facultad de medicina -...
TRANSCRIPT
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
El óxido nítrico en el núcleo del tracto solitario modula el reflejo
hiperglucemiante con retención de glucosa cerebral y la
expresión de la proteína Fos post-estimulación quimiorreceptora
en ratas.
TESIS
Que para obtener el grado de
DOCTORA EN CIENCIAS MÉDICAS
Presenta
M. en C. Mónica Lemus Vidal
ASESORES:
BIÓL. Elena Roces de Álvarez-Buylla
DR. Sergio Adrián Montero Cruz
COASESOR CLÍNICO
DR. Benjamín Trujillo Hernández
Colima, Col., Nov. de 2007.
INDICE
CONTENIDO Págs.
INTRODUCCIÓN 1
ANTECEDENTES 2
JUSTIFICACIÓN 8
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 9
HIPÓTESIS 10
OBJETIVOS GENERAL Y ESPECIFICOS 10
MATRIAL Y METODOS 11
Diseño de estudio 11
Universo de estudio 11
Tamaño muestral 12
Criterios de selección 12
Variables 12
Animales y procedimientos quirúrgicos 13
Análisis estadístico 15
INFRAESTRUCTURA Y APOYO DISPONIBLE 16
RESULTADOS PRELIMINARES 17
CRONOGRAMA DE TRABAJO 20
BIBLIOGRAFÍA 21
ABREVIATURAS
SNC: Sistema nervioso central
NTS: Núcleo del tracto solitario
AVP: Arginina vasopresina
IVC: Intracerebroventricular
GLUT: Glutamato
GABA: Ácido gamma-aminobutirico
NO: Óxido Nítrico
nNOS
NSO: Núcleo supraóptico
NPV: Núcleo paraventrícular
RSCC: Receptores del seno cuerpo carotídeo
PO2: Presión parcial e oxigeno
PCO2 Presión parcial de bióxido de carbono
NaCN: Cianuro de sódio
ip: Intraperitoneal
LCRa: Líquido cefalorraquídeo artificial
Sol. sal: Solución salina
INTRODUCCIÓN
Los estudios de Álvarez-Buylla demuestran que los receptores del seno–cuerpo carotídeo
(RSCC) participan en la homeostasis de la glucosa, no sólo como receptores sensibles a los
niveles de glucosa en la sangre que los irriga (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1988;
Obeso y col., 1998; Pardal y López-Barneo, 2002; López-Barneo, 2003), sino además,
induciendo respuestas reflejas en el sistema nervioso central (SNC) que dependen de los
niveless de glucosa que llegan a los RSCC. Por otro lado, los RSCC juegan también un
papel importante en la respuesta contra-regulatoria insulino-independiente a la
hipoglucemia (Koyama y col., 2000). Las vías eferentes de dichos reflejos no están bien
definidas, pero experimentos previos de este laboratorio, identifican que la neurohipófisis y
las glándulas adrenales participan, por vía humoral, como parte fundamental en el reflejo
hiperglucémico con retención de glucosa por cerebro iniciado por estimulación de los
RSCC con cianuro de sodio (NaCN) (Álvarez-Buylla y col., 1997). Las aferencias de los
quimiorreceptores llegan al núcleo del tracto solitario (NTS) a través del nervio del seno
carotídeo (Housley y Sinclair, 1988). Trabajos previos señalan la importancia del NTS en
la homeostasis de la glucosa, con la participación de la arginina vasopresina (AVP)
(Montero y col., 2000; Yarkov y col., 2001). Existen evidencias que indican que el óxido
nítrico (NO) en SNC estimula a las neuronas vasopresinérgicas (Rivier, 2003; Yamaguchi
y Hama, 2003). Un gran acúmulo de evidencias sugieren que el óxido nítrico (NO)
funciona como un neurotransmisor en el NTS (Lewis y col., 1991; Ogawa y col., 1995).
Esto queda demostrado en trabajos previos en los cuales las microinyecciones de un
donador de NO o un precursor de NO en el NTS producen una respuesta ventilatoria y
cardiovascular (Lewis y col., 1991; Lipton y col., 2001; Lo y col., 1997). De la misma
manera, ha sido demostrado la presencia de la enzima NO sintetasa neuronal (nNOS) en
fibras nerviosas y terminales en el NTS, lo que demuestra que esta enzima es responsable
de la síntesis neural del NO, (Krowicki y col., 1997; Lin y col., 1997) la cual puede ser
importante en la transmisión de señales cardiovasculares en el NTS (Lin y col., 1999;
Talman y col., 2001). Además de la acción directa del NO en el NTS sobre dichas señales,
también se ha observado que este neurotransmisor actúa de manera indirecta inhibiendo los
efectos depresores cardiovasculares producidos por el glutamato (Lo y col., 1997; Di Paola
y col., 1991; Talman y col., 2001). Se tienen evidencias anatómicas que demuestran la
relación estrecha entre neuronas glutamatérgicas y nitrinérgicas en NTS, además en
algunas neuronas se ha demostrado co-localización de nNOS y glutamato (Lin y col.,
2000; Lin y col., 2004En experimentos in vitro se demuestra que neuronale). Por
otro lado, Chan, Chang, Ou y Chan, 2004, encuentran que el NO derivado de la nNOS en
el NTS después de la activación de los barorreceptores carotídeos puede participar en la
expresión de c-fos vía fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta del
AMP cíclico (CREB) en un proceso que involucra a la cascada de señales: guanilato
ciclasa soluble/GMP cíclico/proteína kinasa dependiente de GMP cíclico
(sGC/cGMP/PKG-I).
En otros trabajos se encuentra que la activación de los
barorreceptores carotídeos induce la síntesis de Fos en el NTS (Chan y Sawchenko, 1998;
Chan y col., 1998), el sitio principal de las aferencias baro (Ciriello, 1983) y
quimiorreceptoras (Finley y Katz, 1992). El motivo principal de este estudio fue
analizarin vivo las vías centrales que participan en el reflejo hiperglucemiante con
retención de glucosa por el cerebro inducido por la estimulación de los RSCC,
ndo.
ANTECEDENTES
La homeostasis de la glucosa es un proceso fundamental para el mantenimiento de la vida,
su control se ejerce a múltiples niveles. ; Levin, Routh, Kang, Sanders y Dunn-Meynel,
2004,en las condiciones experimentales Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-
Buylla, 1975; ; Rajasekar y Anuradha, 2007los astrocitosde las . ; Levin, Routh,
Kang, Sanders y Dunn-Meynel, 2004Existen receptores glucosensibles en cerebro
(Ritter y col., 2000) vena porta (Hevener y col, 2001), hígado (Niijima, 1969), páncreas
(Malaisse y Sener 1985), cuerpos carotídeos (Álvarez-Buylla, 1975; Álvarez-Buylla y col.,
1997; Obeso y col, 1998; Pardal y López-Barneo, 2002; López-Barneo, 2003) y NTS
(oomura y, yoshimatsu h. 1984) del hipotálamo,; Levin y col., 2004 (fig. 1). Estos
receptores informan al SNC de los niveles de glucosa en las distintas regiones del
organismo y dicha información se integra principalmente a nivel del núcleo del NTS y del
hipotálamo (Schwartz y Porte, 2005)..
En contraste con la mayoría de los tejidos, que muestran una gran flexibilidad con
respecto a la naturaleza de los sustratos energéticos utilizados, el cerebro depende casi
exclusivamente de la glucosa como fuente de energía. Bajo condiciones normales, el
proceso glucolítico en el cerebro excede al proceso oxidativo, es decir se consume mayor
cantidad de glucosa que la utilizada únicamente para la respiración (Sokoloff, 1984, 1991).
