Edición Genómica: La tecnología CRISPR-Cas9 y su aplicación en enfermedades humanas

Patricia Hinojar Merín1, Elvira Román Gónzalez2

1Grado en Farmacia UCM, 2Departamento de Microbiología II, UCM

INTRODUCCIÓN

El sistema consta de dos componentes: •  Cas9: endonucleasa   más   ampliamente   estudiada   y   u1lizada   en   la  

tecnología   CRISPR.   Realiza   un   corte   de   doble   cadena,   que  posteriormente   es   reparado   por   recombinación   homóloga   (HDR)   o  recombinación  no  homóloga  (NHEJ)                    Para  realizar  el  corte,  Cas9  debe   hallarse   con1gua   a   la   secuencia   PAM   (NGG),   presente   en   la  secuencia  diana,  que  provoca  un  cambio  conformacional  en  la  enzima.  

•  gRNA: Complementario  a  la  secuencia  que  se  desea  modificar,  guía  a  Cas9  a  la  secuencia  diana.  

El   descubrimiento   del   sistema   CRISPR-­‐Cas9   y   su  aplicación  en  la  edición  genómica  ha  tenido  un  enorme  impacto   en   una   amplia   diversidad   de   áreas   de  inves1gación.   Actualmente,   representa   el   método  más  extendido   en   inves1gación   para   generar   modelos   de  ratón   que   recapitulen   la   patología   de   múl1ples  enfermedades   humanas.   La   versa1lidad,   eficacia   y  sencillez   del   sistema   a   la   hora   de   generar   dichos  modelos   experimentales,   ha   posibilitado   el   desarrollo  exponencial   de   estudios   aplicados.   Entre   ellos,   se  incluyen  aquellos  diseñados  para  el  ensayo  de  fármacos  

y/o   terapias   en   modelos   animales,   o   aquellos   que  aplican   la   edición   genómica   en   combinación   con   el  trasplante   autólogo   para   el   tratamiento   de  enfermedades   humanas.   En   el   presente   trabajo   se   ha  llevado   a   cabo   la   revisión   de   diversos   arVculos  relevantes   en   el   campo   de   la   inves1gación   clínica.   En  dicha   revisión   se   pone   en   relieve   el   alcance   y   la  importancia  de  los  resultados  obtenidos,  que  postulan  a  CRISPR/Cas9  como  el   futuro  de   la  edición  genómica  en  general,  y  de  la  terapia  génica  en  par1cular.    

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Modificado de Hsu, P.D. et al. (2014)

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OBJETIVOS Eficacia de CRISPR-Cas9 como método de edición genómica El  obje1vo  del  presente  trabajo  es  la  realización  de  una  revisión  bibliográfica  acerca  de  este  método  de  edición  génica,  mostrando  resultados  que  reflejan  la  eficacia  del  sistema  en  la  edición  de  células  en  cul1vo.  

Aplicación experimental y clínica de CRISPR-Cas9 en enfermedades humanas  Se  describen  varios  casos  representa1vos  de  la  aplicabilidad  de  este  sistema  para  el  estudio  y  tratamiento  de  enfermedades  de  diferente  naturaleza,  con  el  obje1vo  de  reflejar  la  versa1lidad  del  sistema.  

La   dependencia   del   sistema   en   los   sistemas   de   reparación   celulares   permite   la   introducción   de   inserciones   o  deleciones  (indels),  lo  que  diversifica  las  posibilidades  de  edición.  Se  ha  demostrado  que  Cas9  es  altamente  eficaz  en  la  introducción  de  indels  así  como  en  la  edición  bialélica.  

Descubrimiento  CRISPR   Primeras  evidencias  de  aplicación  en  edición  genómica  

Expansión  

ANTECEDENTES

RESULTADOS

BIBLIOGRAFÍA

Aplicación de CRISPR-Cas9 para el tratamiento de enfermedades infecciosas

Hemofilia A

Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV)

Beta Talasemia

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Causa de la enfermedad Síntesis anormal (o inexistente) de ß-globina componente esencial de la hemoglobina

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Componentes y funcionamiento de CRISPR-Cas9

Enfermedades víricas

Figura  3.3.  Ensayo  funcional  in  vivo  de  la  corrección  mediante  CRISPR-­‐Cas9  de  la  mutación  causante  de  la  enfermedad  en  el  gen  de  la  ß-­‐globina.    Células  procedentes  de  2  donantes  (sano/enfermo)  fueron  trasplantadas  en  un  modelo  murino  de  la  enfermedad.  El  ensayo  de  rescate  de  expresión  de  HBB  se  ensayó  en  3  grupos:  •  niPSCs:  células  procedentes  de  donante  sano.  •  ciPSCs:  células  procedentes  de  paciente  beta  talasemia  

corregidas  mediante  CRISPR.  •  piPSCs:  células  procedentes  de  paciente  beta  talasemia.  

