puesta a punto del sistema de edición genómica crispr/cas9

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Tesina de grado – Licenciatura en Ciencias Biológicas 2021Laboratorio de Interacciones Moleculares

Facultad de Ciencias – UDELAR

Tutor: Santiago ChávezCo-tutora: María Ana Duhagon

Puesta a punto del sistema de edicióngenómica CRISPR/Cas9 en Trypanosoma

cruzi

Bach. Selene Píriz

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Abreviaturas............................................................................................................................. 3Resumen................................................................................................................................... 6Introducción ............................................................................................................................. 7

1.1 Antecedentes ........................................................................................................71.2 De la mutagénesis a la edición genómica............................................................. 81.3 De las meganucleasas al CRISPR/Cas9 ............................................................ 11

1.3.1 Meganucleasas............................................................................................ 111.3.2 ZFNs y TALENs ........................................................................................... 111.3.3 CRISPR/Cas9 .............................................................................................. 12

1.3.3.1 CRISPR/Cas como sistema de inmunidad adquirida en bacterias yalgunas arqueas ............................................................................................... 131.3.3.2 Clasificación de los sistemas CRISPR/Cas9 ........................................ 141.3.3.3 Proteínas Cas9: SpCas9 vs SaCas9 .................................................... 161.3.3.4 Generación e introducción de los componentes del sistema en células.......................................................................................................................... 171.3.3.5 Ventajas del sistema CRISPR/Cas9..................................................... 191.3.3.6 Desventajas del sistema CRISPR/Cas9: off-targets y solucionespotenciales ....................................................................................................... 201.3.3.7 CRISPR/Cas como herramienta de edición genómica ......................... 221.3.3.8 Alcance y potencial de aplicación del sistema CRISPR/Cas9 .............. 23

1.4 Trypanosoma cruzi.............................................................................................. 24

Objetivos ................................................................................................................................ 262.1 Objetivo general ..................................................................................................262.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 26

Materiales y Métodos............................................................................................................. 273.1 SaCas9 ............................................................................................................... 27

3.1.1 Expresión de la proteína SaCas9 recombinante.......................................... 273.1.2 Electroforesis de proteínas: SDS-PAGE...................................................... 283.1.3 Purificación de la SaCas9............................................................................ 30

3.1.3.1 Preparación de la columna de níquel Ni2+: Stripping ........................... 303.2 ADN blanco ......................................................................................................... 31

3.2.1 Selección de genes blanco para cortar con la SaCas9................................ 313.2.2 Obtención de ADN blanco............................................................................ 31

3.3 SgRNA ................................................................................................................ 333.3.1 Diseño de sgRNAs....................................................................................... 333.3.2 Generación y purificación del ADN molde para la síntesis de los sgRNAs ..333.3.3 Transcripción In-Vitro (IVT) y purificación de sgRNAs .................................34

3.4 Evaluación de la actividad de la SaCas9 ............................................................ 35

Resultados ............................................................................................................................. 364.1 Expresión y purificación de la SaCas9................................................................ 364.2 ADN blanco ......................................................................................................... 39

Índice

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4.2.1 gp72 ............................................................................................................. 394.2.2 mNeonGreen ............................................................................................... 404.2.3 rbp38............................................................................................................ 41

4.3 Primer diseño de sgRNA..................................................................................... 434.4 Primer ensayo de evaluación del sistema........................................................... 444.5 Segundo diseño de sgRNAs ............................................................................... 46

4.5.1 gp72 ............................................................................................................. 474.5.2 rbp38 y mNeon ............................................................................................ 48

4.6 Segundo ensayo de evaluación del sistema ....................................................... 504.6.1 gp72 ............................................................................................................. 504.6.2 mNeon y rbp38 ............................................................................................ 53

4.6.2.1 mNeon ..................................................................................................534.6.2.2 rbp38 .................................................................................................... 55

Discusión................................................................................................................................ 585.1 Expresión y purificación de la SaCas9............................................................ 585.2 ADN blanco..................................................................................................... 605.3 sgRNA ............................................................................................................ 615.4 Ensayo de evaluación de la SaCas9 .............................................................. 61

Conclusiones y Perspectivas ............................................................................................... 64Agradecimientos.................................................................................................................... 66Referencias ............................................................................................................................ 67

8.1 Bibliográficas....................................................................................................... 678.2 Cibergráficas ....................................................................................................... 73

ANEXO .................................................................................................................................... 74

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• ADN: Ácido Desoxirribonucleico

• APS: Ammonium Persulfate (persulfato de amonio)

• ARN: Ácido Ribonucleico

• ARNi: ARN interferente

• ARNm: ARN mensajero

• C: Citosina

• Cas: CRISPR associated protein (proteína asociada a CRISPR)

• CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (repeticionespalindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas)

• crRNA: CRISPR RNA (ARN asociado al CRISPR)

• dCas9: Dead Cas9 (Cas9 catalíticamente inactiva)

• dsDNA: Double stranded DNA (ADN doble cadena)

• DSB: Double Strand Breaks (cortes doble hebra)

• E. coli: Escherichia coli

• EG: Edición Genómica

• fCas9: FokI-dCas9

• FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography (cromatografía líquida rápida de proteínas)

• FT: Flow Through (flujo continuo)

• FW primer: Forward primer (cebador directo)

• G: Guanina

• GFP: Green Fluorescent Protein (proteína verde fluorescente)

• HR: Homologous Recombination (recombinación homóloga)

• IPTG: Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido

Abreviaturas

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• IVT: In-Vitro Transcription (transcripción in-vitro)

• KO: Knockout (nocaut)

• L: Lavado

• MMEJ: Microhomology-Mediated End Joining (unón de extremos mediado pormicrohomología)

• MPM: Marcador de Peso Molecular

• NEB: New England Biolabs

• NHEJ: Non-Homologous End-Joining (unión de extremos no homólogos)

• Nuc: Nuclease lobe (lóbulo nucleasa)

• OD: Optical density (densidad óptica)

• OMS: Organización Mundial de la Salud

• ON: Over-Night (toda la noche)

• ORF: Open Reading Frame (marco abierto de lectura)

• PAM: Protospacer Adjacent Motif (Motivo adyacente a protoespaciador)

• PCR: Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa)

• PI: PAM Interacting lobe (lóbulo de interacción con el PAM)

• RBP: RNA-Binding Protein

• RE: Retículo Endoplasmático

• REC: Recognition lobe (lóbulo de reconocimiento)

• RGEN: RNA Guided Endonucleases (endonucleasas guiadas por ARN)

• RNP: Ribonucleoprotein (ribonucleoproteina)

• RV primer: Reverse primer (cebador reverso)

• RVD: Repeat Variable Diresidues (repetidos variables de diresiduos)

• SaCas9: Staphylococcus aureus CRISPR associated protein 9 (proteína 9 asociada aCRISPR de Staphylococcus aureus

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• SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (electroforesisen gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico)

• sgRNA: Single Guide RNA (ARN guía único)

• SpCas9: Streptococcus pyogenes CRISPR associated protein 9 (proteína 9 asociada aCRISPR de Streptococcus pyogenes)

• TALE: Transcription Activator Like Effector (efector activador de la transcripción)

• TALEN: Transcription Activator-Like Effector Nuclease (nucleasa de actividad similar aactivador de transcripción).

• T. cruzi: Trypanosoma cruzi

• TEMED: Tetramethylethylenediamine

• Tm: Temperatura de melting (Temperatura de fusión del ADN)

• tracrRNA: Trans-Activating CRISPR RNA (ARN transactivador asociado al CRISPR)

• tru-sgRNA: Truncated sgRNA (sgRNA truncado)

• UA: Unidades de Absorbancia

• ZFN: Zinc Finger Nuclease (nucleasa con dedos de zinc)

• ZFP: Zinc Finger Protein (proteína con dedos de zinc)

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Nuestra capacidad para manipular el ADN ha evolucionado recientemente, desde lamutagénesis, y la transgénesis, hasta las técnicas de edición genómica. CRISPR/Cas es unsistema de edición genómica en donde una nucleasa, generalmente la Cas9, es llevada a susitio blanco, mediante un ARN pequeño, llamado ARN guía, que presenta complementariedadde bases con el ADN que será cortado por la nucleasa. CRISPR/Cas9 puede ser programadopara desempeñar varias funciones como la generación de inserciones y deleciones, edicionesendógenas, activación o represión de la expresión génica, y visualización de ubicacionesgenómicas específicas. El sistema CRISPR/Cas9 se ha aplicado en diversos organismos,desde bacterias, plantas, animales, e incluso humanos, con diferentes fines. Se ha visto quetambién tiene el potencial para ayudarnos a entender los elementos que están involucradosen las interacciones parásito-hospedador, lo que podría ayudar en el desarrollo de un nuevofármaco, que mitigue o erradique la enfermedad que provocan. Sin embargo, no siempre esfácil la manipulación genética de los parásitos, como en el caso de Trypanosoma cruzi (T.cruzi), debido a la baja eficiencia que se consigue con los protocolos de manipulación deADN, la complejidad de su genoma, y el gran tiempo generacional que se requiere para laselección de parásitos transfectados de manera estable. Últimamente se ha visto que lautilización de del sistema CRISPR/Cas9 puede mejorar ampliamente la manipulación génicaen T. cruzi. Por estas razones, en este trabajo se propone poner a punto parte de la estrategiade edición genómica mediada por el complejo Cas9/sgRNAs sintetizados in-vitro, para genesexpresados en T. cruzi. Utilizando como referencia el protocolo de diseño publicado para elknockin del gen gp72 de T. cruzi, para evaluar la eficiencia del corte mediado por loscomponentes producidos en el laboratorio, aportando una nueva herramienta de manipulacióngenética para el trabajo con dicho parásito. El sistema CRISPR/Cas9 producido y puesto apunto en el laboratorio de manera in-vitro mostró una gran eficiencia. Se demostró que loscomplejos ribonucleoproteícos (RNP) de SaCas9-sgRNA indujeron cortes de doble hebraeficientes en los tres genes evaluados in-vitro (gp72, rbp38 y mNeonGreen). En estudiosfuturos con el fin de validar la eficacia in-vivo del sistema generado en el laboratorio, seríanecesario realizar la transfección de los complejos RNP a los parásitos de T. cruzi. Este trabajoademás sirve como punto de partida para comenzar a entender el rol biológico de una proteínade unión a ARN (RBP) de T. cruzi. El uso del CRISPR/Cas9 para realizar KO en genes deRBPs, comenzará a abrir una nueva era en los estudios de regulación de la expresión génicade este parásito humano. La amplia variedad de aplicaciones que ofrece el sistema de edicióngenómica CRISPR/Cas9 en conjunto con la facilidad de producción de complejos RNP, abreun gran abánico de posibilidades a los investigadores que trabajan en la manipulacióngenética de T. cruzi y otros kinetoplástidos.

Resumen

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Introducción

1.1 Antecedentes

Más de 60 años han pasado desde la elucidación de la estructura de doble hélice del ADN.Desde entonces, ha aumentado considerablemente el conocimiento que se tiene sobre estamolécula almacenadora de la información genética. Sin embargo, los intentos por modificar elADN son incluso previos a la descripción de su estructura. De hecho, técnicas de mutagénesisinducidas por agentes físicos, como los rayos X (Muller, 1927) o químicos (Auerbach, C.;Robson, J. M.; Carr, 1947) fueron desarrolladas previamente. Estas fueron útiles como puntosde partida para la búsqueda de métodos sensibles capaces de generar y detectar mutaciones.A partir de aquí, la ambición de los investigadores por modificar la molécula de ADN haaumentado considerablemente. En ese intento por conseguirlo, surgió una disciplina que hoydía se conoce como ingeniería genética. Este campo surge en el contexto de grandes avancesmetodológicos en el área de la biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa(PCR, Polymerase Chain Reaction) y el desarrollo de las tecnologías de ADN recombinante,que permitieron aislar genes y fragmentos génicos, y también introducir alteraciones en losmismos, tanto en sistemas in-vitro, como en cultivos celulares y organismos modelos (Doudna& Charpentier, 2014). La ingeniería genética reúne diversas herramientas y técnicas quepermiten realizar adiciones, deleciones y otras alteraciones al ADN de forma muy precisa. Entrelas primeras aplicaciones que surgen está la de modificar, o corregir, genes responsables dealteraciones funcionales en los seres vivos (Santillán-Doherty et al., 2020). Estasmodificaciones genéticas se han utilizado para brindar aplicaciones biotecnológicas en muydiversos campos, como la agricultura, ganadería, medicina humana y animal. Nuestracapacidad para manipular el ADN ha ido rápidamente evolucionando en estos años, desde lamutagénesis química ó física, pasando por la transgénesis, hasta llegar a lo que hoy día seconoce como técnicas de edición genómica.

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1.2 De la mutagénesis a la edición genómica

Una mutación se define como un cambio heredable en el material genético de un organismo.Dicho cambio puede presentarse de diferentes formas: como una alteración puntual de lasecuencia de un gen; como reorganización de regiones del genoma; como ganancias opérdida de fragmentos de un cromosoma; o incluso, como cambios en el número decromosomas. Las mutaciones pueden darse en células germinales y esto llevará a que loscambios sean heredados a la siguiente generación. También podrían generarse en célulassomáticas y en este caso no serán heredables, sino que se mantienen en el organismo pormitosis y darán lugar a la aparición de ciertas enfermedades genéticas adquiridas, como elcáncer. Sin embargo, no todas las lesiones en el ADN establecerán una mutación, ya que lascélulas cuentan con mecanismos de reparación que se encargan de mantener la integridadde la información genética. Durante la década del 60, frente a la observación de que laexposición de las personas a ciertos agentes (posteriormente denominados mutagénicos) serelacionaba a cambios hereditarios en sus genomas, muchos laboratorios se dedicaron adesarrollar métodos para detectar y manipular la mutagenicidad de diferentes agentes. Es asíque la mutagénesis se convierte en una técnica muy utilizada para generar modificaciones enel ADN. No obstante, aunque hoy en día estas metodologías se continúan utilizando, seprefiere recurrir a otras tecnologías por varios motivos como el alto riesgo al que se exponíael operario. Por otra parte, no se podía dirigir con exactitud las mutaciones, y esto llevaba aun arduo trabajo de screening de los mutantes generados para identificar uno en el cual lamodificación se haya generado en el gen de interés, e incluso de esta forma no se garantizabaque hubiera mutaciones no intencionadas (off-target) en otros genes. Sin embargo, el trabajoen mutagénesis sirvió como puntapié para el desarrollo de otra de las técnicas de modificaciónde secuencias de ADN: la transgénesis (Weeks et al., 2016). La transgénesis consiste en laintroducción de ADN, proveniente de un organismo de cierta especie (organismo donante), enotro de una especie diferente (organismo aceptor), y esto implicó un gran salto desde el puntode vista biotecnológico (Fort, 2018). A diferencia de la mutagénesis, en este caso se introduceun fragmento de ADN (transgén) que confiere alguna ventaja al organismo aceptor, en lugarde generar una mutación, la cual se espera en principio que elimine o le brinde una funciónal gen que la porte, sin embargo el efecto que produce esta modificación no se puede predecircon facilidad. De todas formas, la transgénesis implica en muchas ocasiones la inserción delADN en forma aleatoria en el genoma del organismo aceptor, aprovechándose de losmecanismos celulares de reparación del ADN (Fort, 2018; Ziemienowicz, 2010). En estesentido la transgénesis también puede provocar efectos no intencionados (off-targets), que seexplican en este caso por los efectos secundarios que genera la inserción del transgén en elgenoma. Dependiendo del sitio de inserción puede causar una mutación en un gen o enregiones reguladoras del mismo, lo que puede resultar en pérdida o ganancia de función nobuscadas. (Fort, 2018; Ziemienowicz, 2010). Es probable que se incorporen al genoma unnúmero variable de copias del transgén, incluso con variabilidad en la integridad de lasdiferentes copias. Esto va a influenciar tanto la estabilidad del locus como el nivel de expresióndel transgén. Por un lado, la introducción de muchas copias del transgén debería ocasionarun alto nivel de expresión génica, sin embargo, se ha observado que un exceso de copiaspuede llevar al silenciamiento del locus, o a provocar la pérdida de los mismos debido arearreglos entre las copias. (Fort, 2018). Al mismo tiempo, se debe considerar el efecto deposición, donde la presencia de promotores o elementos reguladores cercanos al sitio deinserción pueden influenciar la expresión del transgén, incluso también la estructura de lacromatina en esa región del genoma puede tener grandes efectos (Fort, 2018; Ziemienowicz,2010). En los últimos años la incorporación de las metodologías de transgénesis generó

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desarrollos biotecnológicos en áreas variadas, como salud humana y agronomía, donde enparticular ha tenido un alcance tal que gran parte de los alimentos que consumimos hoy díacorresponden a organismos genéticamente modificados por transgénesis. Aun así,considerando las desventajas mencionadas acerca de la transgénesis y mutagénesis surge lanecesidad de desarrollar y utilizar otros mecanismos capaces de modificar el ADN, de unaforma más controlada y/o dirigida. En este contexto, nacen las técnicas de edición genómica(EG), que están basadas en la generación de cortes sitio-específicos en la doble hebra delADN (Double-Strand Breaks, DSBs). Estos cortes en el genoma desencadenan las vías dereparación del ADN, y gracias al avance en el entendimiento de estos mecanismos celularesse ha logrado aprovecharlos y utilizarlos tanto para introducir mutaciones puntuales como paraincorporar o eliminar fragmentos de ADN (Zhang et al., 2014). Existen dos vías principales dereparación del ADN que actúan frente a la presencia de DSB, la de unión de extremos nohomólogos (Non-Homologous End-Joining, NHEJ) y la de recombinación homóloga(Homologous Recombination, HR). La reparación por NHEJ implica generalmente lareparación imperfecta de la región donde se introdujo el DSB, se fuerza la ligación de lashebras del ADN en ausencia de una referencia o molde y frecuentemente se pierdeinformación en el proceso. En cambio, la reparación por HR, apela, como su nombre lo indica,a la utilización de un ADN molde que presenta homología con la región donde ocurrió el DSB.Mediante la HR es posible introducir modificaciones específicas en el locus blanco, pero esnecesario contar con un molde de ADN que posea sitios de homología que flanqueen el lugardel corte. (Burle-Caldas et al., 2018). Figura 1.

Figura 1. Los cortes sitio específicos de doble hebra (Double-strand breaks, DSB) pueden ser reparadospor el mecanismo de unión de extremos no homólogos (Non-Homologous End Joining, NHEJ) o porrecombinación homóloga (Homologous Recombination, HR). a) La reparación por NHEJ usualmentegenera inserciones (verde) o deleciones (rojo) de pares de bases al azar, ocasionando un knockout (KO)génico. b) La HR junto con un donante de ADN puede ser utilizado para modificar un gen introduciendouna sustitución de nucleótidos precisa o c) para generar una inserción génica. Imagen adaptada deBortesi & Fischer, 2015.

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La EG a diferencia de la transgénesis y de la mutagénesis es una técnica dirigida que permitedefinir con más precisión y control el sitio donde se realizará la modificación del ADN (Doudna& Charpentier, 2014; Sternberg et al., 2014; Jinek et al., 2012;). Esto ha llevado a que mediantela implementación de técnicas de EG sea posible generar cambios en secuencias específicasdel ADN con alta eficiencia (Ran et al., 2013) y limitando el número de modificaciones enregiones no intencionadas (Fort, 2018; Vincelli, 2016). Las aproximaciones de EG se basan enutilizar endonucleasas capaces de reconocer una región específica del ADN y generar el DSBpara desencadenar las vías de reparación celular. Entre las primeras proteínas utilizadas estánlas meganucleasas, cuya especificidad reside en la propia enzima, por lo que es necesarioutilizar diferentes enzimas para cada ensayo de generación de DSB que se realice. Como partede este grupo de enzimas se incluyen las nucleasas con dedos de Zinc (ZincFinger Nucleases,ZFNs), donde cada dominio dedo de zinc reconoce 3pb, y por lo tanto la especificidad de estesistema reside en la combinación modular de estos dedos. El otro grupo de nucleasas son lasconocidas como de actividad similar a activadores transcripcionales (Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALENs), en las que se fusionan dominios de unión al ADN con 3dominios endonucleasa, para dirigir los DSB hacia secuencias específicas en los genomas(Cong et al., 2013). Por último, se incorporó el sistema CRISPR/Cas9 (Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) al repertorio demetodologías de EG. Esta aproximación proviene de la adaptación del sistema inmuneCRISPR/Cas de tipo II de bacterias y algunas arqueas contra virus y plásmidos exógenos (Kooet al., 2015; Hsu et al., 2014; Gasiunas et al., 2012; Jinek et al., 2012).

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1.3 De las meganucleasas al CRISPR/Cas9

Los sistemas de edición genómica se pueden clasificar en dos grandes grupos según lanaturaleza de la molécula encargada del reconocimiento de la secuencia blanco en el ADN(Khan, 2019). Por un lado, los sistemas basados en proteínas quiméricas como lasmeganucleasas, las ZFNs y las TALENs. Por otro lado están los sistemas basados encomplejos ARN-proteínas (RNA Guided Endonucleases, RGENs), en donde la molécula deARN es la que lleva a cabo el reconocimiento específico de la secuencia blanco. Dentro deeste grupo se incluye el sistema CRISPR/Cas9.

1.3.1 Meganucleasas

Son proteínas de gran tamaño correspondientes a una amplia familia de nucleasas ADN,conocidas como “homing endonucleases”, encontradas en fagos, bacterias, arqueas y varioseucariotas (Stoddard, 2011; Epinat et al., 2003). Se ha visto que DSB inducidos pormeganucleasas permiten una eficiente selección del gen blanco tanto en modelos mamíferoscomo plantas e insectos (Epinat et al., 2003). Trabajar con estas nucleasas presenta unalimitación, dado que el locus blanco debe contener un sitio de reconocimiento para alguna deestas enzimas, las cuales son capaces de reconocer ciertos sitios de entre 12 y 45 pares debases cada una. Por lo que, en todas las aplicaciones que se pretenda utilizar esta herramientase requiere la presencia de un sitio de corte específico para alguna nucleasa (Epinat et al.,2003).