La glucosa es la fuente primaria de energía para las actividades celulares, y en
particular, para las funciones del sistema nervioso central (SNC). Este carbohidrato
constituye el 98% del metabolismo oxidativo del cerebro (Ruderman y Goodman, 1980) y
es su principal combustible metabólico. En el humano el cerebro representa
aproximadamente el 2% del peso corporal, pero en condiciones basales consume el 24% de
la glucosa total (Sokoloff, 1984). Las neuronas necesitan esta energía para mantener los
gradientes iónicos a través de sus membranas por medio de mecanismos de transporte
activo (Fray y col., 1996). Desde los estudios clásicos de Claudio Bernard (1857),
numerosos experimentos fisiológicos señalan la participación del SNC en la homeostasis
de la glucosa (Álvarez-Buylla y Carrasco-Zanini, 1960; Oomura, 1983), pero aún no se
conoce la participación precisa del SNC en el mantenimiento de los niveles de glucosa
(periféricos y centrales). El SNC juega un papel esencial para dirigir la respuesta endógena
compensadora en la alteración de la normoglucemia (Cryer y Gerich, 1986), en la rata se
han descrito valores normales desde 70 a 120 mg/dl (Shinde y Goyal, 2003). Con pocas
excepciones, no existen reservas de glucosa en SNC, y no se conocen los mecanismos
homeostáticos que aseguren el aporte de este carbohidrato al cerebro (Fray y col., 1996).
Utilizando técnicas de microdiálisis, que permiten medir la concentración de glucosa en el
espacio extracelular del cerebro, algunos autores consideran que los astrocitos (glías)
podrían ser el lugar inicial de captación de glucosa del plasma, antes de pasar a las
neuronas, lo que representaría un almacén de glucógeno para SNC (Forsyth, 1996).. 1 y
GLUT 3os
Fig. 1- Modelo hipotético de la relación entre las neuronas glucosensibles, los astrocitos, y los capilares en el SNC. La glucosa se transporta desde los capilares hasta los astrocitos por los GLUT 1; dentro de los astrocitos la glucosa se almacena como glucógeno o induce la formación de lactato que sale al espacio extracelular para entrar a la neurona por los canales MCT. El lactato en la neurona se transforma otra vez en piruvato por la LDH para regular la formación de ATP. La glucosa extracelular también entra a las neuronas directamente por los GLUT3 y sintetiza ATP a través del piruvato y de la glucocinasa. El ATP formado se enlaza a los canales de KATP para cerrarlos y despolarizar la membrana neuronal, con entrada de Ca+2 y glutamato. HKI, hexocinasa I;
LDH, deshidrogenasa láctica; MCT, canal de monocarboxilato; VDCC, canal de Ca+2 dependiente de voltaje. (Modificado de Levin y col., 2004)
La insulina, sustrato clave para mantener los niveles estables de glucosa en plasma,
controlando la entrada de glucosa a la célula blanco y su utilización posterior (Sokoloff,
1984), tiene una pobre penetración a través de la barrera hematoencefálica (LeMay y col.,
1988) por lo que su acceso al cerebro es muy limitado astrocitos (fig. 1).
Se sabe que eventos neuroquímicos en el hipotálamo regulan el metabolismo
basal (Woods y col., 1980), y Las neuronas glucosensibles en áreas hipotalámicas como
el núcleo arcuato, y en el tallo cerebral, como el NTS constituyen el primer centro de
relevo para las funciones viscerales, capaces de influir sobre la activación diferencial del
sistema nervioso simpático y la médula adrenal, estructuras importantes en la homeostasis
de la glucosa (Mizuno y Oomura, 1984)2. El SNC participa en la homeostasis de la
glucosa modulando la glucogenolisis hepática por distintas vías:
22 s
ecreción de catecolaminas, estimulación esplácnica por las neuronas glucosensibles en el
hipotálamo y secreción de AVP (Frohman, 1983). La hipoglucemia inicia mecanismos
nerviosos que aumentan la producción de glucosa y por el contrario la hiperglucemia
activa mecanismos que la inhiben (Rohner-Jeanrenaud y col., 1983) (fig.1).
2-3
La glucosa es la fuente primaria de energía para las funciones del SNC. No se conocen los
mecanismos homeostáticos que aseguren el aporte de este carbohidrato al cerebro (Fray y
col., 1996). En los últimos años se han realizado estudios sobre la correlación entre
concentración de glucosa y actividad de los RSCC (Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla,
1988;). 4
Fig.31 La presentación esquemática de los mecanismos de control neural y hormonal
desencadenados por los cambios en los niveles de glucosa en la sangre que irriga al SNC.
La hipoglucemia (poca glucosa en SNC estimula la producción de glucosa a través del
sistema simpático (nervio esplácnico); la hiperglucemia (exceso de glucosa en SNC) inhibe
la producción de glucosa debido a la estimulación del sistema parasimpático (nervio vago),
que produce un incremento en la secreción de insulina para aumentar la captación de
glucosa sistémica. Flechas continuas, estimulación; flechas discontinuas, inhibición.
(Tomado de Rohner-Jeanrenaud y col., 1983)
4
seve55 55
Los RSCC estratégicamente localizados en la bifurcación de la carótida común
informan al cerebro de los niveles de pO2, pCO2, pH, temperatura, osmolaridad
(Eyzaguirre y Zapata, 1984) y glucosa (Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla, 1988) de la
sangre que lo irriga. Las aferencias de los quimiorreceptores llegan al NTS a través del
nervio del seno carotídeo (Housley y Sinclair, 1988). El ácido -aminobutírico (GABA) en
el NTS participa en la regulación respiratoria y cardiovascular, (Ito y Sved, 1997;
Wasserman y col., 2002; Ciriello y col, 1981; Nosaka y col., 1995). Por otro lado,
trabajos previos señalan la importancia del NTS en la homeostasis de la glucosa, con la
participación de la arginina vasopresina (AVP) (Montero y col., 2000; Yarkov y col.,
2001). En trabajos previos estudiamos el efecto del GABA en el NTS sobre este
mecanismo y encontramos que un antagonista de los receptores GABA-B (phaclofen)
produjo un aumento en la respuesta hiperglucemiante y en la retención de glucosa por
cerebro después de la estimulación de los RSCC con NaCN.
Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla en 1994 plantean el estudio de los mecanismos
reguladores en el suministro de glucosa al SNC estableciendo la participación de los RCC
en esta función. El SNC al recibir la información procedente de las zonas reflexogénicas
de las alteraciones en los niveles de glucemia, inicia respuestas para asegurar el consumo
de este importante carbohidrato por el cerebro (Ensinck y Williams, 1972). En los últimos
años se han realizado estudios sobre la correlación entre concentración de glucosa y
actividad quimiorreceptora de los RCC (Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla, 1988; Obeso y
col., 1998; Pardal y López-Barneo, 2002). Los RCC estratégicamente localizados en la
bifurcación de la carótida común informan al cerebro de los niveles de pO2, pCO2, pH,
temperatura, osmolalidad y glucosa de la sangre que lo irriga (Eyzaguirre y Zapata, 1984;
Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla, 1988; Pardal y López-Barneo, 2002). La disminución
de la descarga barorreceptora por oclusión carotídea o la estimulación quimiorreceptora
con microdosis de cianuro (NaCN) aumenta los niveles de glucosa arterial e incrementa la
captación de glucosa por el encéfalo. El mecanismo preciso mediante el cual se lleva a
cabo esta regulación se desconoce todavía, pero recientemente se ha propuesto la
participación de la neurohipófisis y las glándulas adrenales en la vía eferente del reflejo
hiperglucemiante iniciado por la estimulación RCC con NaCN (Alvarez-Buylla y col.,
1997).
