facultad de ciencias exactas y naturales … · aspergillus, penicillium y fusarium, en condiciones...

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PAMPA

TESINA PRESENTADA PARA OBTENER

EL GRADO ACADÉMICO DE

LICENCIADO EN CIENCIAS BIOLOGICAS

“DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS

BALANCEADOS PARA PONEDORAS”

Dieser, Marilina Anahí

SANTA ROSA (LA PAMPA) ARGENTINA

2014

PREFACIO

Esta Tesina es presentada como parte de los requisitos para optar al grado

Académico de Licenciado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de La Pampa

y no ha sido presentada previamente para la obtención de otro título en esta Universidad ni

en otra Institución Académica. Se llevó a cabo en el Centro de Investigación y Desarrollo

de Fármacos (CIDEF) de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam, en General Pico,

durante el período comprendido entre el 11 de enero de 2014 y el 30 de diciembre del

2014, bajo la dirección del Dr. Toso, Ricardo E. y bajo la codirección de la Dra. Bazán,

Graciela I.

30 de Diciembre de 2014 Firma:

Departamento de Ciencias Biológicas

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad Nacional de La Pampa

Dra. Silvia M. ARDOINO Dr. Ricardo E. TOSO Lic. María J. GALEA

i

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional De La Pampa y a la Facultad de Ciencias Exactas y

Naturales por darme la oportunidad de estudiar y ser un profesional.

A la Facultad de Veterinarias por brindarme un lugar en el laboratorio, equipos y

financiamiento.

Al Dr. Ricardo Toso, mi director, y a la Dra. Graciela Bazán, mi codirectora, por

aceptarme como su tesista, por guiarme, aconsejarme, enseñarme y sobre todo por su

confianza, tiempo, amabilidad, paciencia y buen humor con el que me recibieron y

escucharon siempre. Muchas gracias.

A Dra. Silvia Ordoino por su tiempo, paciencia y enseñanza.

A mis amigos de la vida, de la facultad y de trabajo, que me acompañaron en todo

mi camino por la universidad, por su apoyo, paciencia, compañía y por permitir que los

días complicados no se vieran tan grises.

A mi familia, especialmente a mis padres, por el esfuerzo que hicieron para que

pueda estudiar y llegar a esta instancia. Por estar siempre a mi lado, apoyarme, ayudar a

que no baje los brazos, a sobrepasar cualquier obstáculo y enseñarme que sólo con

esfuerzo, paciencia y perseverancia se logra alcanzar lo que uno desea.

¡Gracias infinitas!

ii

RESUMEN

Las micotoxinas son metabolitos secundarios elaborados por los hongos

Aspergillus, Penicillium y Fusarium, en condiciones favorables de crecimiento: elevada

humedad, temperatura afectando principalmente a los cereales; pudiendo establecerse en

el campo o durante la recolección, transporte y almacenamiento. Ingresan en la cadena

alimentaria al contaminar los alimentos balanceados y las materias primas utilizadas para

su elaboración de tal forma que, al consumir dichos alimentos, provocan en el ser humano

y en los animales trastornos toxicológicos substanciales denominado micotoxicosis. Si bien

se reconocen numerosas micotoxinas sólo algunas tienen propiedades tóxicas de

importancia, entre ellas las aflatoxinas. El objetivo del presente trabajo fue analizar

muestras de alimento balanceado para ponedoras en la cuidad de General Pico, La Pampa,

y determinar en ellos la presencia de Aflatoxinas. Entre los meses de julio y septiembre de

2014 se tomaron muestras de 200 gramos de bolsas de balanceados trazables de distintos

lotes, provenientes de 3 proveedores de la ciudad. Una vez tratadas las muestras se realizó

la lectura mediante la prueba de inmunoensayos enzimáticos competitivos tipo ELISA. El

análisis de los resultados evidenció que el 77,8 % de las muestras de alimento balanceado

para ponedoras dio positivo a Aflatoxinas y el 55,6 % del total alcanzó valores superiores

al permitido comercialmente de 12 ppb. A partir de este estudio advertimos que es

indispensable alertar y concientizar a los productores y comerciantes de alimentos

balanceados sobre las normas de seguridad e higiene en recolección, transporte y

almacenamiento de cereales con destino a alimentos balanceados para evitar el desarrollo

de micotoxinas y prevenir las pérdidas en cuanto a la producción avícola como así

también, evitar los efectos adversos sobre la salud animal y humana.

ABSTRACT

Mycotoxins are produced by Aspergillus, Fusarium and Penicillium fungi under

favorable growth conditions: high humidity and temperature and mainly affect cereals

secondary metabolites, may be established in the field or during harvesting, transportation

and storage. Enter the food chain to contaminate balanced food raw materials used in their

production so that by consuming these foods, cause in humans and animals called

mycotoxicosis substantial toxicological disorders. While many mycotoxins are recognized

iii

only some have toxic properties of importance, including aflatoxins. The objective of this

study was to analyze samples of balanced feed for laying hens in the city of General Pico

(LP) and they determine the presence of Aflatoxin. Between July and September 2014

samples of 200 grams of bags of different lots traceable to balanced, 3 providers from the

city were taken. Once treated samples reading test was performed by competitive ELISA

enzyme immunoassays. The analysis of the results showed that 77.8% of the pet food

samples tested positive for laying Aflatoxins and reached 55.6 % of the total above 12 ppb

commercially allowed values. From this study we note that it is essential to internalize and

awareness among producers and traders balanced about the rules safety and hygiene in

collection, transportation and storage of cereals to balanced foods to prevent the

development of mycotoxins and thereby prevent the adverse effects on animal and human

health.

iv

ÍNDICE DE CONTENIDOS

AGRADECIMIENTOS i

RESUMEN ii

ABSTRACT ii

ÍNDICE DE CONTENIDOS iv

ÍNDICE DE TABLAS, FIGURAS Y LAMINAS v

I INTRODUCCIÓN 1

III HIPÓTESIS 13

VI MATERIALES Y MÉTODOS 14

VII RESULTADOS 16

VIII DISCUSIÓN 18

IX CONCLUSIONES 20

X RECOMENDACIONES 21

X1 INVESTIGACIONES FUTURAS 22

XII REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 23

XIII ÍNDICE GENERAL 27

v

INDICE DE TABLAS, FIGURAS Y LÁMINAS

FIGURAS

Pág.