1.3.2 ZFNs y TALENs

Tanto las ZFNs como las TALENs cuentan con un dominio endonucleasa común derivado dela enzima de restricción FokI del tipo IIS, pero difieren en el dominio de unión al ADN quepresentan (Khan, 2019; Koo et al., 2015). Las ZFNs emplean dedos de zinc, mientras que lasTALENs utilizan TALEs (Transcription Activator Like Effectors) o efectores tipo TAL. Se havisto que estos dominios pueden ser modificados para generar la interacción con diferentessecuencias blanco en el ADN (Koo et al., 2015).Los dominios dedos de zinc son uno de los motivos estructurales más reconocidos para lasinteracciones proteínas-ácidos nucleicos en eucariotas. Estos fueron descubiertos por primeravez en el factor de transcripción IIIA de Xenopus (Pavletich & Pabo, 1991). Debido a lacapacidad de los dedos de zinc de interactuar con el ADN, Kim y colaboradores propusieronque resultaría de gran utilidad fusionar estos dominios a dominios nucleasas del tipo FokI paradirigir DSB a regiones del genoma de un modo secuencia-especifico (Y.-G. Kim et al., 1996).Las ZFNs contienen dedos de zinc del tipo Cys2-His2 como dominios monoméricos de uniónal ADN (ZFP) (Zhang et al., 2014). Dado que FokI necesita encontrarse en forma de dímeropara actuar, son necesarios dos monómeros ZFP para generar la nucleasa activa.Considerando que cada dedo de zinc es capaz de reconocer 3 pares de bases dentro de lasecuencia de ADN, de la combinación de diferentes dedos de zinc se puede generar enzimasquiméricas capaces de identificar secuencias de ADN de diferente largo (Figura 2a). Sinembargo, dado que la capacidad de reconocimiento es limitada a secuencias relativamentecortas, es muy común que las ZFNs introduzcan DSBs en regiones diferentes a la buscada.De esta forma se incorporarán modificaciones off-target que pueden ocasionar efectoscitotóxicos (Koo et al., 2015).Las nucleasas del grupo TALEN presentan dominios tipo TAL para el reconocimiento del ADN

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que son derivados de una proteína natural presente en bacterias patógenas de plantas delgénero Xanthomonas spp (Zhang et al., 2014). Estos dominios TAL se componen por motivosrepetidos de 33-35 aminoácidos conservados, donde cada uno es capaz de reconocer unnucleótido específico (Zhang et al., 2014). La especificidad de nucleótidos de cada dominiorepetido se debe a dos aminoácidos ubicados en las posiciones 12 y 13, conocidos comoRVDs (Repeat Variable Diresidues) (Kim & Kim, 2014). Por ello, las TALEN pueden serdiseñadas para identificar casi cualquier secuencia de ADN, otorgando a este sistema unamayor versatilidad comparado a las nucleasas ZFN (Koo et al., 2015) (Figura 2b). En general,las TALENs, a comparación de las ZFNs no son citotóxicas, aunque también son capaces degenerar mutaciones off-target (Koo et al., 2015) . Los efectos de estas mutaciones puedenevitarse eligiendo secuencias blanco únicas, que difieran en al menos 7 nucleótidos decualquier otro lugar del genoma (Koo et al., 2015; Y. Kim et al., 2013).

1.3.3 CRISPR/Cas9

El sistema CRISPR/Cas9 se trata de un RGEN, en donde la nucleasa, generalmente la Cas9,es llevada a su sitio blanco, mediante un ARN pequeño, llamado ARN guía único (single guideRNA, sgRNA), que presenta complementariedad con el ADN que será clivado por la nucleasa(Figura 2c).

Figura 2. Nucleasas de diseño para edicióngenómica / reemplazo génico. a) Nucleasas condedos de zinc (ZFNs) reconocen secuencias deADN blanco mediante tres proteínas del tipo dedosde zinc, cada una de las cuales reconoce tresnucleótidos, por lo que los ZFN proveen unaespecificidad de 9 nucleótidos. El dominio nucleasade la enzima de restricción FokI se une al C-terminalde cada ZFN, y dos ZFNs se unen a las dos hebrasdel ADN. El espacio existente entre los dos ZFNpermite que los dominios FokI se dimericen ygeneren el DSB. b) Las nucleasas efectoras de tipoTAL (TALENs), cuentan con la enzima FokI comodominio nucleasa, pero como dominio dereconocimiento utilizan un arreglo en tándem de 16o más dominios proteicos idénticos, de 34aminoácidos cada uno. Los repetidos pueden sersintetizados para que reconozcan cualquiersecuencia de ADN. Utilizando dos TALENs quereconozcan ambas hebras del ADN, los dominiosFokI unidos a los efectores TAL pueden dimerizarsey generar el DSB. c) El sistema CRISPR/Cas9 sebasa en la unión de la nucleasa Cas9 a la secuenciade ADN blanco, mediante la dirección de un ARN.Una secuencia de ARN de 20 nucleótidos se hibridamediante complementariedad de bases a lasecuencia de ADN blanco, esta interaccióndesencadena cambios conformacionales en elcomplejo sgRNA/Cas9, lo que activa dos dominiosCas9 independientes y por consiguiente lageneración de un DSB. Imagen adaptada deWeeks et al., 2016.

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1.3.3.1 CRISPR/Cas como sistema de inmunidad adquirida en bacterias y algunasarqueas

El arreglo de secuencias repetidas cortas separadas por espaciadores provenientes de ácidosnucleicos invasores se conoce como loci CRISPR. Los arreglos CRISPR fueron por primeravez identificados en el genoma de Escherichia coli (E. coli) en 1987 (Y. Ishino et al., 1987),sin embargo, su función biológica no fue entendida sino hasta 2005, cuando los grupos deBolotin, Mojica y Pourcel demostraron que los espaciadores eran homólogos a secuencias deADN provenientes de bacteriófagos y plásmidos exógenos, lo que sugería un rol en lainmunidad adaptativa (Bolotin et al., 2005; Mojica et al., 2005; Pourcel et al., 2005). En 2007se confirmó que bacterias y ciertas arqueas eran capaces de desarrollar una respuesta inmuneadaptativa, a través del locus CRISPR, frente al ataque de fagos y de ADN exógenoproveniente de algunos plásmidos conjugados (Barrangou et al., 2007), mediante el clivadodependiente de secuencia del ADN foráneo. El sistema CRISPR más utilizado es el de tipo IIde Streptococcus pyogenes. En este, la inmunidad es adquirida por la integración depequeños fragmentos del ADN invasor conocido como espaciador, que se ubica entre dosrepetidos adyacentes en el extremo proximal del locus CRISPR. Esto se conoce comoadaptación en el proceso de inmunidad adquirida (Figura 3a). El arreglo CRISPR, incluyendolos espaciadores, se transcriben dando lugar a un primigenio pre-crRNA que durante losencuentros subsecuentes con el ADN invasor, son procesados en pequeños CRISPR RNAsinterferentes (crRNAs) de aproximadamente 40 nucleótidos de largo (Deveau et al., 2010), loscuales se combinan con el ARN transactivador (tracrRNA) para activar y guiar a la Cas9. Estodesencadena el paso de interferencia, donde se cliva el ADN doble hebra homólogo al crRNA,secuencia que en el ADN invasor se conoce como protoespaciador (Bortesi & Fischer, 2015)(Figura 3b).

Figura 3. Proceso del sistema inmune adaptativoCRISPR/Cas. a) Adaptación. EL ADN invasor esreconocido por las proteínas Cas, posteriormente esfragmentado e incorporado en la región espaciadora dellocus CRISPR, y almacenado en el genoma bacteriano. b)Expresión. Se generan pre-crRNA mediante transcripciónde la región CRISPR y son procesados en pequeñasunidades de ARN, conocidas como crRNA. Interferencia.El ADN foráneo es capturado debido a la homología quepresenta con la secuencia contenida en el crRNA y ademáses fraccionado gracias a una endonucleasa Cas (Cas9) quecliva el ADN. Imagen adaptada de Ishino et al., 2018.

a)

b)

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1.3.3.2 Clasificación de los sistemas CRISPR/Cas9

Existen varias clases de sistemas CRISPR/Cas que muestran gran diversidad en cuanto acomposición de proteínas Cas, así como también en la arquitectura genómica del loci CRISPR(Makarova et al., 2018). Según Shmakov et al., 2015 las proteínas Cas pueden agruparse endos módulos funcionales principales: por un lado el módulo de adaptación, el cual incorporamaterial genético en el loci CRISPR, para generar posteriormente los CRISPR ARNs(crRNAs); por otro lado está el módulo efector o de interferencia, el cual guiado por el crRNA,reconoce y cliva la/las secuencia/s de ADN foráneo. Los módulos de adaptación son uniformesentre los sistemas CRISPR-Cas, y consisten en dos proteínas esenciales, Cas1 y Cas2. Sinembargo, el módulo efector, presenta mucha variabilidad. Existe una clasificación que dividea los sistemas CRISPR/Cas en dos clases, según la arquitectura de los módulos efectores. Laclase I, involucra a los sistemas CRISPR/Cas tipos I y III, los cuales cuentan con complejosefectores con muchas subunidades y diversas proteínas Cas. En cambio, la clase II, incorporaal sistema CRISPR/Cas tipo II, que se caracteriza por poseer complejos efectores con unaproteína Cas grande y única. La proteína efectora del sistema CRISPR/Cas tipo II es la Cas9,una gran nucleasa multi dominio, que varía de tamaño dependiendo la especie entre 950 a1600 aminoácidos (Shmakov et al., 2015). La nucleasa Cas9 se asocia a dos ARNs nocodificantes: el crispr ARN (crARN) y el ARN transactivador (transactivating crispr ARN,tracrARN). Ambos ARN se producen a partir del locus CRISPR. Los crARN se transcribencomo pre-crARN y se procesan para dar lugar a pequeños ARNs que poseencomplementariedad de secuencia con regiones específicas de ácidos nucleicos, previamentedetectados por el microorganismo en una infección. El tracrARN se une al crARN brindándoleestabilidad al dúplex crARN-tracrARN, y permitiendo a su vez, la unión con la Cas9 paraguiarla a su sitio blanco, donde debe llevar a cabo su función endonucleasa. El tracrARNademás participa en el procesamiento del pre-crARN. Es muy importante que próxima a lasecuencia de ADN blanco de la Cas9 exista lo que se conoce como motivo PAM (ProtospacerAdjacent Motif). (Figura 4 y 5a). El PAM es una pequeña secuencia de nucleótidos ubicadosen la región 3’ de la hebra de ADN blanco, a pocos nucleótidos de la secuencia diana, y no seune al ARN guía. El PAM permite que la Cas9 genere el clivaje específico de secuencia en elADN, luego de la formación del complejo DNA-Cas9 y de la separación de las hebras de ADN,para que la Cas9 y el ARN guía se desplacen rio arriba para encontrar su diana (Sternberg etal., 2014). Es importante recalcar, que el PAM se encuentra en el ADN y no en la secuenciade la Cas9 o en los ARNs a los que se asocia la proteína, y que sin esta secuencia, la Cas9no podrá cortar el ADN, por más que el complejo de ARNs la hayan guiado hasta allí. El motivoPAM varía según el organismo al cual pertenezca el sistema CRISPR/Cas9, e.g. el PAM quereconoce la Cas9 de Streptococcus pyogenes [uno de los primeros grupos de bacterias enque se localizó el sistema (Mojica et al., 2005)] por lo general es un 5’-NGG-3’ rio abajo de lasecuencia blanco. El sistema CRISPR/Cas clase II, tipo II, es el que se ha utilizadomayormente como herramienta de EG. Aunque, a efectos de poder utilizarlo de una maneramás sencilla, en cuanto a la generación de las construcciones en el laboratorio, el sistematradicional fue modificado, de tal forma que se logró que el crRNA y el tracrRNA formaran unaúnica molécula de ARN híbrida, una quimera denominada ARN guía o sgRNA (single guideRNA) (Nishimasu et al., 2014; Doudna & Charpentier, 2014; Sternberg et al., 2014; Jinek etal., 2012).). El sgRNA mantiene las características claves del dúplex crRNA:tracrRNA, lasecuencia de 20 nucleótidos que en su extremo 5’ hibrida con el protoespaciador ubicado enel ADN y la estructura bicatenaria en la región 3’ que facilita la unión entre el sgRNA y la Cas9(Doudna & Charpentier, 2014; Jinek et al., 2012). La Cas9 es guiada por el sgRNA a unaubicación específica dentro del genoma blanco gracias a la hibridación producida por

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complementariedad de bases entre el ARN guía y el ADN blanco. Una vez que la Cas9reconoce el PAM dentro de la secuencia de ADN a la que fue guiada, genera un clivajeespecífico que será reparado principalmente por la NHEJ o por la HR. (Figura 5b). Para quese active la última vía, como se mencionó anteriormente, debe incorporarse un ADN moldeque tenga secuencias de homología que flanqueen el lugar del clivaje. La presencia de estemolde de ADN, permite entre otras cosas, la introducción de secuencias “tag” dentro de laproteína blanco, la generación de mutaciones que producen cambios en el marco abierto delectura, cambiando aminoácidos o introduciendo codones stop que interrumpen la regióncodificante blanco (Burle-Caldas et al., 2018).

Figura 4. Mecanismos naturales de adquisición de inmunidad adaptativa mediante sistemasCRISPR/Cas microbianos. El arreglo CRISPR es un transcripto de ARN no codificante queenzimáticamente madura mediante diferentes vías que son únicas para cada tipo de sistema CRISPR.En los tipos I y III, el pre-crRNA es clivado por las ribonucleasas asociadas a CRISPR, dando lugar amúltiples crRNAs pequeños. En el sistema tipo II, un ARN trans-activador asociado a CRISPR(tracrRNA) se hibrida con los crRNAs, formando un ARN quimérico, que es clivado y procesado por laARNasa III endógena, y otras nucleasas. Los crRNAs de los sistemas tipo I y III son cargados encomplejos proteicos efectores para el reconocimiento y degradación del blanco. En el sistema tipo I, elcomplejo cascada es cargado con crRNAs, constituyendo un complejo de vigilancia catalíticamenteinerte que reconoce el ADN blanco. Luego la Cas3 es reclutada, y lleva a cabo la degradación delblanco. En el sistema tipo III, los crRNAs se asocian al complejo Csm o al complejo Cmr que unen yclivan el ADN y el ARN blanco respectivamente. En sistemas tipo II, el complejo quimérico de ARNsjunto con la proteína Cas9 llevan a cabo la interferencia. Por lo que este sistema sólo requiere la Cas9para degradar el ADN, mediante su unión con el ARN guía (híbrido de crRNA-tracrRNA). Imagenadaptada de Hsu et al., 2014.

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Figura 5. a) ARN guía formado por dúplex crRNA:tracrRNA. b) ARN guía quimérico, formado a partirde la fusión del crRNA y el tracrRNA, mediante un lazo de unión. Véase la presencia y posición delPAM. Imagen adaptada de Doudna & Charpentier, 2014.

1.3.3.3 Proteínas Cas9: SpCas9 vs SaCas9

Streptococcus pyogenes fue el organismo en que se dilucidó el sistema CRISPR/Cas tipo IIpor primera vez (Mojica et al., 2005). La endonucleasa Cas9 de este organismo (SpCas9)posee aproximadamente 160kDa y es parte de la familia de proteínas Cas de bacterias. Losestudios cristalográficos de esta proteína mostraron que la misma cuenta con dos lóbulos,uno de reconocimiento (REC) y otro con función nucleasa (NUC) (Nishimasu et al., 2014). Esposible dividir el lóbulo REC en tres regiones, una región de “hélice puente” rica en arginina,un dominio REC1 y otro REC2 (Nishimasu et al., 2014). El lóbulo REC reconoce al ARN guíae interactúa con el dúplex repetido:antirepetido, que es crítico para la función de la Cas9(Nishimasu et al.,2014). El lóbulo NUC cuenta con los dominios RuvC, NHN y PI o PAMinteracting. Los dominios RuvC y HNH reciben su nombre debido a la homología quepresentan con dominios estructurales de nucleasas conocidas, y son responsables del clivajede las hebras del ADN. RuvC se divide en tres subdominios desde la región N- terminal dondese localiza el subdominio RuvC I hasta aproximadamente la mitad de la proteína donde sesitúan, a ambos flancos del dominio HNH, los subdominios RuvC II y III (Hsu et al., 2014).HNH es un único dominio nucleasa. RuvC cliva la hebra de ADN que no es blanco del ARNguía, mientras que HNH cliva la hebra blanco. El dominio PI se une al ADN rio abajo de lasecuencia PAM, y determina la especificidad de la Cas, convirtiéndolo en uno de loscomponentes más importantes para poder llevar a cabo la actividad enzimática. Elheterodúplex ARN:ADN blanco, negativamente cargado, se acomoda en un surco cargadopositivamente entre los lóbulos REC y NUC (Dai et al., 2018; Shults, 2016; Nishimasu et al2014).Se logró caracterizar y aislar ortólogos de la SpCas9, en cuanto a la extensión de su secuenciaaminoacídica, encontrándose Cas9 con tamaños de entre 900 y 1600 aminoácidos. Ladiferencia de tamaños de las Cas9 recae en el lóbulo REC. Sin embargo, la arquitectura desus dominios es muy similar y comparten regiones muy conservadas en los dominiosnucleasa. De esta forma, se han encontrado Cas9 provenientes de otros organismos comoStaphylococcus aureus (SaCas9), que se utiliza para la edición de genomas eucariotas(Nishimasu et al., 2015; Ran et al., 2015). La SaCas9 comparte sólo un 17% de identidad desecuencia con la SpCas9, lo que destaca las variaciones estructurales y funcionales entreortólogos dentro de los sistemas CRISPR/Cas9 (Nishimasu et al., 2015). SaCas9 cuenta con1053 residuos de aminoácidos, mientras que la SpCas9 posee 1368, esto se traduce en quela SaCas9 es aproximadamente 40kDa más pequeña que la SpCas9 (Medeiros et al., 2017;

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Nishimasu et al., 2015). La SpCas9 reconoce una secuencia PAM 5’-NGG-3’, mientras que elmotivo PAM que suele reconocer la SaCas9 es 5’-NNGRRT-3’ (representando R a las purinasadenina o guanina). (Figura 6). A pesar de estas diferencias, la SaCas9 puede editar genomascon eficiencias similares a la SpCas9, pues al ser más pequeña, hace más fácil su introducciónen tejidos somáticos (Nishimasu et al., 2015; Ran et al., 2015), y en organismos eucariotasunicelulares que presentan limitaciones en la introducción de proteínas y complejosribonucleoprotéicos (RNP) debido a su gran tamaño, esto es lo que sucede en el parásitoTrypanosoma cruzi. Hay estudios que demuestran que la eficiencia de edición del genoma deT. cruzi con SaCas9 es mayor que con los complejos RNP de SpCas9 que son más grandes(Medeiros et al., 2017).

Figura 6. Comparación y estructura cristalográfica de SaCas9 y SpCas9. La SaCas9 posee 1053aminoácidos, mientras que SpCas9 1368. SaCas9 reconoce un PAM del tipo 5’-NNGRRT-3’, mientrasque SpCas9 reconoce la secuencia 5’-NGG-3’. Imagen extraída de Nishimasu et al., 2015).

1.3.3.4 Generación e introducción de los componentes del sistema en células

Existen varias formas para generar e introducir los componentes del sistema en las células deacuerdo al tipo celular que se desee modificar. Es posible realizar la introducción de loscomponentes en forma de ADN, ARN mensajero (ARNm), o como complejos RNP.Para la introducción de la Cas9 y el sgRNA en forma de ADN, se utilizan plásmidoscomerciales que contienen un cassette de expresión de ambos componentes. Es posibleintroducir en las células dos plásmidos, uno que exprese la Cas9 deseada y otro el sgRNA,sin embargo, se puede optar por utilizar un solo vector de expresión que contengasimultáneamente la nucleasa y el ARN (Ran et al., 2013). Para que su expresión sea óptima,es necesario alinear las secuencias de la proteína y el ARN en los vectores, esto asegura queel marco abierto de lectura sea el adecuado. Para la introducción de los complejos RNP esnecesario expresar la nucleasa y el sgRNA previamente, antes de transfectar los componentesa la célula. La Cas9 puede ser expresada de forma recombinante a partir de un plásmido ypurificada mediante cromatografía de afinidad. El sgRNA, puede generarse por transcripciónin-vitro (In-Vitro Transcription, IVT), a partir de un molde de ADN producido con primerssolapantes (Cho et al., 2014; Bassett et al., 2013). El primer forward debe contener la

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secuencia del promotor deseado, y la secuencia guía que es análoga al crRNA y se unirá porcomplementariedad de bases al ADN blanco. El primer reverse, análogo al tracrRNA, contienela secuencia de andamiaje o scaffold, que le da estabilidad al sgRNA y permite la unión conla Cas9. Los primers en sus extremo 3’, deben tener una pequeña región de homología queles permita hibridarse en una PCR, para generar un ADN de doble hebra (double strandedDNA, dsDNA), que será el molde para la IVT. Una vez que se tiene la Cas9 y el sgRNA sedeben incubar juntos por un tiempo determinado, para que se forme el complejo sgRNA-Ca9,y luego se procede a transfectar el complejo a las células de interés (Burle-Caldas et al., 2018).De esta última forma, al no incorporar ADN en las células, se generan modificacionestransitorias, evitando la generación de organismos transgénicos. (Figura 7).Para incorporar los componentes del sistema CRISPR/Cas (en forma de ADN, ARNm ocomplejos RNP) en las células deseadas, se puede recurrir a la transfección química, física,biológica o de fusión proteica. La transfección química se basa en la formación de complejosque las células puedan incorporar, a través de la ruta endocítica o de la membrana plasmática.Dentro de la transfección química, hay diversos métodos que se pueden utilizar como lalipofección, en donde se busca formar complejos entre lípidos catiónicos y ADN, que tienenafinidad por la membrana plasmática, y por ende permiten la entrada del ADN al citosol. Latransfección química suele tener una buena eficiencia, y se puede adaptar y escalar adiferentes situaciones. Por lo general, los métodos químicos son muy útiles para transfectarcélulas en cultivo o embriones. Los métodos físicos de transfección se basan en la introducciónmecánica de moléculas en las células. La transfección física suele utilizarse en el caso detrabajar con células difíciles de transfectar (Burle-Caldas et al., 2018). Varios métodos seincluyen dentro de esta categoría de transfección, como electroporación, núcleofección omicro-inyección. La electroporación se basa en la generación de pulsos eléctricos quedependen del tipo celular y producen poros transitorios en la membrana celular, permitiendoque el ADN, ARN y proteínas sean introducidos. Para facilitar el ingreso de los complejos RNPal núcleo, y aumentar la eficiencia del sistema se puede recurrir a la núcleofección, en la quelos pulsos eléctricos van acompañados del baño celular con una solución amortiguadora de lafuerza iónica. La microinyección consiste en introducir el ADN en la célula mediante unamicroaguja de 10 μm de diámetro. La transfección biológica comprende procesos naturalesque llevan a cabo determinados organismos como virus y bacterias. A la hora de transfectarlos componentes del sistema CRISPR/Cas9 mediante métodos biológicos, se opta por hacerlomediante virus como lentivirus o adenovirus (Abrahimi et al., 2015), ya que resulta ser unmétodo bastante eficiente a la hora de introducir genes dentro de células de mamíferos. Envegetales, por lo general, para la introducción de los componentes del sistema CRISPR/Cas9en células o protoplastos se emplea la infección mediada por Agrobacterium tumefaciens(Bortesi & Fischer, 2015) o biolística. Por último, para la transfección del sistema se puederecurrir a la conjugación química del complejo RNP a péptidos que sean capaces de penetrarla membrana celular y de guiar al complejo. Si la fusión péptido-complejo RNP se añade almedio de cultivo penetrará en las células (Li y Hotta 2015).