Las aferencias de los quimiorreceptores llegan al NTS a través del nervio del seno
carotídeo (Housley y Sinclair, 1988). El NTS es el primer núcleo de relevo de la regulación
respiratoria, cardiovascular, y otros nervios autonómicos (Ito y Sved, 1997; Wasserman y
Col., 2002; Ciriello y col, 1981; Nosaka y col., 1995).
Fig. 2. Representación esquemática de la zona de la bifurcación carotídea en la rata.
(ACC) arteria carótida común; (ACE) arteria carótida externa; (ACI) arteria corótida
interna; (AO) arteria occipital; (AL) arteria lingual; (SC) seno carotídeo; (CC) cuerpo
carotídeo; (NSC) nervio del seno carotídeo o nervio de hering; (NGF) nervio glosifaringeo
(Modificado de Shoukas y col., 1991)
Se sabe que las fibras que llevan información de baro y quimiorreceptores carotídeos
entran al núcleo del tracto solitario (NTS) vía nervio del seno carotídeo, rama del
glosofaríngeo. Sin embargo, las vías neuroanatómicas posteriores para alcanzar el
hipotálamo, así como su procesamiento central están poco estudiados. Los estudios de
Jhamandas y Renaud (1987) describen una vía excitatoria directa desde la médula
vetrolateral caudal (CVLM) que puede mediar la entrada quimiorreceptora (QUIMIO) a las
neuronas vasopresinérgicas del núcleo supraóptico (NSO) que llega a las neuronas
secretoras de AVP del NSO estimulando la liberación de AVP por la neurohipófisis.
Por otro lado, Chan y col., (2004), encuentran que el NO derivado de la nNOS en el NTS
proliferadoractivadordelaexpresi
66después
77
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En trabajos anteriores se demuestra la participación de los quimiorreceptores y
del SNC en la homeostasis de la glucosa. Por otro lado se describe que las aferencias
baro y quimiorreceptores llegan al NTS (Finley y Katz, 1992). Se sabe que los
mecanismos nitroxidérgicos en el NTS son importantes Otros estudiosen la
regulación de la presión arterial sistémica y ventilación pulmonar. En efecto, la
estimulación barorreceptora induce la expresión Además, Chan y col., (2004)
demuestran que elinmediata del gen temprano c-fos en el NTS, l.Con los antecedentes
descritos podemos¿La utilización de fármacos inductores y/o inhibidores del
NO en el NTS ante un estímulo anóxico en los RSCC, modificará el reflejo
hiperglucémico con retención de glucosa por el SNC; induciendo cambios
en la expresión dede manera diferencial este núcleo, e indicando la
participación de mecanismos nitroxidérgicos en la homeostasis de la
glucosa?
de la activación de los barorreceptores carotídeos puede participar en la expresión
de c-fos vía fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta del AMP cíclico
(CREB) en un proceso que involucra a la cascada de señales: guanilato ciclasa
soluble/GMP cíclico/proteína kinasa dependiente de GMP cíclico (sGC/cGMP/PKG-I). En
otros trabajos se encuentra que la activación de los barorreceptores carotídeos induce la
síntesis de Fos en el NTS (Chan y Sawchenko, 1998; Chan y col., 1998) el sitio principal
de las aferencias baro (Ciriello, 1983) y quimiorreceptoras (Finley y Katz, 1992). El factor
de transcripción celular, Fos, es la proteína producto del gen temprano inmediato, c-fos.
La inducción de la expresión del Fos representa un evento intracelular temprano que lleva
a una modulación inhibitoria de la respuesta refleja barorreceptora a largo plazo (Shih y
col., 1996; Chan y col., 1997). La cascada de señalización celular iniciada por las
aferencias barorreceptoras empieza con la activación de los receptores del glutamato en
NTS (Chan y col., 1998b), termina con la activación del CRE en la región promotora del c-
fos por la fosforilación del CREB (pCREB) (Chan y col., 1999). Estudios previos
muestran que el NO, es sintetizado a partir de la L-arginina en el SNC y en otros tejidos
como células endoteliales y macrófagos. El NO juega un papel fisiológico en la
comunicación transcelular facilitando la formación de GMPc en células adyacentes a
través de la activación de la guanilato ciclasa soluble (GC) (Lo, Jan, Wu, Tseng, 1998). El
NO es una molécula gaseosa que juega un papel importante en la regulación cardiovascular
central ya que ha sido reportado que la vía de señalización cGMP/PKG está involucrada en
la regulación de la expresión del c-fos en neuronas del NTS (Haby y col., 1994). En el
NTS el NO induce hipotensión y bradicardía (Tseng y col., 1996; Lin y col., 1999; Paton y
col., 2001) y participa en la respuesta cardiovascular inducida por la activación de los
receptores al glutamato (Lin y col., 1999).
La Calcio/calmodulina también activa a la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) (Bredt
and Snyder,
1990) para producir NO en el NTS después de la activación de los
barorreceptores carotídeos, con la expresión del c-fos via fosforilación del CREB de
manera dependiente de sGC/cGMP/PKG. Chan y col., 2004 demuestran que el NO
derivado del nNOS regula la inducción inmediata del gen temprano c-fos en el NTS
después de la estimulación barorreceptora. En otros trabajos encuentran que durante y
después de la oclusión bilateral de la arteria carótida común provoca liberación de NO en
el NTS e incremento en la presión arterial sistémica (Wu y Chai, 2004). Por el contrario,
Lo y col., (1998) reportan que la microinyección unilateral de L-arginina (donador de NO)
en el NTS producen un decremento en la presión arterial media y en la frecuencia cardiaca
en ratas anestesiadas.
Tagawa y col. (1994) demuestran que el NO incrementa la actividad de neuronas
adyacentes en el NTS a través de un incremento de GMPc. Además, Shuai y Xie
(2004), encuentran una relación entre la producción de NO y de la expresión de c-
fos en el NTS y otras estructuras del SNC. Estos antecedentes refuerzan la idea
de que un estímulo de los quimiorreceptores carotídeos provoca un aumento en la
liberación de NO y de la expresión de c-fos por el NTS modificando la
homeostasis de la glucosa. Por lo tanto, el objetivo de este proyecto es conocer
la participación del NO en el NTS sobre el reflejo hiperglucemiante y la retención
de glucosa cerebral después de la estimulación de los RSCC en ratas.
JUSTIFICACIÓN
los anterioresa tesisa, con objeto deExisten trabajos que encuentran un efecto
modulador de la respuesta cardiovascular y respiratoria del NO en el NTS después de
la estimulación de los baro y quimiorreceptores carotídeosde los mecanismos que
regulan las fuentes de energía en el SNC, y será importante para orientarnos en las
estrategias que se tomarán en las enfermedades con alteraciones de glucosa y en los
síndromes de hipoxia cerebral.
HIPÓTESIS GENERAL
El NO en el NTS modula la expresión del gen c-fos, el reflejo hiperglucemiante y el
aumento en la retención de glucosa cerebral después de la estimulación de los
quimiorreceptores carotídeos con NaCN en ratas.
HIPÓTESIS ESTADÍSTICAS.
Hipótesis alterna:
El NO en el NTS modula la expresión del gen c-fos, el reflejo hiperglucemiante y la
retención de glucosa cerebral después de la estimulación de los RCC con NaCN.