1 2

-Esquema del cuerpo fructífero de un hongo superior. - Fórmula estructural de la Aflatoxina.

1 4

3 4

- Aspergillus flavus. -Fórmula estructural de la Ocratoxina A.

4 5

5 6

-Fórmula estructural de la Zearalenona. -Fórmula estructural de la Fumonisina.

6 6

7 8

-Fórmula estructural del Tricoteceno. -Fórmula estructural de la Citrinina.

6 6

9 10 11 12 13 14 15 16 17

-Fórmula estructural de la Patulina. -Fórmula estructural de la Sterigmatocistina. -Fórmula estructural de la Ergotamina. -Matabolito de aflatoxina en unión con el DNA celular. -Adición de la solución stop a los pocillos. -Lectura de la muestra en ELISA. -Curva de calibración para los estándar de control -Curva de calibración de las muestras problemas. -Curva de calibración de muestras control y muestras problemas.

7 7 8 11 15 16 17 17 18

TABLAS

Pág.

1

-Valores de absorbancia y concentración de aflatoxinas registrados en los controles (Estándar) y en las muestras.

16

DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”

1

INTRODUCCIÓN

Los hongos configuran un grupo de organismos eucarióticos, unicelulares o

pluricelulares. Carecen de clorofila y su estructura histológica y morfológica constituye un

talo. La carencia de pigmentos fotosintéticos es una característica que distingue a los

hongos de las demás talofitas y es condicionante en su actividad biológica pues debido a

ello, estos organismos son capaces de sintetizar materia orgánica sin utilizar la luz solar

como fuente de energía. Por este motivo deben desarrollarse sobre un sustrato que

contenga materia orgánica, factor que condiciona los lugares de crecimiento (Gimeno &

Martins, 2011). La obtención de los nutrientes se lleva a cabo por digestión extracelular ya

que secretan enzimas que descomponen el material orgánico y luego absorben los

productos solubilizados. El talo está formado típicamente por filamentos microscópicos

denominados hifas que se ramifican en todas las direcciones desplegándose sobre el

substrato que le sirve de alimento o dentro de él (Alexopoulos et al., 1996) (Fig. 1). El

conjunto de hifas se denomina micelio. Estos organismos necesitan para crecer una

temperatura óptima que varía entre los 20°C a 30°C y prefieren medios ácidos con un pH

óptimo de 6.

Fig. 1: Esquema del cuerpo fructífero de un hongo superior. Detalle de estructuras reproductivas y del micelio constituido por hifas.

Se reproducen sexual o asexualmente por medio de esporas. La reproducción

asexual permite la propagación de la especie, debido a que conforma la producción de

numerosos individuos y esta se repite varias veces en el año. Se pueden originar por

fragmentación del soma, fisión de las células somáticas, gemación y producción de

esporas. El proceso de reproducción sexual presenta tres fases distintas: plasmogamia,


2

unión de dos protoplastos que reúne los núcleos en el interior de una misma célula;

cariogamia, fusión de los dos núcleos y meiosis, reducción del número de cromosomas

hasta el estado haploide (Alexopoulos et al., 1996).

En relación al hábitat, los hongos han conquistado un gran número de ambientes,

cumpliendo importantes roles en los diversos ecosistemas (Webster & Weber, 2011). Entre

sus hábitos de vida encontramos especies saprófitas, parásitas y simbióticas. Tienen vital

importancia ecológica, ya que junto a las bacterias son los principales descomponedores de

materia orgánica como madera, pelos, alimentos almacenados, etc. Al ser microorganismos

de gran extensión y crecer en todo tipo de materia orgánica, se encuentran frecuentemente

como contaminantes en productos alimenticios, causando pérdidas importantes. Dada su

capacidad invasiva y su gran resistencia constituyen el agente deteriorante más común de

todo tipo de alimentos (Combita Prieto & Mildenberg Ortiz, 2009).

Revisten importancia médica como generadores de antibióticos, alcanzando

notoriedad en la industria química y alimenticia (Herrera & Ulloa, 1990; Alexopoulos et

al., 1996; Martinez, 2007; Ruiz Boyer, 2014).

1- Micotoxinas

Algunos hongos pueden producir sustancias químicas conocidas como micotoxinas.

Los principales géneros de hongos productores de estas sustancias son Aspergillus,

Fusarium y Penicillium (Altolaguirre, 2006; Anguiano Cabello et al., 2012).

Las micotoxinas son “metabolitos secundarios” fúngicos cuya ingestión, inhalación

o absorción cutánea reduce la actividad de otros organismos, causando enfermedades o aún

la muerte en animales, sin excluir las aves y personas (Pitt, 1996). Diversos factores como

temperatura, pH, humedad, presencia de plagas, madurez del grano al momento de la

cosecha, daño mecánico y condiciones de almacenamiento, influyen en la producción de

micotoxinas, pudiéndoselas encontrar en diversos alimentos y forrajes, por lo que se han

relacionado con diferentes enfermedades de animales y personas (Mayer, 1953; Coker,

1997).

La exposición de animales a micotoxinas puede producir toxicidad tanto aguda

como crónica, con resultados que van desde efectos nocivos en el sistema nervioso central,

en el aparato digestivo, cardiovascular, respiratorio y problemas hepáticos, relacionados

con la formación de un hígado graso y de mayor tamaño, hasta la muerte. Todas estas

complicaciones afectan al mercado, debido a que no sólo se observa una disminución en la

productividad, sino que también se ve una baja en la calidad de los productos.