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Aplicación de CRISPR-Cas9 para el tratamiento de enfermedades genéticas

Enfermedades hereditarias monogénicas

Causa de la enfermedad (Hemofilia severa) Inversión intrón 1/ intrón 22 gen F8 gen codificante para el Factor de coagulación VIII

Figura  3.1.  Corrección  de  la  inversión  parcial  del  gen  F8  (intrón1)  en  CMPIs  procedentes  de  un  paciente  de  Hemofilia  A.  Ensayo  de  endonucleasa  T7  para  RGEN01.  (b)  PCR  de  los  clones  modificados  por  CRISPR-­‐Cas9  y  sus  respec1vos  controles  posi1vo  y  nega1vo.  

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Figura  3.2.  Rescate   funcional  de   la  deficiencia  del   factor  VIII   en  modelo  murino  de  Hemofilia  mediante  uLlización  de  CMPIs   con  mutación  reverLda  por  CRISPR-­‐Cas9.  Compara1va  de  expresión  del  Factor  VIII  en  células  endoteliales  WT,  células  madre  inducidas  de  los  pacientes  1  y  2  (Pa-­‐1  y  Pa-­‐2)  y  células  madre  inducidas  tras  la  corrección  con  CRISPR  de  los  pacientes  1  y  2  (Pa1-­‐Co1  y  Pa2-­‐Co2).    La  modificación  por  CRISPR-­‐Cas9  de  la  mutación  en  el  gen  F8  en  células  procedentes  de  pacientes  enfermos  y  su  posterior  trasplante  en  un  modelo  murino  de  la  enfermedad  permi1ó  rescatar  el  feno1po  enfermo.     MODELO DE APLICACIÓN CLÍNICA DE CRISPR

Paciente

Bio-productos vía edición genómica

Mutación genética

CRISPR

CMPIs derivadas del paciente

Descubrimiento de fármacos

Doudna et al. (2014)

Figura  3.4.  Comparación  de  la  eficiencia  de  CRISPR  vs.  TALENs  para  la  edición  del  gen  CCR5.  Ensayo  de  PCR  sobre  clones  de  linfocitos  CD4+  humanos,  para  ambos  métodos  de  edición.  HR:  banda  de  referencia  de  proceso  de  reparación  del  ADN.  CCR5:  Banda  de  evaluación  de  la  eficiencia  de  la  edición  en  los  clones.  P:  Control  de  células  no  editadas.  (b)  Tabla  compara1va  de  la  eficiencia  (en  porcentaje)  de  CRISPR-­‐Cas9  y  TALEN  para  la  edición  de  CCR5  en  clones  de  linfocitos  CD4+.  

Observación de la enfermedad e hipótesis de partida: (CCR5Δ32 mutación natural) Pacientes con deleción de 32 pares de bases en CCR5 Resistentes a la infección

Ou et al. (2016)

Ye et al. (2014)

Figura  3.5.  Presencia  de  anSgeno  viral  p24  en  culLvos  de  linfocitos  CD4+  WT  o  modificados  mediante  CRISPR  tras  inocularlos  con  HIV-­‐1.  Se  muestra  la  concentración  de  p24  (pg/mL)  frente  al  1empo  post-­‐inoculación.  En  cul1vos  WT  se  observó  un  fuerte  incremento  en  la  carga  viral  mientras  que  la  modificación  del  receptor  en  las  células  editadas  impidió  la  propagación  viral.  

CONCLUSIONES •  El   sistema   CRISPR-­‐Cas9   ha   supuesto   una   revolución   en   la   Genómica   por   su   sencillez,   versa1lidad,   y   aplicabilidad  

sobre  cualquier  1po  de  célula.  •  En  la  terapéu1ca  moderna,  se  ha  demostrado  su  u1lidad  en  enfermedades  con  causas  muy  diferentes:  trastornos  

hereditarios,   procesos   infecciosos,   y   procesos   oncológicos,   a   través   de   la   combinación   del   sistema   con   la  metodología  del  trasplante  autólogo.  

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Park et al. (2016)

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