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Figura 7. Diversas estrategias de transfección del sistema CRISPR/Cas9. a) Introducción de múltiplesvectores de expresión; b) Introducción un único vector de expresión; c) Introducción del complejo RNP,con los sgRNA transcriptos in-vitro, y la Cas9 en forma proteica. Imagen adaptada de Sakuma yYamamoto 2015

1.3.3.5 Ventajas del sistema CRISPR/Cas9

Todo lo que es posible conseguir con el sistema CRISPR/Cas9 es posible en principio,obtenerlo también con los ZFNs y los TALENs. Sin embargo, muchos estudios handemostrado que existen claras ventajas del sistema CRISPR/Cas en términos de simplicidad,accesibilidad, costo y versatilidad (Bortesi & Fischer, 2015). Esto se debe a que, no esnecesario ningún paso de modificación de proteínas para determinar la especificidad delsistema. Sólo una secuencia de 20nt en el sgRNA es necesaria para conferir la especificidadpor la diana, lo que hace más rentable el trabajo de probar muchos sgRNAs para cada genblanco, además implica que el clonado no sea necesario. Esto permite el montaje económicode librerías de sgRNA para que el sistema CRISPR/Cas9 pueda ser utilizado para aplicacionesde genómica funcional de alto rendimiento, lo que lleva la edición genómica al presupuesto decasi cualquier laboratorio de biología molecular (Bortesi & Fischer, 2015). El sistemaCRISPR/Cas9 es capaz de reconocer y clivar ADN metilado en células humanas (Hsu et al.,2013; Ran et al., 2013), permitiendo modificaciones genómicas que están más allá del alcancede las meganucleasas, ZFNs y TALENs. De todas formas, la ventaja más práctica quepresenta el CRISPR/Cas9 en comparación con los otros sistemas de nucleasas programables,es la facilidad de realizar multiplexing, es decir, la introducción simultánea de DSBs enmúltiples sitios, con el fin de editar muchos genes a la misma vez o realizar knockout en genesredundantes, vías metabólicas paralelas, cluster de genes, etc. (Bortesi & Fischer, 2015; Maet al., 2014; Peng et al., 2014; Cong et al., 2013). La edición múltiple con CRISPR/Cas requieresólo la nucleasa Cas9 y la cantidad de sgRNA específicos con secuencias diferentes entre síque se deseen probar. Mientras que la edición múltiple con ZFNs o TALENS requiere muchosdímeros proteicos específicos para cada sitio blanco (Bortesi & Fischer, 2015). Otra ventajaque presenta el sistema CRISPR/Cas9 frente a las otras nucleasas es la facilidad con que sepueden determinar, mediante análisis de secuencia, los sitios donde es probable que segeneren mutaciones fuera del sitio blanco u off-targets, debido a que la interacción entre elsgRNA y el ADN es del tipo Watson y Crick (Bortesi & Fischer, 2015). El hecho de que losorganismos eucariotas carezcan del sistema CRISPR/Cas9, resulta ser una importante

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ventaja para utilizarlo como herramienta de EG frente al ARN de interferencia (ARNi).CRISPR/Cas9 no necesita factores endógenos del hospedero como las proteínas DICER, oel complejo Argonauta, esto hace que sea un sistema más específico (Bortesi & Fischer,2015). Además, el sistema CRISPR/Cas9 permite llevar a cabo múltiples aplicaciones,mientras que el ARNi, está restringido al silenciamiento de la expresión de los genes (Doudna& Charpentier, 2014). Otra ventaja muy importante de este sistema de EG es la política delibre ingreso que tiene la comunidad de investigación, hecho que ha promovido el uso de estatecnología. Así mismo, se cuenta con el acceso a plásmidos, herramientas en línea paraseleccionar y predecir la especificidad de los sgRNAs, y la participación gratuita a grupos dediscusión activos (Bortesi & Fischer, 2015).

1.3.3.6 Desventajas del sistema CRISPR/Cas9: off-targets y soluciones potenciales

El sistema CRISPR/Cas9 es la herramienta de EG que posee mayor eficiencia, y permite laobtención rápida de resultados a partir de un fácil manejo y un bajo costo. Sin embargo, esuna herramienta que muchas veces genera modificaciones en sitios inespecíficos, que noforman parte del blanco que se desea modificar (off-targets). Los efectos off-target se dandebido a que en los organismos que poseen el sistema CRISPR/Cas9 naturalmente, en elintento por adquirir inmunidad adaptativa contra ácidos nucleicos foráneos, puede ser útil elreconocimiento y destrucción de ADN viral y plasmídico hipervariable. Esa flexibilidad en elreconocimiento de secuencias variables cuando el sistema se saca de su contexto original yse utiliza con otros fines, muchas veces da lugar a mutaciones indeseadas y genera efectoscolaterales imprevisibles (Koo et al., 2015).Aunque inicialmente una secuencia de 20nt en el sgRNA era considerada necesaria paradeterminar la especificidad del sistema, posteriormente se demostró que sólo los nucleótidosdel 8 al 12 en el extremo 3’ (conocidos como secuencia semilla) se necesitan para elreconocimiento del sitio blanco (Bortesi & Fischer, 2015; Cong et al., 2013; Jinek et al., 2012),por lo que modificaciones en esos nucleótidos no son tolerados y es posible que se generenefectos off-target (Hsu et al., 2013). Los efectos off-target en determinado tipo celulardependen además de las secuencias blanco según el diseño del sistema, de la epigenética yla estructura de la cromatina.Varias estrategias se han diseñado para reducir las mutaciones off-target, pero la másimportante se considera que es el diseño del sgRNA (Bortesi & Fischer, 2015), en el cual seevita que el sgRNA pueda hibridarse a más de una secuencia blanco. A diferencia de losZFNs y los TALENs cuya especificidad por el ADN blanco está determinado por la interacciónimpredecible y contexto dependiente ADN-proteína, el sistema CRISPR/Cas9 reconoce el sitioblanco mediante interacciones del tipo Watson y Crick, lo que permite predecir de una formamás fácil los sitios off-target mediante el análisis de secuencia (Bortesi & Fischer, 2015; Choet al., 2014). Muchas herramientas en línea han sido desarrolladas para facilitar la selecciónde sgRNA con el fin de que posean sitios blancos únicos. Estas herramientas buscan generarsgRNAs con un alto contenido en las bases Guanina (G) y Citocina (C), ya que esto promueveuna mejor hibridación del sgRNA con el ADN blanco, y disminuye los off-target. Optimizar laexpresión de la Cas9 es otra forma de controlar la especificidad del sistema, debido a quealtas concentraciones de esta y del sgRNA pueden promover efectos off-target (Bortesi &Fischer, 2015; Hsu et al., 2013). Por eso, muchas veces se prefiere introducir la Cas9purificada junto con el sgRNA en la célula a editar, a efectos de poseer una concentracióndeterminada del complejo RNP. También es posible generar variantes del sistema con el finde reducir los off-targets. Se puede generar una mutación D10A en el dominio RuvC de laCas9 produciendo una versión mutada de la nucleasa, conocida como nickasa, que es capaz

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de clivar una sola hebra del ADN. El uso de dos nickasas Cas9 incrementa el número de basesreconocidas específicamente para el clivaje, reduciendo la probabilidad de que la secuenciahomóloga al sgRNA, esté presente en algún otro sitio del genoma (Bortesi & Fischer, 2015)(Figura 8a). Para trabajar con un par de nickasas eficaces, es necesario contar con dossgRNA igualmente eficientes. Aunque los cortes realizados con las nickasas, por lo generalson reparados con alta fidelidad, existe la posibilidad de que se generen mutaciones off-targetadicionales. Para solucionar este problema, se puede generar una fusión entre la Cas9catalíticamente inactiva (deadCas9, dCas9) y la nucleasa FokI, dando lugar a la fCas9 (Bortesi& Fischer, 2015). Recordemos que FokI posee su actividad catalítica cuando se encuentra enforma de dímero, por lo que es necesario utilizar dos dCas9-FokI, con dos sgRNA, para queambos dominios FokI se encuentren y cliven el ADN. La fusión de FokI a la Cas9 obliga quese produzca la dimerización que generará el corte entre dos sgRNAs separados por entre15 y 25 pb, con sus PAMs orientados hacia afuera (Bortesi & Fischer, 2015) (Figura 8b). Estaestrategia aumenta mucho la especificidad y la eficiencia de corte, ya que reduce el númeropotencial de secuencias off-target (Bortesi & Fischer, 2015). Alterar la longitud del sgRNAtambién puede minimizar las modificaciones off-target (Bortesi & Fischer, 2015). Es posiblealargar o acortar el sgRNA. Para el primer caso, se pueden añadir dos residuos de guanina(G) en el extremo 5’, estos permitirán evadir los sitios off-target con mayor eficiencia que elsgRNA normal, pero harán que el sgRNA sea menos activo en los sitios blancos deseados(Bortesi & Fischer, 2015; Cho et al., 2014) (Figura 8c). En el segundo caso, es posible utilizarun sgRNA quimérico truncado (tru-sgRNA) de 17nt, que reduce las modificaciones off-targetsin afectar los sitios blancos, lo que incrementa la especificidad y la inflexibilidad del sistema(Bortesi & Fischer, 2015; Fu et al., 2014) (Figura 8d).

Figura 8. Estrategias que incrementanla especificidad por el blanco en elsistema CRISPR/Cas9, y reducen lasmutaciones off-target. Diversasestrategias pueden emplearse parareducir el clivaje off-target. (a). El usosimultáneo de dos nickasas Cas9 quese unen a secuencias opuestas enambas hebras de ADN genera un DSBescalonado con proyecciones uoverhangs. (b) Fusion de las proteínasFokI y la Cas9 cataliticamente inactiva(dCas9), para dar lugar a la fCas9. Elclivaje del ADN dado por FokI esdependiente de dimerización. La fusiónde FokI a la Cas9 obliga que seproduzca la dimerización que generaráel corte entre dos sgRNAs. También sepuede modificar la longitud del sgRNA,generando (c) una extensión del sgRNAmediante la adición de dos residuos deguanina (G) en el extremo 5’; o (d) unacortamiento que da lugar a un ARNtruncado (tru-sgRNA) de 17nt. Imagenextraída de Bortesi & Fischer, 2015

(d)

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1.3.3.7 CRISPR/Cas como herramienta de edición genómica

CRISPR/Cas9 puede ser programada para desempeñar varias funciones que dan lugar adiversas consecuencias genéticas, como la generación de inserciones y deleciones, edicionesendógenas, activación o represión de la expresión génica, e incluso puede ser utilizado paravisualizar ubicaciones genómicas específicas. Para que se produzca una inserción o deleciónen el gen blanco, el DSB generado por la Cas9 debe ser reparado mediante NHEJ, que generareparaciones imperfectas e indefinidas y no requiere la presencia de un molde homólogo parala reparación. A través de esta vía, pueden ser insertados o deletados nucleótidos de maneraaleatoria en el sitio de corte. Estos efectos generados por la NHEJ es posible que alteren elmarco abierto de lectura (Open Reading Frame, ORF) de la proteína codificada por el genblanco, lo que producirá un cambio en su secuencia aminoacídica, o la generación de uncodón stop, que dará lugar a una proteína trunca y por ende a la pérdida de función del gen.Para generar este tipo de efectos es recomendable que el sgRNA se diseñe para sitios blancosubicados lo más cerca posible del extremo N-terminal de la proteína que se verá afectada, deesta forma se asegura la pérdida de función total del gen blanco (Bortesi & Fischer, 2015;Cong et al., 2013). Sin embargo, para obtener un cambio particular de nucleótido/s en el gende interés, es necesario que el DSB sea reparado mediante la vía HR, que requiere de unmolde de reparación, que debe tener un alto grado de homología con las secuencias queflanquean el DSB en el ADN a editar. Por lo general, si el cambio que se desea introducir noes de un tamaño superior a 50pb el molde es diseñado en forma de oligonucleótido de simplehebra y contiene la mutación puntual que se desea introducir en el gen blanco, además, losbrazos de homología que flanquean la mutación, para que pueda darse la recombinaciónhomóloga con el ADN blanco, tienen una longitud de entre 50 y 80pb cada uno. Por elcontrario, si el cambio a introducir posee un tamaño mayor a 100pb, generalmente se usanplásmidos que contienen una región de homología de 800pb (Bortesi & Fischer, 2015; Conget al., 2013). Es muy importante que en el molde no existan secuencias PAM específicas dela Cas9 que se utiliza, ya que es probable que la nucleasa identifique al molde como diana ygenere un corte en él. El sistema CRISPR/Cas9 también puede ser adaptado comoherramienta de regulación de la expresión génica, para ello se necesita una dCas9 que no escapaz de llevar a cabo su función nucleasa con ninguno de sus dos dominios, pero puedeseguir siendo reclutada a secuencias de ADN específicos por el sgRNA (Bortesi & Fischer,2015). La dCas9 se fusiona con diferentes dominios efectores que modulan la expresióngénica para activar o reprimir la transcripción de un gen específico, sin embargo, para el últimocaso, se pueden emplear dos estrategias, por un lado, utilizar la dCas9 en solitario, o fusionarla dCas9 a dominios silenciadores de la transcripción, de esta manera se consigue un efectoknockdown mayor (Bortesi & Fischer, 2015). Para asegurar que se dé la regulacióntranscripcional, el sgRNA debe diseñarse de modo que su secuencia blanco en el ADN estécerca del promotor del gen cuya expresión se desea regular. La dCas9 también puede serutilizada para llevar cargas a un sitio específico en el genoma. Es así que se puede fusionarla dCas9 con la Green Fluorescent Protein (GFP), para visualizar determinados loci en célulasvivas (Anton et al., 2014).Por último, cabe destacar que a diferencia de los ZFNs y TALENs, el sistema CRISPR/Casclase 1 tipo III-B presente en Pyrococcus furiosus es capaz de diferenciar entre blancos deADN y ARN. Este sistema de silenciamiento de ARN involucra la degradación dependiente dehomología de ARNs complementarios en presencia de crRNA modificados (Bortesi & Fischer,2015). El clivaje del ARN puede ser útil, cuando el ADN blanco es protegido por algunaproteína o complejo proteico, o cuando dicho ADN se encuentra en una región de

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heterocromatina y es difícil acceder a él. También puede ser útil cuando se desea tener unaúnica variante de splicing, entre muchas (Bortesi & Fischer, 2015).

1.3.3.8 Alcance y potencial de aplicación del sistema CRISPR/Cas9

El sistema CRISPR/Cas9 se ha aplicado en diversos organismos, como bacterias, plantas,animales, e incluso humanos, con diferentes fines. Por ejemplo en plantas, mediante elsistema CRISPR/Cas9 es posible modificar la secuencia regulatoria del gen de una planta quedetermina una característica agronómica de interés. También se pueden incorporar nuevosgenes en posiciones determinadas, y se pueden agrupar genes que posean características deinterés con la finalidad de que segreguen juntos al realizar cruzamientos (Fort, 2018; Bortesi& Fischer, 2015). Otra ventaja que presenta este sistema en el ámbito agrícola es que puedeutilizarse sin dejar huellas asociadas al método de integración. Según Fort, 2018 existen variasformas de generar plantas libres de transgenes, que incluyen la expresión transitoria de laCas9, la introducción del complejo Cas9/sgRNA, o la incorporación de los transgenes delsgRNA y la Cas9 en cromosomas diferentes al que posee la característica a editar, con el finde que dichos componentes puedan ser removidos por segregación, pero transmitiendo laedición generada en la primera generación, a la progenie de la planta.Además de la gran capacidad que ha demostrado tener la aplicación del sistemaCRISPR/Cas9 en plantas, se ha visto que también tiene el potencial para ayudarnos aentender los elementos que están involucrados en las interacciones parásito-hospedador, loque podría ayudar en el desarrollo de un nuevo fármaco, que mitigue o erradique laenfermedad. Sin embargo, no siempre es fácil la manipulación genética de los parásitos, tales el caso de Trypanosoma cruzi, cuya modificación génica ha sido mucho más desafiante encomparación con otros parásitos, debido a la baja eficiencia que se consigue con losprotocolos de manipulación de ADN, la complejidad de su genoma, y el gran tiempogeneracional que se requiere para la selección de parásitos transfectados de manera estable(Burle-Caldas et al., 2018). Pero, últimamente se ha visto que la utilización de sistemas queinvolucran endonucleasas de restricción, como CRISPR/Cas9, pueden mejorar ampliamentela manipulación génica en T. cruzi (Burle-Caldas et al., 2018; Medeiros et al., 2017; Peng etal., 2014).

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1.4 Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi es el protozoario responsable de la enfermedad de Chagas. Según la OMS,dicha enfermedad afecta a entre seis y siete millones de personas alrededor del mundo. Esteparásito es endémico de Latinoamérica; pero debido al aumento de las tasas de migración, elprotozoario se ha extendido en forma global, principalmente afectando América del Norte yEuropa. T. cruzi tiene un ciclo de vida complejo que alterna formas replicativas e infectivasmientras pasa de un vector, un insecto de la familia Reduvidae (generalmente de la especieTriatoma infestans), a varios hospederos mamíferos definitivos, que incluyen al ser humano(Burle-Caldas et al., 2018). La morfología que adopta el parásito en el estadío proliferativodentro del insecto, recibe el nombre de epimastigota y tienen un tiempo generacional largo. Lamorfología que poseen en el estadío proliferativo intracelular en el humano se conoce comoamastigota. También en el humano existe un estadío infectivo en el que el parásito no se divide,y la morfología que el parásito adopta se llama trypomastigota. Bastan unos pocostrypomastigotas para infectar humanos, por lo que accidentes en el laboratorio son realmenteuna preocupación (Lander et al., 2015; Souza, 2002). La figura 9 muestra como es el ciclo devida de estos protozoarios. Desde el punto de vista celular la multiplicación de lostrypanosomatidos es compleja debido a su arquitectura celular altamente polarizada, y a lapresencia de una sola copia de organelos, que incluye una única gran mitocondria, ademásestos organismos poseen un genoma divido en varios círculos de ADN, y un flagelo, conectadomediante filamentos del citoesqueleto (Chávez et al., 2017; Elias et al., 2007; McKean, 2003).En cuanto al ciclo celular, T. cruzi presenta una mitosis cerrada, no cuenta con centriolos yposee kinetoplastos (Hammarton, 2007; Souza, 2002). Estas diferencias con respecto al ciclocelular que poseen la mayoría de los eucariotas, explica la divergencia existente entre losmecanismos de proliferación de los trypanosomatidos en comparación con sus hospederosmamíferos (Chávez et al., 2017). A su vez, la maquinaria de replicación del ADN de estosparásitos ha sido parcialmente caracterizada y se ha demostrado que presenta componentes ymecanismos de regulación diferentes en comparación con los eucariotas superiores (Chávezet al., 2017; S. Calderano et al., 2014; S. G. Calderano et al., 2011). Trypanosoma cruzi tambiénpresenta características muy peculiares desde el punto de vista molecular, sobre todo en susmecanismos de regulación de expresión génica. En primer lugar, hay estudios que handemostrado que no existe control en el inicio de la transcripción (Chávez et al., 2017; Clayton,2002). En segundo lugar, los genes codificantes de proteínas se encuentran organizados enlargas unidades transcripcionales policistrónicas, a partir de las cuales se generan ARNmindividuales mediante un proceso de trans-splicing. Este procesamiento particular involucra laincorporación de un pequeño ARN conservado conocido como miniexón o spliced leader de 39nucleótidos y portador de la 5’ caperuza, que se conformará como el extremo 5’ del ARNm(Michaeli, 2011; Sutton & Boothroyd, 1986). En tercer lugar, los genes de este parásito engeneral carecen de intrones, a pesar de ser organismos eucariotas (Duhagon et al., 2003; Mairet al., 2000). Por último, los transcritos mitocondriales necesitan sufrir un proceso de ediciónpara su maduración, que implica la adición o deleción más o menos frecuente, de residuos deribonucléotidos, generalmente uridinas (Duhagon, 2007; Shaw et al., 1988). T. cuzi tambiéncuenta con un gran número de familias génicas. Entre las más grandes están aquellas quecodifican para proteínas del tipo trans-sialidasa, mucinas y proteínas de asociación a mucinasque son expresadas en la superficie del parásito e interactúan directamente con los hospederos(Peng et al., 2014).La localización de las proteínas del parásito es importante para determinar su función celular.Estudios previos en T. cruzi han utilizado anticuerpos o métodos de etiquetado génico queutilizan vectores que sobre-expresan las proteínas (Lander et al., 2016). Sin embargo, no

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siempre es posible obtener proteínas endógenas, debido a que tienen baja antigenicidad o aque los anticuerpos reaccionan con otras proteínas (Lander et al., 2016). Por otra parte, losplásmidos que permiten el etiquetado de genes en sus loci endógenos no están disponiblespara T. cruzi y el mayor inconveniente de la sobre-expresión de proteínas etiquetadas es quemuchas veces las proteínas de interés quedan retenidas en el retículo endoplasmático (RE), ose dirigen a otros compartimentos (Lander et al., 2016). Además en estos parásitos, lageneración de mutantes KO ha probado ser muy dificultosa y frecuentemente no exitosa debidoa la generación de rearreglos genómicos que mantienen activos los loci que se intentabasilenciar. En T. cruzi en particular, a diferencia de otros tripanosomátidos, tampoco se cuentacon los mecanismos de regulación por ARNs pequeños, dado que carecen del sistema deproteínas que conforman el complejo RISC funcional (Barnes et al., 2012; Darocha et al., 2004).Por estas razones, surge la necesidad de encontrar y utilizar una herramienta que resulteeficiente y accesible para manipular genéticamente a T. cruzi. Hoy día ya existen trabajos queutilizan el sistema de EG CRISPR/Cas9 como herramienta práctica, para modificargenéticamente a este parásito (Burle-Caldas et al., 2018; Medeiros et al., 2017; Lander et al.,2016, 2015; Peng et al., 2014), debido a la relativa facilidad de su uso, la alta eficiencia que seconsigue, y por su capacidad de obtener múltiples modificaciones en un único organismo océlula (Peng et al., 2014). En T. cruzi el DSB generado por la Cas9 puede ser reparado por dosvías. Por un lado por HR que permite la edición precisa, desde mutaciones puntuales hastagrandes inserciones o deleciones, dependiendo del molde de homología disponible (Peng etal., 2014). Por otro lado, en ausencia de un molde de homología, el corte será reparadoexclusivamente por la vía de microhomology-mediated end joining (MMEJ). MMEJ es una víade reparación alternativa al NHEJ, que también se basa en el arreglo del DSB independientede recombinación homóloga, pero que utiliza cinco o más bases de microhomología durante launión de los extremos del corte (Peng et al., 2014; Glover et al., 2011; McVey & Lee, 2008;Burton et al., 2007).El sistema CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta para la manipulación del genoma deTrypanosoma cruzi, y abre las puertas al mejor entendimiento del rol de los genes esenciales yde las familias génicas en la biología de este patógeno humano y sus interacciones con loshospederos (Peng et al., 2014). Debido a estas razones y junto con las peculiares propiedadesque caracterizan a T. cruzi, en este trabajo se propone poner a punto el sistema CRISPR/Cas9en este parásito, lo que facilitaría mucho el diseño de experimentos de manipulación genéticasobre este organismo.