3

Las micotoxinas también pueden ser agentes cancerígenos, mutágenos, teratógenos

e inmunodepresores. Actualmente está muy extendida la opinión de que el efecto más

importante de las micotoxinas, particularmente en los países en desarrollo, es la capacidad

de algunas de ellas de obstaculizar la respuesta inmunitaria y por consiguiente, reducen la

resistencia a enfermedades infecciosas (FAO, 2003). La exposición a las micotoxinas se

produce principalmente por ingestión, aunque también por su inhalación y contacto

cutáneo. Los efectos producidos se conocen como micotoxicosis, cuya gravedad depende

de la toxicidad de la micotoxina, del grado de exposición, edad, estado nutricional del

individuo, tipo de producción y de los posibles efectos sinérgicos de otros agentes

químicos a los que este expuesto (Combita Prieto, 2009; Torres, 2011).

Se han identificado hasta el momento más de 200 micotoxinas, las que se pueden

encontrar de forma más frecuente como contaminantes naturales en los alimentos para

animales y para humanos son: aflatoxinas, ocratoxinas, fusariotoxinas, citrinina, patulina,

sterigmatocistina, alcaloides del Ergot (Gimeno & Martins, 2011).

· Aflatoxinas: (Fig. 2) el término fue acuñado a comienzos de 1960, cuando

miles de pavos, patos y otros animales domésticos murieron a causa de una enfermedad

conocida como "enfermedad X de los pavos" que se atribuyó a la presencia de toxinas de

Aspergillus flavus (Fig. 3) en harina de maní, importada de Sudamérica (Austwick, 1978).

Entre los hongos de importancia mundial en la producción de este tipo de toxinas

encontramos a Aspergillus parasiticus que produce aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, y A.

flavus con aflatoxinas B1 y B2 (Miller, 1994).

El género Aspergillus fue descrito por primera vez en 1729 por P. A. Micheli, quien

comprobó que la cabeza conidial de este hongo se parecía a un "aspergillum”, (aspersor) es

un hongo filamentoso hialino, es "patógeno oportunista" que suele afectar a pacientes con

mecanismos de defensa comprometidos.

Aspergillus spp requiere determinadas condiciones para su desarrollo y producción

de toxinas. Crecen en ambientes con una humedad relativa del 80-90 % y una temperatura

que va desde los 4°C hasta 45°C. La toxina se produce entre los 11°C y hasta 35°C, siendo

la temperatura óptima 22°C. Estas especies de hongos crecen saprofíticamente y los

productos alimenticios pueden servir como sustrato. A. parasiticus se aísla principalmente

del suelo, mientras que A. flavus se lo puede encontrar en las partes aéreas de las plantas.


4

Fig. 2: Fórmula estructural de Fig. 3: Aspergillus flavus. la aflatoxina.

Las aflatoxinas exhiben baja solubilidad en agua y son solubles en soluciones

acuosas de metano, acetonitrilo o acetona. Son relativamente inestables a la luz y al aire en

estado puro y susceptibles a la hidrólisis alcalina; son afectadas por amoníaco o hipoclorito

de sodio (pH>10.5); termo-resistentes, estables en un rango de pH entre 3 y 10; inodoras,

incoloras e insípidas; así como químicamente estables en los alimentos y resistentes a la

degradación bajo procedimientos de cocción normales y de difícil eliminación una vez que

se producen (Guzmán-De Peña, 2007). Tienen una gran actividad cancerígena,

teratogénica y mutagénica. El principal síndrome que producen es el hepatotóxico,

pudiendo también provocar problemas renales. Los principales órganos afectados son:

hígado, riñón y cerebro. Las aflatoxinas son inmunosupresivas ya que inhiben la

fagocitosis e interrumpen la síntesis del ADN, ARN y proteínas en el ribosoma. La

absorción de los aminoácidos se ve alterada y la retención hepática de éstos aumenta. El

efecto inmunosupresivo predispone al organismo animal a que sea invadido por

microorganismos patógenos (Gimeno & Martins, 2011). Se las considerada el agente

cancerígeno más potente. Pueden desarrollar el denominado síndrome de aflacotoxicosis,

que se caracteriza por vómitos, dolor abdominal, convulsiones y, en el peor de los casos,

alteraciones en riñones y corazón (Gimferrer Morató, 2012).

El nivel máximo admisible de aflatoxinas en los alimentos para consumo humano

dado por la FAO/OMS es de 20 ppb. Niveles superiores de estas toxinas pueden causar

intoxicación que se manifiesta sobre todo en lesiones hepáticas. Por el contrario el valor

límite de estas toxinas en alimento comerciales para ponedoras varía de acuerdo a la

especie, edad, peso y producción; siendo el valor límite para ponedoras de 12 ppb (Lesson,

et at., 1996) concentraciones superiores llevan a afectar la producción y salud de las aves.


5

Hasta el momento han sido identificadas 20 aflatoxinas diferentes, sin embargo

únicamente las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se originan de manera natural en sustratos

contaminados por Aspergillus aflatoxigénicos. Las demás aflatoxinas como M1, M2, P1,

Q1 y aflatoxicol entre otras, ocurren como productos metabólicos de sistemas microbianos

o animales (Rojas Contreras et al., 2009).

· Ocratoxinas: producidas por Aspergillus ochraceus y diversas especies del

género Penicillium (Fig. 4) (Valle Vega & Florentino, 2000). Están presente en maíz,

arroz, guisantes, café, cerveza, vino, cacao, nueces e higos (Pavón Moreno, 2007). Los

principales animales afectados son el cerdo y el ganado avícola. Son principalmente

nefrotóxicas (nefrosis tubular), hepatotóxicas, teratógenas y afectan el intestino delgado

(Altolaguirre, 2006).

Fig. 4: Fórmula estructural de la Ocratoxina A.

· Fusariotoxinas: poseen como principales representantes las fumonisinas

(Fig. 5), la zearalenona (Fig. 6) y los tricotecenos (Fig. 7), producidas por diversas especies

del género Fusarium, que forma parte de la flora de campo (sustratos fitopatógenos,

plantas vivas) y de la flora intermedia (sustratos de cereales recién recogidos y aún

húmedos). Este moho crece entre 6°C y 40ºC con un óptimo entre 18°C y 30ºC.