Hipótesis nula:
El NO en el NTS no influye en la modulación de la expresión del gen c-fos, en el reflejo
hiperglucemiante ni en el aumento en la retención de glucosa cerebral después de la
estimulación de los RCC con NaCN.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el papel del NO en el NTS sobre la expresión del gen c-fos, el reflejo
hiperglucemiante y la retención de glucosa por el cerebro después de la estimulación de los
receptores del cuerpo carotídeo con NaCN.
Oobjetivo específicos
:
Cuantificar los niveles de glucosa en plasma, la retención de glucosa cerebral y la
expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de LCRa en NTS y estimulación de los
RSCC con NaCN.
Cuantificar los niveles de glucosa en plasma, la retención de glucosa cerebral y la
expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de un donador de NO, Nitroprusiato de
sodio (NPS), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.
Cuantificar los niveles de glucosa en plasma, la retención de glucosa cerebral y la
expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección del inhibidor de la NOS, N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.
MATERIAL Y METODOS
Diseño de estudio: Experimental
Universo de estudio: Ratas Wistar. Actualmente uno de los animales de mayor
preferencia para las intervenciones quirúrgicas complejas es la rata. Además, se utiliza
esta especie porque son fácilmente manipulables, por su alta capacidad de reproducción y
por su semejanza en sus aparatos y sistemas con los humanos (Chousleb y col., 1997)
Tamaño muestral: Mediante la fórmula para medias de muestras independientes se
consideró un tamaño muestral de 6 ratas para cada grupo, considerando estudios previos
que evaluaron la actividad del NO en el NTS .
Criterios de selección:
Inclusión: ratas wistar de 280-300 g de peso, 4 meses de edad, mantenidas en condiciones
de luz-obscuridad 12h/12h, a temperatura de 24o C y en ayuno de 12h antes del
experimento.
No inclusión: Los que no cumplan los criterios de inclusión
Eliminación: Ratas que se desangren, niveles basales de glucosa mayores de 150 mg/dl,
que el sitio de la inyección no esté en el NTS, que no esté bien regulada la respiración o
que el procedimiento quirúrgico no sea el adecuado.
Variables:
Independiente:
La aplicación de drogas en el NTS y la estimulación de los RSCC.
Clasificación de la variable independiente por su naturaleza, escala de medición:
Cualitativa, nominal.
Operacionalización de la variable independiente
Las inyecciones de LCRa, NPS y L-NAME en NTS y la inyección de NaCN en el seno
carotídeo circulatoriamente aislado.
Dependiente:
La expresión de c-fos, la respuesta glucémica y la retención de glucosa por cerebro
Clasificación de la variable por su naturaleza, escala de medición:
Cuantitativa, continua.
Operacionalización de la variable
Es la cantidad de glucosa circulante en la sangre arterial y venosa, así como su retención
por el cerebro, en ratas sometidas al estudio experimental. La unidad de medición será
mg/dL. La retención de glucosa por cerebro se determinará de manera indirecta, tomando
como referencia las diferencias de glucosa en la arteria femoral (como indicador de la
glucosa que entra al cerebro) y en el seno yugular (como indicador de la glucosa que sale
del cerebro). Respecto al c-fos, se considerará inmunoreactividad positiva, la aparición de
núcleos con marcas fluorescentes correspondientes a la presencia del anticuerpo unido a c-
fos. El promedio de células positivas a c-fos será registrado como el resultado para cada
grupo experimental y control.
Animales y procedimientos quirúrgicos:
Los experimentos se realizarán en ratas Wistar de 250-300 g de peso (se consideró un
tamaño muestral de 6 ratas para cada grupo, considerando los estudios previos que
evaluaron la actividad del NO en el NTS, mantenidas en condiciones de luz-obscuridad
12h/12h, a temperatura de 24 oC, en ayuno de 12h con libre acceso a agua.Todos los
procedimientos experimentales se llevarán a cabo de acuerdo a la Guía para el Cuidado y
Uso de Animales de Laboratorio (National Research Council, 1997). Las ratas se
anestesiarán con pentobarbital sódico (3 mg/ml) por vía intraperitoneal. El nivel de
anestesia se mantendrá constante durante todo el experimento, por goteo i.p. continuo del
anestésico diluido en solución salina (63 mg/100 mL), es decir 0.063 mg/min. La
profundidad de la anestesia se vigilará mediante el reflejo palpebral. Bajo estas
condiciones no se observan reacciones dolorosas pero se conserva el reflejo palpebral.
Las ratas se ventilarán artificialmente con un respirador Ugo Basile (Stoelting) conectado
a una cánula endotraqueal (intubación por vía bucal), con frecuencia de 50
respiraciones/min y presión positiva hasta evitar los movimientos respiratorios
espontáneos de la rata. La temperatura se mantendrá constante a 37oC por medio de un
cojín eléctrico (Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla, 1988).
El seno carotídeo izquierdo se aislará temporalmente de la circulación (preparación
de seno carotídeo aislado) (Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla, 1975, 1994) durante
las inyecciones de cianuro de sodio al seno. Tanto la carótida externa (por encima de la
arteria lingual) como la carótida interna izquierda (cerca del foramen yugular) se ocluirán
temporalmente (40 s) durante las inyecciones de NaCN para evitar su paso a la circulación
cefálica y/o circulación general. Serían necesarios más de 5 min para producir isquemia
cerebral (Wu y col., 2003). Con esta técnica únicamente el área del seno-cuerpo carotídeo
izquierdo queda expuesta al cianuro. 8La estimulación quimiorreceptora se efectuará
inyectando lentamente cianuro (5 µg/100 g en 0.25 ml de sol. salina) a través de una aguja
del No 27, con objeto de evitar la estimulación barorreceptora (Álvarez-Buylla, 1954).
Para las inyecciones en NTS:
Se fijará la cabeza de la rata en un aparato estereotáxico (Stoelting), se realizará una
craneotomía occipital por donde se introducirá una cánula de vidrio preparada por
estiramiento de un tubo especial (Microcaps 0.7 mm) o una aguja de 200 µm 8de diámetro
conectada a una microjeringa (Hamilton, de 0.1 a 0.5 µl) para las inyecciones de las drogas
en un volumen de 200 nL durante 20-30 s (Montero y col., 2000) para la inyección de los
donadores e inhibidores del NO (Yarkov y col., 1994), siguiendo las coordenadas
adecuadas del atlas (Paxinos y Watson,1986) para NTS. Las inyecciones se realizarán con
microjeringas de 1-10 µl (Microliter 800 Sigma). Para verificar el lugar de las inyecciones
en NTS, después de obtener la última muestra de sangre o LCR, se inyectará azul de
metileno. Una vez terminados los experimentos las ratas se decapitarán para extraer los
cerebros. Se sacrificarán las ratas por decapitación con guillotina (Waynforth y Flecknell,
1992), removiendo los cerebros que se congelarán en ultracongelador (Revco) para
después realizar los cortes en criomicrotomo (Leica), en secciones coronales de 40 µm
para verificar histológicamente el lugar de la inyección (Bures y col., 1983).
8
Administración de donadores e inhibidores del NO en NTS:
Las drogas que utilizaremos son nitroprusiato de sodio (Sigma), L-arginina (Sigma), L-
NAME (N-nitro-L-arginina metil ester, Sigma); Las drogas estarán disueltas en 200 nL de
líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) (Yarkov y col., 1994). En los experimentos control
se inyectará solamente LCRa (NaCl 145 mM, KCl 2.7 mM, MgCl2 1.0 mM, CaCl2 1.2 mM,
ascorbato 2mM, NaH2PO4 2mM, pH 7.3-7.4, J.T. Baker y Hycel). El LCRa se preparará
cada 48 horas y se conservará en refrigeración.
En los experimentos control se inyectará LCRa solo.
