doyle y Doyle, 1987); C: Muestras en gel de agarosa al 0.8 % a partir del protocolo (Doyle y Doyle modificado por el CIMMYT, 2006)

44

Establecimiento del banco de ADN

Al validar el protocolo de extracción, se permitió realizar la cuantificación de toda la población. Se estableció el banco de ADN con 388 muestras y está disponible en el Laboratorio de Genética de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, conservado a una temperatura de -50°C y acompañado de una base de datos computarizada en la cual se encuentran registrado los datos de pasaporte disponibles (Figura 11).

Figura 11. A: Conservación del ADN en cadena de frio para su ubicación B: Información de trazabilidad de las introducciones C: Ubicación en las muestras en los rack divididos por colores D: Ubicación los rack con las muestras en las casillas E: Colección de ADN establecida en el laboratorio de Genética a -50 °C.

Distribución de los materiales

Se seleccionaron 20 materiales a partir del banco de ADN y se ubicaron espacialmente en un mapa, permitiendo proponer una primera aproximación en la distribución del muestreo (Figura 12). Se aprecia que la mayoría de las introducciones analizadas son colombianas (50%) del total de introducciones. México posee el segundo lugar en aporte de introducciones (25%). El 75% del muestreo fue en estos dos países debido a que en estos sitios se les adjudica como centro de domesticación en la especie. Otros países de Centroamérica con representación en el estudio son: Costa Rica (10%), Honduras (5%), El Salvador (5%) y Guatemala (5%).

45

Figura 12. Distribución del muestreo de las introducciones incluidas en el estudio. Se delimitaron tres poblaciones, mexicana, centroamericana y colombiana georeferenciadas mediante el programa Google Earth Plus 5.2.1.1547.

46

Tasa de éxito en la amplificación por PCR

La tasa de éxito en la amplificación por PCR de los marcadores, mostró que alguno de ellos presentaba problemas. El marcador AdhC, mostró un 95% de múltiples bandas y el 5% no amplifico. Respecto al marcador G3pdh, amplificó un 20% de las muestras y el siguiente 80% no amplificó por lo que su eficiencia fue muy baja. En el caso del marcador rpl32-trnl, el 100% de las muestras no amplificaron, por lo que su eficiencia era nula, por lo tanto ninguno de estos marcadores se incluyeron para el análisis posterior. En el caso de los marcadores ITS4-ITS5A, ndhF-rpl32, 3’rps16–5’trnK(UUU), trnQ(UUG)-5’rps16 y psbA-trnH alcanzaron la mayor eficiencia en el número de amplificados con el 100% de las muestras (marcado en negrilla), utilizando un par de cebadores universales por locus. Se obtuvieron longitudes en las bandas entre <500 y >1000 pb (Tabla 10).

Tabla 10. Marcadores seleccionados por su tasa de éxito en la amplificación.

Marcador pb Amplificaciones

exitosas (bandas

individuales)

Amplificaciones No especificas

(bandas múltiples)

No amplificó

Usado para el estudio

AdhC 0/20=0% 19/20=95% 1/20=5% NO G3pdh 4/20=20% * 0/20=0% 16/20=80% NO rpl32-trnL 0/20=0% 0/20=0% 20/20=100% NO ITS4-ITS5A 714 20/20=100% 0/20=0% 0/20=0% SI ndhF-rpl32 904 20/20=100% 0/20=0% 0/20=0% SI 3’rps16–5’trnK(UUU) 1070 20/20=100% 0/20=0% 0/20=0% SI trnQ(UUG)-5’rps16 1062 20/20=100% 0/20=0% 0/20=0% SI psbA-trnH 335 20/20=100% 0/20=0% 0/20=0% SI

*Indica baja eficiencia en su amplificación.

Total de secuencias para el estudio

Para observar la variabilidad a nivel intraespecífica e interespecífica de los cinco marcadores candidatos a código de barras de ADN, se seleccionaron 180 secuencias de C. moschata, seguido de 10 secuencias para C maxima, y finalmente 10 secuencias C moschata sp respectivamente, distribuidas en los marcadores a evaluar, completando así un total de 200 secuencias (Tabla 11). Para cada una de las especies se secuenciaron en los dos sentidos de la cadena de ADN.

Tabla 11. Número total de secuencias en el estudio

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Especie Marcadores F R Total

ITS4- ITS5A

ndhF- rpl32

3’rps16– 5’trnK(UUU)

trnQ(UUG)- 5’rps16

psbA- trnH

C. moschata, 18 18 18 18 18 90 90 180 C máxima 1 1 1 1 1 5 5 10 C moschata sp 1 1 1 1 1 5 5 10

Secuencias 20 20 20 20 20 100 100 200 F y R= Amplificación en los dos sentidos de la cadena.

Nivel de identidad de los marcadores

El nivel de identidad de los marcadores se realizó a partir de un BLASTn de la base de datos NCBI, que permitió identificar de forma preliminar para cada marcador evaluado el vecino más cercano a nuestra secuencias problemas. Se encontró que el marcador que más se aproximó en la identificación a nivel de especie fue ITS4- ITS5A de origen nuclear, con un porcentaje de similaridad del 98%. A nivel de género igualmente el loci ITS4-ITS5A funciono en un 96% al identificar a Cucurbita pepo (Marcado en negrilla). En el caso de los marcadores ndhF-rpl32, 3’rps16– 5’trnK(UUU), trnQ(UUG)-5’rps16 y psbA-trnH se logró una mayor tasa de éxito a nivel de género y familia que oscilo entre el 85% y 94% (Tabla 12).

Tabla 12. Lista de vecinos cercanos para C. moschata. Ordenadas de acuerdo a su E-valor

Loci Vecino cercano E-valor Identidad

ITS4-ITS5A Cucurbita moschata Cucurbita pepo

0,0 0,0

98% 96%

3’rps16 5’trnK(UUU) Cucumis sativus Cucumis melo

0,0 0,0

86% 90%

ndhF-rpl32 Cucumis sativus Cucumis sativus cultivar

0,0 4E-118

85% 90%

trnQ(UUG)-5’rps16 Cucumis melo Cucumis sativus

3 E -125 2 E -140

87% 78%

psbA-trnH Cionosicyos guabubu Cucumis melo subsp. melo

3 E -104 6 E -101

94% 93%

E-valor igual a cero mayor "significancia" y más cercano a C. moschata

ariaciòn de las secuencias de ADN en los marcadores

48

A partir de una matriz de datos con número de sitios totales como se describe en la Tabla.13, se encontró que los marcadores ndhF-rpl32, trnQ(UUG)-5’rps16 y psbA-trnH presentaron muy baja variación, indicando que las secuencias exploradas fueron idénticas en todas las introducciones. Los marcadores 3’rps16 - 5’trnK(UUU) y ITS4-ITS5A, presentaron valores polimórficos altos entre 15 y 19 haplotipos respectivamente. Lo que indica, que el cebador ITS4-ITS5A, el único marcador ADNnr explorado, explica con superioridad la gran variabilidad genética existente en la colecciòn (marcado en negrilla) que los marcadores ADNcp. El estúdio indica tambien un número mayor de haplotipos en el marcador ITS4-ITS5A a ló mostrado por Flórez, (2009).

Tabla 13. Estadística descriptiva para los 5 marcadores evaluados en C. moschata ordenados de mayor a menor

Marcador No de sitios

polimórficos Diversidad

Nucleotídica (Pi) Diversidad

Haplotipica (Hd)

ITS4-ITS5A 19 0.02754±0.00746 0.995±0,018 3’rps16 - 5’trnK(UUU) 15 0.02163±0.00598 0,958±0,033 ndhF-rpl32 8 0.14827±0.05858 0,562±0,0,12 psbA-trnH 8 0.05113±0.03643 0,647±0,120 trnQ(UUG)-5’rps16 7 0,19053±0,08682 0,911±0,077

Alta diversidad haplotípica (>0.5) y baja diversidad nucleotídica (< 0.005)

Divergencia promedio intraespecífica e inter específica

Para el estudio, se tomó como referencia los promedios de (Vences et al., 2005) para la evaluación de los marcadores. En la tabla 14, se muestra uno a uno los promedio de divergencia intraespecífica e interespecífica entre los marcadores explorados (Anexo 4).