Los síntomas de intoxicación son taquicardia, vómitos, diarreas, hemorragia en

mucosas, edema, necrosis de piel, destrucción de tejido hematopoyético, disminución de

células blancas y plaquetas en sangre, hemorragia en meninges, desordenes nerviosos y

rechazo del alimento. No son cancerogénicas como las aflatoxinas y las ocratoxinas y su

principal efecto tóxico parece ser la inhibición de la síntesis proteica. Afectan la división

celular de mucosas del tracto gastrointestinal, piel y tejido linfoide (Perusia, 2001; Flores

Ortíz et al., 2006).


6

Fig. 5: Fórmula estructural de la Zearalenona. Fig. 6: Fórmula estructural de la Fumonisina.

Fig. 7: Fórmula estructural del Tricoteceno.

· Citrinina: es la única micotoxina producida por Penicillium citrinun, si

bien P. expansum y P. verrucosum también puede originarla (Fig. 8). Las fuentes más

comunes en las que se la suele encontrar son: granos molidos, harina y todos los cereales,

maní y frutas. Causa daño a los riñones y al hígado. Otros efectos incluyen la

vasodilatación, constricción de bronquios e incremento del tono muscular (Altolaguirre,

2006).

Fig. 8: Fórmula estructural de la Citrinina.


7

· Patulina: es producida por algunas especies fúngicas de los géneros

Penicillium, Aspergillus y Byssochlamys (Fig. 9). Crece en las frutas, incluyendo la

manzana, la pera y las uvas, causando manchas de pudrimiento color café y otras

características de podredumbre. Posee propiedades antibióticas de amplio espectro y se ha

probado para tratar el resfriado común. Sin embargo, nunca se ha demostrado su

efectividad y, a la luz de su toxicidad, no se ha insistido en el uso para tratamiento médicos

debido a que es irritante estomacal y produce nauseas y vómitos.

Entre los síntomas de toxicidad por patulina encontramos hemorragia del tracto digestivo

en ganado (Perusia, 2001; Borrell & Gimeno 2012).

Fig. 9: Fórmula estructural de la Patulina.

· Sterigmatocistina: es producida por diferentes especies de hongos,

pero Aspergillus versicolor es el más importante (Fig. 10). Se lo encuentra en granos de

trigo, maíz, arroz, harinas, granos de café verde, especias, queso y carnes. Este compuesto

puede ser un precursor en la biosíntesis de las aflatoxinas. Produce los mismos efectos, es

tóxico, carcinogénico, mutagénico y teratogénico, pero su actividad es menor que la de las

aflatoxinas (Altolaguirre, 2006).

Fig. 10: Fórmula estructural de la Sterigmatocistina.


8

· Alcaloides del Ergot: es producido por Claviceps purpúrea (Fig. 11). Se

encuentra en cereales como centeno, trigo, cebada, avena, mijo, sorgo y maíz. En los seres

humanos causa diversos efectos que van desde mareos, dolor de cabeza, calambres, hasta

el ergotismo gangrenoso.

Fig. 11: Fórmula estructural de la Ergotamina.

2- Factores de crecimiento

Los hongos productores de aflatoxinas están muy extendidos por todo el mundo, en

climas templados, subtropicales y tropicales. Potencialmente, pueden producir estos

metabolitos, antes o después de la cosecha, en numerosos alimentos y piensos,

especialmente semillas de oleaginosas, nueces comestibles y cereales (Coker, 1997). Si

bien las aflatoxinas están relacionadas predominantemente con productos de origen

subtropical y tropical, se ha comunicado también su presencia en climas templados en

cereales tratados con ácidos (Pettersson et al., 1989).

Para el crecimiento de los hongos y la producción de micotoxinas existen tres

factores fundamentales que son condicionantes:

a.- Factores físicos (humedad o agua libre y actividad de agua (aw); temperatura;

zonas de microflora; integridad física de los granos).

b.- Factores químicos (pH; composición del sustrato; nutrientes minerales;

potencial de oxi-reducción, O2/CO2).

c.- Factores biológicos (presencia de invertebrados; cepas específicas) (Gimeno &

Martins, 2011).

Factores climáticos y condiciones inadecuadas de almacenamiento en los alimentos

para aves, influyen sobre una gran variedad de cultivos favoreciendo la presencia de

aflatoxinas (Flores Ortiz et al., 2006; Chi & Broomhead, 2009). A su vez el tipo de

nutrientes y de sustrato son importantes para la producción de aflatoxinas, la cual puede ser


9

estimulada por un alto nivel de carbohidratos y un bajo nivel de proteínas; los

carbohidratos proveen los dos carbonos precursores para la síntesis de la toxina.

Algunos autores estiman que, de no controlarlos convenientemente, en algunos

años la mayoría de los alimentos presentarán indicios de aflatoxinas (Udagawa, 1988;

Alexopoulos et al., 1996).

El factor más común que produce variabilidad en el análisis de las toxinas es el

muestreo inadecuado del alimento, debido a que estas no están distribuidas uniformemente

en todo el lote de alimento para animales o para humanos. Se concentran más en áreas de

mayor humedad y/o con niveles de oxígeno más elevados (FAO, 2003).

3- Aflatoxicosis y producción avícola

Las micotoxinas usualmente ingresan al animal a través del consumo de alimento

contaminado. La importancia de las aflatoxinas en aves no sólo se debe a su presencia

frecuente, sino también, a su alto potencial tóxico en la producción de aves. Los efectos y

la susceptibilidad pueden variar dependiendo de la edad, raza, estado nutricional, dosis,

sexo, estado inmune y tratamiento con drogas. Se ha comprobado, por ejemplo, que lo

pollos jóvenes son más sensibles a las toxinas que los pollos de más edad.