Figura 9. Ciclo de vida deTrypanosoma cruzi.Imagen extraída dewww.dpd.cdc.gov/dpdx

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Objetivos

2.1 Objetivo general

Poner a punto parte de la estrategia de edición genómica mediada por el complejoCas9/sgRNAs sintetizados in-vitro, para genes expresados en Trypanosoma cruzi. Utilizandocomo referencia el protocolo de diseño publicado para el knockin del gen gp72 de T. cruzi,para evaluar la eficiencia del corte.

2.2 Objetivos específicos

1. Obtener proteína SaCas9 recombinante pura.

2. Diseñar los componentes del sistema de edición para el gen rbp38 y para el reporteromNeonGreen.

3. Evaluar la eficiencia de corte de los componentes generados en un ensayo in-vitro.

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Materiales y Métodos3.1 SaCas9

3.1.1 Expresión de la proteína SaCas9 recombinante

Se expresó la proteína SaCas9 recombinante a partir de la transformación de bacteriascompetentes de la cepa RosettaTM 2(DE3) pLysS (Novagen) de Escherichia coli con elplásmido inducible comercial p6xHis_NLS-SaCas9 (https://www.addgene.org/101086/,Medeiros et al., 2017). Se seleccionó la SaCas9 en lugar de la tradicional SpCas9 dado quetiene una actividad de edición equivalente pero es más pequeña (SaCas tiene 130KDa ySpCas9 posee 160KDa), y se adapta mejor a protocolos de co-transfección del complejo RNPsgRNA/Cas9 (Burle-Caldas et al., 2018).El plásmido p6xHis_NLS-SaCas9 es de alto número de copias, posee el esqueleto delplásmido pET-32 EK/LIC y resistencia a ampicilina. También, tiene un inserto con la secuenciacodificante para la SaCas9 fusionado a un tag o etiqueta de seis histidinas (His-Tag) en elextremo N-terminal de la proteína. El His-Tag está muy cercano a un sitio de corte portrombina, cuya función es eliminar el tag para que no influya en la estructura o en elfuncionamiento posterior de la proteína purificada. Las secuencias codificantes de estoscomponentes del plásmido se encuentran bajo la regulación de un promotor T7lac.E. coli crecío en el medio 2xYT pH 6.8 ± 0.2 a 37°C (ver Tabla 1) debido a los aminoácidosadicionales, precursores nucleotídicos, vitaminas y otros metabolitos esenciales que la célulanecesita durante su crecimiento y desarrollo. El cloruro de sodio (NaCl) está presente en elmedio y provee un entorno osmótico favorable para las bacterias en replicación.(http://www.interchim.fr/ft/N/N14800.pdf).

Tabla 1. Reactivos necesarios para un litro de medio de cultivo 2xYT.

Se realizó un pre cultivo con 25mL del medio 2xYT, al cual se le agregaron 25µL de Ampicilina(100mg/mL), y 25µL del vial o Stab Rosetta 2(DE3). Se dejó a 37°C, 200rpm overnight (ON).Al día siguiente, en dos matraces Erlenmeyer de 2L se preparó el cultivo, con 500mL de medio2xYT, 500µL de ampicilina y 10mL del pre-cultivo. Los matraces se dejaron a 37°C en el shakera 200rpm, hasta que la DO600nm (densidad óptica) alcanzó valores de entre 0,4 y 0,6 UA(unidades de absorbancia). Cuando se alcanzó dicha DO, se tomó 1mL de cultivo, secentrifugó a 10.000rpm durante tres minutos, se resuspendió el pellet en agua mQ (Milli-Q)hasta llevarlo a 5UA y se guardó a -80°C. Esta muestra se correspondió con la expresión dela proteína previamente a la inducción del cultivo con IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido). En ausencia de IPTG la proteína LacL se une e inhibe al promotor T7lac.Pero cuando el IPTG está presente se une a LacL, separando a este último del promotor ypermitiendo la transcripción río debajo de los genes que estan bajo el control de dichopromotor (Marbach & Bettenbrock, 2012; Shults, 2016). Posteriormente, se indujo la expresiónde la SaCas9 con 500µl IPTG 1M, y luego se dejó el cultivo en el shaker a 200rpm y 18°Cdurante 24hs. Paralelamente se hizo un pre-cultivo de Rossetta que no contaba con elplásmido de interés a modo de control negativo, para lograr visualizar el perfil proteico de dichabacteria en una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) y así

Reactivos Masa (g)Tryptona 16,0

Extracto de levadura 10,0Cloruro de sodio (NaCl) 5,0

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compararla con la cepa que si contenía la proteína buscada. Luego se hizo una dilución 1/10de los cultivos, y se midió la DO600nm. Se tomó 1mL, se centrifugó a 10000rpm por tres minutos,se resuspendió el pellet en agua mQ (Milli-Q) hasta llevarlo a una DO600nm de 5UA y se guardóa -80°C. Esta muestra se correspondió con la expresión de la proteína inducida. Se traspasóel cultivo a tubos Falcon de 50mL, y se los centrifugó por 20 minutos a 10000rpm y 4°C. Semasó el peso húmedo de los pellets resultantes para calcular aproximadamente el rendimientode los cultivos y se los guardó a -80°C.Posteriormente, se lisaron las células químicamente, para ello se resuspendió el pellet enbuffer fosfato en un volumen 1/20 correspondiente al cultivo y se prosiguió según la Tabla 2.

Tabla 2. Pasos seguidos y volumen de reactivos agregados para llevar a cabo la lisis química de lasbacterias.

Paso Reactivo Volumen Concentración final1) Resuspender el pellet de

100mL de cultivoBufferfosfato

5 µL 1X

2) Agregar PMSF100mM

50µL 1mM

Lisozima50mg/mL

100µL 1mg/mL

3) Agregar perlas de vidrio yagitar por 30 minutos atemperatura ambiente

4) Adicionar DNAsa10mg/mL

4µL 8µg/mL

RNAsa10mg/mL

4µL 8ug/mL

MgCl2 1M 5µL 1mM5) Agitar por 30 minutos a

temperatura ambiente

6) Quitar las perlas de vidrio

Se tomó una muestra de 500µL y se centrifugó a máxima velocidad (16000g/10000rpm) por10 minutos. Se guardó el sobrenadante como “fracción soluble”, se resuspendió el pellet en500 µL de agua y se guardó como “fracción insoluble.” Estas muestras se controlaronmediante SDS-PAGE. Paralelamente, se centrifugó el lisado a 10000g por 3 minutos a 4°C,se guardó el pellet a -20°C hasta su procesamiento y el sobrenadante a 4°C. Se esperaba quela fracción soluble fuera la que contuviera más cantidad de la proteína deseada.Se realizó un SDS-PAGE para verificar si la SaCas9 estaba presente antes de purificarla.

3.1.2 Electroforesis de proteínas: SDS-PAGE

Para hacer los geles se mezclaron los componentes del gel de corrida o gel separador, y seagregó por último APS 10% y TEMED. El porcentaje de acrilamida del gel a preparar dependede la proteína a separar de acuerdo al rango lineal de separación que se muestra en la Tabla3. Para evaluar el perfil proteico de las bacterias se realizaron geles de 10% poliacrilacrilamidasegún la Tabla 4. Luego se llenó la cuba de electroforesis con la mezcla hasta ¾ de su altura.Posteriormente, se mezclaron los componente del gel de carga o gel concentrador, según la

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Tabla 5, agregando igualmente el APS 10% y el TEMED en última instancia. Se vertió lamezcla sobre el gel de corrida y se insertó el peine que luego de 10-20 minutos se retiró.Para preparar las muestras, en primera instancia se mezclaron con el volumen necesario deBuffer de carga 4X (ver Anexo) y se hervieron durante 5 minutos, con el fin de desnaturalizarlas proteínas. Se dejaron enfriar las muestras y antes de cargarlas en el gel se les dió un spin.Luego de armar la cuba de electroforesis y llenarla con buffer de corrida 1X (ver Anexo), secargaron las muestras y el marcador de peso molecular adecuado. El gel se corrió a 100Vmientras las muestras atravesaban el gel de carga, y a 120V cuando pasaron al gel de corrida.Se dejaron migrar las muestras hasta que el frente de corrida, indicado por el azul debromofenol, alcanzó la parte inferior del gel. Al terminar la corrida, se tiñó el gel durante unahora con agitación suave con azul de Coomassie (ver Anexo) que es un colorante que formacomplejos fuertes no covalentes con las proteínas, además su incorporación esaproximadamente proporcional a la cantidad de proteínas y permite detectar bandas de hasta100ng de proteína. Por último se reemplazó la solución de tinción por solución de desteñido(ver Anexo) y se incubó con agitación suave por al menos una hora.

Tabla 3. Rango lineal de separación de proteínas.

Acrilamida (%) Rango lineal deseparación (kDa)

18 5-40

15 10-43

12 12-60

10 20-80

7.5 36-94

5 57-212

10%

Cantidad gelesReactivos

1 2

Acrilamida:Bisacrilamida 30%

1,6mL 3,2mL

Tris-HCl 1.5 M pH 8 SDS0.4%

1,3mL 2,6mL

APS 10% 30,0µL

60,0µL

TEMED 6,0µL 10,0µL

Agua mQ 2,1mL 4,2mL

Cantidad geles

Reactivos

1 2

Acrilamida: Bisacrilamida30%

243,50µL 487,00µL

Tris-HCl 0,5MpH6,8 SDS 0,4%

468,50µL 937,00µL

APS 10% 15,00 µL 25,00µL

TEMED 3,00 µL 5,00 µL

Agua mQ 1,14mL 2,28mL

Tabla 4. Preparación de gel de corrida oseparador al 10% según cantidad de geles.

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3.1.3 Purificación de la SaCas9

Debido a que la SaCas9 recombinante está fusionada a un tag de seis histidinas en su extremoN-terminal, para purificarla se utilizó una cromatografía de afinidad con columna de níquel(Ni2+) de 1mL (HisTrap HP, GE™). Es necesario preparar la columna previamente a su uso(ver apartado 3.1.3.1). Una vez que la columna estaba lista para ser usada, se centrifugó ellisado bacteriano obtenido en el apartado 3.1.1 a 4000rpm y 4°C por 30 minutos. Elsobrenadante (fracción soluble) fue recuperado y filtrado por 0.22µm. Se usó un equipo deFPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) de Cytiva y modelo ÄKTA, seteando la colecciónde fracciones cada 4mL de fase móvil. La columna se carga con la muestra que contiene laproteína SaCas9 y luego se realizan lavados con buffer de unión (30mM imidazol). Luego seeluye utilizando concentraciones crecientes de imidazol, lo que desplaza a la proteína SaCas9al actuar como competidor de la unión de las histidinas en su interacción con la columna. Alcomienzo una baja concentración de imidazol, 30mM permite la interacción especifica de laproteína con la matriz (100% buffer de unión, ver Anexo) y luego se aumenta la concentraciónde imidazol incorporando el buffer de elución (300mM imidazol, ver Anexo). En primer lugar,lavando con buffer de unión se colecta la fracción de proteínas no unidas a la columna (FT,de flow-through). Luego se incrementa la proporción del buffer de elución a 5%, 11%, 20% y100%, lo cual corresponde respectivamente a 53, 82, 124 y 500 mM de imidazol. Lasdiferentes fracciones obtenidas a partir del FPLC, se analizaron por SDS-PAGE con geles de10% acrilamida (ver apartado 3.1.2). Se desalaron las muestras para obtener la proteína pura,sin sales de los buffers, mediante gel filtración con una PD-10 de SephadexTM siguiendo lasinstrucciones del fabricante (N° de catálogo: 17-0851-01, Amersham). También se utilizaroncentricones MilliporeSigmaTM AmiconTM Ultra Centrifugal Filter Units (N° de catálogo:UFC901008, Fisher scientific) para llevar a la proteína a una concentración que permitiera suutilización en las posteriores aplicaciones. El producto resultante del desalado se conservó en40% de glicerol y se almacenó a -20°C. En todos los ensayos realizados en este trabajo seutilizaron alícuotas de SaCas9 que poseían un tiempo de criopreservación menor a 18 meses.

3.1.3.1 Preparación de la columna de níquel Ni2+: Stripping

Antes de comenzar con la purificación de la proteína es necesario preparar la columna deníquel (HisTrap HP, GE™), mediante el stripping. Este método permite que el níquel se una ala matriz estacionaria de la columna de Sepharose™, y por consiguiente al pasar la fase móvil(buffer con proteínas), la SaCas9 gracias a su cola de histidinas, queda retenida en la matriz.La preparación de la columna es un procedimiento que debe hacerse con cuidado, para noestropear la columna, y asegurarse de que sea completamente funcional, para poder lograr lapurificación deseada. Por estas razones es deseable evitar la entrada de aire a la columna,así como trabajar a un flujo máximo de 1mL/min. Además, es importante que todas lassoluciones que atraviesen la columna, estén filtradas por 0.22µm.Para su preparación, en primer lugar se debe descargar la columna haciendo pasar diezvolúmenes de agua, debido a que se encuentra almacenada en etanol. Para pasar líquidos enla columna, se puede usar una bomba peristáltica, o una jeringa. Posteriormente, se debenpasar diez volúmenes de buffer de unión (ver Anexo) con 50mM de EDTA. En segundo lugar,hay que realizar la limpieza de la columna, para ello, es necesario pasar diez volúmenes dehidróxido de sodio (NaOH) 1M, permitiendo una hora de contacto. Luego, pasar diezvolúmenes del buffer de unión, y después diez volúmenes de agua. El tercer paso, es larecarga de la columna, para ello es necesario pasar dos volúmenes de sulfato de níquel(NiSO4) y diez volúmenes de agua. En este punto la columna ya está lista para ser utilizada,y se puede almacenar en etanol 20% bien cerrada a 4°C. Previo al uso se debe retirar el etanoly equilibrar la comuna en buffer de unión.

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3.2 ADN blanco

3.2.1 Selección de genes blanco para cortar con la SaCas9

El sistema CRISPR/Cas se puso a punto utilizando tres genes, dos endógenos de Trypanosomacruzi (rbp38 y gp72), y uno exógeno a dicho parásito (mNeonGreen). El gen gp72(TcCLB.509561.20. Ver Anexo), tiene un tamaño de 1740pb y fue elegido a partir del trabajode Burle-Caldas et al., 2018, donde se realizó un estudio similar al presente, que se tomó comoreferencia. En dicho trabajo se vio que al interrumpir ambos alelos del gen mediante KO, elflagelo quedaba separado del cuerpo celular, fenotipo fácilmente observable al microscopio(Burle-Caldas et al., 2018). Rbp38 (RNA binding protein 38, TcCLB.508641.180. Ver Anexo),posee 1599pb y codifica para una proteína de unión a ARN (RBP38). RBP38 está codificadapor el genoma mitocondrial de T. cruzi, y se cree que tiene un rol muy importante en el desarrollocelular del parásito, sin embargo no existe evidencia concluyente al respecto (Sbicego et al.,2003). mNeonGreen (mNeon en adelante) es un gen con un tamaño de 499pb que se expresaa partir de un plásmido que es capaz de integrarse al genoma (pPOTv4 blast-blast mNeon-Green, Costa et al., 2018; Beneke et al., 2017) y que fue previamente transfectado por el equipode Costa et al., 2018 en los parásitos de la cepa CL Brener, que son los que se utilizaron eneste estudio. Dicho gen codifica una proteína fluorescente verde, que es fácil de detectar alvisualizar los parásitos en un microscopio de fluorescencia (Costa et al., 2018). La alteracióndel gen mediante KO, se refleja con la disminución de fluorescencia (Costa et al., 2018). Por lotanto, mNeon es un buen candidato para evaluar si el sistema CRISPR/SaCas9 funciona in-vivo al transfectar T. cruzi con los complejos RNP. mNeon igualmente sirve como gen controlpara evaluar si el sistema funciona correctamente de manera in-vitro.

3.2.2 Obtención de ADN blanco

Se extrajo ADN genómico a partir de un cultivo de Trypanosoma cruzi con DNAzolTM Reagent,for isolation of genomic DNA from solid and liquid samples (N° de catálogo: 10503027,ThermoFisher Scientific). A partir del ADN genómico se amplificaron por PCR regionesgenómicas de los genes de interés (gp72, rbp38 y mNeon), utilizando los primers o cebadoresmostrados en la Tabla 6.). Los primers a utilizados amplificaron productos de 1,7kb, 796pb y499pb para gp72, rbp38 y mNeon respectivamente. Cabe aclarar que los primers utilizados paragp72 son los publicados por el grupo colaborador de la Profesora Santuza Teixeira (Burle-Caldas et al., 2018). La Tabla 7 ilustra la preparación de las reacciones de PCR, y la Tabla 8el programa de termociclado que se utilizó, de acuerdo a la Taq DNA Polymerase, recombinante(N° de catálogo: 10342020, ThermoFisher Scientific). Los productos de PCR se purificaron conel Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit [N° de catálogo: T1030S, New England BioLabs (NEB)]y con el QIAquick PCR Purification Kit (N° de catálogo: 28104, QIAGEN). Para conseguir unaconcentración adecuada de gp72 también se utilizó el Monarch® DNA Gel extraction Kit (N°catálogo T1020S, New England Biolabs (NEB)). Los productos purificados, se visualizaronmediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.

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Tabla 6. Primers que se utilizaron para amplificar por PCR regiones genómicas de los genes blancosa cortar con la SaCas9

Tabla 7. Reactivos necesarios para 25µLy 50µL de reacción de PCR para amplificar el ADN blancoque se utilizó para cortar con la SaCas9.

Tabla 8. Programa de termociclado para amplificar el ADN blanco que se utilizó para cortar con laSaCas9.

Gen Primersgp72 Fw: 5’- ATGCTTTCAAAAAGGACGTCGCCA -3’

Rv: 5’- CCAACCATCAGTGCAATGAGTGCG -3’rbp38 Fw: 5’- GGGAGCGAGAAGTACGACAG -3’

Rv: 5’-TTTTCCGTGTTGCCAAGCTC -3’mneon Fw: 5’- CTTCTACCCCCTGGAGGACG -3’

Rv: 5’- GTACTCGTTGAAGCCTGGGG -3’

VolumenReactivo 25µL 50µL Concentración

final10X PCR buffer, -Mg 2,5µL 5µL 1X50mM MgCl2 0,75µL 1,5µL 1,5mM10mM dNTP Mix 0,5µL 1µL 0,2mM c/u10µM fw primer 1,25µL 2,5 0,5 µM10µM rv primer 1,25µL 2,5 0,5µMADN genómico(~100-160ng/µL)

- - 1-500ng

Taq DNA Polymerase,recombinant (5U/µL)

0,1µL 0,2µL 1,0- 2,5U/reacción

Agregar agua a completar 25µL 50µL

Paso Temperatura Tiempo N° de CiclosDesnaturalización inicial 94°C 3 minutos 1

Desnaturalización 94°C 45 segundos 35Annealing 59°C 30 segundos 35Extensión 72°C 90 segundos/kb 35

Extensión final 72°C 10 minutos 1

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3.3 SgRNA

3.3.1 Diseño de sgRNAs

El diseño de los ARNs guías se realizó en la plataforma web CRISPOR (http://crispor.tefor.net/,Concordet & Haeussler, 2018). CRISPOR es un programa que asiste en el diseño deestrategias de CRISPR/Cas evaluando posibles sgRNAs que pueden dirigir un corte en elADN para un determinado gen. El software identifica las posibles regiones para sgRNA enbase a la existencia de sitios PAMs reconocidos específicamente por la nucleasa Cas9seleccionada (Concordet & Haeussler, 2018). Para el diseño de los sgRNAs se le proporcionaa CRISPOR la secuencia del gen que se desea cortar. Para el caso de los guías del gen rbp38y gp72, se usó la base de datos TriTrypDB (https://tritrypdb.org/tritrypdb/app), que esespecífica de kinetoplástidos. Para mneon se utilizó la secuencia del gen contenida en elplásmido de integración al genoma transfectado en la cepa CL brener. Según la secuenciaproporcionada a la base de datos, junto con la información del PAM a reconocer por la Cas9,que en este caso por tratarse de la SaCas9 es 5’-NNGRRT-3; CRISPOR encuentra PAMssobre la secuencia de interés y predice posibles secuencias de ARNs guías, desde la quetiene mayor especificidad a la que menos tiene (Concordet & Haeussler, 2018; Hsu et al.,2013). Además, predice su eficiencia, y la cantidad de off-targets en base a los mismatchespresentes en ellos (Concordet & Haeussler, 2018). Una vez elegida la secuencia deseada, enbase a las características mencionadas, CRISPOR diseña oligonucleótidos solapantes parala generación del molde para la producción de los sgRNA por transcripción in-vitro (IVT). Eloligonucleótido directo contiene en su extremo 5’ la secuencia del promotor T7, que esreconocida exclusivamente por la ARN polimerasa T7, la secuencia complementaria al ADNblanco y en su extremo 3’ una región que se solapa con el extremo 3’ del oligo reverso,permitiendo la hibridación de ambos oligos (Bassett et al., 2013). El oligonucleótido reversocontiene la secuencia del scaffold para la SaCas9, que será universal cada vez que se utiliceesta nucleasa (Bassett et al., 2013). Una vez diseñados los oligos, se solicita la síntesis deestos a un proveedor (Macrogen, https://dna.macrogen.com/).