Obtención de muestras de sangre para análisis de glucosa.
Se obtendrán muestras de sangre arterial (arteria femoral) y venosa del cerebro (seno
yugular) por medio de catéteres permanentes en estos vasos (tubo de polietileno, Clay
Adams PE-10, y tubo de silastic, Dow Corning 602-135) sin interrumpir la circulación
normal en los vasos 8(Álvarez-Buylla y Bencosme, 1981). Al final de cada experimento
se verificará la posición correcta de los catéteres. Después de una muestra basal, el tiempo
de colección de sangre será a los 5, 10, 20 y 30 min después de la estimulación de los
RSCC en ratas con previa inyección de drogas en NTS. Las muestras de sangre se
centrifugarán en centrífuga refrigerada a 3000 xg durante 5 min y se guardarán a -70 °C
hasta su análisis. La concentración de glucosa en plasma se determinará por el método de
glucosa-oxidasa (analizador Beckman). Para la determinación c-fos, se harán cortes del
NTS, se incubarán con antisuero policlonal anti-c-fos, a una dilución de 1:4000, durante
una hora a 4 °C en cámara húmeda. Después de quitar el exceso de anticuerpo no unido,
lavando con un buffer, se incubará con un anticuerpo secundario marcado con fitc durante
30 min a 4 ° en cámara húmeda y en obscuridad. Una laminilla de corte histológico similar
se utilizará como control negativo, incubando sólo con suero normal de cabra. Se
considerará inmunoreactividad positiva, la aparición de núcleos con marcas fluorescentes
correspondientes a la presencia del anticuerpo unido a c-fos. El promedio de células
positivas a c-fos será registrado como el resultado para cada grupo experimental y control.
Inmunohistoquímica para detección de c-fos OJO CUAL DE LAS DOS TECNICAS
Cinco min después de concluir, cinco min después,9 L s Fos-ir positivas
manualmenteobservadores (Brunton, Meddle, Ma, Ochedalski, Douglas y Russell,
2005); la diferencia en el conteo realizado por los dos observadores no fue
estadísticamente significativa (P>0.05, t de Student) f4
9
)protocolo experimental:
Después de tomar una basal, el tiempo de colección de sangre será a los 5, 10, 20,
30 min. después la administración de las drogas en el NTS o de la estimulación RCC. Las
muestras de sangre se centrifugarán a 3000 g durante 5 min para determinar la
concentración de glucosa en plasma por el método de glucosa-oxidasa en un analizador de
glucosa (Beckman). Y se realizará inmunocitoquìmica para determinar expresión del gen
c-fos.
Experimento No. 1
Cuantificar los niveles de glucosa en plasma, la retención de glucosa cerebral y la
expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de LCRa en NTS y estimulación de los
RSCC con NaCN.
Experimento No.2
Cuantificar los niveles de glucosa en plasma, la retención de glucosa cerebral y la
expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de un donador de NO, Nitroprusiato de
sodio (NPS), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.
Experimento No.3
Cuantificar los niveles de glucosa en plasma, la retención de glucosa cerebral y la
expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección del inhibidor de la NOS, N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.
Fig. 5. Diseño experimental. A) Se aisló temporalmente el seno carotídeo de la
circulación general durante las inyecciones de NaCN, para estimular los quimiorreceptores
carotídeos. Las tomas de sangre se obtendrán del seno yugular (venosa encefálica) y la
arteria femoral (arterial). B) Se introducirá una cánula en NTS (estereotáxico) para hacer
las microinyecciones de sustancias químicas.
análisis estadístico:Se utilizó las pruebas t de Student (t-pareada) para
medir los cambios en las concentraciones de glucosaexpresadas en promedios,
desviación estándar y porcentajes. La comparación de entre los grupos se realizará
con ANOVA o Kruskall-Wallis, así comopara comparar los promedios antes y
después de la aplicación de las drogass; la misma prueba se utilizó para
comparar el conteo de las célula positivas a la proteína Fos realizado por
dos observadoresSe utilizó la prueba de de una vía y medidas repetidaso de
Wilcoxon según se requiera. phacer y para analizar las diferencias en laEl
intervalo de confianza que se utilizará será del 95% y se considerará significancia
estadística cuando P<0.05.(Brunton y col., 2005). y la
-10 0 10 20 30
0
10
20
30
40
80
100
120
140
160
180
200
*
***
*
***
**B
*
*NaCN(SC)
LCRa(NTS)
30201050BASAL
RE
TE
NC
IÓN
(m
g/d
L)
G
LU
CE
MIA
(m
g/d
L)
MIN
a
v
a-v
10, t-pareada, t-pareada10, t-pareada
10promedios, t-pareada, t-pareada11, t-pareada1, t-pareada11
-10 0 10 20 30
0
10
20
30
40
80
100
120
140
160
180
200
****
***
B
30201050BASAL
RE
TEN
CIÓ
N (m
g/dL
)
G
LUC
EM
IA (m
g/dL
)
NaCN(SC)NPS(NTS)
*
MIN
a
v
a-v
1promedios2, t-pareada, t-pareada2
2promedios33 de medidas repetidas, 2 grupos3de medidas repetidas, 2 grupos3
3 promedios de medidas repetidas.
trabajoun incremento significativo en la en estas ratas, en comparación con las
ratas del grupo control que sólo recibieron LCRa (P = 0.050, ANOVA de una vía
para muestras independientes); a los 40 min (tiempo transcurrido entre la
-10 0 10 20 30
0
10
20
30
40
80
100
120
140
160
180
200B
*
30201050BASAL
NaCN (SC)
RE
TEN
CIÓ
N (m
g/dL
)
GLU
CE
MIA
(mg/
dL)
MINUTOS
LCRa
NPS
L-NAME
LCRa
NPS
L-NAME
-10 0 10 20 30
0
10
20
30
40
80
100
120
140
160
180
200
*
*
*
*
***
B
30201050BASAL
L-NAME(NTS)
NaCN(SC)
RE
TE
NC
IÓN
(m
g/d
L)
G
LU
CE
MIA
(m
g/d
L)
MIN
a
v
a-v
estimulación RSCC y el inicio de la perfusión con la solución de
paraformaldehido)de la estimulación; [] (P = 0.000001 ANOVA, de una vía para
muestras independientes) con la obtenida(P =0.00000000003 ANOVA, de una vía
para muestras independientes)
45
4
2 4 6 8 10121416
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
*0.001
0.05
*NaCN
SC
400-10
NÚ
MM
ER
O D
E C
ÉL
UL
AS
FO
S P
OS
ITIV
AS
EN
EL
NT
S
MIN
LCRa
NPS
L-NAME
NTS
5promedios con LCRa+ P<0.05 con NPS, de una vía.
En esta tesis se analizó la interacción de las vías nitroxidérgicas en el NTS con los
cambios en la homeostasis de la glucosa después de estimular los RSCC con
NaCN. En estas condiciones, se determinó la expresión de la proteína Fos-ir en el
NTS. como un indicador de la actividad neuronal que tiene lugar en dicho núcleo
durante las distintas variables experimentales. aguda con fármacos que inhiben
todas las isoformas de la NOS, como el L-NAME, npor aumento en la resistencia a
la insulina y de su ante una carga de glucosa o arginina se deben cambios en las
concentraciones de catecolaminas circulantes, sino a vías centrales eferentes,
como serían las vías nitroxidérgicas secundarias a la nNOS Uemura, Tamagawa,
Chen, Maeda, Yoshioka, Ito, Miura, Iguchi y Hotta, 1997; 10113en experimentos in
vitro elevandodirecto in vivocomo señalábamos antes, estudios anteriores indican
que el bloqueo de todas las NOS por el L-NAME i.p. durante cuatro días aumenta
los niveles de glucosa plasmática en ratas hipertensas por encima del incremento
observado en ratas normotensas, a pesar de que los niveles de insulina en sangre
son semejantes en ambos grupos de ratas; indicando que el NO juega un papel en
la homeostasis de la glucosa compensando los niveles de este carbohidrato (Lyla
estimulación de los RSCC con NaCN; efecto debido, probablemente, al efecto
vasodilatador del NO derivado del NPS, con un incremento en el aporte de
oxígeno al NTS y disminución del estrés metabólico ocasionado por el cianuro en
el seno carotídeo (Schwenke, Bolter y Cragg) con la consecuente disminución de
la actividad neuronal. Es decir, el efecto vasodilatador del NPS contrarresta el
efecto anóxico del cianuro.