La presencia silenciosa de éstas toxinas, sólo se hace evidente cuando sus

concentraciones actúan deprimiendo el crecimiento en las aves y la eficiencia alimenticia

entre un 5-8%, ya que los problemas como fragilidad folicular aviar y disminución de la

calcificación suelen pasar desapercibidos. Se puede observar también palidez en las

mucosas y en las patas de los pollos y ponedoras que reciben alimento balanceado

contaminado con aflatoxinas (Mallmann, 2007).

En brotes de aflatoxicosis, una de las características más destacadas es la mala

absorción del alimento, lo que se manifiesta por la presencia de partículas mal digeridas de

alimento balanceado en las excretas de las aves y un aumento de la excreción de lípidos.

En pollos de engorde la esteatorrea está acompañada por una reducción en la actividad de

la lipasa pancreática, principal enzima digestiva de las grasas, y una disminución de las

sales biliares necesarias tanto para la digestión como para la absorción de grasas,

ocasionando el desarrollo de hígado graso (Soria, 2013). Un hígado graso va a contener

alrededor del 55 % de grasa, en contraposición con un hígado normal que tiene 36 %. La

muerte generalmente ocurre por la ruptura del hígado junto con fuertes hemorragias.

El peso del cuerpo en los pollitos de 6 días de edad decrece significativamente al

ingerir alimentos contaminados con concentraciones de 5 ppb de aflatoxinas y, con niveles


10

de 2,5 ppb este efecto aparece a los 17 días de nacidos. Por otro lado a partir de los 12 días,

los valores de hematocrito y hemoglobina también se ven reducidos en los pollos que

ingieren dietas con 5 ppb de aflatoxinas (Huff et al., 1986).

Pequeñas cantidades de aflatoxinas en el alimento balanceado pueden causar una

disminución significativa en el aumento de peso, un mayor porcentaje de mortalidad,

menor producción y peso de huevos (Chi & Broomhead, 2009). Además se produce una

disminución proporcional en el tamaño de las yemas, debido a los daños causados en la

síntesis proteica y lipídica. A pesar de ello, la deposición de calcio en la cáscara de los

huevos en sí misma no se ve afectada, pero si se origina un aumento del espesor de la

cáscara, pudiendo afectar esto la eclosionabilidad, debido a una reducción de los

intercambios gaseosos entre el embrión y el medio ambiente (Mallmman et al., 2007).

La aflatoxicosis está fuertemente asociada con un aumento a la susceptibilidad de

enfermedades infecciosas, debido a la capacidad de las aflatoxinas de interferir con la

síntesis de proteínas. En pollos, estas toxinas aumentan la susceptibilidad o severidad a la

coccidiosis, salmonelosis y demás agentes patógenos.

4- Riesgos para la salud humana

El mayor peligro potencial para el hombre radica en los consumidores de carne o

huevos contaminados, ya que en éstos, pueden producir distintas patologías, algunas tan

graves como cáncer de hígado (Beardall & Miller, 1994; Arrieta Mendoza et al., 2006). El

mecanismo de acción de las aflatoxinas en el organismo toma la siguiente secuencia:

a. Penetración en las células y sus núcleos.

b. Combinación con el ADN.

c. Reducción de la síntesis de ARN, especialmente del ARNm.

d. En pocos minutos bloquean la proteosíntesis y causa la inhibición del ARNm y de la

mitosis.

e. La inhibición de la mitosis es seguida por la muerte celular (Rojas Contreras et al.,

2009).

Cuando se ingiere un alimento contaminado con aflatoxina B, ésta primero se

absorbe en el intestino delgado y luego es transportada en la sangre, donde los glóbulos

rojos y proteínas plasmáticas la conducen hacia el hígado. En las células hepáticas la

toxina se metaboliza en el retículo endoplasmático para transformarse en las aflatoxinas P,

M, Q (Martínez Padrón et al., 2013).


11

La capacidad de la aflatoxina para producir mutaciones se observa en la habilidad

que presenta un metabolito activado para unirse covalentemente a la guanina del ADN en

la posición N-7 (Fig. 13). Estos enlaces ocasionan disrupciones en la transcripción y

traducción, acciones que podría ser importante en el inicio del cáncer (Álvarez Bañuelos et

al., 2000; Novoa Urrego & Gonzalo, 2006)

También producen otros efectos patológicos sobre el sistema inmunitario, sobre el

metabolismo, sistema gastrointestinal, piel, sistema nervioso central. En India fallecieron

varias personas en 1974 a causa de una intoxicación aguda por aflatoxinas, cuando las

lluvias intempestivas y la escasez de alimentos impulsaron el consumo de maíz

contaminado (Krishnamachari et al., 1975).

Fig. 12: Metabolito de aflatoxina en unión con el DNA celular.

Si la acción inmunodepresora de las aflatoxinas en el ganado se manifiesta de

forma similar en las personas, es posible que tanto las aflatoxinas como otras micotoxinas,

desempeñen un papel importante en la etiología de las enfermedades que sufre la población

en ciertos países en desarrollo, en los que se ha comunicado una alta exposición a estas

toxinas (Peraica et al., 1999; Bogantes Ledezma et al., 2004; Lazo & Sierra, 2008).


12

5- Estrategias de prevención y control

La prevención debe comenzar en el campo, allí se inicia uno de los focos de

contaminación de muchos suministros básicos para la elaboración tanto de los alimentos

compuestos para animales como de los alimentos para humanos.

Deben ser utilizados, fungistáticos, fungicidas e insecticidas adecuados, debiendo

cuidar en estos últimos, que los niveles de residuos estén dentro de las concentraciones no

nocivas y permitidas. Con ellos, no solo reduciremos la posibilidad de crecimiento fúngico

y proliferación sino que también mantendremos la integridad física de los granos en lo que

respecta al ataque de insectos (Gimeno & Martins, 2011).

El control biológico parece ser otro recurso para reducir la acumulación de

aflatoxinas y consiste en utilizar cepas no-toxigénicas de Aspergillus para disminuir la

incidencia de hongos productores de la toxina a través del desplazamiento competitivo

(Rubio Martínez, 2011); también se ha observado la utilización de cultivos resistentes a la

contaminación por toxinas.