Los loci ITS4-ITS5A, mostró un nivel de divergencia intraespecífica promedio de 0.0173 para C moschata, siendo lo suficientemente baja entre individuos de la misma especie. Al confrontarlo con C máxima, la divergencia interespecífica promedio fue de 0,07704 siendo lo suficientemente alta entre especies, por lo que difiere entre especies estrechamente relacionadas (Marcado en negrilla). En lo que respecta a los loci ndhF-rpl32, logró un nivel de divergencia intraespecífica promedio de 0,1849 siendo suficientemente baja entre individuos de la misma especie. Sin embargo, al compararlo con C máxima, la divergencia interespecífica promedio fue de 1,066 siendo muy alta entre especies, mostrando una distribución muy amplia entre especies.

49

Los loci 3’rps16-5’trnK(UUU) presentó, un nivel de divergencia intraespecífica promedio de 0,0207 siendo medianamente baja. Sin embargo en la correlación de datos entre individuos de la misma especie, la divergencia intraespecífica de algunas de ellas superaba la divergencia interespecífica entre especies, alterando la distribución de los datos en un rango conciso. Al calcular su divergencia interespecífica obtuvo un promedio de 0,060 siendo lo suficientemente alta entre especies estrechamente relacionadas.

Por otra parte, los loci trnQ(UUG)-5’rps16, exhibió un nivel de divergencia intraespecífica promedio de 0,2651 siendo muy alta entre individuos, concluyendo que el marcador no es lo suficiente específico para obtener una relación íntima entre ellos. Al calcular su divergencia interespecífica promedio, confrontándola con C máxima, fue de 0,1084 siendo muy alta lo que nos indica un valor para la identificación de géneros (9.93%).

Por último, los loci psbA-trnH con 335 pb de longitud, mostró un nivel de divergencia intraespecífica promedio de 0,0470, siendo un valor estimativo muy alto entre individuos. Por otra parte, Al calcular su divergencia interespecífica promedio fue de 0,011 estando por debajo de la intraespecífica, por lo tanto es un marcador que no crea un límite claro entre las relaciones interespecífica de nivel de especie (Tabla 14.).

Tabla 14. Promedio del nivel de divergencia intra e inter especifica entre los marcadores explorados

% Diver intraespecífica % Diver

interespecífica

Loci C moschata C moschata sp C maxima pb

ITS4-ITS5A 0,0173 0,0250 0,077 714 ndhF-rpl32 0,1849 0,0020 1,066 904 3’rps16 - 5’trnK(UUU) 0,0207 0,0114 0,060 1070 trnQ(UUG)-5’rps16 0,2651 0,0084 0,944 1062

psbA-trnH 0,0470 0,0048 0,011 335

Para C moschata sp, manifestó una baja divergencia intraespecífica en todos los marcadores (ITS4-ITS5A: 0,0250, ndhF-rpl32: 0,0020. 3’rps16 - 5’trnK(UUU): 0,0114. trnQ(UUG)-5’rps16: 0,1084. psbA-trnH: 0,0048), siendo muy cercanos a los valores de C moschata (ITS4-ITS5A: 0,017, ndhF-rpl32: 0,185, 3’rps16- 5’trnK(UUU): 0,021, trnQ(UUG)-5’rps16: 0,265 y psbA-trnH: 0,047). Esto nos indica que los marcadores no son adecuados para diferenciar a nivel de subespecies o variedades (Figura 13).

50

Figura 13. Divergencia promedio intra e inter específica entre C. maxima, C. moschata sp y C. moschata para cada marcador evaluado.

Frecuencia a nivel de rangos acumulativos

i ITS4-ITS5A

En la Tabla 15, se observa la frecuencia acumulativa de los individuos de C.

moschata entre rangos intermedios de divergencia. En el rango de -0,01E-18<x<-

0,9E-17 no se acumuló ningún individuo del muestreo. Entre 0,9E-17<x<0,01,

obtuvo un conteo acumulativo de 1 individuo que representa una validación del 5%.

Entre el rango de 0,01<x<0,02 obtuvo un conteo de 14 individuo que representa

una validación del 70%.del muestreo total. Para el rango que oscila entre

0,02<x<0,03 logró un conteo de 2 individuos entre ellos se encuentra C. moschata

sp que representa una validación del 10%. Entre 0,03<x<0,07 se ubicaron 2

individuos de C. moschata que constituye una validación del 10%, acumulando así

un 95% del muestreo total. Por último, en el rango que oscila entre 0,07<x<0,08 se

ubica un individuo de la especie C. maxima validando un 100% del porcentaje

acumulativo del muestreo. No hubo datos perdidos en el conteo para el marcador

en estudio.

51

Tabla 15. Rangos acumulativos entre los individuos para ITS4-ITS5A

Especie % Rango Conteo Conteo

acumulativo %

Validación %

Acumulativo todos los

casos

C. moschata -0,01E-18 <x<-0,9E-17 0 0 0,0 0,0

-0,9E-17 <x<0,01 1 1 5,0 5,0

0,01<x<0,02 14 15 70,0 75,0

C.moschata sp 0,02<x<0,03 2 17 10,0 85,0

0,03<x<0,04 1 18 5,0 90,0

0,04<x<0,05 1 19 5,0 95,0

0,05<x<0,06 0 19 0,0 95,0

0,06<x<0,07 0 19 0,0 95,0

C. maxima 0,07<x<0,08 1 20 5,0 100,0

Perdidos 0 20 0,0 100,0

Al graficar los datos de distribución acumulativa con el marcador ITS4-ITS5A se forman dos grupos entre los individuos que se delimitan claramente. En el primero se reúnen C. moschata y C. moschata sp (encerrada en un círculo) que oscila entre 0<x<0,04 y el segundo donde se ubica la especie C. maxima entre 0,07<x<0,08 (encerrada en un triángulo) siendo la divergencia interespecífica lo suficientemente alta entre especies (Figura 14).

Figura 14. Distribución de los individuos entre rangos intermedios evaluados con los loci ITS4-ITS5A

52

i ndhF-rpl32.

En la Tabla 16, se observa la frecuencia acumulativa de los individuos de C.

moschata entre rangos intermedios de divergencia. En el rango de -0,20E-

15<x<0,722E-15 obtuvo un conteo acumulativo de 1 individuo que representa una

validación del 5% del muestreo. Entre 0,722E-15<x<0,20, alcanzó un conteo de 14

individuo que representa una validación del 70%.del muestreo. Dentro de estos

grupos se encuentran C. moschata y C. moschata sp. Entre 0,20<x<1,0 se ubicó un

conteo de 3 individuos pertenecientes a C. moschata que representa una validación

del 90%.del conteo acumulado. Por último, entre 1,0<x<1,2 se ubica un solo

individuo de la especie C. maxima validando un 100% del porcentaje acumulativo

del muestreo. No hubo datos perdidos en el conteo de los datos para este marcador.

Tabla 16. Rangos acumulativos entre los individuos para ndhF-rpl32.

Especie % Rango Conteo Conteo

acumulativo %

Validación % Acumulativo

todos los casos

C. moschata -0,20E-15<x<0,722E-15 1 1 5,0 5,0

C. moschata sp 0, 722E-15<x<0,20 14 15 70,0 75,0

0,20<x<0,40 2 17 10,0 85,0

0,40<x<0,60 0 17 0,0 85,0

0,60<x<0,80 0 17 0,0 85,0

C. maxima 0,80<x<1,0 1 18 5,0 90,0

1,0<x<1,2 2 20 10,0 100,0

Perdidos 0 20 0,0 100,0

Al graficar los datos distribución acumulativa con los valores del marcador ndhF- rpl32.se integran todos los individuos en un mismo grupo C. moschata, C. moschata sp (encerrada en un círculo) y C. maxima (encerrada en un triángulo) entre 0<x<1,2, por ende no hay un límite claro entre las especies estrechamente relacionadas, siendo la divergencia intraespecífica lo suficientemente alta entre individuos de la misma especies (Figura 15)

53

Figura 15. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos intermedios para ndhF-rpl32.

