酵素のはたらきを「視る」技術により 病気に関わるタンパク …3...
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1国立研究開発法人 科学技術振興機構
新技術説明会2018年2月1日 JST東京本部別館１階ホール
創薬
酵素のはたらきを「視る」技術により
病気に関わるタンパク質の
機能異常を発見する
小松 徹
東京大学大学院薬学系研究科革新創薬化学教室特任助教
2 酵素を「視る」研究
生体内には 5,000 種類を超える代謝反応が存在する．
Phenotypes(Diseases)
Transcription
Transcripto-mics
Genomics Proteomics Enzymomics
Central Dogma
“Comprehensive” analysis
Translation Function
Gene mRNAProteins
(Enzymes) Enzymatic Activity
3 本日の発表内容
■■新技術の概要■■
(A) 生体サンプル中の酵素活性を網羅的に評価する技術
(B) 疾患と関わる代謝活性の責任酵素を明らかにする技術
酵素の生きた機能である「代謝活性」そのものを網羅的に評価する方法論「enzymomics（enzymeのomics）」により、疾患に直結するタンパク質機能の異常を見出すことが可能となることが期待される．
■■従来技術の問題点■■
・ DNA，mRNA，タンパク質などの「物質の量」の変化と細胞内の質的変化のギャップ
・酵素の活性評価における感度の不足
■■新技術の特徴■■
・ 100種類を超える多様な酵素活性を評価
・ 0.1 ng以下の酵素の高感度検出
■■想定される用途■■
・疾患と関わるタンパク質機能異常の発見と機能制御（臨床研究）
・疾患の成り立ちや生命現象の理解（基礎研究） 1942 June 3, Florence Morning News, Mutt and Jeff Comic Strip, Page 7,
Florence, South Carolina. (Newspaper Archive)
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■■ Diced electrophoresis gel (DEG) assay■■
プロテオームを非変性電気泳動によって分離し，酵素アッセイをおこなうことで目的の活性を有するタンパク質を見出す手法．
→ 酵素活性の網羅的評価
→ 新規酵素活性の発見
基盤技術の紹介
Ester hydrolytic enzymes
SAINOME®
The method was used to evaluate the activity of more than 50 enzymes. 10 new enzymatic functions were characterized.
5 Enzymomicsのためのプラットフォーム5
Fluorescent Probes Peptide Library
Pathway-oriented Assay Single Enzymography
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プラットフォーム 代表的な対象酵素 対象数 適用サンプル
Fluorescent probes（蛍光アッセイ）
PeptidasesAmidasesGlycosidases
~60
・体液（血清，尿，唾液等）・細胞，組織破砕液・生細胞・組織，動物個体
Peptide library（LC-MS法）
PeptidasesPTM enzymes（開発中）
~200・体液（血清，尿，唾液等）・細胞，組織破砕液
Pathway-oriented Assay
（代謝評価に基づく阻害剤開発）
Amino acidsSugarsLipids（開発中）
~20×20 ・生細胞
Single Enzymography（一酵素解析）
ALPPeptidases（開発中）
・体液（血清，尿，唾液等）・細胞，組織破砕液
Enzymomics
赤字 = 実施例あり
各プラットフォームと適用対象
7 Enzymomics
■■ Enzymomics ■■
Enzymome: The complete set of enzymes active in a cell at a given time.
- Kahl, G., The Dictionary of Genomics, Transcriptomics and Proteomics; John Wiley & Sons; 2015.
Substrates
Normal
Disease
Characterization of target proteins= Altered functions in disease
(A) 生体サンプル中の酵素活性を網羅的に評価する技術
(B) 疾患と関わる代謝活性について、その責任酵素を明らかにする技術
(A) (B)
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Protein binding reporter (Serum Albumins)
Bioorg. Med. Chem. Lett. in press
Enzymomics
酵素活性の可視化により、新規のタンパク質機能を発見.
b-cell specific activity(N4-(beta-N-acetylglucosaminyl)-
L-asparaginase)
High activity in non-cancerous cells(Target under characterization)
Liver-restricted activity(CES2)
J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 12187-12190
High activity in colorectal tumor(Chymotrypsin-like protease)
Low activity in colorectal tumor(a-Fucosidase)
High activity in inflammatory BALf (APEH)
- Contribution in formyl peptide metabolismJ. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 6002-6005.
- Contribution in pyruvyl peptide metabolismChem. Commun., 2016, 52, 4377-4380.
- Elevated activity in inflammatory BALFsChem. Pharm. Bull. 2016, 64, 1533-1538.
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■■ Enzymomics ■■
Enzymome: The complete set of enzymes active in a cell at a given time.
- Kahl, G., The Dictionary of Genomics, Transcriptomics and Proteomics; John Wiley & Sons; 2015.