Se han estudiado métodos físicos, químicos y biológicos para la prevención,

descontaminación, detoxificación o inactivación de las micotoxinas. Los estudios

efectuados con algunos de estos procedimientos están aún en la fase de planta piloto o

experimental (Gimeno & Martins, 2011). Otros son impracticables, por su elevado costo o

porque éstos dejan residuos en el alimento que pueden ser perjudiciales a la salud.

La evaluación de las pérdidas económicas derivadas de la presencia de aflatoxinas

en alimentos es compleja, debido a que son muchos los factores que hay que tener en

cuenta para poder realizar la valoración. La detección de materias primas o alimentos

contaminados puede ocasionar desde la pérdida absoluta del producto o cultivo, a la

pérdida de mercados y la consecuente disminución de ingresos por la venta de mercancías

a menor precio.

Por otro lado, es necesario considerar las pérdidas económicas que se dan ante la

aparición de brotes de intoxicación en animales de abasto, que son muy altas, sobre todo

cuando se produce la muerte de un elevado número de animales, cuando provoca en ellos

mayor susceptibilidad a los procesos infecciosos y parasitarios y cuando ocasiona una baja

en la productividad de los animales o retraso en su crecimiento (Combita Prieto et al.,

2009).

El instrumento principal para combatir a las micotoxinas la constituye la difusión

objetiva de la información a todos los integrantes de las cadenas productivas de alimentos,


13

con las consecuentes medidas de prevención y control que se puedan aplicar a lo largo de

la misma (Requena et al., 2005).

HIPÓTESIS

- Se encontrarán alimentos balanceados con niveles de aflatoxinas superiores al valor

aceptable comercialmente de 12 ppb.

OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de aflatoxinas totales; B1, B2, G1 y G2, en alimentos para

gallinas ponedoras.

IMPORTANCIA

La importancia de este proyecto se centra en conocer la calidad sanitaria del

alimento balanceado para ponedoras que se comercializa en la ciudad de General Pico, La

Pampa.

La presencia de aflatoxinas en alimentos para animales de granja causa grandes

pérdidas económicas en la producción agrícola. A esto se suma el riesgo para la salud

humana por ingesta de productos contaminados por estas toxinas, como así también por su

inhalación o contacto directo por parte de quienes manipulan los ingredientes y alimentos.


14

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de las muestras

La recolección se realizó en los meses de julio-agosto y septiembre, épocas del año

donde las condiciones climáticas (temperatura y humedad), fueron óptimas para el

desarrollo de hongos productores de micotoxinas.

Se determinaron 3 proveedores de alimentos comerciales trazables de la ciudad de

General Pico, La Pampa. Se tomaron ocho (8) muestras de bolsas de alimento balanceado

de distintos lotes, para evaluar la posible presencia de aflatoxinas. Las muestras, de 200

gramos cada una, se preservaron en bolsas de plástico, fueron rotuladas y llevadas al

Centro de Investigación y Desarrollo de Fármacos (CIDEF) de la Facultad de Veterinaria

para su conservación, aisladas de la luz y refrigeradas hasta el momento de la realización

de los ensayos.

Las muestras 1b y 2b contenían como ingredientes: granos de trigo, avena, cebada,

maíz tratado por extrusión, afrechillo de trigo, harina de carne y soja, poroto de soja

desactivada, complementos vitamínicos y macro/microminerales. Las muestras 3a y 3c

compuestas por: maíz, expeller, conchilla, harina de carne, sal, metionina y núcleo.

También se analizó una muestra de maíz que formaba parte de la formulación de las

muestras de alimentos 3a y 3c, que fue provista por el fabricante e identificada como 3b.

En total se analizaron 9 muestras, 8 pertenecieron a alimentos balanceados

preparados en formulación y la restante correspondió a la muestra de maíz (3b) que era

parte de la formulación de las muestras de alimentos 3a y 3c, anteriormente mencionada.

Cabe destacar que los proveedores fueron reticentes a entregar las muestras y datos

de las mismas, motivo por el cuál no se contó con la fórmula de elaboración de las

muestras 1a, 1c, 2a y 2c.

Preparación de la muestra / Extracción

La determinación de aflatoxinas requiere realizar una extracción metanólica. Cada

muestra por separado fue molida y tamizada. Se pesaron 20 g (10 g en el caso de muestras

de maíz). Luego se agregó 100 mililitros de una solución metanol-agua (70/30, v/v) y agitó

durante 3 minutos. Se dejó sedimentar y filtró utilizando papel de filtro Whatman grado 1

Las muestras fueron procesadas evitando la contaminación cruzada, se rotularon y controló

el pH (rango 6-8, requerido para evaluar la presencia de aflatoxinas por el test de ELISA).


15

Determinación de aflatoxinas

El extracto metanólico de las muestras, se utilizó para realizar la prueba de

inmunoensayos enzimáticos competitivos de tipo ELISA (Fernandez-Surumay et al. 2000)

para determinar la concentración de aflatoxinas presentes en cada una de ellas.

El Kit empleado para determinar la presencia de aflatoxinas totales fue el

AgraQuant® Total Aflatoxin (COKAQ1000) con un rango de cuantificación de 4-40 ng/ml

y límite de detección de 3 ng/ml.

Las soluciones estándar y las muestras fueron añadidas a los pocillos que contienen

los anticuerpos anti-aflatoxinas. Se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Durante el período de incubación, las moléculas libres de aflatoxinas se unen a los

mencionados anticuerpos. Las sustancias que quedan sin unir se eliminan en el proceso de

lavado con agua destilada. La actividad de la enzima ligante se determina añadiendo una

enzima sustrato que da a la solución un color azul. Se lo dejó incubar 5 minutos a

temperatura ambiente y luego se añadió la solución stop, la cual frena la reacción y

produce un cambio de coloración de azul a amarillo (Fig. 13).