Loci 3’rps16 - 5’trnK(UUU)

En la Tabla 17, se observa, que entre el rango de -0,9E-17<x<0,01 obtuvo un conteo de un individuo que representa una validación del 5%.del muestreo. Para 0,01<x<0,02 logró un conteo de 12 individuos donde representa el mayor número de secuencias del muestreo para este loci, reuniendo las especies C. moschata y C. moschata sp que representan una validación del 60%. Para 0,02<x<0,05 adquirió 6 individuo de la especie C. moschata validando un 95% del muestreo. Por último, entre 0,05<x<0,06 conto un solo individuo de C. maxima validando un 5% y obteniendo así un porcentaje acumulativo en todos los casos del 100%.

Tabla 17. Rangos acumulativos entre los individuos para 3’rps16 - 5’trnK(UUU)

Especie % Rango Conteo Conteo

acumulativo %Validación %

Acumulativo todos los

casos

C. moschata -0,019E-17<x<-0,9E-17 0 0 0,0 0,0

-0,9E-17 <x<0,01 1 1 5,0 5,0

C.moschata sp 0,01<x<0,02 12 13 60,0 65,0

0,02<x<0,03 2 15 10,0 75,0

0,03<x<0,04 3 18 15,0 90,0

0,04<x<0,05 1 19 5,0 95,0

C. maxima 0,05<x<0,06 1 20 5,0 100,0

Perdidos 0,0 0,0 100,0

54

Al presentar un esquema de distribución acumulativa del marcador 3’rps16- 5’trnK(UUU), se observó que los individuos de C. moschata, C. moschata sp (encerrada en un círculo) se reúnen en un grupo homogéneo entre 0.0<x<0,05, lo que indica que hay un límite claro entre C. maxima (encerrada en un triángulo) que se ubica entre 0,05<x<0,06 (Figura 16).

Figura 16. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos intermedios para 3’rps16 - 5’trnK(UUU).

i trnQ(UUG)-5’rps16

En la Tabla 18, en el rango de -0,20E-15<x<0,7E-15 se encontró un individuo de C.

moschata validando un 5% del muestreo. Entre 0,722E-15<x<0,20 representó el

mayor número, con un total de 9 individuos para el loci en estudio. Reunió individuos

tanto de C. moschata y C. moschata sp validando así el 45%.del muestreo. El

segundo rango con mayor número de individuos para C. moschata está entre

0,20<x<0,40 con un total de 7, que representan una validación del 35% de los datos.

Entre el rango de 0,40<x<1,00 se ubicó un solo individuo de la especie C. maxima

validando un 90% del porcentaje acumulativo del muestreo. Por último, en el rango

que abarca entre 1,0<x<1,20 se encontró 2 individuos de C. moschata que

representa una validación del 100% del porcentaje acumulativo de todos los casos.

Tabla 18. Rangos acumulativos entre los individuos para trnQ(UUG)-5’rps16

55

Especie % Rango Conteo Conteo

acumulativo %

Validación %

Acumulativo todos los

casos

C. moschata -0,20E-15<x<0,7E-15 1 1 5,0 5,0

C. moschata sp 0,722E-15<x<0,20 9 10 45,0 50,0

0,20<x<0,40 7 17 35,0 85,0

0,40<x<0,60 0 17 0,0 85,0

0,60<x<0,80 0 17 0,0 85,0

C. maxima 0,80<x<1,00 1 18 5,0 90,0

1,0<x<1,20 2 20 10,0 100,0

Perdidos 0,0 0,0 100,0

La grafica de distribución acumulativa del marcador trnQ(UUG)-5’rps16, se observó que los individuos de C. moschata, C. moschata sp (encerrada en un círculo) y C. maxima (encerrada en un triángulo) se reúnen en un mismo grupo homogéneo que oscila entre 0,0<x<1,5, lo que indica que no hay un límite claro entre las especies en estudio (Figura 17).

Figura 17. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos intermedios para trnQ (UUG)-5’rps16

Loci psbA-trnH

56

En el rango de -0,10E-14<x<0,214E-14 se presentó un individuo de C. moschata

validando un 5% del muestreo. Sin embargo, para el rango que oscila entre 0,214E-

14<x<0,10 representó el mayor número de individuos con un total de 18, que

representa un porcentaje de validación del 90%, incluyendo las especies C.

moschata, C. moschata sp y C. maxima en un mismo grupo homogéneo. Por último,

en el rango de 0,70<x<0,80 se encontró 1 solo individuos de C. moschata validando

un 5% del muestreo que representa el 100% del porcentaje acumulativo de todos

los casos (Tabla 19).

Tabla 19. Rangos acumulativos entre los individuos para psbA-trnH

Especie % Rango Conteo Conteo

acumulativo %

Validación %

Acumulativo todos los

casos

C. moschata -0,10E-14<x<0,214E-14 1 1 5,0 5,0

C.moschata sp C. maxima

0,214E-14<x<0,10 18 19 90,0 95,0

0,10<x<0,20 0 19 0,0 95,0

0,20<x<0,30 0 19 0,0 95,0

0,30<x<0,40 0 19 0,0 95,0

0,40<x<0,50 0 19 0,0 95,0

0,50<x<0,60 0 19 0,0 95,0

0,60<x<0,70 0 19 0,0 95,0

C. moschata 0,70<x<0,80 1 20 5,0 100,0

Perdidos 0,0 0,0 100,0

Al expresar los datos de divergencia gráficamente para el marcador psbA-trnH, se

reunieron todos los individuos de C. moschata, C. moschata sp y C. maxima en un

mismo grupo que oscila entre 0,0<x<0,8 de divergencia. Sin embargo, 19 de ellos

oscila entre 0,0<x<0,1 exhibiendo una estrecha relación para especies muy

relacionadas (Figura 18).

57

Figura 18. Frecuencia acumulativa y distribución de los individuos entre rangos intermedios para psbA-trnH

Análisis descriptivo

De acuerdo a la evaluación de los marcadores, el marcador que sobresale en la capacidad de discriminar a nivel de especie es ITS4-ITS5A. A partir de los resultados se construyó un árbol de distancia genética entre C. moschata, C. moschata sp y C. maxima para observar su nivel de asociación. De acuerdo al dendrograma basado en el método de Kimura-2-parametros, se observa un patrón claro de separación entre los 18 individuos de C. moschata y C. moschata sp con el individuo de C. maxima, que están representadas en las líneas de apoyo al lado derecho para su discriminación interespecífica, validando así su capacidad de discriminación. En este último agrupamiento no se mide el valor de Bootstrap debido a que el árbol no tiene raíz para establecerlo (Figura 19).

58

Figura 19. Árbol de distancias basado en el modelo de Kimura-2-parameter entre las especies C. moschata, C. moschata sp y C. maxima utilizando el multilocus ITS4-ITS5A. Las líneas engrosadas representan valores de apoyo para la discriminación entre especies.

Para probar el poder de discriminación de los loci ITS4-ITS5A, se descargaron seis secuencias de Cucurbita pepo de la base de datos NCBI con número de accesión EF595858.1, FJ915103.2, FJ915102.2, AM981168.1, AM981169.1, FJ915107.2 Se observar que a partir de un árbol de distancias basado en el modelo de Kimura-2- parametro la conformación de tres grupos: 1: C, moschata, 2: C. maxima 3: C.pepo Por lo que, el multilocus ITS4-ITS5A, encabeza la lista de los marcadores evaluados de más alta eficiencia en la identificación a nivel de especies, postulándolo como un potente código de barra de ADN.