E210deduceExperimentos anteriores indican atenúa los reflejos baro y
cardiopulmonares sugiriendo la participación de NO como un neuromodulador
fisiológico importante en la función cardiovascular. 2;a
,L,importanteien el NTS de este núcleo
.
significativasos-ir -ir,con la participación de la vasopresina, en respuesta a un
estímulo hipóxico o hipoglucémico de los es carotídeos Con los resultados
obtenidos hasta ahora se propone un modelo de trabajo que permitirá continuar el
estudio de la homeostasis de la glucosa (fig. 16). Lsustancial .
Fig. 16. Esquema tentativo que propone las vías que participarían en la regulación glucémica.
analizar la participación del NO en el reflejo hiperglucémico con retención de
glucosa por el cerebro en ratas normales sometidas a ejercicio, y en ratas obesas.
El ode , proporcionará datos adicionales para identificar las vías del SNC que
participan en la homeostasis glucémica
CRONOGRAMA DE TRABAJO:
2005
2006
2007
Actividades En Fe Mz Ab Ma Ju Jul Ag Se Oc No DI En Fe Mz Ab Ma Ju Jul Ag Se Oc No Di En Fe
Revisión
Bibliográfica
☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼
Elaboración
Anteproyecto
☼ ☼ ☼
Correcciones
Anteproyecto
☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼
Realización
Experimentos
☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼
Obtención
datos prelim.
☼ ☼ ☼ ☼
Análisis de
datos
☼ ☼ ☼
Conclusiones ☼
Escritura de
tesis
☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼
Brunton, P.J., Meddle, S.L., Ma, S., Ochedalski, T., Douglas, A.J. y Russell, J.A.
(2005).. Endogenous opioids and attenuated hypothalamic-pituitary-adrenal
axis responses to immune challenge in pregnant rats. The Journal of
Neuroscience, 25, 5117-5126.y .Is.
Levin, B.E., Routh, V.H., Kang, L., Sanders, N.M., y Dunn-Meynell, A.A. (2004).
Neuronal glucosensing. What do we know after 50 years. Diabetes, 53,
3521-2528.. C . y . ay g . , . a
Rajasekar, P., . d ,
Schwartz, M.W y Porte, D.Jr. (2005) Diabetes, obesity, and the brain. Science,
307, 375-379.
Schwenke, D.O., Bolter, C.P. y Cragg, P.A. (2006). Are the carotid bodies of the
guinea-pig functional? Comparative Biochemistry and Physiology. Part A
Molecular & Integrative Physiology, 146 180-188.
. . of and . .....,.y. , y T t
Uemura, K., Tamagawa, T., Chen, Y., Maeda, N., Yoshioka, S., Ito, K., Miura, H.,
Iguchi A. y Hotta, N. (1997) NG-methyl-L-arginine, an inhibitor of nitric oxide
synthase, affects the central nervous system to produce peripheral hyperglycemia
in conscious rats. Neuroendocrinology, 66, 136-44 . ,y of :: y : , : . :
▓ Realizado
☼ Programado
BIBLIOGRAFÍA
ÁLVAREZ-BUYLLA, R. (1954). Disociación de las actividades quimiorreceptoras y
barorreceptoras en gatos. Archivos del Instituto Nacional de Cardiología (Méx), 24, 6-37.
ALVAREZ-BUYLLA, R. & CARRASCO-ZANINI, J. (1960). A conditioned reflex wish
reproduces the hypoglycemic effect of insulin. Acta Physiol Latinoam 10, 153-158.
ÁLVAREZ-BUYLLA, R. Y ROCES DE ÁLVAREZ-BUYLLA, E. (1975). Hypoglycemic
conditiod reflex in rats: preliminary study of its mechanism, Journal Comparative
Physiology and Psychology, 88, 155-160.
ÁLVAREZ-BUYLLA, R. y BENCOSME, S. A. (1981). Reflex hypoglycemia initiated by
insulin. Acta Physiologica Latinoamericana., 31, 5-11.
ALVAREZ-BUYLLA, R. & ALVAREZ-BUYLLA, E. (1988). Carotid sinus receptors
participate in glucose homeostasis . Respir Physiol 72, 347-360.
ÁLVAREZ-BUYLLA, R., QUINTANAR-STEPHANO, A., QUINTANAR-STEPHANO,
J.L. y ÁLVAREZ-BUYLLA DE, E.R. (1991). Removal of the unfragmented pituitary
gland (hypophysectomy) in the rat. Boletín del Instituto de Investigaciones Biomédicas
(Méx.), 39, 33-38.
ALVAREZ-BUYLLA, R. & ROCES DEALVAREZ-BUYLLA, E. (1994). Changes in
blood glucose concentration in the carotid body-sinus modify brain glucose retention.
Brain Res 654, 167-170.
ALVAREZ-BUYLLA, R., ALVAREZ-BUYLLA, DE E. R., MENDOZA, H.,
MONTERO, S. A. & ALVAREZ-BUYLLA, A. (1997). Pituitary and adrenals are required
for hyperglycemic reflex initiated by stimulation of CBR with cyanide. Am J Physiol 272,
R392-R399.
BERNARD, M. C. (1857). Lecons sur systieme nerveux. In , pp. 549- 555. París: Balliere.
Bredt and Snyder 1990
BRENNAN, T. J., MORRIS, M. & HAYWOOD, J.R. (1984). GABA agonists inhibit the
vasopressin dependent pressor effect of central angiotensin II. Neuroendocrinol 39, 429-
436.
BURES, J., BURESOVA, O. y HUNSTON, J.P. (1983). Techniques and basic
experiments for the study of brain and behaviour. Elsevier, Amsterdam.
CALABRESI, P., MERCURI, N. B., STEFANI, A. & BERNARDI, G. (1992)
Phisiological role of GABAb receptors in the mammalian neostriatum. In GABAergic
Synaptic Transmission. Ed. Biggio, G., Concas, A. & Costa, E. Pp. 217-221. New York:
Raven Press.
CATELLI, J.M., GIAKAS, W.J. & SVED, A.F. (1987) GABAergic mechanisms in
nucleus tractus solitarius alter blood pressure and vasopressin release. Brain Res 403, 279-
89.
CHAN SH, CHANG KF, OU CC, CHAN JY. (2004) Nitric oxide regulates c-fos
expression in nucleus tractus solitarii induced by baroreceptor activation via cGMP-
dependent protein kinase and cAMP response
element-binding protein phosphorylation. Mol Pharmacol. 65, 319-25.
Chan y Sawchenko 1998
Chan y col 1998
CHAMPAGNAT, J., DENAVIT-SAUBIE, M., MOYANOVA, S. & RONDOUIN, G.
(1982). Involvement of amino acids in periodic inhibitions of bulbar respiratory neurones.