Fig. 13: Pocillos conteniendo estándares y muestras. Se observa la coloración azul producida por la adición de la solución stop

Los micropozos fueron medidos ópticamente usando un lector con un filtro de

absorbancia de 450 nm (OD450) (Fig. 14).


16

Fig. 14: Lectura de las muestras en ELISA.

Las densidades ópticas de la muestra fueron comparadas con las densidades ópticas

de los estándares y se calcularon las concentraciones de aflatoxinas a través de la curva de

calibración obtenida previamente con los estándares provistos en el kit. La intensidad del

color desarrollada en el momento de la lectura es inversamente proporcional a la

concentración de aflatoxinas en la muestra.

RESULTADOS

Realizadas las lecturas de las absorbancias de los controles y de las muestras

problemas se obtuvieron los resultados detallados en la Tabla 1.

Tabla 1: Valores de absorbancia y concentración de aflatoxinas registrados en los controles (estándar) y en las muestras.

Pocillos Muestra Absorbancia

(nm) Concentración de aflatoxina (ng/g)

F1 Muestra 1.a 1.088 22.264

G1 Muestra 1.b 1.750 39.667

H1 Muestra 1.c 0.687 12.468

A2 Muestra 2.a 0.283 -1.420

B2 Muestra 2.b 0.635 11.251

C2 Muestra 2.c 1.236 26.151

D2 Muestra 3.a 0.492 6.960

E2 Muestra 3.b (Maíz) 0.834 15.991

F2 Muestra 3.c 0.302 - 0.573

A1 Estándar 1 0.302 0.000

B1 Estándar 2 0.403 4.000

C1 Estándar 3 0.583 10.000

E1 Estándar 4 1.002 20.000

D1 Estándar 5 1.763 40.000


17

En la Fig. 15 se observa la curva de calibración obtenida con los cinco estándares

provistos por el kit (0; 4; 10; 20 y 40 ppb).

Fig. 15: Curva de calibración para los estándar de control

En la Fig. 16 se muestran los datos obtenidos de las muestras problema.

La comparación de datos, a través de la absorbancias medidas y expresadas en la

Tabla 1, permite cuantificar las aflatoxinas presentes en las muestras tomando como

referencia la curva de calibración (Fig. 17).

Fig. 16: Curva de calibración de las muestras problemas.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 10 20 30 40 50

Ab

sorb

an

cia

(n

m)

Concentración de aflatoxina (ppb)

Estándar

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

-10 0 10 20 30 40 50

Ab

sorb

an

cia

(n

m)


Muestras


18

Fig. 17: Curva de calibración de muestras control y muestras problemas.

DISCUSIÓN

En el presente estudio se determinó y cuantificó por medio de la técnica de ELISA

la concentración de aflatoxinas en diferentes lotes de alimentos balanceados para

ponedoras. La elección de esta técnica de detección de micotoxinas se fijó de acuerdo a la

disponibilidad de los kits y de la lectora, que fueron brindados por el Centro de

Investigación y Desarrollo de Fármacos (CIDEF) de la Facultad de Veterinaria (UNLPam).

Si bien Pineda Mejía et al. (2012) indican que, para la confirmación de los resultados

obtenidos aplicando ELISA, se requieren además otras técnicas, Fernández Surumay et al.

(2000) afirman que la determinación de aflatoxinas por el método espectrofotométrico

ELISA, resulta ser una técnica eficaz para la cuantificación de estas toxinas en materias

primas para alimentos balanceados, por su gran rapidez y sensibilidad, siendo capaz de

detectar niveles que oscilan entre 0,26 y 44 ppb de aflatoxinas.

Los resultados registrados en el presente trabajo evidencian la presencia de

aflatoxinas en el 77,8 % de las muestras de alimento balanceado para aves, de estas, el

71,5 % estuvo por encima del valor aceptado comercialmente, 12 ppb, según Lesson et al.

(1995).

Datos aportados para México por Flores Ortiz et al. (2006) establecen en sus

estudios que el 57 % de las muestras analizadas presentaron cantidades detectable de

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

-10 0 10 20 30 40 50

Abs

orba

ncia

(nm

)


Estándar

Muestras


19

micotoxinas y sólo el 11,2 % de las muestras revelaron niveles superiores a los

establecidos en las normas de regulación para micotoxinas.

Concentraciones de aflatoxinas por encima del valor permitido llegan a alterar en

las ponedoras la digestión de las proteínas y la absorción de los aminoácidos causando un

retraso en el crecimiento. La legislación mexicana y americana indican como nivel

máximo de tolerancia 20 ppb de aflatoxinas en alimentos para gallinas ponedoras (Verma

et al., 2003). Sin embargo Lesson et al. (1995) han descripto en su estudio que a partir de

los 8 ppb, estas toxinas producen hígado graso en ponedoras cuando se suministra por

varios días seguidos y provocan disminución de calcio, colesterol y triglicéridos

plasmáticos. Asimismo se ha observado una deficiencia en la respuesta inmunitaria,

dejando al organismo predispuesto a otras enfermedades y una disminución en la eficiencia

reproductiva, en la puesta y tamaño de los huevos, ingesta de alimento, tal como lo

detectan Chi Fang & Broomhead (2009), en USA, donde con pequeñas cantidades de

aflatoxinas en el alimento ya se ve afectado el rendimiento.

Durante el período de obtención de muestras, se observó que los sitios de

almacenamiento del balanceado que poseen los distintos proveedores de las muestras

estudiadas, no presentaban las condiciones necesarias para la conservación del alimento

tales como son baja temperatura ambiente, restricción de la humedad y buena aireación,

(Mallmann et al. 2007), situación que favorecería el desarrollo de micotoxinas (García et

al. 2012), como queda evidenciado en el presente estudio, acorde a los valores de

aflatoxinas detectados.

La suma de desaciertos ocasiona pérdidas económicas considerables a la industria

avícola, pone en riesgo la salud de los animales y constituye una preocupación para la

población consumidora de carne y huevo de pollo.