より高い網羅性をもって正常と疾患における酵素活性の差の評価を可能とする．
Peptide Enzymomics
Disease-related enzymatic activity
NPDPWAK NP | DPWAK
Target enzyme identification
= DPPIV
RT
RT
LC-MS
PeptideLibrary
Normal
Disease
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タンパク質の加水分解を利用したペプチドライブラリーの調整
Peptide Enzymomics
MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLTSSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA
BSA
Trypsin
・ Peptide sequence・m/z value (calcd.)
LC-MSAnalysis
・m/z value (obsd.)・Retention time (RT)
Peptide library
LGEYGFQNALIVR 1479.71 24.18TVMENFVAFVDK 1399.59 26.69HLVDEPQNLIK 1305.60 17.68HPEYAVSVLLR 1283.61 20.60LVNELTEFAK 1163.55 21.46CCTESLVNR 1024.50 19.87QTALVELLK 1014.53 22.95LVVSTQTALA 1002.50 20.05DLGEEHFK 974.39 14.36YLYEIAR 927.40 19.02AEFVEVTK 922.40 15.97DDSPDLPK 886.32 14.16ATEEQLK 818.34 10.35LVTDLTK 789.40 15.24NYQEAK 752.26 8.52VLTSSAR 733.32 10.12AWSVAR 689.30 15.39TPVSEK 660.27 7.77CASIQK 649.26 11.37AFDEK 609.20 10.14
Sequence m/z RT
Assignment withm/z value
J. Onagi
11 Peptide Enzymomics
ペプチドライブラリーを用いた大腸癌特異的代謝活性の探索
同一患者の腫瘍部分 (T)，非腫瘍部分 (N)を用いて，代謝活性(Left) および T/N (Tumor to Normal ratio; right)を Heat Mapで示した．
大腸癌患者由来癌部／非癌部ライセートに対して酵素活性の網羅的解析をおこなった．
12 Peptide Enzymomics
ペプチドライブラリーを用いた大腸癌特異的代謝活性の探索．
同一患者の腫瘍部分 (T)，非腫瘍部分 (N)を用いて，代謝活性(Left) および T/N (Tumor to Normal ratio; right)を Heat Mapで示した．
大腸癌患者由来癌部／非癌部ライセートに対して酵素活性の網羅的解析をおこなった．
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従来の DEG 法では蛍光基質の合成が必要．
→ UPLC-MSを利用したハイスループット分析を利用した代謝活性評価．
1分析 = 3 分間とすることで，1 プレート（320 ウェル） = 16 時間で解析を完了することができる．
Peptide Enzymomics
Waters Acquity UPLC H Class/Xevo TQD quadruple MS/MS
analyzer
LVVSTQTALA LVVSTQ | TALA
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DEG法を用いてペプチド LVVSTQTALA の代謝酵素を探索した．
Peptide Enzymomics
List of Candidate Proteins
Neurolysin(EC 3.4.24.16)
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大腸癌細胞において Neurolysin 活性が上昇していることが示唆される．
診断バイオマーカーへの利用，大腸癌の原因タンパク質としての可能性について検討を進めている．
Peptide Enzymomics
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■■想定される用途■■
疾患などと関わるタンパク質を発見するツール
• 診断バイオマーカー
• 臨床研究への展開
• 幅広い分野への応用
■■企業への期待■■
• DEG 法の装置（sainome株式会社より開発）を利用した新たな測定対象や測定キットの開発に関して助言をいただきたい．
• 多様な酵素活性を指標として疾患関連タンパク質を見出す汎用的な手法となり得ることが期待される．さらに疾患以外の分野（生命系基礎研究，環境分野など）への応用に関する知見を広く求めており，是非ご助言をいただければ幸いです．
用途・期待
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DEG 法専用装置の開発
発明の名称 ゲルプレートの小片化・分注装置および小片化・分注方法発明者 長野哲雄，小松徹，金野覚，下田昌弘出願人 株式会社昇竜建設登録番号 特許第 5594501 号
酵素活性可視化手法の開発
発明の名称 酵素活性検出用試薬発明者 長野哲雄，花岡健二郎，小松徹，木村勇亮出願人 東京大学登録番号 特願 2014-038427
発明の名称 細胞外代謝物を検出するための蛍光プローブ及び当該蛍光プローブを用いるスクリーニング方法発明者 浦野泰照，小松徹，柳光一出願人 東京大学登録番号 PCT/JP2016/84669
発明の名称 マイクロデバイスへの適合性の高い酵素活性可視化蛍光プローブ発明者 浦野泰照，小松徹，坂本眞伍，野地博行，渡邊力也，張翼出願人 東京大学登録番号 特願2017-041149
知的財産権
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■■産学連携の経歴■■
2013-2016年 JST さきがけ研究（疾患代謝領域）に採択
2014年 株式会社 sainome 設立（DEG 法専用装置）
2017年 JST さきがけネットワーク事業に採択
■■コーディネーター■■
株式会社東京大学 TLO
石堂菜々子
TEL: 03-5805-7672
FAX: 03-5805-7699
email: [email protected]
経歴・連絡先