Figura 10. Esquema del diseño de los moldes para la producción de los sgRNA por IVT. En eloligonucleótido directo se indica en rojo el promotor T7, en azul la región de complementaridad con elgen de interés. Para ambos oligonucleótidos se muestra en verde la secuencia que codifica la regióndel scaffold del sgRNA y se marca también la región que permite la hibridación de ambos oligos.

3.3.2 Generación y purificación del ADN molde para la síntesis de los sgRNAs

Para producir los ARNs guía, se llevó a cabo la transcripción in-vitro (IVT), que requiere de unmolde de ADN a partir del cual se sintetiza el ARN. El molde se generó mediante una PCR conlos oligonucleótidos solapantes diseñados en el apartado 3.3.1. Esta PCR, no necesita un ADNmolde (template), ya que los oligos al solaparse permiten a la ADN polimerasa extender losextremos 3’ libres y generar el ADN doble hebra completo que se utililiza posteriormente comomolde en la IVT (Bassett et al., 2013) (Figura 10).

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Es importante que en la PCR se utilice una ADN polimerasa de alta fidelidad como la PhusionTM

High-Fidelity DNA Polymesase (N° de catálogo: F-530XL, ThermoFisher Scientific), debido aque las ADN polimerasas convencionales poseen actividad adenil transferasa terminal, y por lotanto incorporan dATP al finalizar su extensión. El ADN molde para las producción de los sgRNAdebe ser muy preciso y la adición de la adenina final puede afectar la eficiencia de la producciónpor IVT. Se realizaron reacciones de PCR para los tres genes en cuestión (rbp38, mneon ygp72), según la Tabla 9 y se usó el programa de termociclado mostrado en la Tabla 10. Losproductos de PCR se purificaron con el Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit [N° de catálogo:T1030S, New England BioLabs (NEB)]. Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 2%con los productos de PCR antes y después de su purificación.

Tabla 9. Reactivos en 100µL de reacción para generar el ADN molde que se utilizó en las IVT.

Tabla 10. Programa de termociclado para generar los ADN moldes que se utilizaron en las IVT.

3.3.3 Transcripción In-Vitro (IVT) y purificación de sgRNAs

La síntesis de los sgRNAs se llevó a cabo mediante una IVT utilizando el ADN molde generadoy purificado en el apartado 3.3.2. Se utilizó el HiScribeTM T7 High Yield RNA synthesis Kit [N°de catálogo: E2040S, New England Biolabs (NEB)]. Se preparó la reacción de transcripciónen 20µL finales, según la Tabla 11, usando aproximadamente entre 1 y 2µg del ADN moldeobtenido por PCR, luego se incubaron los tubos a 37°C ON (16 horas) (Bassett et al., 2013).Los sgRNAs se purificaron con el Monarch® RNA Cleanup Kit [N° de catálogo: T2040S, NewEngland Biolabs (NEB)], y luego se midió su concentración y pureza en el nanodrop. Se realizóuna electroforesis en gel de agarosa al 2% específico para ARN con los guías purificados.Para preparar el gel se añadió 1g de agarosa en 47,5mL de buffer MOPS (1X) (ver Anexo),se disolvió la agarosa calentando, y se agregaron 2,5mL de formaldehido, y 4µL de bromurode etidio (20µg/mL). Para correr las muestras, se colocó 1µL de sgARN purificado junto con9µL de agua, 5µL de buffer de carga para ARN (ver Anexo), y se calentaron las muestras por10 minutos a 65°C. Una vez cargadas las muestras, el gel se corrió a 100V durante 45 minutos.Los sgRNAs se almacenaron a -80°C para evitar su degradación

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Tabla 11. Reactivos utilizados en 20µL finales por reacción de IVT para generar los sgRNAs

Reactivos Volumen Concentración final10X buffer de reacción 2µL 1X

ATP (100mM) 2µL 10mM finalCTP (100mM) 2µL 10mM finalGTP (100mM) 2µL 10mM finalUTP (100mM) 2µL 10mM final

ADN molde - 1-2 µg.T7 ARN polimerasa mix 2µL

3.4 Evaluación de la actividad de la SaCas9

A efectos de corroborar que el sistema CRISPR/SaCas9 generado en el laboratorio funcionacorrectamente, se llevaron a cabo ensayos para evaluar in-vitro la actividad de la SaCas9recombinante. Según Burle-Caldas et al., 2018 es necesario incubar por 1 hora a 37°C ,6µgde SaCas9 (obtenida en el apartado 3.1) con 2µg de ADN blanco purificado a cortar (obtenidoen el apartado 3.2), 6µg de sgRNA purificado dirigido a uno de los genes en cuestión (obtenidoen el apartado 3.3) y 2µL del buffer de SaCas9 (ver Anexo). Se realizó una electroforesis engel de agarosa al 1% con el producto de la incubación para determinar si la SaCas9 efectuóel DSB correspondiente al ADN molde. Para ello es importante conocer el tamaño total de losgenes en cuestión, y el tamaño de las bandas esperadas para el corte con la SaCas9 en baseal diseño del sgRNA.

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Resultados

4.1 Expresión y purificación de la SaCas9

Para la realización de este trabajo el primer paso consistió en obtener la proteína SaCas9.Esto se llevó a cabo transformando bacterias competentes de la cepa RosettaTM 2(DE3) pLysS(Novagen) de E. coli con el plásmido comercial inducible p6xHis_NLS-SaCas9. A partir de lainducción con IPTG de 5.4 L de cultivo se obtuvieron seis pellets de 9,0 g de peso humedocorrespondientes a 900mL de cultivo cada uno, Lo que correspondió a un rendimiento de 10g/Lde cultivo. La Figura 11 muestra el contenido proteico observado por electroforesis en gel depoliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) para las muestrasobtenidas de la inducción con los controles correspondientes: bacterias sin transformar con elplásmido (s/plas), transformadas previo a la inducción (c/plas) y luego de la inducción(inducido). También se analizó la composición de la muestra proteica soluble (frac Sol) einsoluble (frac IS) obtenidas a partir de la lisis química.

Figura 11. Inducción de expresión de SaCas9. a) SDS-PAGE al 10% del perfil proteico expresadoa partir de las cepas Rosetta con y sin plásmido antes y después de la inducción de los cultivos conIPTG (carriles 1-3), y de las fracciones solubles e insolubles obtenidas a partir de la lisis química(carriles 5 y 6). Los volúmenes indicados corresponden a los cargados en el gel. En b) Marcador depeso molecular (MPM) utilizado, AccuRuler RGB PLUS (GeneBio Systems, INC™).

Se puede apreciar claramente la expresión de la proteína SaCas9 recombinante deaproximadamente 130kDa en las muestras inducidas, tanto en la fracción soluble como en lainsoluble, siendo la nucleasa la proteína más expresada en ambos casos. Se corrobora quelas muestras sin plásmido y sin inducir no expresan la proteína SaCas9 y que en términosgenerales no se observan alteraciones mayores en el perfil protéico fuera de la expresióninducida.

Luego de confirmar la correcta inducción de la proteína SaCas9 recombinante, se procedió ala purificación por afinidad en una columna de Niquel (HisTrap HP de 1mL, GE™) capturandola cola de Histidinas presente en el N-terminal de la nucleasa. En primer lugar, se preparó la

a) b)

37

columna, realizando el stripping de la misma siguiendo las instrucciones del frabricante yequilibrando con el buffer de unión (30mM Imidazol). Se obtuvo la fracción protéica solublecentrifugando el lisado bacteriano a 4000 RPM a 4°C por 30 minutos, recuperando elsobrenadante para luego filtrarlo por 0,22µm. Una vez preparada la columna y el equipo AKTA,se procedió a inyectar la fracción soluble en la columna y a lavar con buffer de unión paraeliminar todos los componentes que no se unieron a la columna. Se continuó lavando hastaobservar niveles estables de absorbancia similares a los observados previamente a lainyección de la muestra. En estas primeras eluciones se colectaron las fracciones de proteínasno unidas, que corresponden al Flow-through (FT). Luego se procedió a incrementar laconcentación de imidazol en tres lavados y se colectaron muestras para analizar por SDS-PAGE. El primer lavado (L1) se realizó en 53 mM de imidazol (5/95% elución/unión), elsegundo en 82 mM (11/89% elución/unión) y el tercer lavado (L3) se realizó con 124 mM deimidazol o (20/80% elución/unión). Para el lavado final de la columna (elución, E) se utilizó 500mM de imidazol, lo cual correspondía al 100% del buffer de elución. El contenido de loslavados junto con el de la elución y el FT se visualizaron mediante SDS-PAGE (Figura 12).Además, se sembró una alícuota de SaCas9 producida en el laboratorio de la ProfesoraSantuza Teixeira (Universidad Federal de Minas Gerais) que fue donada para uso comocontrol.

Figura 12. Purificación por Afinidad de SaCas9 a) SDS-PAGE al 10% de las diferentes fraccionesobtenidas a partir de la cromatografía de afinidad. Se presentan FT (fracción no retenida), Lavados L1,L2 y L3 (53, 82 y 124 mM de imidazol respectivamente), el eluyente final E (500mM de imidazol) ycomo control una alícuota de SaCas9 donada, ST. Se presentan los volúmenes de muestra cargadosen cada carril del gel. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado, AccuRuler RGB PLUS (GeneBioSystems, INC™).

a) b)

38

En el análisis por SDS-PAGE se puede apreciar que la SaCas9 expresada y purificada eneste trabajo coincide en peso molecular con la SaCas9 tomada como referencia (130 kDAaproximadamente), a pesar de que en esta muestra control se observa también un posiblecontaminante de aproximadamente 100 kDa. Se obtuvo la mayor concentración de SaCas9en el lavado correspondiente a 82 mM de imidazol (L2). Sin embargo, también se pudoobservar elución de la proteína en L1 y en L3 en concentraciones sensiblemente menorescomparado a L2. También se pueden observar bandas revelando la presencia de proteínasde menor tamaño al esperado para SaCas9 en L2, que podrían corresponder a contaminantesque se co-purifican con la SaCas9, o productos de degradación resultantes de la manipulaciónen el proceso de purificación. En la elución final (E) no se visualiza ningún tipo de bandas.

Luego de observar que en el segundo lavado (82mM de imidazol) se obtenía la mayorconcentración de proteína. Se repitió la expresión y la purificación de la SaCas9, en este casoconsiderando un único lavado con 82mM de imidazol, y una elución con 20% de buffer deelución (124 mM). Luego se procedió a realizar una purificación por gel filtración con lacolumna PD-10 siguiendo las instrucciones de fabricante (ver apartado 3.1.3). También seutilizó un centricon Milipore para tubo de centrifuga de 50 mL con umbral de corte en 30KDa(ver apartado 3.1.3) y se monitoreo la concentración por espectofotometría hasta alcanzar laconcentración deseada, que resulto en 2,4µg/µL. En total se obtuvieron 24 mg de proteínaSaCas9 que se alicuotó en 40% glicerol a efectos de mantener su integridad y se preservó a-20°C.

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4.2 ADN blanco

Luego de conseguir expresar, purificar y conservar la SaCas9 en una concentración óptimase pasó a la preparación de los elementos para el ensayo de evaluación de la actividad. Enprimer lugar se amplificaron por PCR regiones genómicas de los tres genes blancos a someteral ensayo de evaluación utilizando los cebadores y procedimientos detallados en el apartado3.2.2.

4.2.1 gp72

Se tomó el gen gp72 para poner a punto el ensayo de evaluación de la actividad Cas9 a nivelde prueba de concepto, ya que para este gen se han diseñado estrategias eficaces de KO porCRISPR/Cas en el laboratorio de la Profesora Santuza Teixeira, colaboradora de nuestrogrupo de trabajo. Se utilizaron 170 ng de ADN genómico de Trypanosoma cruzi cepa CLbrener para la amplificación en un volumen de reacción de 50 µL utilizando los parámetrosespecificados previamente (Burle-Caldas et al., 2018). La presencia del fragmento de 1,7kbesperado se evaluó por electroforesis en gel de agarosa al 1% (Figura 13).

Figura 13. Amplificación de gp72. a) Electroforesis en gel de agarosa al 1% para el producto deamplificación por PCR de una región genómica del gen gp72. Entre paréntesis se indican losvolúmenes cargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (GeneRuler 1kbDNA Ladder, ThermoFisher Scientific).

El fragmento obtenido en la amplificación del gen gp72 presenta el tamaño esperado tomandocomo referencia el marcador de peso molecular. También se observan al menos dosfragmentos de menor peso molecular (entre 250 y 500 pb) y por ello, para purificar el productodeseado, se recorto la banda del gel en el tamaño específico y se utilizó el Monarch® DNAGel extraction Kit (N° de catálogo: T1020S, NEB). Una vez purificado el producto obtenido, seobservó una concentración de 222 ng/µL al analizar una alícuota en un espectrofotómetro demicrovolúmenes (Nanodrop™).

a) b)

40

4.2.2 mNeonGreen

Para amplificar mNeonGreen en una reacción de 50µL se utilizaron 90 ng de ADN genómicode una línea celular de T. cruzi cepa CL brener que porta integrado al genoma un locus deexpresión para la proteína fluorescente. Se realizaron reacciones de PCR a tres temperaturasdiferentes (58°C, 59°C y 60°C) en un termociclador de gradiente a efectos de identificar latemperatura de hibridación óptima. La amplificación del fragmento esperado de 499pb paraeste gen se analizó por electroforesis de agarosa al 1.5% (Figura 14).

Figura 14. Amplificación de mNeon. a) Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% del productoobtenido por PCR para mneon con diferentes temperaturas de annealing (58°C, 59°C y 60°C). Losvolúmenes entre paréntesis son los cargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM)utilizado (100 bp DNA Ladder, NEB).

Aún cuando se obtuvo un fragmento de tamaño esperado a las tres temperaturas evaluadas,considerando la intensidad de las bandas, se logró la mejor amplificación en la reacción con59°C para la hibridación. Sin embargo, no se obtuvo cantidad de ADN suficiente, así que setomó el producto obtenido en esta primera reacción para utilizarlo como molde en una segundareacción de amplificación por PCR. En estas reacciones también se utilizó la Taq DNAPolymerase, recombinante. Para determinar la concentración óptima del molde se hicieron tresreacciones de 25µL, variando la concentración y el volúmen del molde, en todos los casosutilizando el producto obtenido a 59°C: A- 1µL de una dilución 1/10; B- 1µL sin diluir; C- 10µLsin diluir. Estas tres reacciones se analizaron en una electroforesis en gel de agarosa al 1.5%(Figura 15).

a) b)

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Figura 15. Amplificación de mNeon utilizando producto de PCR como molde. a) Electroforesisen gel de agarosa al 1,5% de los productos de PCR de mNeon, con diferentes cantidades de moldedel producto obtenido a 59°C (Figura 15). mNeon A- 1µL de una dilución 1/10; mNeon B- 1µL sindiluir; mNeon C- 10µL sin diluir. Los volúmenes indicados entre paréntesis corresponden a loscargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (100 bp DNA Ladder, NEB).

En esta electroforesis se puede apreciar que mNeon amplificó en todas las reacciones dandolugar al producto esperado de aproximadamente 500pb. En la reacción C es donde se obtuvomás cantidad de producto, si embargo, en esta reacción se observaron productosinespecíficos de amplificación, los cuales no estaban presentes en las reacciónes A y B.Dado que se necesita mucha cantidad de ADN molde para los ensayos de evaluación de laSaCas9 (2µg), se realizaron 30 reacciones de PCR de 50µL utilizando como molde 1µL dela dilución 1/10 del producto de PCR obtenido a 59°C. Los productos de PCR obtenidosfueron purificados con el QIAquick PCR Purification Kit (N° catálogo: 28104, QIAGEN). Laconcentración de los productos purificados fue medida por espectrofotometría y seregistraron valores en el rango de 20 y 40ng/µL para todas las reacciones, dando comoresultado aproximadamente 9µg totales de producto.

4.2.3 rbp38

Para amplificar por PCR rbp38 se utilizó ADN genómico de la cepa TcIA de T. cruzi con unaconcentración de 32 ng/µL. Con el fin de determinar la cantidad óptima de ADN molde paraamplificar la región genómica de rbp38 se hicieron cuatro reacciones variando el volumen deADN genómico (reacciones A, B, C y D, para respectivamente 10, 7, 5 y 3µL). Los productosde PCR de un tamaño esperado de 796 pb se analizaron en una electroforesis en gel deagarosa al 1.5% (Figura 16).

a) b)

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Figura 16. Amplificación de rbp38. a) Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de las reacciones dePCR para rbp38 con diferentes volúmenes de ADN genómico. rbp38 A- 10µL; rbp38 B- 7µL; rbp38C- 5µL y rbp38 D- 3µL de ADN molde. Entre paréntesis se indican los volúmenes cargados en cadacarril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (TrackIt 100 bp DNA Ladder, ThermoFisherScientific).

En primer lugar, se puede observar que hay producto de amplificación para las cuatroreacciones, ya que las bandas observadas coinciden aproximadamente con la banda de800pb del MPM utilizado. El mejor resultado respecto a la cantidad de ADN producido seobtuvo al utilizar 5uL (C), aunque se observa que amplificaron productos inespecíficos, enparticular un fragmento de peso molecular menor (aproximadamente 700pb). A efectos deobtener suficiente ADN molde para el ensayo con la SaCas9 se realizaron 20 reacciones dePCR de rbp38 de 25µL con 5µL de ADN genómico de la cepa TcIA. Los productos obtenidosfueron purificados con el QIAquick PCR Purification Kit (N° de catálogo: 28104, QIAGEN).Se midió la concentración de los productos purificados por espectrofotometría y seobservaron valores en el rango de 20 y 60 ng/µL, dando como resultado 8µg totales deproducto.

a) b)

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4.3 Primer diseño de sgRNA

Luego de obtener la nucleasa y los ADN blanco a ser cortados, se debe contar con los ARNguía (sgRNA) que son los responsables de dirigir los cortes. Se optó por una estrategia deproducción de los sgRNA por transcripción in-vitro (IVT) a partir de moldes de ADNsintetizados con oligonucleótidos solapantes. Varios servidores web ofrecen el diseño de lossgRNA considerando una región genómica y un genoma de referencia para descartar aquellossgRNA que presenten muchos sitios posibles de reconocimiento dentro del genoma (off-targets). En esta instancia se optó por trabajar con el sitio CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)ya que cuenta con diseño específico para la SaCas9 y al mismo tiempo cuenta en su base dedatos con el genoma de T. cruzi como referencia. En primer lugar se diseñó un sgRNA parael gen rbp38 y los oligonucleótidos para la sintesís del molde de la IVT se muestran en laTabla 12. El diseño en el sitio CRISPOR da como resultado dos oligonucleótidos, uno directo(Fw) y uno reverso (Rv). El oligonucleótido directo de 67 nt incluye la secuencia promotorapara la ARN polimerasa T7, la secuencia guía de 21 nt complementaria a la secuencia del genrbp38 y una región de 23 nt de la secuencia estructural de sgRNA (región scaffold), que almismo tiempo aporta complementaridad para la hibridación con el oligonucleótido reverso. Porsu parte, el oligonucleótido reverso de 80 nt porta la región scaffold completa que seráuniversal para cualquier sgRNA siempre que se utilice la misma Cas9 (ver apartado 3.3.2,Figura 10). Por lo tanto, solo se requiere diseñar nuevos oligonucleótidos directos en funciónde los genes que hayan sido elegidos para trabajar. Considerando que el ADN a digerirpresenta un tamaño de 796pb se espera observar una doble banda de igual tamaño(aproximadamente 400pb) en un gel de electroforesis ya que se producen fragmentos de406pb y 390pb según el sitio donde el sgRNA dirige el corte.

Tabla 12. Oligos solapantes diseñados en CRISPOR para sintetizar los sgRNAs para rbp38. Enrojo se marca secuencia correspondiente al promotor fuerte T7, en azul a la secuencia complementariaal gen rbp38 y en verde se representa el scaffold del sgRNA.

Luego de diseñar y sintetizar los oligos correspondientes, se realizó una PCR para extenderextremos y generar el ADN molde completo doble hebra (ver apartado 3.3.2). Los productosde ADN doble hebra obtenidos se visualizaron mediante una electroforesis en gel de agarosaal 2% (Figura 17). En el gel se puede apreciar una única banda con un correcto peso molecularestimado (100 pb con respecto al MPM utilizado). Dicho ADN molde fue purificado con elQIAquick PCR Purification Kit (N° catálogo: 28104, QIAGEN), y se determino porespectrofotometría su concentración (205 ng/µL) y pureza (1,9 Abs 260/Abs280).

Gen Primersrbp38 Fw:5’-

GAAATTAATACGACTCACTATAGTATAAAAAATGCCGCTGCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’Rv:5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’

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Figura 17. Generación del molde para IVT del sgRNA para rbp38. a) Electroforesis en gel deagarosa al 2% del producto de PCR generado a partir de los oligos solapantes para generar el ADNmolde del sgRNA de rbp38. Entre paréntesis se indican los volúmenes cargados en cada carril. b)Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (TrackIt 100 bp DNA Ladder, ThermoFisher Scientific).

Se realizó la IVT a partir de 1.5 µg de ADN molde purificado para rbp38 (7,5µL) utilizando elkit comercial HiScribeTM T7 High Yield RNA (N° de catálogo: E2040S, NEB) y siguiendo lasrecomendaciones del fabricante para generar ARNs de pequeño tamaño (ver apartado 3.3.3).El sgRNA de rbp38 generado, fue purificado con el Monarch® RNA Cleanup Kit (N° catálogo:T2040S, NEB), y se obtuvieron 10µL de una concentración de 9µg/µL, por lo que se obtuvieron90 µg de sgRNA en total. El sgRNA producido se muestra en la Figura 18, carril 4.