Se ha comprobado que estas toxinas se ligan al ADN, favoreciendo la aparición de

mutaciones, considerándose de esta forma a estos metabolitos secundarios como agentes

cancerígenos, teratógenos y mutagénicos. Los efectos tóxicos dependen tanto de la dosis

diaria como del tiempo de exposición a la misma.

Debido a que es imposible evitar en su totalidad la presencia de aflatoxinas, se han

desarrollado métodos físicos y químicos de detoxificación para destruir o inactivar las

aflatoxinas. Dentro de los métodos físicos se encuentran la extracción con solventes

orgánicos, la inactivación térmica, la irradiación y la adición de absorbentes. La

amoniación y el uso de peróxido de hidrógeno han sido empleados con éxito en la

destrucción química de las aflatoxinas (Dìaz, 1996).


20

Para la adopción de medidas de control, coincidiendo con Mallmann et al. (2007),

es necesario saber con exactitud el grado de contaminación existente, siendo

imprescindible la implementación de un programa de monitoreo de materias primas

destinada al consumo.

El control futuro del problema de micotoxinas en la economía avícola, dependerá

del desarrollo y ejecución de políticas adecuadas en el ámbito del manejo agrícola, y de los

sistemas de almacenamiento, que como se observa son el meollo de la cuestión.

CONCLUSIONES

-La investigación realizada a partir del análisis de muestras de alimento balanceado

para ponedoras en la ciudad de General Pico, La Pampa y los resultados alcanzados

permitieron aceptar la hipótesis planteada en el presente trabajo:

ü Se encontrarán alimentos balanceados con niveles de aflatoxinas

superiores al valor aceptable comercialmente de 12 ppb.

-Los datos obtenidos en el presente trabajo evidencian la presencia de aflatoxinas

en el 77,8 % de las muestras de alimento balanceado para aves.

-Del total de muestras el 55,6 % estuvo por encima del valor admisible

comercialmente (12 ppb).

-En las muestras analizadas 1a, 1b, 1c, 2b y 2c la concentración de aflatoxinas

sobrepasa el límite permitido. De ellas, sólo de la 1b y 2b se pudo conocer los posibles

ingredientes: granos de trigo, avena, cebada, maíz tratado por extrusión, afrechillo de trigo,

harina de carne y soja, poroto de soja desactivada, complementos vitamínicos y

macro/microminerales.

-La presencia de micotoxinas en las dietas suministradas a las aves puede

determinar pérdidas considerables en el sistema de producción avícola, al producir el

síndrome del hígado, como resultado de una acumulación excesiva de grasas cuando el

transporte de lipoproteínas se trastorna. El hígado es el principal sitio de la síntesis de

lípidos en las especies aviares, el cual es muy activo en las hembras adultas que están

produciendo huevos. También se puede observar una reducción en el peso de las

ponedoras, una disminución o inhibición total de la puesta de huevos como también una


21

merma en el tamaño de los mismos. Para poder evitar la presencia de estas toxinas o al

menos morigerar su desarrollo es necesario un monitoreo continuo de materias primas y

alimentos balanceados sumado a la adopción de medidas de control.

-Los resultados encontrados evidencian la necesidad de concientizar a los

productores y proveedores de alimentos balanceados a adoptar medidas en la producción y

almacenamiento de materias primas, como así también durante el proceso de elaboración y

almacenamiento del producto terminado hasta su consumo, para evitar la proliferación de

hongos productores de aflatoxinas.

-Las condiciones óptimas de transporte y almacenamiento garantizarán alimentos

libres no sólo de aflatoxinas sino también de otras micotoxinas que afectan, como hemos

descripto en esta tesina, la salud tanto de animales como de seres humanos.

RECOMENDACIONES

Es relevante aplicar programas para el control de aflatoxinas, con la finalidad de

suscitar un mayor conocimiento de la problemática originada por estos compuestos

tóxicos.

Asimismo sería importante implementar campañas para concientizar a los

proveedores de alimento balanceados y asegurarse que las instalaciones de

almacenamiento sean las adecuadas, para reducir al máximo la formación de micotoxinas.

Por último, es necesaria la realización de nuevas investigaciones que permitieran

profundizar los resultados obtenidos y progresar en el conocimiento sobre este tema en la

Pcia. de La Pampa. Es importante considerar algunas medidas a la hora de la toma de

muestras que permitan mejorar la representatividad del resultado del análisis de

micotoxinas, por ejemplo:

· Muestreos más amplios en cuanto a cantidad de muestras y departamentos

provinciales,

· Submuestreos, considerando que un gran número de productores elaboran sus propios

balanceados sin control de la materia prima.

· Análisis de un mayor número de muestras para obtener datos confiables

estadísticamente.


22

INVESTIGACIONES FUTURAS

Es importante realizar un estudio posterior para evaluar luego, la posible presencia

de aflatoxinas en pechuga, muslo e hígado de pollos faenados destinados al consumo

humano.

Considerando que muchas veces se completa el engorde de las aves utilizando

granos, es probable que, aún cuando los estudios en alimentos resulten negativos, se

detecten concentraciones en músculo de alguna de estas toxinas, contribuyendo de esta

forma al conocimiento de la contaminación de aflatoxinas en carne de pollo destinada al

consumo humano.


23

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27

INDICE GENERAL

Agradecimiento i

Resumen ii

Abstract ii

Índice de contenidos iv

Índice de tablas, figuras y láminas v

Introducción 1

1. Micotoxinas 2

2. Factores de crecimiento 8

3. Aflatoxicosis y la producción avícola 9

4. Riesgos para la salud humana 10

5. Estrategias de prevención y control 12

Hipótesis 13

Objetivo General 13

Importancia del estudio 13

Materiales y métodos 14

1. Obtención de la muestras 14

2. Preparación de las muestras/Extracción 14

3. Determinación de aflatoxinas 15

Resultados 16

Discusión 18

Conclusiones 20

Recomendaciones 21

Investigaciones futuras 22

Referencia Bibliográfica 23

Índice general 27

facultad de ciencias exactas y naturales … · aspergillus, penicillium y fusarium, en condiciones...

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