59

Figura 22. Árbol de distancias, basado en el método de Kimura-2-parametros entre C. moschata, C maxima y C pepo, utilizando el multilocus ITS4-ITS5. Las líneas engrosadas representan valores de apoyo para la discriminación entre especies del mismo género

60

6 DISCUSIÓN

En el presente trabajo, se estableció un banco de ADN en C. moschata y fueron probados concretamente la viabilidad de ocho cebadores, siete de origen ADNcp (AdhC, G3pdh, rpl32-trnL, ndhF-rpl32, 3’rps16–5’trnK(UUU), trnQ(UUG)-5’rps16, psbA-trnH) y uno ADNnr (ITS4-ITS5A) descrita por (White et al., 1990; Strand et al., 1997, Small et al., 1998, Kress et al., 2005, Shaw et al., 2007), como posibles candidatos a código de barras de ADN para su autenticación.

Para la extracción del ADN, se tomó material vegetal liofilizado debido a que la técnica reduce las pérdidas de los componentes volátiles o termo-sensibles y no altera la estructura físico-química del material, permitiendo la conservación en cadena de frío por muchos años y alta estabilidad microbiológica (Alvarado, 1996). En él estudió, presentó un rendimiento de 210 mg en base seca por introducción. De acuerdo con el protocolo de extracción de ADN se necesitó 20 mg de muestra para obtener ADN viable., Esto nos indica, que se puede extraer ADN 10.5 veces por cada introducción siendo material suficiente para poder desarrollar trabajos presentes y futuros en el área molecular.

Para obtener ADN viable para su conservación, se realizó un paralelo entre los protocolos propuestos por (Dellaporta et al., 1983 modificado por Posso, 2011); y el segundo propuesto por (Doyle y Doyle, 1990 a base de CTAB 1%, modificado por el CIMMYT, 2006). Los resultados obtenidos señalan que el método de CTAB 1%, permitió extraer ADN de manera adecuada con un volumen de 100 µl a una concentración promedio entre 60 y 80 ng/µl, debido a que los detergentes usados tienen propiedades específicas (Valadez y Kalh, 2000). Esto coincide con lo reportado por: Weir et al., (1996). Wang et al., (1993); Henry, (1997), Jewit et al. (1998) entre otros autores, que han utilizado CTAB para aislamiento de ADN de hojas maduras para estudios de caracterización de especies con la técnica RAPD (ADN Polimórfico Amplificado Aleatoriamente).

La primera región propuesta como código de barras de ADN fue AdhC. Manifestó baja eficiencia en la amplificación por PCR, además el 95% de los individuos expresó múltiples bandas, siendo inadecuado para su secuenciación. La región G3pdh, presentó baja eficiencia en el éxito de su amplificación, de 20 introducciones procedentes de la colección Cucurbita sp el 80% no amplificó, siendo no incluidas para su secuenciación (Tabla 10).

La tercera región propuesta rpl32-trnL, no amplificó ningún de las 20 introducciones. El posible fracaso de rpl32-trnL en su amplificación fue debido a los bajos porcentajes de sitios variables de C. moschata con esta región. La región ndhF- rpl32, mostró ventajas en la eficiencia de su amplificación por PCR y secuenciación

61

(Tabla 6); De las 20 introducciones amplificó el 100% de ellas (Tabla 10). Sin embargo, la variación de las secuencias a nivel de especie fue insuficiente debido a que su nivel de discriminación fue a nivel de género, teniendo una eficiencia en la identificación de sólo el 85% (Tabla 12).

Ahora bien, la región 3’rps16–5’trnK(UUU) mostró facilidades en la amplificación por PCR y secuenciación de las 20 introducciones (Tabla 10); Sin embargo, mostró una tasa de resolución más baja para identificar las especies dentro de un género, conservando una eficiencia en la identificación del 90% con Cucumis melo y un 86% con Cucumis sativus (Tabla 12). La sexta región propuesta trnQ(UUG)- 5’rps16, expresó ventajas en la eficiencia de su amplificación por PCR y secuenciación (Tabla 6). No obstante, su variación de las secuencias a nivel de especie fue insuficiente para discriminar las especies del genero Cucurbita. Al realizar el nivel de identidad, permitió identificar un 87% y 78% con Cucumis melo y Cucumis sativus respectivamente.

El espaciador intergénico psbA-trnH es un marcador no codificantes más variables en el cloroplasto. Se trata de una herramienta popular para estudio a nivel de filogenia y poblaciones de plantas y ha sido propuesto en los últimos años para estudios de código de barras de ADN (Storchová, 2007). Presentó facilidad en su amplificación en las 20 introducciones y posterior secuenciación. (Tabla 10). Sin embargo en nuestro estudio, mostró discriminación solo a nivel de familia relacionándolas con Cionosicyos guabubu con una identidad del 94% siendo no apto como código de barras de ADN para C. moschata.

El multilocus espaciador trascrito interno ITS4-ITS5A, es ampliamente utilizado en la taxonomía y filogenia molecular, debido a su alto número de copias de genes de rRNA para amplificar así sea en pequeñas cantidades de ADN, además tiene un alto grado de variación incluso entre especies estrechamente relacionadas. Esto se puede explicar por la presión evolutiva relativamente baja que actúa en estas secuencias (Chen et al., 2001). También cabe señalar, que en la tercera conferencia internacional sobre «barcoding life» y the Consortium for the Barcode of Life (CBOL) recomienda la combinación de dos locus para establecer un código de barras de ADN en plantas (CBOL, 2009). En nuestro estudió se encontró que la longitud de los loci ITS4-ITS5A era de 714 pares de bases, siendo relativamente fácil de ser amplificado utilizando un par de cebadores universales (Tabla 10). De acuerdo con el método BLASTn, la precisión de la identificación utilizando el multilocus ITS4-ITS5A fue del 98%, y se pudo identificar el vecino más cercano con un 96% de identidad (Tabla 12). El nivel de polimorfismo fue superior a lo reportado por (Flórez, 2009).

62

De acuerdo a la divergencias genéticas, intra e inter especificas usando distancias genéticas y frecuencia acumulativa, confirmaron que el espaciador ITS4-ITS5A poseía una variación lo suficientemente alta entre especies para diferir entre ellas y lo suficientemente baja entre individuos de la misma especie para crear un límite claro entre ellas (Vences et al., 2005). Por lo tanto, es bastante claro que entre las ocho marcadores propuestos, ITS4-ITS5A es el más prometedor código de barras para C. moschata. Sin embargo, esta herramienta no tuvo la capacidad de identificar la subespecie C. moschata sp, lo que indica que a nivel de variedades o subespecies, no puede ser correctamente discriminados por código de barras de ADN. Esto coincide con lo reportado por (Liu et al., 2008, Liu et al., 2012). Para estos casos puede ser adecuado el uso de otros marcadores moleculares (Por ejemplo: SNP, SSRs, etc) como herramientas auxiliares para el código de barra de ADN.

Para evaluar adicionalmente la capacidad de la región ITS4-ITS5A en la identificación de especies, se amplió el número de individuos a seis de la especie Cucurbita pepo. El resultado mostró que la región ITS4-ITS5A constantemente mantiene una tasa de eficiencia en la identificación.

63

7 CONCLUSIONES

El método clásico de CTAB con material liofilizado funcionó de manera adecuada para obtener ADN, con un volumen aproximado de 100 µl por introducción. Así, se logró establecer el banco de ADN para C. moschata que estará ubicado en el laboratorio de Genética de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Además, con el protocolo se obtuvo ADN de manera rápida y a bajo costo ya que no requiere de la utilización de equipos especializados como espectrofotómetros o fluorómetros. Sin embargo, los reactivos manejados son tóxicos y peligrosos debido a que son compuestos cancerígenos como el CTAB (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio), β-mercaptoetanol, EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético) y fenol cloroformo isoamílico (FCI: 25:24:1). Lo que la propone como una metodología fácil y rápida para la obtención de ADN en C. moschata pero con precauciones en su uso.