4.4 Primer ensayo de evaluación del sistema

Una vez obtenidos todos los componentes del sistema de edición CRISPR/Cas9 se procedióa evaluar su actividad en conjunto en un ensayo de digestión in-vitro. En breve, se incuban a37°C durante una hora 2µg de ADN blanco junto a 6µg de sgRNA y 6µg de SaCas9 (Burle-Caldas et al., 2018) y se evalua el efecto de la acción de la nucleasa mediante electroforesisen gel de agarosa al 1%. Para este ensayo de evaluación se dispuso además de una SaCas9comercial a efectos de comparar la eficiencia de corte de la nucleasa SaCas9 producida eneste trabajo. Se realizaron 4 incubaciones, 2 correspondientes a ensayos de digestión: unocon la SaCas9 comercial y otra con la SaCas9 producida en nuestro trabajo. Las otras 2incubaciones correspondían a controles: uno que solo incluía ADN blanco y otro solo con elsgRNA, a efectos de evaluar el patron de migración de estos componentes individualmente,así como para descartar algún efecto por degradación no debida a la SaCas9 en lascondiciones del ensayo. Luego de la incubación se analizaron las muestras por electroforesisen gel de agarosa al 1% (Figura 18).

a) b)

45

Figura 18. Ensayo de evaluación de la actividad de la SaCas9 sobre un ADN blanco de rbp38.a) Electroforesis en gel de agarosa al 1% del ensayo de evaluación del sistema: 1- ensayo de digestiónde rbp38 con la SaCas9 producida en este trabajo; 2- ensayo de digestión de rbp38 con una SaCas9comercial; 3- ADN blanco de rbp38. 4- sgRNA de rbp38. Los volúmenes entre paréntesis son loscargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (GeneRuler 100bp Plus DnaLadder, ThermoFisher Scientific).

En primer lugar, se verifica en el carril 3 la migración del ADN blanco, el cual muestra unfragmento principal migrando a los 800pb, y dos subproductos generados durante laamplificación por PCR menores, de aproximadamente 700pb y de 300pb tomando comoreferencia el MPM. En el carril 4, se puede observar el patrón de migración del sgRNA, comoun smear de bajo peso molecular, menor a la ultima banda del MPM de 100pb. En los carrilesdonde se cargaron ensayos de digestión, ya sea con la SaCas9 producida en el laboratorio(carril 1) o la comercial (carril 2), se puede apreciar el fragmento completo de ADN blanco derbp38, junto con los subproductos generados en la amplificación por PCR del ADN molde yel sgARN. En ninguno de los casos se pudo observar evidencia de la acción de las nucleasas,ya que no se observa ninguna banda correspondiente a los fragmentos de aproximadamente400 pb que se producirían por el DSB generado por las SaCas9.

b)a)

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4.5 Segundo diseño de sgRNAs

Dado el resultado inesperado en los ensayos de digestión, donde no se pudo apreciar laactividad de corte de las SaCas9, y considerando que se utilizó una nucleasa comercial quedebería ser una enzima activa, se pasó a reevaluar exhaustivamente la conformación de lossgRNA. En particular, se revisó el diseño de los oligonucleótidos solapantes y se detectó quela secuencia provista en el sitio CRISPOR del oligo reverso, donde se codifica la regionscaffold, se correspondía con la secuencia de los sgRNA para la nucleasa SpCas9, másampliamente utilizada que la SaCas9. En la Figura 19 se muestra un alineamiento realizadoen el paquete de software MEGA-X de las secuencias de scaffolds de ambas nucleasas. Sepuede apreciar mediante este análisis las diferencias entre estas secuencias.

Figura 19. Alineamiento de regiones scaffold de los sgRNA para SpCas9 y SaCas9. Se utilizo elalgoritmo muscle del paquete MEGA-X (https://www.megasoftware.net/) para el alineamiento de lassecuencias correspondientes a las regiones scaffold de la SpCas9 (arriba) y de la SaCas9 (abajo).

Dado que el equipo de mantenimiento del sitio CRISPOR está continuamente aplicandomejoras a las herramientas ofrecidas en base a la experiencia de los usuarios, esta imprecisiónfue notificada al equipo desarrollador del sitio. Luego de revisar la información provista pornosotros la imprecisión se corrigió en la última actualización del sitio (versión Version 4.98,junio 2020, http://crispor.tefor.net/doc/changes.html).

Mientras el sitio actualizaba sus datos, llevamos a cabo un nuevo diseño de losoligonucleótidos solapantes, ajustando manualmente la secuencia para corresponderla con lasecuencia scaffold de la SaCas9. Se utilizó la misma secuencia del promotor T7, la secuenciahomóloga a los diferentes genes blanco, y se modificó la secuencia scaffold afectando porcompleto el oligo reverso universal y parcialmente a los oligos directos, donde se ajusto laregión 3’ que permite la hibridación entre ambos oligos. Para corroborar que la ausencia deactividad de la nucleasa se debiera exclusivamente a incorporar la región scaffold errónea yexcluír la posibilidad del diseño de los sgRNA, se incorporó la evaluación del sistema para elgen gp72 a modo de control positivo. En este ensayo se tomó el diseño de sgRNA y se siguióestrictamente el protocolo puesto a punto en el laboratorio de la Prof. Santuza Teixeira (Burle-Caldas et al., 2018). Los nuevos oligos solapantes para la síntesis de los sgRNAs de gp72,rbp38 y mNeon se muestran en la Tabla 13. Luego de diseñar y ordenar la síntesis de losnuevos oligos a los proveedores de este servicio, se realizaron las PCRs según el apartado3.3.2 para sintetizar los ADN molde que se utilizaron en la producción de los distintos sgRNAspor IVT (ver apartado 3.3.3).

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Tabla 13. Oligos solapantes corregidos con el scaffold de la SaCas9. En rojo se marca secuenciacorrespondiente al promotor fuerte T7, en azul a la secuencia complementaria a los genes blancocorrespondientes y en verde se representa el scaffold del sgRNA.

Gen Primergp72(scaffoldSaCas9)

Fw:5’-AAGCTAATACGACTCACTATAGGTGTCACTTCCGGTGTAGGCGTGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAA-3’

gp72(scaffoldSpCas9)

Fw:5’-AAGCTAATACGACTCACTATAGGTGTCACTTCCGGTGTAGGCGTGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’

rbp38 Fw:5’-AAGCTAATACGACTCACTATAGGTATAAAAAATGCCGCTGCATCGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAA-3’

mNeon Fw:5’-AAGCTAATACGACTCACTATAGGTACGGCCTGAACACCAACCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAA-3’

ReversoUniversalSpCas9

Rv: 5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’

ReversoUniversalSaCas9

Rv:5’-TAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAAC -3’

4.5.1 gp72

Para corroborar la hipótesis de ausencia de actividad debido a la secuencia scaffold incorrecta,para el gen gp72 se generaron por PCR dos ADN molde para IVT de los sgRNA, uno con elscaffold del SaCas9 y otro con el de SpCas9. Los productos de PCR fueron purificados y sedeterminó su concentración por espectrofotometría. Se obtuvieron los moldes para IVT de lossgRNA con el scaffold SaCas9 a una concentración de 147.5 ng/µL y con el scaffold deSpCas9 a 132.3ng/µL. Estos productos purificados se evaluaron por electroforesis en un gelde agarosa al 2% (Figura 20).

Figura 20. Moldes para IVT de los sgRNA para el gen gp72. a) Electroforesis en gel de agarosa al2% de los ADN molde generados para producir los sgRNAs de gp72. A- sgRNA con scaffold deSaCas9. B- sgRNA con scaffold para SpCas9. Los volúmenes entre paréntesis son los cargados encada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (GeneRuler 100bp Plus Dna Ladder,ThermoFisher Scientific).

a) b)

48

Se puede apreciar que para ambos moldes se observan bandas por encima del fragmento de100pb del MPM, acorde a lo esperado (124pb SpCas9, 128pb SaCas9). En este punto se pasóa realizar las IVT según las instrucciones del fabricante del kit (ver apartado 3.3.3), utilizando10µL de ADN molde (1.3 y 1.5 µg respectivamente para SpCas9 y SaCas9). Los sgRNA degp72 obtenidos se purificaron y se determinó su concentración por espectrofotometría,resultando en 2.02 µg/µL y 1.78 µg/µL respectivamente para los scaffolds de SpCas9 y SaCas9.Se analizó la integridad de los sgRNA por electroforesis en gel de agarosa al 2% con bufferMOPS (Figura 21). A pesar de que se obtuvo una señal de menor intensidad para el sgRNAcon scaffold de SaCas9, se pudo corroborar que ninguno de los dos sgRNAs se encuentradegradado.

Figura 21. Visualización de los sgRNAs de gp72. a) Electroforesis en gel de agarosa al 2% con bufferMOPS, de los sgRNA de gp72. A- sgRNA con scaffold para SaCas9. B- sgRNA con scaffold paraSpCas9. Los volúmenes entre paréntesis son los cargados en cada carril. b) Marcador de pesomolecular (MPM) utilizado (GeneRuler 100bp Plus Dna Ladder, ThermoFisher Scientific).

4.5.2 rbp38 y mNeon

En esta instancia, para los genes rbp38 y mNeon se produjo únicamente el ADN moldecodificante para los sgRNA con scaffold de la SaCas9 el cual luego de purificado se utilizópara realizar las IVT. Los sgRNA obtenidos fueron purificados y se determinó su concentraciónpor espectrofotometría, resultando en 2,1 µg/µL para el sgRNA de mNeon y 1.9 µg/µL pararbp38. Se pudo corroborar el estado de los sgRNA mediante electroforesis en gel de agarosaal 2% con buffer MOPS (Figura 22), donde no se observaron señales de degradación.

a) b)

49

Figura 22. Visualización de los sgRNAs de mNeon y rbp38. a) Electroforesis en gel de agarosa al2% con buffer MOPS de los sgRNA de mNeon y rbp38. Entre paréntesis se indican los volúmenescargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (Century™-Plus RNAMarkers, ThermoFisher Scientific).

a) b)

50

4.6 Segundo ensayo de evaluación del sistema

4.6.1 gp72

En una primera instancia se evaluó el nuevo diseño del sgRNA para gp72 utilizando la SaCas9producida en este trabajo. Se realizó el ensayo de digestión sobre el ADN blanco de gp72 de1700 pb. Considerando el sitio donde el sgRNA dirige el corte doble hebra se espera que selibere un fragmento de 1100 pb y otro de 600 pb. En la Tabla 14 se presentan los componentesdel ensayo de digestión (reacción 1) y de los controles preparados (reacciones 2 y 3). Luegode la incubación a 37 °C por una hora las reacciones se analizaron por electroforesis en ungel de agarosa al 1% (Figura 23).

Tabla 14. Reactivos utilizados en cada reacción que se realizó para llevar a cabo el ensayo deevaluación de corte de gp72 con la SaCas9 expresada y purificada en el laboratorio y los controlescorrespondientes.

ReacciónReactivo

1 2 3

Buffer SaCas9 2µL - -SaCas9 (total 6µg) 2,5µL - -sgRNA (total: 6µg) 3,4µL - 3,4µL

gp72 (total: 2 µg y 0.4 µg) 9µL 2µL -Agua 3,1µL 11µL 16,6 µL

Figura 23. Ensayo de actividad SaCas9 con nuevo diseño de sgRNAs para gp72. a) Electroforesisen gel de agarosa al 1% del primer ensayo de evaluación con gp72 utilizando el sgRNAcorrespondiente al nuevo diseño adaptado para el scaffold de SaCas9. 1- Incubación de la SaCas9producida en este trabajo (6µg) con el sgRNA con scaffold de SaCas9 (6µg) y ADN blanco para gp72(2µg). 2- ADN blanco de gp72 (0.4 µg). 3- sgRNA (6µg). Entre paréntesis se muestran los volumenescargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (GeneRuler 1kb DNA Ladder,ThermoFisher Scientific).

b)a)

51

Para el control con ADN blanco (carril 2) y el control del sgRNA (carril 3) se observan lasbandas esperadas en ambos casos, sin señales de degradación. En el carril donde se cargóel ensayo de digestión (carril 1) se observan cuatro bandas, una que coincide con el sgRNA(carril 3), otra que coincide con el ADN blanco de gp72 (carril 2), y luego se observan 2 bandasque coinciden aproximadamente con los fragmentos esperados de ser digerido el ADN blanco(1,1 kb y 600pb), al comparar con el MPM. Por lo tanto, se pudo corroborar la actividad de laSaCas9 al evidenciarse fragmentos resultantes del corte por esta nucleasa. Sin embargo,dado que se observa ADN blanco de 1.7 kb se puede concluir que en las condiciones yproporciones del ensayo la digestión no fue completa

En este punto se decidió realizar un ensayo para corroborar que el nuevo diseño del sgRNAsera efectivamente el responsable de recuperar la actividad de la nucleasa. Se realizó un nuevoensayo de digestión para el gen gp72, pero esta vez incorporando los sgRNAs con scaffoldde SpCas9 y utilizando tanto la SaCas9 generada en nuestro trabajo como la SaCas9 controlcomercial (reacciones 4 y 5). A su vez se repitió el ensayo de digestión anterior, es decirutilizando el sgRNA con el scaffold de SaCas9 y la nucleasa generada en nuestro trabajo(reacción 3). En la Tabla 15 se indican los componentes que se incorporaron en cada reacción,incluidos los controles con solo sgRNA y solo ADN blanco (reacciones 1 y 2 respectivamente).

Tabla 15. Reactivos utilizados en cada reacción que se realizó para llevar a cabo el ensayo deevaluación de corte de gp72 para determinar la influencia de la incorporación de la secuencia correctapara el sgRNA.

Reacción

Reactivo1 2 3 4 5

Buffer SaCas9 - - 2µL 2µL 2µLSaCas9 comercial

(total: 6µg) - - -- 2,4µL -

SaCas9 del trabajo(total: 6µg) - - 2,5µL - 2,5µL

sgRNA scaffoldSpCas9 (total: 6µg) 3µL - - 3µL 3µL

sgRNA scaffoldSaCas9 (total: 6µg) - - 3,4µL - -

ADN blanco gp72(total: 0.4 y 2µg) - 2µL 9µL 9µL 9µL

Agua milli-Q 17µL 11µL 3,1µL 3,6µL 3,5µL

52

Figura 24. Ensayo de actividad SaCas9 con ambos diseños de sgRNAs para gp72.a) Electroforesis en gel de agarosa al 1% del segundo ensayo de evaluación con gp72 utilizando ambossgRNA, correspondiente al nuevo diseño adaptado para el scaffold de SaCas9 como el diseño originalbasado en la secuencia del scaffold de la SpCas9. 1- SgRNA para gp72 (6µg) 2- ADN blanco de gp72(0.4 µg). 3- Ensayo para la SaCas9 producida en este trabajo (6µg) con el nuevo sgRNA con scaffoldpara SaCas9 (6µg) y ADN blanco para gp72 (2µg). 4- Ensayo para la SaCas9 comercial (6µg) con elsgRNA original de scaffold para SpCas9 (6µg) y ADN blanco para gp72 (2µg). 5- Ensayo para laSaCas9 de este trabajo (6µg) con el sgRNA original de scaffold para SpCas9 (6µg) y ADN blanco paragp72 (2µg). b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (GeneRuler 1kb DNA Ladder,ThermoFisher Scientific).

En la Figura 24 se presenta el análisis por electroforesis en gel de agarosa al 1% de lasreacciones. En dicha figura se puede corroborar la acción de la nucleasa para el carril 3, dondese aprecian dos bandas correspondientes al corte por la SaCas9 (1.1 kb y 600 pb) de formamayoritaria y muy tenue la banda correspondiente al fragmento de ADN blanco sin digerir(1.7kb). Se pueden apreciar bandas contaminantes correspondientes a productosinespecíficos de amplificación ya que los mismos están presentes en el control con ADNblanco solo (carril 2), a pesar de que la señal en este caso es más tenue porque se cargómenos cantidad de producto. Se puede decir que en este caso la digestión por parte de laSaCas9 generada en nuestro trabajo es casi completa, ya que una alta proporción del ADNfue digerido en las condiciones del ensayo. Para los ensayos con el sgRNA original, con lasecuencia del scaffold SpCas9, se puede apreciar que no hay actividad de corte en ningunade las nucleasas (SaCas9 comercial en carril 4, SaCas9 de este trabajo, carril 5) ya que no seobservan claramente ambas señales de corte en 1.1 kb y 600 pb. Sin embargo, si se puedenapreciar los productos de amplificación inespecífica, incluso con mayor claridad que en el carril2. Algunos de estos productos dan lugar a bandas que migran de forma similar a losfragmentos de corte, sin embargo, estos se pueden diferenciar gracias a la resolución obtenidaen el gel. De esta forma podemos concluir que incorporar la secuencia del scaffold de SpCas9

a) b)

53

efectivamente llevó a la falta de actividad de la nucleasa en nuestro diseño original, dondeesto no fue percibido.

4.6.2 mNeon y rbp38

Luego de corregir la imprecisión en el diseño de los sgRNA y confirmar que la nucleasagenerada en nuestro trabajo presentaba actividad corroborada para el sistema con gp72, seprocedió a evaluar nuestros diseños de sgRNAs para los genes mNeon y rbp38. Es importantemencionar que para los siguientes ensayos de evaluación de la SaCas9, no se utilizaron lascantidades recomendadas por Burle-Caldas et al., 2018, sino que se utilizó la mitad de cadauno de los reactivos, ya que el ADN blanco a digerir resultó ser limitante para ambos genes.Por lo tanto, se emplearon 3µg de sgRNA, 3µg de SaCas9 y 1µg de ADN blanco, y en algunoscasos se llevó el volumen total de reacción a 30µL en lugar de los 20µL originales.

4.6.2.1 mNeon

Para el primer ensayo de digestión con mNeon se realizaron los 2 controles de incubación deADN blanco y sgRNA (reacciones 1 y 2) y un ensayo de actividad (reacción 3) según la Tabla16. Para este gen, el ADN blanco a digerir tiene un tamaño de 499pb y considerando el sitiodonde el sgRNA dirige el corte se esperan observar dos fragmentos al actuar la nucleasa, unode 313pb y otro de 186pb.

Tabla 16. Reactivos utilizados en cada reacción que se realizó para llevar a cabo el ensayo deevaluación de corte de mNeon con la SaCas9 expresada en el laboratorio y el sgRNA del nuevo diseño.

El resultado de este primer ensayo se analizó por electroforesis en agarosa al 1% (Figura 25).Donde se cargó el sgRNA (carril 1) es posible observar dos bandas de por encima de lareferencia de 100pb. Este patrón de migración para los sgRNA se había observadopreviamente y es probable que responda a conformaciones alternativas de este ARN y no ala degradación del mismo. Se pudo confirmar la migración del fragmento de ADN blanco a sercortado (carril 2), donde se observó una única banda a la altura de 500 pb. Para el ensayo deevaluación del sistema (carril 3), se puede apreciar tanto el sgRNA como el fragmento demNeon sin digerir con migraciones similares a los controles. También se observan una bandaligeramente por encima de la referencia de 300pb y otra por debajo de la referencia de 200pb,correspondientes a los fragmentos resultantes de la digestión, corroborando la funcionalidaddel sistema que se diseño para el corte del gen mNeon. Además, cercano a la referencia de600pb es posible observar otra banda, de mayor peso molecular que el fragmento completode ADN blanco. En base a esta observación se especula que esta banda pueda correspondera un complejo macromolecular del ADN blanco ya sea con la proteína SaCas9 o con el sgRNA,

Reacción

Reactivo1 2 3

Buffer SaCas9 3µL 3µL 3µLSaCas9 (total: 3µg) - - 1,25µLsgRNA (total: 3µg) 1,4µL - 1,4µL

ADN Blanco mNeon(total: 1µg) - 25,5µL 25,5µL

Agua 25,6µL 1,5µL -

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explicando de esta forma el desplazamiento o “shift” respecto a la banda de ADN de mNeonsin digerir.

Figura 25. Primer ensayo de evaluación del sistema sobre mNeon. a) Electroforesis en gel deagarosa al 1% del ensayo de evaluación del sistema de edición diseñado para mNeon. 1- sgRNA (3µg).2- ADN blanco mNeon (3µg). 3- Ensayo de digestión con sgRNA (3µg), SaCas9 (3µg) y ADN blancode mNeon (1µg). Entre paréntesis se especifican los volúmenes cargados en cada carril. b) Marcadorde peso molecular (MPM) utilizado (TrackIt 100 bp DNA Ladder, ThermoFisher Scientific).

Con la intención de eliminar el artefacto del shift generado se volvieron a realizar ensayos deevaluación de sistema para la edición de mNeon según la Tabla 16 pero luego de la incubaciónse incorporó el tratamiento con 2 agentes que consideramos pueden contribuir a la disolucióndel complejo. Se aplicaron independientemente un tratamiento con proteasa y otro con unanucleasa de ARN para verificar la posibilidad de que ya sea la SaCas9 o el sgRNA formaranel complejo respectivamente. La reacción de digestión con la SaCas9 se dividió en dosalícuotas y se agregó 1µL de proteínasa K (800 unidades/mL, NEB) en una de ellas y 0.2µLde RNAsa H (5000 unidades/mL, NEB) con 4µL de su buffer de reacción (10X, NEB) en laotra. Ambos ensayos se incubaron por 30 minutos a 37°C y luego su contenido se analizó enun gel de electroforesis en agarosa al 1% (Figura 26). En la alícuota tratada con proteínasa Kse pudo apreciar que el complejo macromolecular desaparece al no observarse la banda deaproximadamente 600 pb (carril 3’). Al mismo tiempo, se observó una digestión básicamentecompleta del ADN blanco, ya que se observa una banda muy tenue a 500pb y una bandatestigo de la digestión a los 300pb. Sin embargo, la segunda banda de la digestión quemigraría a 200pb no se puede apreciar claramente en este gel ya que migra muy cerca de unade las bandas del sgRNA. Por otro lado, en la reacción tratada con RNAsa H (carril 3’’) no seaprecia la banda correspondiente al ADN blanco y se observa una banda muy tenue a los 300pb, evidenciando que en la reacción previo al tratamiento la nucleasa actuó de forma correcta.Sin embargo, luego del tratamiento se observa aún el complejo macromolecular comprobandoque la proteinasa K es más eficiente y degrada a la proteína Cas9 para disolver el complejo.

a) b)

55

Figura 26. Ensayo de evaluación del sistema sobre mNeon con Proteinasa K y RNAasa H.a) Electroforesis en gel de agarosa al 1% del segundo ensayo de evaluación de mNeon con la SaCas9producida en el laboratorio, y el sgRNA del nuevo diseño. 1- sgRNA (3µg). 2- ADN blanco mNeon(3µg). 3’- Primer alícuota del ensayo de digestión con sgRNA (3µg), SaCas9 (3µg) y ADN blanco demNeon (1µg) tratada con 1µL de proteinasa K (800 unidades/mL, NEB) por 30 minutos a 37°C. 3’’-Segunda alícuota del ensayo de digestión con sgRNA (3µg), SaCas9 (3µg) y ADN blanco de mNeon(1µg) tratada con 0.2µL de RNAsa H (5000 unidades/mL, NEB) por 30 minutos a 37°C. Entreparéntesis se indican los volúmenes cargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM)utilizado (GeneRuler 100bp DNA Ladder, ThermoFisher Scientific).