Brain Res 237, 351-65
CHEN, I. L., WEBER, J. T. & YATES, R. D. (1994). Synaptic connections of central
carotid sinus afferents in the nucleus of the tractus solitarius of the rat. 11. Connections
with substance P-immunoreactive neurons. J Neurocytol 23, 313-322.
CHOUSLEB, A., HERNÁNDEZ, M.C., CARRASCO, A., CELAYA, R., HEREDIA, N.,
MONDRAGÓN, A. (1997). Anastomosis de cuernos uterinos por laparoscopia. Modelo
experimental en rata. Cirujano General 19, 55-59.
CIRIELLO, J., HRYCYSHYN, A. W. & CALARESU, F. R. (1981).
Horseradish peroxidase study of brain stem projections of carotid sinus and aortic
depressor nerves in the cat. J Auton Nerv Syst 4, 43-61.
Ciriello 1983
CRYER, P. E. & GERICH, J. E. (1986). The sympathochromaffin system and the
pituitary-adrenocortical response to hypoglycemia. Science 231, 501.
DECAVEL, C. & VAN DEN POL, A. N. (1990) GABA: a dominant transmitter in the
hypothalamus. J Comp Neurol 302: 1019-1037.
ENSINCK, J. W. & WILLIAMS, R. H. (1972). Hormonal and non- hormonal factors
modifying mans response to insulin. Handbook of Physiology. Endocrine Pancreas, eds.
STEINER, D. & FREINKEL, N., pp 665-684. Washington D.C.: American Physiological
Society.
EYZAGUIRRE, C. & ZAPATA, P. (1984). Perspectives in carotid body research. J Appl
Physiol: 57, 931-957.
FINLEY JC, KATZ DM. The central organization of carotid body afferent projections to
the brainstem
of the rat. Brain Res. 1992 Feb 14;572(1-2):108-16.
FORSYTH, R. J. (1996). Astrocytes and the delivery of glucose from plasma to neurons.
Neurochem Int. 28, 231-241.
FRAY, A. E., FORSYTH, R. J., BOUTELLE, M. G. & FILLENZ, M. (1996).
The mechanisms controlling physiologically stimulated changes in rat rain glucose and
lactate: a microdialysis study. J Physiol. 496.1, 49- 7.
FROHMAN, L. (1983). CNS peptides and glucoregulation. Annual Reviews of Physiology,
45, 95-107.
HABY C, LISOVOSKI F, AUNIS D, ZWILLER J. (1994) Stimulation of the cyclic GMP pathway by
NO induces expression of the immediate early genes c-fos and junB in PC12 cells. J Neurochem.
62, 496-501.
HENRY, J. L. & SESSLE, B. J. (1985). Effects of glutamate, substance P and eledoisin-
related peptide on solitary tract neurons involved in respiration and respiratory reflexes.
Neuroscience 14, 863-870.
HEVENER AL, BERGMAN RN, DONOVAN CM. (2001). Hypoglycemic detection does
not occur in the hepatic artery or liver: findings consistent with a portal vein glucosensor
locus. Diabetes 50:399-403.
HOUSLEY, G.D. & SINCLAAIR, J.D. (1988). Localization by kainic acid lesions of
neurons transmitting the carotid chemoreceptor stimulus for respiration in rat. J. Physiol.
406: 99-114.
ITO, S. & SVED, A.F. (1997). Influence of GABA in the nucleus of the solitary tract on
blood pressure in baroreceptor- denervated rats. Am J Physiol. Regul Intregr Comp
Physiol 273: 1657-1662.
JHAMANDAS, J. & RENAUD, L. (1987). Neurophysiology of a central baroreceptor
pathway projecting to hypothalamic vasopressin neurons. Canadian J. Neurol. 14: 17-24.
KALIA, M., FUXE, K., HOKFELT, T., JOHANSSON, O., LANG, R., GANTEN, D.,
CUELLO, C. & TERENIUS, L. (1984). Distribution of neuropeptide immunoreactive
nerve terminals within the subnuclei of the nucleus of the tractus solitarius of the rat. J
Com Neurol.y 22, 409-444.
Kandel, E.R., Schwartz, J.H. & Jessell, T.M. (2000) In: Principles of neural Science Ed.
Wc. Grow-Hill, New York. 4th
Edition
KNEPEL, W., NUTTO, D. & HERTTING, G. (1980). Evidence for the involvement of a
GABA-mediated inhibition in the hypovolaemia-induced vasopressin released. Pflugers
Arch 388, 177-183.
KOYAMA Y, COKER RH, STONE EE, LACY DB, JABBOUR K, WILLIAMS PE,
WASSERMAN DH. (2000) Evidence that carotid bodies play an important role in
glucoregulation in vivo. Diabetes. 49:1434-1442.
Krowicki y col 1997
LANDULPHO, C.D., DIAS, A.C % COLOMBARI E. (2003) Cardiovascular mechanisms
activated by microinjection of baclofen into NTS of conscious rats. Am J Physiol Heart
Circ Physiol 284, H987-93.
LANG, CH. H. (1995). Inhibition of central GABAa receptors enhances hepatic glucose
production and peripheral glucose uptake. Brain Res. 37, 611-616.
LEMAY, D. R., GEHUA, L., ZELENOCK, G. B. & D' ALCEY, L. G. (1988). Insulin
administration protects neurologic function in cerebral ischemia in rats. Stroke 19, 1411-
1419.
LIN HC, WAN FJ, TSENG CJ. (1999) Modulation of cardiovascular effects produced by nitric oxide
and ionotropic glutamate receptor interaction in the nucleus tractus solitarii of rats.
Neuropharmacology. 38, 935-41.
Lin y col 2004
Lewis y col 1991
Lipton 2001
Lo y col 1997
Lo, jan wu tseng 1998
LOPEZ-BARNEO J. (2003). Oxygen and glucose sensing by carotid body glomus
cells. Curr Opin Neurobiol. 13, 493-9.
MALAISSE WJ, SENER A. (1985). Glucokinase is not the pancreatic B-cell
glucoreceptor. Diabetologia. 28, 520-527.
MCWILLIAM, P.N. & SHEPHEARD, S.L. (1988). A GABA-mediated inhibition of
neurones in the nucleus tractus solitarius of the cat that respond to electrical stimulation of
the carotid sinus nerve. Neurosci Lett 94, 321-6.
MINCHIN, M. C. W., ENNIS, C., LATTIMER, N., WHITE, J.F., WHITE, A.C. &
LLOYD, G.K. (1992). The GABAA-like autoreceptor is a phamacologycally novel
GABA receptor. Adv Biochem Psychopharmacol. 47, 199-203.
MIZUNO, Y. & OOMURA, Y. (1984). Glucose responding neurons in the nucleus tractus
solitarius of the rat: in vitro study. Brain Res. 307, 109-116.
MONTERO, S.A., YARKOV, A., ALVAREZ-BUYLLA, R. (2000). Carotid
chemoreceptors participation in brain glucose regulation. Adv Exp Med Biol. 475:749-60.
NIIJIMA A (1969). Afferent impulse discharges from glucoreceptors in the liver of the
guinea pig. Ann N Y Acad Sci 157, 690-700.
NOSAKA, S., MURASE, S., MURATA, K. & lNUI, K. (1995). Aortic baroreceptor
neurons in the nucleus tractus solitarius in rats: Convergence of cardiovascular inputs as
revealed by heartbeat- locked activity . Journal of the Autonomic Nervous System 55, 69-
80.
OBESO, A., ALMARAZ, L. & GONZÁLEZ, C. (1998). Effects of 2-deoxy-D- glucose on
in vitro cat carotid body. Brain Research 369, 25.