De acuerdo a los niveles de divergencia y frecuencia molecular con el multilocus ITS4-ITS5A, se logró delimitar especies estrechamente relacionadas a C. moschata. Por lo tanto, ITS4-ITS5A del cistròn 18S-5.8S-26S del ADN ribosomal, presentó la más alta eficiencia en la identificación a nivel de especies, postulando como un potente código de barras de ADN para C. moschata. Sin embargo, para validar la información se requiere información morfológica y taxonómica detallada que sustente la investigación, con el objetivo de no adoptar decisiones definitivas.

El trabajo resulta de gran utilidad para formular hipótesis y orientar futuras investigaciones en el campo de la sistemática con otras especies estrechamente relacionadas a C. moschata.

64

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9 ANEXOS

Anexo 1. Colección conformada por 388 introducciones del género Cucurbita

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud 1 2-79-S2-1-F C. moschata Colombia - -

2 BOLO VERDE (ALTO CASTILLO) C. moschata Colombia - - 3 75-S3-F C. moschata Colombia - - 4 2-S3-A (2*2) F C. moschata Colombia - -

5 3-28-S0-4 F C. moschata Colombia - - 6 1-1-4-A C. moschata Colombia - - 7 CUELLO LARGO 2007-B C. moschata Colombia 74°22'11" 9°17'33"

8 41 C. moschata Colombia - - 9 SO-1 C. moschata Colombia - -

10 (BC1-4-A)*(BC1*34S3-4) C C. moschata Colombia -75,185579 10,773725

11 (108-S2-2)*(2-75-S2-2) C. moschata Colombia -74,242866 11,019260

12 5-108-S2-4 F C. moschata Colombia - - 13 S0-3 C. moschata Colombia - -

14 802*343-(4*5)F C. moschata Colombia - - 15 (28-S2-2-P)*(3-75-S2-2-M) C. moschata Colombia - - 16 1-1-18-2-B C. moschata Colombia - -

17 75-53-F (1*1)F C. moschata Colombia - - 18 BC2-A(1*1)A C. moschata Colombia -75,185579 10,773725

19 P2 C. moschata Colombia -74,242866 11,019260

20 (79-S2-4-P)*(2-108-S2-4-M) C. moschata Colombia -74,242866 11,019260

21 P6 C. moschata Colombia - - 22 75 S3 LP C. moschata Colombia - -

23 2-5-1-A C. moschata Colombia - - 24 (75 S3-1-F)*(6 S2-6-A) C C. moschata Colombia 77°0.0'0.5" 2°33'14" 25 34*79 S1-B C. moschata Colombia - -

74

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

26 P7 C. moschata Colombia - - 27 3-79-S0-4-F C. moschata Colombia - - 28 80 S3-A (2*3)F C. moschata Colombia -74,177884 11,228218

29 (B4-P5-4)4*5 C. moschata Colombia -74,050886 8,930911

30 1-80-S0-3-F C. moschata Colombia - - 31 S0-21 C. moschata Colombia - - 32 1-34-S1-1 C. moschata Colombia -74,124753 9,419598

33 2-6-S2-3-F C. moschata Colombia -74,728918 9,257953

34 BC*753 (4*3 F C. moschata Colombia - - 35 (79-S2-3-P)*(3-75-S2-3-M) C. moschata Colombia - - 36 2-34-S2-2-F C. moschata Colombia - - 37 CUELLO LARGO ZAMORANO C. moschata Colombia -74,153633 9,074785

38 34 S3 A (4*5) F C. moschata Colombia

39 B1-S2-19-1 C. moschata Colombia -74,410022 9,172201

40 S0-6 C. moschata Colombia - - 41 1-3-2-A C. moschata Colombia - - 42 1-80-S1-1-F C. moschata Colombia - - 43 (2 S2*BC1-2)*(2 S2*BC1-4) F C. moschata Colombia -74,808171 10,985396

44 2-34-S0-5-F C. moschata Colombia

45 SO-10 C. moschata Colombia

46 1-2-20-3-B C. moschata Colombia -74,728918 9,257953

47 75 S4-A (4*5) F C. moschata Colombia - - 48 (2-108-S2-1)*(2-79-S2-2) C. moschata Colombia 77°00'15.7" 02°05'53.9"

49 1-6-S0-4-F C. moschata Colombia - - 50 3-1-20-4 C. moschata Colombia - - 51 P4 C. moschata Colombia - - 52 BC1-34 S3 (1*2) F C. moschata Colombia 74°43'44" 9°15'28"

53 PZ (3*3) A C. moschata Colombia - - 54 1-2-S0-5-F C. moschata Colombia - - 55 B4-P3 (2*3) F C. moschata Colombia - -

75

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

56 75 S4-A (1*1) A C. moschata Colombia -74,369892 9,292736 57 3-28-S2-1-F C. moschata Colombia - - 58 BC1-5-A (5*5) A C. moschata Colombia - - 59 CUELLO LARGO ZAMORANO 2 C. moschata Colombia - - 60 3-6-S2-4-F C. moschata Colombia - - 61 5-79-S2-4-A C. moschata Colombia - -

62 Cucurbita máxima C. máxima Colombia

63 1229 C. moschata México 18°39'26" 098°55'28" 64 55 C. moschata México 16°19'28" 095°14'20"

65 1235 C. moschata México 16°20'17" 091°56'57"

66 393 C. moschata México 16°34'03" 093°49'01"

67 954 C. moschata México 24°47'31" 107°23'53"

68 1208 C. moschata México 20°00'37" 103°36'00"

69 217 C. moschata México 21°35'44" 098°58'00"

70 802 C. moschata México 21°29'00" 098°58'05"

71 1200 C. moschata México 19°43'07" 104°12'12"

72 1205 C. moschata México 19°40'39" 104°19'37"

73 419 C. moschata México 16°45'45" 093°22'30"

74 890 C. moschata México 28°01'56" 105°17'21"

75 646 C. moschata México 27°23'55" 108°50'38"

76 311 C. moschata México 19°19'37" 096°29'00" 77 1201 C. moschata México 19°41'16" 104°21'27"

78 CAMPINAS C. moschata Brasil - -

79 656 C. moschata México 19°26'53" 103°43'07"

80 964 C. moschata México 22°29'33" 105°21'39"

81 1213 C. moschata México 16°42'27" 093°25'36"

82 1204 C. moschata México 18°39'26" 098°55'28" 83 908 C. moschata México 28°25'49" 108°38'45"

84 448 C. moschata México 19°28'59" 101°19'04"

85 681 C. moschata México 16°20'43" 098°02'36"

76

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

86 735 C. moschata México 18°48'41" 096°43'12" 87 945 C. moschata México 25°24'49" 107°25'52" 88 1219 C. moschata México 19°50'21" 104°08'18"

89 233 C. moschata México 21°37'16" 099°01'16"

90 1212 C. moschata México 20°46'02" 104°22'02" 91 1244 C. moschata México 16°21'09" 091°55'05" 92 1236 C. moschata México 17°03'45" 096°09'43" 93 1203 C. moschata México 20°46'02" 104°22'02" 94 786 C. moschata México 21°21'48" 098°59'29" 95 1120 C. moschata México 18°54'53" 099°31'23" 96 1209 C. moschata México 18°57'08" 098°53'18" 97 296 C. moschata México 18°53'28" 096°55'54" 98 1222 C. moschata México 20°35'54" 100°47'48" 99 1210 C. moschata México 20°46'02" 104°22'02"