4.6.2.2 rbp38

En esta instancia se pasó a considerar repetir el ensayo de digestión para rbp38, esta vezutilizando los sgRNA correspondientes al scaffold de la SaCas9. Se realizó un ensayo deactividad (reacción 1) y los 2 controles de incubación de ADN blanco y sgRNA (reacciones 2y 3) según la Tabla 17. Con la experiencia ganada del ensayo generado para mNeon serealizaron los tratamientos con proteasa y nucleasa de ARN a efectos de interpretar losresultados de la digestión sin el efecto de la formación del complejo macromolecular. Demanera equivalente se separó en dos alícuotas la reacción de digestión con la SaCas9 paraagregar 1µL de proteinasa K (800 unidades/mL, NEB) en una y 0,2µL de RNAsa H (5000unidades/mL, NEB) con 4µL de su buffer (10X, NEB) en la otra y luego incubarlas por 30minutos a 37°C. El resultado de estas reacciónes junto con los controles se analizaron porelectroforesis en gel de agarosa al 1% (Figura 27).

a) b)

56

Tabla 17. Reactivos utilizados en cada reacción para el ensayo de evaluación del corte de rbp38 conla SaCas9 expresada en el laboratorio y el sgRNA con el nuevo diseño.

Figura 27. Segundo ensayo de evaluación del sistema sobre rbp38. a) Electroforesis en gel deagarosa al 1% del segundo ensayo de evaluación de rbp38 con la SaCas9 producida en el laboratorio,y el sgRNA del nuevo diseño. 1’- Primer alícuota del ensayo de digestión con sgRNA (3µg), SaCas9(3µg) y ADN blanco de rbp38 (1µg) tratada con 1µL de proteinasa K (800 unidades/mL, NEB) por 30minutos a 37°C. 1’’- Segunda alícuota del ensayo de digestión con sgRNA (3µg), SaCas9 (3µg) y ADNblanco de rbp38 (1µg) tratada con 0.2µL de RNAsa H (5000 unidades/mL, NEB) por 30 minutos a37°C. 2- sgRNA (3µg). 3- ADN blanco rbp38 (3µg). Entre paréntesis se indican los volúmenescargados en cada carril. b) Marcador de peso molecular (MPM) utilizado (GeneRuler 100bp DNALadder, ThermoFisher Scientific).

Vale recordar que para este gen se obtuvo un fragmento a digerir de 796pb y se espera unadoble banda de aproximadamente 400pb dado el sitio de corte dirigido por el sgRNA. En loscarriles donde se cargaron los controles (2 y 3) se obervan perfiles muy similares a los vistosen el primer ensayo de digestión de rbp38, no hay señales de degradación de las moléculasy se aprecia una banda tenue de amplificación inespecífica justo por debajo de la bandaprincipal de 800pb para el carril con ADN blanco. En el carril donde se cargó la reacción tratadacon proteinasa K (carril 1’) se pueden visualizar tres bandas principales, la correspondiente alsgRNA, otra correspondiente al ADN blanco de rbp38 sin digerir y sin presencia de un shift, yfinalmente la doble banda que evidencia el corte generado por la SaCas9 de

Reacción

Reactivo1 2 3

Buffer SaCas9 2µL 2µL 1µLSaCas9 (Total: 3µg) 1,25µL - -SgRNA (Total: 3µg) 1,55µL 1,55µL -ADN blanco rbp38

(Total: 1µg) 10,6µL - 11,6µLAgua 4,6µL 16,45µL 7,4µL

a) b)

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aproximadamente 400pb. Al igual que en el carril 3 se observa la banda inespecífica en elADN sin digerir y también se observa una banda con un perfil similar por debajo de la bandaprincipal de 400pb, por lo que el fragmento inespecífico podría representar un subproductointerno de amplificación que también presenta sitio de corte y por lo tanto da lugar a la bandaresultante del corte de la nucleasa que genera un fragmento de menor tamaño. En la reaccióncon tratamiento de RNAsa H (carril 1’’) no se pudo corroborar la acción de la nucleasa, ya queno se observan bandas a la altura de 400pb a pesar de que si se observa una disminución dela señal del ADN sin digerir y se puede apreciar un leve shift en esta banda respecto al carrilcontrol con ADN blanco. Nuevamente, el tratamiento con proteinasa K resultó ser el másindicado para poder evidenciar la actividad de la nucleasa. Se pudo comprobar la eficacia delsistema de edición diseñado para el gen rbp38 y comprobar que la nucleasa SaCas9producida en nuestro trabajo se muestra activa para llevar a cabo las actividades previstas aposteriori.

58

Discusión

CRISPR/Cas9 ha sido rápidamente elegido como el método para editar una amplia variedad degenomas, incluyendo los de patógenos eucariotas unicelulares que causan enfermedadeshumanas devastadoras. Kinetoplástidos han desafiado la manipulación genética, requiriendovarias rondas de selección para la producción de líneas transgénicas y mutantes nulos.Trypanosoma cruzi carece de la maquinaria de RNAi, por lo que los estudios de genéticafuncional han sido más limitados en estos patógenos (Medeiros et al., 2017; Barnes et al., 2012;Darocha et al., 2004). En este contexto, nuestro trabajo propuso la alternativa de evaluar yponer a punto las etapas de diseño del sistema de edición CRISPR/Cas9 de forma in-vitroutilizando genes endógenos y exógenos de este patógeno. Este sistema ya ha sido aplicadopor varios grupos de investigación trabajando en T. cruzi, logrando editar eficientemente elgenoma de este parásito (Romagnoli et al., 2020; Burle-Caldas et al., 2018; Medeiros et al.,2018; Medeiros et al., 2017; Lander et al., 2016; Lander et al.,2015; Peng et al., 2014). Aquí seplantea evaluar la producción de los componentes para el diseño de experimentos deCRISPR/Cas9 por transfección conjunta del complejo ribonucleoprotéico SaCas9/sgRNA. Laventaja de este sistema reside en evitar la necesidad de construir o trabajar con líneas queexpresen de manera constitutiva los componentes del sistema de edición, ya sea la nucleasaCas9 o el sgRNA, y de esta forma luego de que se realice la edición a nivel genómico se trabajacon una línea celular básicamente inalterada en otros aspectos.

5.1 Expresión y purificación de la SaCas9

Estudios previos han sugerido que la masa molecular podría afectar la eficiencia detransfección del complejo ribonucleoprotéico (RNP) Cas9/sgRNA (Burle-Caldas et al., 2018;Medeiros et al., 2017). A pesar de que la SaCas9 es de menor peso molecular que la nucleasamas comúnmente utilizada, la SpCas9, existe evidencia de que la primera posee una eficienciade edición equivalente a la segunda y que de hecho el tamaño de la misma es clave en la altaeficiencia de transfección que se observa en los complejos RNP en la edición genómica (Burle-Caldas et al., 2018; Medeiros et al., 2017; Nishimasu et al., 2015). Adicionalmente, la SaCas9reconoce un PAM más largo que la SpCas9 (NNGRRT versus NGG), el cual se esperaencontrar menos frecuentemente en los genomas, y de esta forma contribuir a menoreseventos de off-target (Medeiros et al., 2017). Por estas razones, en este trabajo se seleccionóla SaCas9 como nucleasa para la producción de complejos RNP de edición.

Con respecto a la cantidad de SaCas9 obtenida a partir de la producción realizada en estetrabajo, se obtuvieron rendimientos satisfactorios en los cultivos bacterianos (pellets debacterias de 10g/L) lo cual permitió obtener una gran cantidad de proteína suficiente tanto parala realización de los ensayos de evaluación aquí presentados, como para posteriores ensayosde edición genómica por transfección de cultivos de T. cruzi. Se obtuvo una mayorconcentración de la proteína expresada en la fracción soluble lo cual fue un contribuyente aque la purificación de esta fuera más sencilla. Sin embargo, en la fracción insoluble tambiénse obtuvo una señal considerable de proteína SaCas9. Esto puede representar que unafracción de la proteína no se puede plegar de forma correcta y resulta incorporada a cuerposde inclusión, así como también podría simplemente representar que parte de las bacterias no

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se lisaron y co-sedimentan con lo que denominamos fracción insoluble. Este último escenariopodría ser más plausible ya que se intentó incorporar una lisis que no fuera muy agresiva enpos de conservar la actividad de la proteína. Esta fracción insoluble fue descartada ya que seconsideró que se obtendría cantidad suficiente de proteína solo trabajando con la fracciónsoluble. Respecto a la purificación, se esperaba obtener la proteína en el tercer lavado al pasarpor la columna a un 20% del buffer de elución (124 mM de imidazol), pero se observo que lamisma eluyó en los primeros lavados de 5% y 11% (53 mM y 82 mM de imidazol) (Figura 12).El hecho de que no se requirieron altas concentraciones de imidazol para desplazar a laproteína de la fase estacionaria implica que la interacción entre el tag de histidinas y lacolumna es relativamente débil. Esto puede deberse a la existencia de un plegamientoparticular de la proteína en el extremo N-terminal que podría enmascarar parte del tag. Valenotar que el tag de histidinas no se encuentra precisamente en el extremo N-terminal ya queexisten otros elementos allí presentes. Por ejemplo, el primer elemento presente es el tag defusión Trx que se utiliza comúnmente para ayudar a solubilizar las proteínas de expresiónectopica en E. coli, ya que actúa evitando la formación de cuerpos de inclusión (Figura 28).Este elemento de 109 aminoácidos de extensión podría dificultar el reconocimiento de la colade histidinas por la columna, dando lugar a la interacción débil mencionada. También espertinente recalcar que en este trabajo no se utilizó ninguna proteasa para eliminar loselementos N-terminal que no son necesarios para la actividad de la nucleasa, aunque no sedescarta realizar este procesamiento previo a la transfección para obtener la proteína SaCas9con el menor tamaño posible para facilitar el procedimiento.

Figura 28. Extremo N-terminal de la proteína SaCas9. Elementos presentes en el extremo N-terminal de la proteína SaCas9. TrxA- Tag de fusión para la estabilización y solubilidad de la proteínarecombinante a expresar. 6xHis- Tag de histidinas para la purificación por afinidad. Thrombin site-Sitio de corte proteolítico para procesamiento posterior. S-tag- Tag de purificación/reconocimientoderivado de la Ribonucleasa A. Enterokinase site- Sitio de corte proteolítico para procesamientoposterior. SV40 NLS – Señal eucariótica de localización nuclear.

Las proteínas SaCas9 utilizadas a lo largo de este trabajo contaban con un tiempo no mayor a 18meses de criopreservación. Sin embargo, no se realizaron estudios cuantitativos de la actividad de laenzima a lo largo del tiempo. Por lo que realmente no se puede determinar con certeza el tiempo quela proteína puede ser criopreservada sin perder su actividad enzimática.

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5.2 ADN blanco

En este trabajo era muy importante contar con una gran cantidad de ADN para someter alensayo de digestión con la SaCas9, ya que, según Burle-Caldas et al., 2018, se deben utilizar2µg de ADN para cada reacción. El ADN resultó ser limitante en varias de nuestraspreparaciones para los ensayos de evaluación. Con gp72 no existieron grandescomplicaciones, porque la reacción de PCR para amplificarlo a partir de ADN genómico yaestaba puesta a punto por Burle-Caldas et al., 2018. Sin embargo, las amplificaciones demNeon y rbp38 fueron un poco más complejas, y hubo que ponerlas a punto para maximizarla cantidad de producto obtenido. Para mNeon se debía utilizar una cepa de T. cruzi quecontuviera el plásmido de integración al genoma expresando este gen reportero. Se tuvieronque realizar PCRs en gradiente para determinar que temperatura de hibridación era la óptima(Figura 14) y a partir de este resultado determinar una dilución adecuada para llevar a cabola amplificación utilizando el producto de PCRs como molde. A pesar de la optimización deesta reacción y de la gran cantidad de reacciones que se hicieron, se siguió obteniendocantidades totales relativamente bajas. Quizá se podría haber utilizado otro método depurificación, por ejemplo fenol:cloroformo, en lugar de los kits por columnas de afinidad, dadoque estas pueden saturarse y se pierde el ADN que no resultó retenido en las mismas. Cabedestacar que se utilizaron de manera indistinta dos kits diferentes de purificación de productosde PCR según la disponibilidad de ellos en el laboratorio al momento de llevar a cabo losensayos. Respecto al gen rbp38, paso algo más llamativo. En los inicios de este trabajo, serealizaron PCRs en gradiente para amplificar este gen, se probaron temperaturas dehibridación desde 53°C hasta 56°C en base a la Tm de los cebadores utlizados (Tabla 6). Sibien esta información no se muestra, se determinó que rbp38 amplificaba mejor a 53°C. Deese punto en adelante se utilizó dicha temperatura de hibridación, hasta un momento dondeno se pudo amplificar este gen a pesar de repetidos intentos. Se realizaron nuevos stocks decebadores y se consiguó que amplificara, aunque se observaron bandas muy tenues. Seintentó realizar amplificaciones usando como molde diluciones de los productos de PCRsobtenidos, en estos casos se observaron smears en los carriles, no siendo posible optimizarla dilución adecuada para las reacciones. Luego, trabajando en amplificaciones usandoproducto de PCR como molde para mNeon (temperatura de hibridación de 59°C) en paraleloa amplificaciones de rbp38 (temperatura de hibridación de 53°C) por error los tubos secolocaron cruzados en las temperaturas (mNeon a 53°C y rbp38 a 59°C). Al analizar laselectroforesis de estas reacciones se observó producto de amplificación en todos los carriles,de hecho, la Figura 16 corresponde a esa amplificación. En el caso de mNeon era esperableque a una temperatura menos exigente hubiese amplificación, a pesar de que podrían habersefavorecido la aparición de productos inespecíficos de amplificación, que no fueron observados.Sin embargo, rbp38 con 5µL de la reacción de una dilución 1/5 del ADN genómico de TcIA fuela mejor amplificación que se pudo observar (Figura 16). Por esta razón, en las posterioresreacciones de PCR para amplificar rbp38 se utilizó 59°C como temperatura de hibridación. Sibien se consiguieron concentraciones más altas respecto a las vistas para mNeon, en amboscasos las cantidades totales obtenidas no fueron suficientes para realizar los ensayos deevaluación siguiendo las recomendaciones de Burle-Caldas et al., 2018. En este sentido,también hubiera sido acertado evaluar otros métodos de purificación, como fenol:cloroformo,con el fin recuperar una mayor cantidad de ADN. Otra opción por considerar es realizar nuevosdiseños de cebadores que puedan tener mejores eficiencias de amplificación a los realizadosen primera instancia. En todos los geles que se corrieron con rbp38, incluso en los ensayosde evaluación donde dicho ADN estaba purificado se ve una segunda banda inmediatamentepor debajo de la banda del tamaño esperado (Figura 16, 18 y 27). Es probable que esta

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segunda banda sea un subproducto de amplificación interna, artefacto del diseño de loscebadores que se utilizaron. Pareciera que los primers amplifican reconociendo algúnfragmento interno diferente al esperado, pero cercano ya que este subproducto cuenta conaproximadamente 750pb en lugar de los 800pb esperados. Esto puede confirmarse al analizarel corte con la SaCas9, ya que si hubiera sido un producto inespecífico no se debería esperarque el sistema CRISPR/Cas9 lo hubiera reconocido, dando lugar a un subproducto tambiénen los fragmentos de corte (Figura 27). Lo más acertado sería diseñar un nuevo set decebadores para rbp38, para evitar estos efectos artefactuales.Es importante destacar que para la amplificación de mNeon y de rbp38 se utilizaron diferentescepas de T. cruzi (CL brener para mNeon y TcIA para rbp38). Esto se debió exclusivamente ala disponibilidad del laboratorio. Ya que aunque no se muestra en este trabajo, se intentóamplificar rbp38 a partir de la cepa CL brener, pero no se obtuvo producto de amplificaciónalguno. Por esta razón se tuvo que recurrir a otra cepa disponible.

5.3 sgRNA

Un paso crítico para que el sistema CRISPR/Cas9 funcione adecuadamente es el diseño delos guías de ARN y a pesar de que existen consideraciones que los software de diseño tomanen cuenta, en gran parte se sigue considerando una etapa que en muchas ocasiones seresuelve de manera empírica (Medeiros et al., 2017). A la hora de diseñar los sgRNAs esnecesario identificar los sitios PAM en la secuencia de ADN blanco a editar y seleccionar laregión adyacente de complementaridad en el sgARN y el ADN genómico. También es muyrelevante verificar la secuencia del scaffold en función de la nucleasa Cas9 que se va a utilizar,sobretodo cuando no se trabaje con la nucleasa SpCas9, que es la más ampliamente utilizada.En este sentido, revisar los oligos solapantes generados por los algoritmos del software dediseño resultó ser clave para la actividad experimental posterior. De hecho, se podría haberahorrado mucho tiempo y reactivos de haber corroborado desde una primer instancia estedetalle.

En ambas instancias de síntesis de los sgRNAs mediante IVT se logró una concentración ypureza satisfactoria. En este caso, los kits de columna de afinidad utilizados resultaron ser unexcelente método de purificación. Sin embargo, en la mayoría de los geles es posible distinguirun patrón de dos bandas tanto en los carriles donde se carga únicamente los sgRNAs, comoen los que se carga el ensayo de evaluación con todos los componentes del sistema. Estepatrón de bandas ha sido reportado previamente. Según Liu et al., 2016 la segunda banda delsgRNA que se ve en los geles, puede deberse a la formación de dímeros o multímeros entrelas moléculas de ARN guía; y propone que estas estructuras pueden ser resueltas mediantesu desnaturalización con incubación a alta temperatura previo al experimento de evaluacióncon la Cas9.

5.4 Ensayo de evaluación de la SaCas9

El clivaje in-vitro de los genes blanco por el sistema CRISPR/Cas9 en forma de complejosRNP es un método simple y rápido para validar la funcionalidad y eficiencia relativa del sistemaprevio a su utilización en sistemas celulares (Mehravar et al., 2018). En el primer ensayo deevaluación realizado para rbp38 en este trabajo no se pudo evidenciar ningún DSB generadopor la SaCas9 (Figura 18). Inicialmente se consideraron varias hipótesis sobre donde podríaestar la falla en nuestro sistema. En primer lugar se pensó que la nucleasa producida ennuestro trabajo no fuera funcional, o que al menos hubiese perdido gran parte de su actividad

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por la manipulación a la que estuvo expuesta. Sin embargo, al visualizar en el gel de la Figura18 que la SaCas9 comercial adquirida por el grupo tampoco era capaz de generar los cortesen el ADN de rbp38, se descartó de momento esta hipótesis. Luego se consideró que elproblema estuviera en el diseño o síntesis de los sgRNA. Entonces al analizar conminuciosidad las secuencias de los oligos solapantes se pudo constatar que efectivamente elscaffold del sgRNA que estábamos utilizando correspondía a la SpCas9 y no a la SaCas9. Secomprobó con el alineamiento de las secuencias de ambos scaffolds que existía un altonúmero de diferencias entre estas secuencias sugiriendo la incompatibilidad de utilizacióncruzada de las mismas (Figura 19). De todas formas, para corroborar que efectivmente elsgRNA utilizado era el responsable de la falta de actividad se decidió implementar, a nivel decontrol positivo, el ensayo realizado en Burle-Caldas et al., 2018 con el gen gp72. Como seaprecia en la Figura 23 la SaCas9 producida en nuestro trabajo fue capaz de cortar elfragmento de ADN de gp72, a pesar de que con baja eficiencia en este primer ensayo, ya queno digirió todo el ADN molde de gp72. Mas aún, en el siguiente ensayo presentado en laFigura 24, el sgRNA con el scaffold correcto se utilizó como control positivo, y se evaluó laeficiencia del corte tanto de la SaCas9 comercial como la de nuestro trabajo empleando losguías del diseño incorrecto. En esta ocasión, se obtuvo una eficiencia de corte muy alta paranuestra SaCas9 y en las reacciones con el sgRNA del scaffold de SpCas9 se pudo corroborarla ausencia de actividad de la nucleasa, ya que no se observaron claramente las dos bandascorrespondientes al corte de la Cas9. En este punto se procedió a realizar los ensayos deevaluación del sistema de edición para los dos genes a los que se le diseñaron sgRNAs eneste trabajo (mNeon y rbp38), utilizando el scaffold corregido específico para la SaCas9. Comose mencionó previamente, el ADN molde para ambos genes resultó ser limitante en losensayos de evaluación, y por ende se decidió bajar la cantidad de los reactivosestequiometricamente a la mitad. Además esta limitación del ADN molde, impidió realizarcontroles con el fin de visualizar posibles off-targets por parte de la SaCas9 o del sgRNAdentro de los genes estudiados de manera in-vitro. Hubiera sido acertado realizar controlesque contuvieran únicamente el ADN molde y la SaCas9, o el sgRNA y el ADN molde. Al nocontar con una concentración suficiente para el ADN blanco, se necesitó llevar la reacción delensayo de evaluación de mNeon a 30µL, excediendo el volumen típico de 20µL utilizado en elresto de los ensayos. En el primer ensayo realizado para mNeon (Figura 25) se puedeobservar claramente una banda correspondiente al corte del gen por la SaCas9(aproximadamente 300pb), mientras que la segunda banda se visualiza, pero migra muy cercaa una de las bandas del sgRNA. Para evitar esta interferencia, se podría haber calentado lamuestra como propone Liu et al., 2016, o incluso tratar la muestra con una RNAsa A, paradegradar el ARN guía remanente luego de completar el ensayo. En principio se optó por evitarestos pasos, debido a que se consideró que la visualización de la banda del mayor tamañoesperado y la disminución acorde de la banda del ADN sin digerir eran suficientes paraconfirmar la actividad de la nucleasa. Luego, al observar una banda de mayor peso molecularque el ADN sin digerir se consideró la posibilidad de que este fenómeno se debía a laformación de un complejo macromolecular. En este sentido se ensayaron tratamientos conproteasa y con RNAsa para lograr la disolución del complejo y permitir una más sencillainterpretación de los ensayos de actividad. Luego de los perfiles observados tanto en lasfiguras 26 y 27, se pudo concluir que el tratamiento con la proteinasa K es el mas indicadopara la resolución del complejo que al mismo tiempo mantiene la integridad de los fragmentosde corte, permitiendo una correcta interpretación del ensayo. A pesar de que la RNAsa Htrabaja degradando específicamente el ARN que se encuentra formando híbridos con el ADN,también se pudo observar degradación del ARN guía. Incluso podría haber causado ladegradación de fragmentos de ADN ya que se aprecian intensidades claramente menores

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respecto al carril donde se cargó el tratamiento con proteinasa K. Esto confirma la hipótesisde que la migración diferencial o shift observado, corresponde al producto de la interacciónentre la SaCas9 y el ADN, guiado por el sgRNA. Para rbp38 se observó algo muy similar(Figura 27). Si bien no se realizó en este caso un ensayo sin tratamiento de proteinasa K oRNAsa H, se puede visualizar el corte de rbp38 solo en el carril donde se trató con proteinasaK, mientras que en tratamiento con la RNAsa H aún se observa la migración diferencial y nose pueden apreciar las bandas correspondientes al corte de la nucleasa. Nuevamenteapoyando la hipótesis de la interacción ADN:SaCas9 y confirmando que el tratamiento conproteinasa K es el más adecuado para resolver estos complejos. De todas formas, es llamativoque el shift no se haya observado para los ensayos de evaluación de gp72.Es importante destacar que este fue un trabajo cualitativo, en el cual se consideró que erasuficiente ver las bandas de corte del tamaño adecuado en los geles, para confirmar que laSaCas9 realizó -los DSB en el ADN blanco. Sin embargo, para una confirmación definitivasería necesario la secuenciación de los fragmentos generados a partir de los cortes por lanucleasa.