OLENEV, S. N. (1987). Construction of the Brain. Leningrad: Meditsina Press.
OOMURA, Y. (1983). Glucose as a regulator of neuronal activity. In dvances in Metabolic
Disorders, ed. SZABO, A. J., pp. 31-65. New York: Academic Press.
OOMURA Y, YOSHIMATSU H. (1984). Neural network of glucose monitoring system. J
Auton Nerv Syst.
10, 359-72.
Ogawa y col 1995
PARDAL, R., & LOPEZ-BARNEO, J. (2002). Low glucose-sensing cells in the carotid
body. Nat Neurosci. 5, 197-198.
Paton y col 2001
PAXINOS, G. & W ATSON, C. (1986). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. New
York: Academic Press .
RAITERI, M., BONANNO, G., GEMIGNANI, A., PENDE, M., VALLEBUONA, F. &
LANZA M. (1992). Phamacologically distinct GABAB receptor subtypes modulate
neurotransmitter release in the rat brain cortex. In GABAergic Synaptic Transmission. Ed.
Biggio, G., Concas, A. & Costa, E. Pp. 205-216. New York: Raven Press.
RITTER S, DINH TT, ZHANG Y: Localization of hindbrain glucoreceptive sites
controlling food intake and blood glucose. Brain Res. 856:37 -47, 2000
RIVIER C. (2003). Role of nitric oxide in regulating the rat hypothalamic-pituitary-adrenal
axis response to endotoxemia. Ann N Y Acad Sci, 992, 72-85.
ROHNER-JEANRENAUD, F., BOBBIONI, E., IONESCU, E., SAUTER, J.E. &
JEANRENAUD, B. (1983). Central nervous system regulation of insulin secretion. In
Advances in Metabolic Disorders, Ed. Szabo, A. J., Pp. 193-220. New York: Academy of
Sciences.
RUDERMAN, N. B. & GOÓDMAN, M. N. (1980). Brain metabolism in Diabetes.
Horm.Metab.Res.(Suppl) 9, 1-8.
SHINDE UA. & GOYAL RK. (2003). Effect of chromium picolinate on
histopathological alterations in STZ and neonatal STZ diabetic rats. J Cell Mol Med.7:322-
9.
Shih y col, 1996
SHOUKAS A.A., CALLAHAN, C.A., LASH, J.M., & HAASE, E.B. (1991) New
technique to completely y isolate carotid sinus baroreceptor regions in rats. Am J. Physiol.
260, 300-303
Shuay y Xie 2004
SOKOLOFF, L. (1984). Modelling metabolic processes in the brain in vivo. Annual
Neurology' Supplements 15, 325-340.
SOKOLOFF, L. (1991). Measurement of local cerebral glucose utilization and its relation
to local functional activity in the brain. En M. Vranic and et al. (Eds.) Fuel Homeostasis
and the Nervous System (pp. 21-42). New York: Plenum Press.
SPRUCE, B. A., McCULLOCH, A.J., BURSD, J., ORSKOV, H., HEATON, H.,
BAYLIS, P. H. & ALBERTI, K. G. M. M. (1985). The effect of vasopressin infusion on
glucose metabolism in man. Clin. Endocrinol. (Oxf.) 22, 463-468.
TABATA, M., KUROSAWA, H., KIKUCHI, Y., HIDA, W., OGAWA, H., OKABE, S.,
TUN, Y., HATTORI, T. & SHIRATO, K. (2001). Role of GABA within the nucleus
tractus solitarii in the hypoxic ventilatory decline of awake rats. Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol 281, R1411-9
Talman y col 2001
TANAKA, J., MASHIKO, N., KAWAKAMI, A., USHIGOME, A., NOMURA M., (2002)
GABAergic systems in the nucleus tractus solitarius regulate noradrenaline
release in the subfornical organ area in the rat. Auton Neurosci. 100(1-2):58-65.
TAPPAZ, M., BROWNSTEIN, M. & KOPIN Y (1997) Glutamate descarboxylase (GAD)
and g-aminobutyric acid (GABA) in discrete nuclei of hypothalamus and substantia nigra.
Brain Research 125, 109-121.
Tagawa y col 1994
Tseng y col 1996
VITELA, M & MIFFLIN, S.W. (2001) Gamma-Aminobutyric acid(B) receptor-mediated
responses in the nucleus tractus solitarius are altered in acute and chronic hypertension.
Hypertension 37, 619-22
WASSERMAN, A. M., FERREIRA, M. JR., SAHIBZADA, N., HERNÁNDEZ, Y. M.,
GILLIS, R. A. (2002) GABA-mediated neurotransmission in the ventrolateral NTS plays a
role in respiratory regulation in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283,
R1423-41.
WAYNFORTH y FLECKNELL, (1992). Experimental and surgical technique in the rat.
Acad. Press. London.
WIELAND, H.A., LUDDENS, H. & SEEBURG, P.H. (1992). Molecular determinants in
BAGAA/ BZ receptor subtypes. In GABAergic Synaptic Transmission. Ed. Biggio, G.,
Concas, A. & Costa, E. Pp. 29-40. New York: Raven Press.
WOODS, S. C., SMITH, P. H. & PORTE, JR. D. (1980). The role of the nervous system in
metabolic regulation and its effects on diabetes and obesity. In Handbook of Diabetes
Mellitus: Clinical Experimental Aspects, ed. BROWNLEE, M., Pp. 1-113. New York: Cin
Press.
WOODS, S. C., & PORTE, JR. D. (1975). Effect of intracisternal insulin on plasma
glucose and insulin in the dog, Diabetes, 24: 905-909
WU WC, CHAI CY. 2004 Nitric oxide release in the nucleus tractus solitarius during and
after bilateral common carotid artery occlusion.
Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 152-158.
WU C, FUJIHARA H, YAO J, QI S, LI H, SHIMOJI K. y BABA H. (2003). Different
expression patterns of Bcl-2, Bcl-xl, and Bax proteins after sublethal forebrain ischemia in
C57Black/Crj6 mouse striatum. Stroke, 34, 1803-1808
YAMAGUCHI, K. Y HAMA, H. (2003). A study on the mechanism by which sodium
nitroprusside, a nitric oxide donor, applied to the anteroventral third ventricular region
provokes facilitation of vasopressin secretion in conscious rats. Brain Research, 968, 35-
43.
YARKOV, A. V., GALTCHENKO, A. A. & KOVALEV, G. l. (1994). Changes in rat
brain electrical activity during central administration of various doses of GABA agonists
and antagonists. Exper.Clin.Pharmacol.(Rus) 57, 6-11.
YARKOV, A., MONTERO, S., LEMUS, M., ROCES DE ÁLVAREZ-BUYLLA, E. &
ALVAREZ-BUYLLA, R. (2001) Arginine- vasopressin in nucleus of the tractus solitarius
induces hyperglycemia and brain glucose retention. Brain Res. 902, 212-222.
Lo,WC., Jan,CR., Wu,SN.,Tseng,CJ. (1998) Cardiovascular effects of nitric oxide and
adenosine in the nucleus tractus solitarii of rats. Hypertension. 32(6):1034-8
Tagawa,T., Imaizumi, T., Harada, S., Endo, T., Shiramoto, M., Hirooka, Y.,
Takeshita, A (1994) Nitric oxide influences neuronal activity in the nucleus tractus
solitarius of rat brainstem slices. Circulation Research, Vol 75, 70-76,
SHUAI XW, XIE PY. Expression and localization of c-Fos and NOS in the central nerve
system following esophageal acid stimulation in rats. World J Gastroenterol. 2004 Aug
1;10(15):2287-91.