100 705 C. moschata México 21°33'47" 104°53'00" 101 635 C. moschata México 30°49'25" 112°51'03" 102 215 C. moschata México 22°15'19" 097°52'07" 103 386 C. moschata México 16°39'35" 093°34'52" 104 677 C. moschata México 17°38'40" 101°33'04" 105 262 C. moschata México 20°31'44" 100°48'54" 106 1218 C. moschata México 19°52'18" 104°13'04" 107 1216 C. moschata México 20°46'02" 104°22'02" 108 1211 C. moschata México 20°46'02" 104°22'02" 109 1217 C. moschata México 20°46'07" 104°19'11" 110 932 C. moschata México 23°30'05" 105°58'12" 111 662 C. moschata México 21°30'59" 104°53'39" 112 1234 C. moschata México 16°21'09" 091°55'05" 113 1237 C. moschata México 16°55'15" 096°21'42" 114 683 C. moschata México 15°40'00" 096°29'26" 115 1215 C. moschata México 19°54'20" 104°09'45"

77

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

116 895 C. moschata México 28°20'39" 105°32'39" 117 707 C. moschata México 28°27'38" 109°31'38" 118 1202 C. moschata México 19°52'03" 104°04'57"

120 363 C. moschata México 23°17'13" 106°03'50"

121 715 C. moschata México 19°19'13" 096°37'46" 122 439 C. moschata México 16°27'22" 093°49'39"

123 1248 C. moschata México 19°57'28" 103°59'21"

124 1207 C. moschata México 19°43'07" 104°12'12"

125 1204-1 C. moschata C. América - -

126 393-1 C. moschata C. América 88°09'03" 013°28'01" 127 802-3 C. moschata C. América - -

128 1206-2 C. moschata C. América 82,430677 8,314444

129 1219-2 C. moschata C. América - - 130 802-1 F C. moschata C. América - -

131 213-1 A C. moschata C. América - - 132 890-1 C. moschata C. América 90°44'06" 14°33'12"

133 802-2 F C. moschata C. América 87°42'12" 014°23'36"

134 1235-3 C. moschata C. América - - 135 419-1 A C. moschata C. América - - 136 1200-F-2 C. moschata C. América - -

137 393-3 C. moschata C. América 83°17'10" 8°54'39"

138 1206-1 C. moschata C. América - - 139 1213-1 C. moschata C. América - -

140 1202 C. moschata C. América 95°14'20" 16°19'28"

141 1205-2 C. moschata C. América - - 142 393-2 C. moschata C. América 83,722786 10,277267

143 213-2 C. moschata C. América 89,322694 15,124887

144 786-3 F C. moschata C. América 83,286256 8,910991 145 1200-1 C. moschata C. América 88,150837 13,467219

146 1213-F-3 C. moschata C. América 90,735262 14,553416

78

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

147 1219-1 C. moschata C. América - - 148 1201 C. moschata C. América 83°43'22" 10°16'38" 149 786-2 A C. moschata C. América - - 150 786-1 A C. moschata C. América 98°55'28" 18°39'26"

151 932-F C. moschata C. América - - 152 1205-F-1 C. moschata C. América -88,896530 13,794185

153 1222 F C. moschata C. América - - 154 1219-3 C. moschata C. América - - 155 1229 A C. moschata C. América -88350647 13,512270

156 1235-1 F C. moschata C. América - - 157 1235-2 C. moschata C. América -86,111458 12,009129 158 1213-F-4 C. moschata C. América -83,286256 8,910991

159 890-2 C. moschata C. América -87,703606 14,393394

160 1213-F-2 C. moschata C. América -87,824265 14,585542 161 1205-3 C. moschata C. América -87,894245 13,488644

162 802-4 C. moschata C. América -86,111458 12,009129

163 419-2 F C. moschata C. América - -

164 1204-2 C. moschata C. América - -

165 19-2-A C. moschata Colombia - - 166 12-6 (29-6) C. moschata Colombia - -

167 15-1-A C. moschata Colombia - - 168 82-2 C. moschata Colombia - - 169 4-6 (16-06-05) C. moschata Colombia 75°11'08" 10°46'25"

170 50-5-A (15-06-05) C. moschata Colombia - - 171 40-5 C. moschata Colombia - - 172 108-6 C. moschata Colombia - -

173 9-2 (29-06) C. moschata Colombia - - 174 25- (27-05-06) C. moschata Colombia - - 175 25-4 (11-07-05) C. moschata Colombia - -

176 77-5 C. moschata Colombia - -

79

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

177 48-5-A (15-06-05) C. moschata Colombia - - 178 21-5 (14-07-05) C. moschata Colombia - - 179 82-3 (14-07-05) C. moschata Colombia - - 180 26-3 (16-06-05) C. moschata Colombia - - 181 120-5 (15-06-05) C. moschata Colombia - - 182 84-3 C. moschata Colombia - - 183 60-1 (29-06) C. moschata Colombia - -

184 16-3 (9-06-05) C. moschata Colombia - - 185 10-6-A C. moschata Colombia - - 186 81-3 (30-06) C. moschata Colombia - - 187 31-3-A (12-07) C. moschata Colombia - - 188 27-5 (15-06-05) C. moschata Colombia - - 189 37-1 (6-07) C. moschata Colombia - - 190 20-2-A (11-07) C. moschata Colombia - - 191 18-5-A (10-06-05) C. moschata Colombia - - 192 70-3 (31-05-05) C. moschata Colombia - - 193 48-5 C. moschata Colombia - - 194 40-1 (14-07-05) C. moschata Colombia - - 195 2-2-A (14-07) C. moschata Colombia - - 196 3-2-A (29-06) C. moschata Colombia - - 197 41-5 (30-06) C. moschata Colombia - - 198 38-5-A (6-06-05) C. moschata Colombia - - 199 65-6 (30-6) C. moschata Colombia - - 200 42-2 ( 6-07) C. moschata Colombia - - 201 B8-S1-3 (15-06-05) C. moschata Colombia - - 202 34-1-A C. moschata Colombia - - 203 86-3 C. moschata Colombia - - 204 29-6 (14-07-05) C. moschata Colombia - - 205 88-5 C. moschata Colombia - - 206 7-6-A C. moschata Colombia - -

80

Banco Registro Introducción País - -

207 5-5 (29-06 C. moschata Colombia - - 208 3/05/2011 C. moschata Colombia - - 209 36-5 C. moschata Colombia - - 210 10-5-F C. moschata Colombia - - 211 70-3 C. moschata Colombia - - 212 47-2-A (13-06-06) C. moschata Colombia - - 213 38-2 (15-06-05) C. moschata Colombia - -

214 78-3 (30-06) C. moschata Colombia - - 215 100-1 C. moschata Colombia - - 216 17-2 (28-06) C. moschata Colombia - - 217 C-3-A C. moschata Colombia - - 218 MERCADO PALMIRA 1-2-10 C. moschata Colombia - - 219 33 C. moschata Colombia - - 220 26-6-A (11-07) C. moschata Colombia - - 221 18-2 ( 6-07) C. moschata Colombia - - 222 144-1 (30-06) C. moschata Colombia - - 223 14-2 (9-06-05) C. moschata Colombia - - 224 82-3 (14-07-05) C. moschata Colombia - - 225 8-5-A (29-06) C. moschata Colombia - - 226 69-05 (31-05-05) C. moschata Colombia - - 227 20-2 (14-07) C. moschata Colombia - - 228 118-1 (15-06) C. moschata Colombia - - 229 114-2-A (29-06-05) C. moschata Colombia - - 230 57-3 (6-07) C. moschata Colombia - - 231 84-3 (30-6) C. moschata Colombia - - 232 80-4 (30-6) C. moschata Colombia - - 233 119 (15-06) C. moschata Colombia - - 234 C-5-A C. moschata Colombia - - 235 51-2-A (11-07) C. moschata Colombia - - 236 35-1 (30-06) C. moschata Colombia - -

81

Banco Registro Introducción País - -

237 66 C. moschata Colombia - - 238 73 (6-07) C. moschata Colombia - - 239 4-5-A(14-07) C. moschata Colombia - - 240 42-2 C. moschata Colombia - - 241 32-2-A (30-06) C. moschata Colombia - - 242 108 C. moschata Colombia - - 243 64-3-A (2-06-05) C. moschata Colombia - -