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Conclusiones y Perspectivas

Según lo discutido en base a los resultados obtenidos, puede considerarse que los objetivosde este trabajo tanto generales como específicos (apartados 2.1 y 2.2 respectivamente) fueroncumplidos. El sistema CRISPR/Cas9 diseñado, producido y puesto a punto en el laboratoriode manera in-vitro mostró una gran eficiencia. Se demostró que los complejosribonucleoproteícos de SaCas9-sgRNA indujeron DSB de manera eficiente en los tres genesevaluados in-vitro. Sin embargo, como expresó Mehravar et al., 2018 los ensayos deevaluación de la Cas9 son una forma de pre-validar el sistema antes de la transfección de suscomponentes en las células. Por ende, en estudios futuros con el fin de validar la eficacia in-vivo del sistema generado en el laboratorio sería necesario realizar la transfección de dichosistema en los parásitos de T. cruzi. Al elegir la estrategia de los complejos RNP para losensayos in-vivo, se evitarán etapas de clonado, construcción de plásmidos y procesos deselección con drogas para generar líneas de parásitos que expresen la SaCas9, lo que puedeconsumir mucho tiempo y en muchos casos compromete el crecimiento del parásito (Medeiroset al., 2017). El utilizar complejos RNP permite generar por un lado, mutaciones génicas y KOfuncionales debido a las inserciones/deleciones mediadas por el MMEJ. Por otro lado, cuandoel complejo RNP se combina con ADN moldes que dirijan el sistema hacia la reparación porHR, se pueden truncar genes de manera dirigida y realizar tagging de genes en el lociendógeno (Medeiros et al., 2017). Bajo esta estrategia, el ensayo múltiple en simultáneo omultiplexing, puede llevarse a cabo de manera eficiente (Medeiros et al., 2017). Además seha visto que el knockdown rápido y eficiente que se consigue con los complejos RNP seríanútiles para dirigir la función de potenciales blancos de drogas, así como para dilucidar genesesenciales (Medeiros et al., 2017).Este trabajo además sirve como punto de partida para comenzar a entender el rol biológicode la proteína RBP38 en T. cruzi, la cual resulta ser de particular importancia para el grupo.Se sabe que en general el procesamiento del ARN, el transporte dentro de la célula y lalocalización celular está mediado por RBPs, que determinan el destino del ARNm (Romagnoliet al., 2020). Todos los estudios que se han realizado para dilucidar el papel que juegan estasproteínas, ha devenido en la modulación de los niveles de expresión y en la investigación delimpacto en los procesos vitales de estos parásitos como su proliferación, diferenciación einfección (Romagnoli et al., 2020). Para estudiar el impacto de la ausencia de un RBPespecífico se han realizado KO mediante la incorporación de cassettes de ADN que contenianun marcador de droga selectivo en el gen blanco por recombinación homóloga (Romagnoli etal., 2020). Sin embargo, la generación de estos KO no ha sido tan fácil, y muy escasos gruposde trabajo lo han conseguido (Alcantara et al., 2018). De ahí surge la necesidad de contar contecnologías de edición nuevas y más eficientes, como el CRISPR/Cas9. Es así que paraestudiar las RBPs, el grupo de Romagnoli et al., 2020 estableció un protocolo parainvestigar/confirmar los fenotipos relacionados a una disrupción generada por el sistemaCRISPR/Cas9 tan rápido como fuera posible, lo que es crucial considerando que la distorsiónde elementos regulatorios importantes es probable que sea esencial para el parásito. Ellosproponen generar una población de parásitos altamente enriquecida y estable que expreseCas9:GFP y luego transfectar a dicha población con los sgRNA producidos in-vitro que tienencomo blanco los genes RBP, junto con un molde de ADN simple hebra que contiene un únicositio de restricción y una secuencia que codifica codones STOP en los tres marcos de lectura(Romagnoli et al., 2020). Ellos consiguieron modificar tres RBPs diferentes (TcZC3H39,

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TcZC3H29 y TcZC3HTTP) utilizando esta aproximación (Romagnoli et al., 2020). Realmentesería interesante utilizar un protocolo similar para RBP38, pero incorporando la estrategia detransfección en conjunto de los complejos RNP, ya que el KO en el gen de esta RBP podríadilucidar el rol de esta proteína en la regulación de la expresión génica en el ciclo celular deTrypanosoma cruzi. El uso del CRISPR/Cas9 para realizar KO en genes de RBPs, comenzaráa abrir una nueva era en los estudios de regulación de la expresión génica y probablementepermitirá avanzar en el descubrimiento y mapeo de redes de genes reguladores en T. cruzi(Romagnoli et al., 2020). La amplia variedad de aplicaciones que ofrece el sistema de EdiciónGenómica CRISPR/Cas9 en conjunto con la facilidad de producción de complejos RNP, abreun gran abánico de posibilidades a los investigadores que trabajan en la manipulacióngenética de T. cruzi y otros kinetoplástidos.

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Agradecimientos

Realmente es muy difícil llegar a este apartado de la tesina sin emocionarme, porque implicael cierre de una etapa crucial en mi vida. Sinceramente estoy agradecida con todas laspersonas que conozco y conocí a lo largo de mi vida y mi carrera, porque todas ellas dejaronsu pequeño granito en mí y contribuyeron a formarme como persona y como profesional. Sinembargo, me parece muy importante agradecer de una forma más personalizada a ciertaspersonas, que me ayudaron, me apoyaron y me valoraron a lo largo de esta etapa. En primerlugar, me gustaría agradecer a Santi Chávez por ser un gran tutor y una persona excelente,que me ayudó y me asesoró siempre que lo necesité. También quiero agradecer a Juancho,que junto con Santi me enseñaron todo lo que necesitaba saber, me cuidaron de nointoxicarme con acrilamida o con bromuro de etidio y me tuvieron muchísima paciencia. Nopuedo no agradecer a Maria Ana, en primer lugar por todo lo que hizo por mi a nivel académico,permitirme formar parte del hermoso equipo que es el LIM, darme la oportunidad de iniciar yenamorarme más de la biología molecular; en segundo lugar por los consejos y ayudabrindada a nivel personal, por ayudarme a encontrar un lugarsito con las plantas y por ser unapersona tan luchadora, trabajadora y tan excelente. Agradecer a Lore, por las risas lasexcelentes enseñanzas, y las tardes locas en el laboratorio escuchando su música extraña.Quiere agradecer especialmente a Bea por recibirme de una manera tan cálida y acogedorasiempre en el laboratorio, haciéndome formar parte de una gran familia. Agradecer a Carito,Ceci, Rafa, Flo, Leti, Pablito, Lu Bilbao, Gonza y Lucas por siempre hacerme sentir parte dellaboratorio desde el primer momento, por cada enseñanza y risa compartida. Obviamente queno me puedo olvidar de uno de los agradecimientos más importantes que es para Lu C, miamiga y confidente del lab, gracias por las risas, los chismes, las comidas, el cariño, la ayuda,el estudio, el trabajo y la compañía que me brindaste.Agradezco haber conocido a Mariana y a Martita que si bien fue hace poquito, me dieron laoportunidad trabajar y de aprender de y con ellas. Amo que me enseñen del el mundo queamo, el mundo de las plantas y de la biología molecular.Gracias a Anto y a Vicky, mis mejores amigas de la vida, mis hermanas de la vida, gracias porsoportarme desde siempre, aguantar mis chistes ciertíficos y apoyarme durante toda mi vida.Gracias a Fati, Lou, Euge, Ale y Lu Leites, por ser mis amigas de la facu, por haberme apoyadosiempre, por haber dejado que me uniera a su grupo y por haberme aceptado como soy desdeel primer momento.Gracias a mis hermanas, por apoyarme desde donde y como les fue posible.Gracias a Lea, mi amorsito, por haber formado parte de tooooda esta gran etapa, de siempredarme para delante, sin excepciones. Gracias por nunca haberme dejado caer. Gracias porser el cordonsito de esta cometa voladora, y hacer que nunca sacara los pies de la tierra.Gracias por ser mi admirador siempre, por cualquier bobada. Gracias, gracias, gracias.Especialmente quiero agradecer a papá y a mamá. Sin ellos, sin su ayuda, su apoyo, sucomprensión, su amor incondicional hacía mí, no hubiera podido llegar donde estoy. Graciaspor enseñarme a soñar, a viajar, por hacer todo por mí. Por hacer posible y siempreincentivarme a estudiar lo que me gustara por más descabellado que fuera. Gracias mamápor sentarte a estudiar conmigo todas las noches cuando era pequeña, y por ayudarme adescubrir con ayuda de una enciclopedia a los 11 años mi pasión por la biotecnología y labiología molecular. Enserio que nunca me voy a cansar de agradecerles a mis padres todo loque hicieron por mí, para formar esta persona, estudiante y profesional que soy hoy.

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73

8.2 Cibergráficas

Nombre de la página: AmrescoLink de la página: http://www.interchim.fr/ft/N/N14800.pdfFecha/s de consulta: 26/10/2020

Nombre de la página: CRISPORLink de la página: http://crispor.tefor.net/Fecha/s de consulta: 20/5/19 – 10/1/20 -17/7/20

Nombre de la página: CRISPOR (actualizaciones de software)Link de la página: http://crispor.tefor.net/doc/changes.htmlFecha de consulta: 06/2020

Nombre de la página: DPDxLink de la página:https://mcdinternational.org/trainings/malaria/spanish/DPDx/HTML/TrypanosomosisAmericanaFecha/s de consulta: 15/7/20

Nombre de la página: Humanizing Genomics MacrogenLink de la página: https://dna.macrogen.com/Fecha/s de consulta: 22/5/19 – 15/1/20

Nombre de la página: MegaLink de la página: https://www.megasoftware.net/Fecha/s de consulta: 25/11/20

Nombre de la página: TriTrypDBLink de la página: https://tritrypdb.org/tritrypdb/appFecha/s de consulta: 20/5/19 – 10/1/20

Nombre de la página: Amersham BiosciencesLink de la página:http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/dialysis/AMERSHAM_PD10Desalting.pdf

Fecha/s de consulta: 12/6/19 – 29/10/20

74

ANEXO

Buffers del SDS-PAGE

Buffer de carga (4X)

• 25mL Tris-HCl 0,5M pH 6.8 SDS 0,4%• 4g SDS• 20mL glicerol• 2mL β-mercaptoetanol• 1mg azul de bromofeno• Llevar a 50mL con agua destilada

Buffer de corrida (5X)

• Tris-base 15,15g• Glicina 72g• SDS 5g• Llevar a 1L con agua destilada

Tinción con Azul de Coomassie

• 80mL de ácido acético glacial• 250 mL etanol• 1g de azul de Coomassie• Agua destilada hasta completar 1L

Solución de desteñir

• 80mL de ácido acético glacial• 250mL etanol• Agua destilada hasta completar 1L

Buffers para purificación de la SaCas9Según Burle-Caldas et al., 2018:

1) Buffers fosfato base

• Solución A: 27,6g fosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4.H2O) en 1L de agua destilada.• Solución B: 53,65g fosfato sódico hepta-hidratado (Na2HPO4.7H2O) en 1Lde agua destilada.

2) Buffer fosfato 0,1M (pH 7,4)

• 19mL solución A• 81mL solución B• Llevar hasta 200mL con agua milli-Q

3) Buffer fosfato 20mM

• 200mL de Buffer fosfato• 29,22g cloruro de sodio (NaCl)

75

• Llevar a 1L con agua milli-Q

4) Buffer de unión (binding)

• 500mL de 3)• 30mM imidazol (1,02g)• Ajustar pH a 7,5• Filtrar por 0.22µm

5) Buffer de elución

• 500ml de 3)• 500mM imidazol (17,0g)• Llevar a 100mL con agua milli-Q• Ajustar pH a 7,5• Filtrar por 0.22µm

Buffers para ARN

Según Burle-Caldas et al., 2018

Buffer MOPS 10x (1L)

• 41,8g MOPS (sigma)• 800mL H2O RNAsa-free.• Ajustar pH a 7 con NaOH concentrado o ácido acético.• 16,6mL NaAc 3M.• 20mL EDTA 0,5M pH 8.• Autoclavar

Buffer de carga 3x

• 750µL formamida• 150µL buffer MOPS 10x• 240µL formaldehido• 100µL H2O RNAsa-free• 10 µL glicerol• 80µL azul de bromofenol 10%

Buffer para evaluación de la actividad SaCas9

• 2 µL HEPES 200mM• 2µL KCl 1,5M• 2µL MgCl2 100mM• 2µL DTT 5mM

76

Secuencia genómica de gp72 (TcCLB.509561.20)

>ATGCTTTCAAAAAGGACGTCGCCAGCACCCTTCCGTGCGCTCCTGCTGCCGGTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCATCTGTGGCCCTCCCTGCAGGAGCGCAGTTTGATTTAAGGCAGCAGCTGGTTATACAGGATTTCTTCATCAGTCGCTCCTGCGCAGGATGTTCACAGGGGCAAACCGATGGCCCAAGCGGTGTCGGCACACTCTTCACTGCCGCCGGTGGTTCGCTTGGCAGCGATGCTTCCACGCTGCTGTTGTGTGACCATGGTGGTGGTGGCTCCAGCGTGCGTTTGGTGAACAAATCCGGCATTTTCACCCTTGCCGGTAGTAAAACGACGCGTGGCAATCAAAATGGTCCGGCGGCGACGGCACTCTTCAACATACCCCGAGCTGTGGTGCTTGAGGATGGAGCGCTTTACGTGGCTGACAGTGCCAACAACCTCGTTCGAGAAATCTCCAATGGTATTGTCACTTCGTTTATTACGGAAGGACTGCTGGGCCCATCGTACATCAAACCGTACAGCCGTCCAAATGGCGCCCATGACTTGTTTGTGTCGGACACGGGCAAATCACGTATCATTTTTGCCCCAATTCAGAAACAAACGTTCATCACAGTGTTTATAACGGGATTCCAGCCGGATGTTCTTCAAATTAGCGAGAACAGTCGTTTTATGTTTGCCATCTGCAATTCCACGAAAATTCTTGCGATTAATATGCAGGGAGCCACAACCCCGAGGGATTACTGGCAAGTTGGGGATGCGGACTGCATGGGCTATCAGAGTTCCCTCATGCTCACGGCCGAGGAGGATAAACTCCTCTACTACGGCGTATTAAAAGGAATCCCATCCATCATGTCTTTACCCACCACCAAAACGAAGACGGAAGCACCCAAAATTTGCCCGGATGTGTTGTTGCAGTGGCCACATGGGCCCATTGTTTCGCTTGTGAATATTAACAAACATGCATTTTACGTTGTTACCGTCTCCAATGTATACATTGTACATGATGGCTCGTATCATCCGACTGTGACGCCGACACCTCCTCTGACACCGACGCCTACACCGGAAGTGACGCCCACACCGCCAGTGACCCCGACGCCTACACCGGAAGTGACACCCACACCGCCAGTGACCCCGAGCCCCACCATCACAATCCACCGGGGTTTTGCTGTGGCAGCCTTTTCTGCCCGAAGTCTTCCAATCGAAGACCCGCGGCTTATGCATGAACTGCTTTCTTGGATAATGAAGGATGTAGGGATTGCGTTCGAATCCACGGACTTTTTTGCCGTATTTCCGCCGGATAGAGAGGTTCTGGTGCCCGGTGATGTAAATGTCTCCACCTGGAATAACTTGACGGTGCTATTCAACTTTGACCACACCATTCTCATCACGGAATATTACACTCCAGAGGGCATGTCTTCAGAGGAGGGACAGGCCCGACTCTTCGCTTCGCCGTGGTACTGGACGAGAAAGCTCCTTGATTCATTAAGGGAAACAGTAGCTTGGAAGGACTTGGAGGCGTTTTGCATGGTCAACTGTGTTGAGCACTGTGAGACAATGACATTCCATAAGTCAGAATGTGTAGGCTACGTCCGGCCCCCAGTATGCAACGACGTCTGTGTGGGGGCGGTAGTGTCCTCCGCGGTGCTTGGCGCCACAGGTATCGCACTCATTGCACTGATGGTTGGAAGTTCGGCGAACGTACGGAGCGCTGTGATTCTTGTTCCACCCATGTAG

77

Secuencia genómica de rbp38 (TcCLB.508641.180)

>ATGCCGGTGCATCCAGAGTTCATTCCGCTGGCAAAGCAGAAGGAGATGTTCGCCATCAGCTCCTGGCGGGACTCGCCGCAGACTGCCGCCGCAGCACAGCCGATGGTACCGAGTCCCGCCATTTTACCGGAGGCCCAGTGTGACAAGGACGGTGCTTCGCAAGTCAAAGGGGGGCATCGCTCACGCAGGGGGCGTCGTGGGAAAAATCGACTGGTTCAGCGGCAACAAGATGTGGATGACTTTTTTTTGAACTGTGTGCTTCCAAAGGGAGTCTCGTTCGCCACACTCAACTCGGAGCTGCAATGTAACGCAACGATGCCACTTCGTGCCTACGACATTGGAACGCCGTACGCCCTGTTTACCCGACGTAATTGTGGGGCGTTGTCGGGCGGCATGGAGCCTGGCAACACGGAAAATGCCAGTGGTAGTGGTGCCACTGCGACGGCTGCAACTGGCACAAAAGCGCCGATGCCACCAGGAGGAGATCACAGTAGTAGTACTAATAATAATACTAATAACCATAATCCTAATACCACTAATACTGTCACAATTGCTGCTGCCGATGCGAGAATAGGGACTTCTTCATCTGAAGCAGAGGCAGCTGTAGTAGCAATAGCGTCAGGGGATGGTTTGGCGACAACAACAAAGAAGTCAAACCATCCTGCTGTGACTTTTTCACCCTTTCGTACGCCAATGGTGGGAGCGTCAGGAGCGGCTGTACTGACGCCGGCTGACGACAGCGACGATTCACCAGGCGACGCTCCTCCTCCAGACTTGGTCCTTCCACCGTCCGTCCCCTCCGAAATACTTTCGAAGGGGCATCTGATTTCGCTTCTTTATGCCGAGAGTGGCGAGGCAGAGAAGACCAGTGAGTGGCTGCAGAAAAAGTGGCCGCAAGCGACGGTGATGGTTGTAGCTCGCAACCGTTCCATCCTGAACTCCTCACTGGTCCTAAAGGGGCTTCCCAGCCTGGCGAAAACGGAACGCATCATTGAGGAGGTTGAGAAGGTCATCCCACAGAAGCCGTCTTACATCCGTCTGCATCGCGGTGAACGGGGGGTGTTCAAAAATGTTGTCTTTGTGAAGTACCCCAATCGAGAGGTCGCGGAGGAAAGTAAGTTGCGTCTTGAACGGTTTTTCATTGGATCGCGCCAACTTAAGGTGGAGTTTAAAAAGAGGGAAAAGGGAACCGCGGAACGGGAGAGCGAGGCTTCTCTTCAGCAGCTGGTCCGCGACCTCCGCGTCAGCACGGAACACGAAGGCTTTATATATCAACGCAGCGACCTCACAAAGGATGAATTGAAGTTGTTGAAGCAGCTTTGCCACTCTTACGGCCTCTCCTTCGACCTCAGCGAGCAGAAAGTGACGGTGAAGCGCATCCTTCCAGGAAACGACCGCCAGTCACCGGCGCTACGCCCCAGCCAGACCACGCCGTTGAACTGGACGCAGGCCACACCCGGTGCTTTGCGACCGATGGACTTCAAAGGCATACGTCACTGGGGGGAGATGCGCAGCAAGTACTCATCCCTGGGTATTGCTCGTCCGAAGGGACCCCACGATGTGCCACCTTTCGCCTCCGGCCGGGGACGTCCGCTGTGA

puesta a punto del sistema de edición genómica crispr/cas9

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