244 1-6 (14-07) C. moschata Colombia - - 245 122-1-A (11-07) C. moschata Colombia - - 246 71-1-A (6-06-05) C. moschata Colombia - - 247 77 C. moschata Colombia - - 248 49-1-F (28-7) C. moschata Colombia - - 249 24-3-A (28-07-05) C. moschata Colombia - - 250 ABANICO-75 C. moschata Colombia - -

251 1215-3 C. moschata sp México 19°54'20" 104°09'45" 252 908-2 C. moschata sp México 28°25'49" 108°38'45" 253 646 C. moschata sp México 27°23'55" 108°50'38" 254 809 C. moschata sp México - - 255 908-1 C. moschata sp México 28°25'49" 108°38'45" 256 954 A C. moschata sp México 24°47'31" 107°23'53" 257 1211-5 C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02" 258 1203 A C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02" 259 1211-3 C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02" 260 1207 F C. moschata sp México 19°43'07" 104°12'12" 261 1211-4 C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02"

262 1210 C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02" 263 677 F C. moschata sp México 17°38'40" 101°33'04" 264 1211-1 F C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02" 265 1211-2 F C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02" 266 1215-2 C. moschata sp México 19°54'20" 104°09'45"

82

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

265 1211-2 F C. moschata sp México 20°46'02" 104°22'02" 266 1215-2 C. moschata sp México 19°54'20" 104°09'45" 267 677 VARIANTE C. moschata sp México 17°38'40" 101°33'04" 268 685 A C. moschata sp México - - 269 1218 C. moschata sp México 19°52'18" 104°13'04"

270 1215-1 F C. moschata sp México 19°54'20" 104°09'45"

271 1 FRANCO C. moschata Colombia - -

272 4 FRANCO C. moschata Colombia - - 273 12 FRANCO C. moschata Colombia - - 274 18 FRANCO C. moschata Colombia - - 275 11 FRANCO C. moschata Colombia - -

276 17 FRANCO C. moschata Colombia - - 277 16 FRANCO C. moschata Colombia - - 278 9 FRANCO C. moschata Colombia - -

279 14 FRANCO C. moschata Colombia - - 280 13 FRANCO C. moschata Colombia - - 281 3 FRANCO C. moschata Colombia - -

282 10 FRANCO C. moschata Colombia - - 283 20 FRANCO C. moschata Colombia - - 284 7 FRANCO C. moschata Colombia - -

285 6 FRANCO C. moschata Colombia - - 286 8 FRANCO C. moschata Colombia - - 287 17 FRANCO C. moschata Colombia - -

288 5 FRANCO C. moschata Colombia - - 289 2 FRANCO C. moschata Colombia - -

290 19 FRANCO C. moschata Colombia - -

291 8008 A AG/08 C. moschata Colombia - - 292 LP 38.5 C. moschata Colombia - - 293 9.1(1) A C. moschata Colombia - -

294 3.5*3.5(2) C. moschata Colombia - -

83

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

295 4.3(1) LP C. moschata Colombia - - 296 12035 LP AG/08 C. moschata Colombia - - 297 9213 LP AG/08 C. moschata Colombia - - 298 5.3(2) LP AG/08 C. moschata Colombia - - 299 9099 A AG/08 C. moschata Colombia - - 300 10789 A AG/08 C. moschata Colombia - - 301 11878 A AG/08 C. moschata Colombia - - 302 12125 A AG/08 C. moschata Colombia - - 303 9089 A AG/08 C. moschata Colombia - - 304 37.5 A C. moschata Colombia - - 305 11015 LP AG/08 C. moschata Colombia - - 306 18168 A AG /08 C. moschata Colombia - - 307 17.5 LP (2) C. moschata Colombia - - 308 2.2*2.4(1) C. moschata Colombia - - 309 40.5 A C. moschata Colombia - - 310 9091 LP AG/08 C. moschata Colombia - - 311 8.4 (1) LP C. moschata Colombia - - 312 18834 A AG/08 C. moschata Colombia - - 313 16.2(1) LP C. moschata Colombia - - 314 44.5(1) A C. moschata Colombia - - 315 54.2 (1) LP C. moschata Colombia - -

316 (34 S3 * BC S1-3) * (34 S3-4-A) C. moschata B Colombia - - 317 (34 S3 * BC S1-2) * (34 S3-3-A) C C. moschata B Colombia - - 318 (34 S3 * BC S1-2) C. moschata B Colombia - - 319 (34 S3 * BC S1-5) * (34 S3-4-A) C C. moschata B Colombia - - 320 (34 S3 * BC S1-1) * (34 S3-3 A) C C. moschata B Colombia - - 321 (1 A 52.3) C. moschata B Colombia - - 322 (34 S3 * BC S1-5) * (34 S3-2-A

323

PADRE) (34 S3 * BC S1-1) * (BC S1-5-A) C

C. moschata B C. moschata B

Colombia

Colombia

- -

- -

84

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

325 (34 S3 * BC S1-3) * (34 S3-4-A) C C. moschata B Colombia - - 326 (34 S3 * BC S1-2) * (34 S3-3-A) C. moschata B Colombia - - 327 (34 S3 * BC S1-3) * (34 S3-2-A) C. moschata B Colombia - - 328 (34 S3 * BC S1-1) * (BC S1-5-A) C C. moschata B Colombia - - 329 (34 S3 * BC S1-3) * (34 S3-4-A) C C. moschata B Colombia - - 330 (34 S3 * BC S1-5) * (34 S3-2-A) C. moschata B Colombia - - 331 (51.4 (2) LP) C. moschata B Colombia - - 332 (34 S3 * BC S1-5) * (34 S3-4-A) C C. moschata B Colombia - - 333 (34 S3 * BC S1-3) * (34 S3-4-A) C C. moschata B Colombia - - 334 (34 S3 * BC S1-3) * (34 S3-3-A) C C. moschata B Colombia - - 335 (34 S3 * BC S1-3) * (34 S3-2-A) C C. moschata B Colombia - - 336 (34 S3 * BC S1-2) * (34 S3-3-A) C C. moschata B Colombia - - 337 (51.4 (3) LP) C. moschata B Colombia - - 338 (49.5 * 48.5) C. moschata B Colombia - - 339 (51.4 (1)A) C. moschata B Colombia - - 340 (BC S1 * 34 S3-3) * (34 S3-2-A) C C. moschata B Colombia - - 341 (BC S1 * 34 S3-1) * (34 S3-2-A) C C. moschata B Colombia - - 342 (BC S1 * 34 S3-3) * (34 S3-2-A) C C. moschata B Colombia - - 343 (BC S1 * 34 S3-1) * (34 S3-2-A) C C. moschata B Colombia - - 344 (BC S1 * 34 S3-1) * (34 S3-4-A) C C. moschata B Colombia - - 345 (BC S1 * 34 S3-1) * (34 S3-4-A) C C. moschata B Colombia - - 346 (34 S3 * BC S1) 2*2 A C. moschata B Colombia - - 347 (34 S3 * BC S1) 2*2 A C. moschata B Colombia - - 348 (34 S3 * BC S1) 5*5 A C. moschata B Colombia - - 349 (34 S3 * BC S1) 5*5 A C. moschata B Colombia - - 350 (BC S1 * 34 S3) 5*5 A C. moschata B Colombia - - 351 (BC S1 * 34 S3) 5*5 A C. moschata B Colombia - - 352 (BC S1 * 34 S3-2) * (BC S1-5-A) C C. moschata B Colombia - - 353 (BC S1 * 34 S3-2) * (BC S1-5-A) C C. moschata B Colombia - - 354 (BC S1 * 34 S3-4) * (BC S1-2-A) C C. moschata B Colombia - -

85

Banco Registro Introducción País - -

355 (BC S1 * 34 S3-4) * (BC S1-2-A) C C. moschata B Colombia - - 356 (BC S1 * 34 S3-3) * (BC S1-4-A) C C. moschata B Colombia - - 357 (BC S1 * 34 S3-3) * (BC S1-4-A) C C. moschata B Colombia - - 358 (BC S1 * 34 S3-3) * (BC S1-3-A) C C. moschata B Colombia - - 359 (BC S1 * 34 S3-3) * (BC S1-3-A) C C. moschata B Colombia - - 360 (BC S1 * 34 S3-3) * (BC S1-3-A) C C. moschata B Colombia - - 361 (BC S1 * 34 S3-3) * (BC S1-3-A) C C. moschata B Colombia - -

362 CBordo 1 C. moschata Colombia 02°05'53,9" 77°00'15,7" 363 CPatia2 C. moschata Colombia 02°02'05,3" 77°06'18" 364 CMercaderes3 C. moschata Colombia 01°48'072" 77°69'938" 365 CMercaderes4 C. moschata Colombia 01°47'57.0" 77°09'48.8" 366 CMercaderes5 C. moschata Colombia 01°47'55" 77°09'52.1" 367 CMercaderes6 C. moschata Colombia 01°47'54" 77°09'51" 368 CBordo 7 C. moschata Colombia 02°03'38,4" 70°58'52,9" 369 CMercaderes8 C. moschata Colombia 01°46'26,7" 77°09'49,7" 370 CRosas9 C. moschata Colombia 02°17'15,8" 76°42'31,3" 371 CTimbio10 C. moschata Colombia 02°20'08,1" 76°41'32,6" 372 CTimbio11 C. moschata Colombia 02°21'206" 76°41'0,80" 373 CPopa12 C. moschata Colombia 02°26'04,73" 76°36'33,32" 374 CPopa13 C. moschata Colombia 02°26'04,73" 76°36'33,32" 375 CPopa14 C. moschata Colombia 02°26'40,34" 76°36'55,31" 376 CPopa15 C. moschata Colombia 02°26'40,34" 76°36'55,31" 377 CSilvia16 C. moschata Colombia 02°36'49" 76°22'089" 378 CSilvia17 C. moschata Colombia 02°36,9'16" 76°22,4'17" 379 CSilvia18 C. moschata Colombia 02°37'37,7" 76°30'48,6" 380 Cpienda26 C. moschata Colombia 02°38,2'4,6" 76°31,3'9,8" 381 Cpienda27 C. moschata Colombia 02°38,2'4,6" 76°311,3'9,8" 382 Cpes30 C. moschata Colombia 02°47'59,4" 76°33'38" 383 Csant31 C. moschata Colombia 03°00'21,5" 76°29'08" 384 Csant32 C. moschata Colombia 03°00'21,5" 76°29'08"

86

Banco Registro Introducción País Latitud Longitud

385 Csant33 C. moschata Colombia 03°00'21,5" 76°29'08" 386 Csant34 C. moschata Colombia 03°02'33,3" 76°30'59,0" 387 Csant35 C. moschata Colombia 03°00'21,5" 76°29'08"

388 Csant36 C. moschata Colombia 03°00'21,5" 76°29'08"

Anexo 2 Protocolos de extracción probados en la investigación (Dellaporta et al. 1983)

1. Pese 0,2 g de tejido macerado (hasta la marca de 100uL en un tubo Eppendorf de 1.5 ml).

2. Agregue 940 ul de buffer de extracción precalentado a 65ºC. 3. Incube a 65ºC durante 45 min, con agitación cada 5min. 4. Agregue 400 ul de acetato de potasio 5M (frío). Mezclar bien. 5. Incube en hielo por 30 min, con agitación. 6. Centrifugue a 8000 rpm por 10 min a temperatura ambiente. 7. Pase el sobrenadante a un tubo nuevo. 8. Centrifugue a 6000 rpm por 4 min a temperatura ambiente. 9. Divida la muestra en dos tubos de 1,5mL. 10. Agregue un volumen igual de isopropanol y 1/10 volumen de acetato de

sodio 3M pH 5.2. 11. Incube a –20ºC, como mínimo 1 hora. Se puede dejar hasta el día

siguiente a –20ºC. 12. Centrifugue a 12000 rpm por 5 min a temperatura ambiente. 13. Lave con 400 ul de etanol al 70%. 14. Centrifugue a 12000 por 3 min a temperatura ambiente. 15. Descarte el sobrenadante y deje secar el “pellet” a temperatura

ambiente. 16. Resuspenda en 100 ul de TE + RNAasa. 17. Incube a 37ºC por 30 min. 18. Almacene a –20ºC. Chequee la integridad del ADN mediante corrida en

gel de agarosa al 0.8%

CTAB 1% (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio o Bromuro de cetiltrimetilamonio)

1. Calentar la solución de amortiguadora CTAB (CTAB= Bromuro de

hexadeciltrimetilamonio, β-mercaptoetanol y EDTA= Ácido etilendiaminotetraacético) a 65°C.

2. Colocar 50 mg de tejido liofilizado y molido en un tubo de 2 ml (como se utilizó un tubo de 1.5 ml, se redujeron todos los volúmenes en un 25%).

3. Agregar 750 ul de la solución amortiguadora CTAB. Mezclar por inversión, para homogenizar el tejido con la solución amortiguadora.

4. Incubar y mover los tubos con suavidad en un agitador de balance en un horno a 65°C durante 90 minutos.

5. Retirar los tubos del horno y enfriar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente.

6. Agregar 375 ul de fenol cloroformo alcohol isoamílico (FCI, 24:24:1). Agitar los tubos por inmersión durante 10 minutos a temperatura ambiente.

88

7. Centrifugar a 13.200 rpm a temperatura ambiente por 5 minutos para formar una fase acuosa (líquido de color amarillo) y una fase orgánica (color verde oscuro).

8. Recuperar aproximadamente 563 ul de la fase acuosa y vacíela en un tubo nuevo de 1.5 ml.

9. Agregar 375 ul de cloroformo alcohol isoamílico (C:I, 24:1). Agitar los tubos por inversión durante 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 13.200 rpm durante 5 minutos.

10. Recuperar la fase acuosa en un tubo nuevo. 11. Agregar 1 volumen de isopropanol al 100% previamente enfriado en un

refrigerador a -20°C. Mezclar por inversión para favorecer la precipitación del DNA e incubar por 1 hora a -20°C. Paso opcional: incubar las muestras a - 20°C durante toda la noche, sobre todo si no es visible el DNA precipitado.

12. Centrifugar a 13.200 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos para precipitar y formar la pastilla de DNA en el fondo del tubo. Desechar el isopropanol por decantación.

13. Agregar 750 ul de etanol al 75%. Lavar suavemente la pastilla de DNA. Desechar el alcohol por decantación. Dejar que el alcohol se seque a temperatura ambiente hasta que la pastilla se seque. Si todavía se siente olor a alcohol, esto indica que la pastilla no está completamente seca.

14. Resuspender la pastilla en 50 ul de TE1X 15. Adicionar 0.5 ul de RNAsa a cada muestra e incubar a 37°C durante 30

minutos, agitándolos periódicamente 16. Almacenar a -20°C para sus posteriores usos.

Anexo 3. Paso para la solicitud del servicio de secuenciación

1. Realizar un registro por parte del solicitante en la página web de MACROGEN 2. La empresa hace su registro en la base de datos de MACROGEN INC 3. Se envía una carta solicitando el servicio para tener acceso al envío de muestras 4. Llenar una Solicitud de servicio que está disponible en la página Web 5. Enviar un volumen de 25ul por reacción a la casa secuenciadora por correo directo a Corea. Si envía más de 10 reacciones él envió es gratis por Fedex – Colombia. 6. Comunicación del proceso de secuenciación por la casa secuenciadora. 7. Visualización de los archivos de secuencia para descargar por parte del usuario.

89

Anexo 4. Matriz de divergencias entre las secuencias problemas

loci ITS4-ITS5.

loci ndhF-rpl32

Loci psbA-trnH

90

Loci 3’rps16 - 5’trnK(UUU)

Loci trnQ(UUG)-5’rps16

Matriz de divergencia ITS4-ITS5A entre C. pepo, C. moschata y C. máxima