耐熱性酵素を用いたニコチンアミド 補酵素の安定化技術の開発

～In vitro代謝工学による有用代謝産物のオンデマンド生産～

大阪大学大学院工学研究科 生命先端工学専攻

准教授 本田 孝祐 ほんだ こうすけ

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代謝工学・合成生物学的アプローチによる有用物質生産

・限定されたレパートリー ・長い開発期間 ・分離精製プロセスの煩雑さ

生物が望む代謝産物

我々が望む代謝産物

≠

発酵法による有用代謝物生産

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イソプレン（合成ゴム原料）

米国・デュポン×グッドイヤー

アルテミシン （抗マラリア薬

原料） 米国・アミリス

クモの糸 （機能性素材） 日本・スパイバー

Step 1: 好熱菌由来代謝酵素遺伝子の取得

耐熱性酵素を用いたin vitro代謝工学

Step 2: 中温性宿主（大腸菌など）内での発現

Step 3: 微生物菌体の熱処理（70oC、30分間程度）

Step 4: 耐熱性酵素モジュールによるin vitro人工代謝経路の構築

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Before heating

50

37

25

20

(kDa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Lane Enzyme (Molecular weight)

1 Glucokinase (31,483) 2 G6P isomerase (46,087) 3 Phosphofructokinase (33,541) 4 FBP aldrase (32,992) 5 Triose isomerase (27,089) 6 G3P dehydrogenase (55,490) 7 Phosphoglycerate mutase (23,600) 8 Enolase (45,486) 9 Pyruvate kinase (51,174) 10 Lactate dehydrogenase (32,799) 11 None

Cell-free extract of E. coli BL21 overproduing a glycolytic enzyme was subjected to SDS-PAGE analysis on a 12.5% polyacrylamide gel

50

37

25

20

(kDa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

熱処理による耐熱性酵素モジュールのワンステップ調製 4/19

Bacterial/Eukaryotic EM pathway Glucose

Glucose 6P

Fructose 6P

Fructose 1,6P2

GAP DHAP

1,3-BPG×2

3-PG×2

2-PG×2

PEP×2

Pyruvate×2 2 ATP 2 ADP

ADP ATP

ADP ATP

2 ATP 2 ADP

2 NAD(P)H 2 NAD（P)+

2 fdred

2 fdox

ADP

AMP

ADP

AMP

2 ATP 2 AMP

Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD(P)+

2 Pyruvate + 2 ATP + 2 NAD(P)H + 2 H+

Archaeal modified EM pathway (Pyrococcus furiosus)

Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 fdox

(2 NAD(P)+) 2 Pyruvate + 2 ATP + 2 fdred (2 NAD(P)H + 2 H+)

Ohshima & Sakuraba (2009)

2 NAD(P)H 2 NAD（P)+

Chimeric EM pathway

Glucose + 2 NAD(P)+

2 Pyruvate + 2 NAD(P)H + 2 H+

GAPN from Thermococcus kodakarensis KOD1 Others from Thermus thermophilus HB8

non-phospholyrating GAP dehydrogenase

(GAPN)

In vitro代謝工学によるATP非生産性キメラ型解糖経路の構築 5/19

Addition of 1 mM NADH

NAD+ + NADH

Final lactate conc = 12 mM Over all molar yield = 100% ATP turnover number = 31

Con

cent

ratio

n (m

M)

Time (h)

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10

Ye X et al. (2012) Microbial Cell Fact., 11: 120

Lactate

Supplied glucose

14

キメラ型解糖経路によるin vitroでのL-乳酸発酵

In vitro代謝工学による化学品生産

細胞の生存・増殖と物質生産が独立 副反応が生じない高収率での生産が可能 培地・細胞由来夾雑物を含まず分離・精製ステップを簡略化 ワンポットでの多段階反応

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単一遺伝子発現株の組み合わせによるin vitro代謝経路構築

Heat treatment

Heat treatment

耐熱性酵素モジュールの単一組換え体内での共発現

複数遺伝子共発現株によるin vitro代謝経路構築

複数ポットでの培養 ワンポットでの生産

ワンポットでの培養 ワンポットでの生産

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1 2

23.1 9.4 6.6 4.4

2.3 2.0

(kbp)

0.6

GTT AGA

TAG ACC ATC TGA TAC CAG GCT ATC

CGA FBA TTG AAC

GTC ENO ATG PGM TGG PFK TAG PK ACT TIM TCT PGI GK CAA GAPN

Pr

pGETS-CGP (25.85 kb)

EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI

Lane 1: λ DNA/ HindIII digestion Lane 2: pGETS-CGP/ EcoRI ditestion

人工オペロンを用いた耐熱性酵素の共発現

2

4

6

8

10

0

mR

NA

(× 1

08 cop

ies/

mg

wet

cel

ls)

GAP

N

PK

PGI

PGM

ENO

PFK

GK

FBA

TIM

Ninh PH et al. (2015) Biotechnol. Biong., 112: 189-196

8/19

75

50

37

27

20

(kDa) M

GAPN (55.5 kDa) PK (51.1 kDa) PGM (45.1 kDa) PGI (46.1 kDa) ENO (45.5 kDa) FBA (32.3 kDa)

PFK (33.5 kDa)

GK (31.5 kDa)

TIM (27.0 kDa)

GAPN FBA GK ENO PGM PFK PK TIM PGI

1.81 1.69 4.10 158 577 44.8 371 23.1 10.3

Specific enzyme activities (×10-3 U/mg wet cells)

人工オペロンを用いた耐熱性酵素の共発現 9/19

Glucose 6P Fructose 6P

Glucose

Fructose 1,6P

GAP 2-PG Pyruvate 3-PG DHAP

Glucokinase G6P isomerase F6P kinase

FBP aldolase

Triose isomerase GAPN Phosphoglycerate

mutase

PEP Enolase Pyruvate kinase

G3P dehydrogenase

Glycerol 3P

Glycerol

Glycerol kinase

Lactate

Malate

Acetaldehyde Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA 3-Hydroxybutyryl-CoA

Crotonyl-CoA

Crotonaldehyde

Butylaldehyde 1-Butanol

Malic enzyme

Lactate dehydrogenase

Pyruvate decarboxylase

Aldehyde dehydrogenase

Acetyl-CoA acetyl- transferase

Hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase

Hydroxypropionyl-CoA dehydrogenase

Ene reductase

Alcohol dehydrogenase

Final conc: 2.9 mM Production rate: 0.72 mM/h Molar yield: 60%

(Ye, X. et al., 2013)

Final conc: 3.5 mM Production rate: 0.5 mM/h Molar yield: 82% (Krutsakorn, B. et al., 2013)

From Glucose Final conc: 12 mM Production rate: 1.2 mM/h Molar yield: 100%

(Ye, X. et al., 2012)

Aldehyde dehydrogenase From Glycerol

Final conc: 14.7 mM Production rate: 2.1 mM/h Molar yield: 88% (Jaturapaktrarak, C. et al., 2014)

Chimeric EM pathway

In vitro代謝工学による有用代謝産物の選択的生産 10/19

ニコチンアミド補酵素の熱分解による反応停止

NAD+ + NADH

Final conc = 12 mM Molar yield = 100%

Con

cent

ratio

n (m

M)

Time (h)

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10

Ye X et al. (2012) Microbial Cell Fact., 11: 120

Lactate

14

1

0

3

2

4

0 1 2 3 4 5 6 7

Time (h)

1mM NAD+ and NADH

Final conc = 3.5 mM Molar yield = 82%

1mM NADH

Con

cent

ratio

n (m

M)

Krutsakorn B et al. (2013) Metab. Eng., 20: 84-91

ケース１： グルコース Ｌ-乳酸 （10ステッ

プ）

ケース２： グルコース 1-ブタノール （17ステップ）

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NAD(P)+, NAD(P)H (Vitamin B3 derivatives) ≈ 2000 reactions

PQQ, TPP, FAD, FMN, Folate, etc…

ATP, ADP, AMP ≈ 650 reactions

CoA (Vitamin B5 derivatives) ≈ 550 reactions

NAD+

¥ 1,600/g

ATP

¥ 800/g

CoA

¥ 63,500/g

補酵素が関わる代謝反応

※価格は和光純薬カタログより算出

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NAD+

In vitro代謝工学によるサルベージ合成

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既存の解決策：アナログ物質による置換

» 天然型補酵素に比べ、触媒効率は1/10～1/1000程度 N+

O

NH2

(CH2)3-CH3

N

O

NH2

ClN+

O

NH2

O

HOOH

OH

OH

熱分解

N +NH2

OH

N

NH2

N

H2N

NH2

OH

NN

N

NH2

O

OH

OH

HON

N

OH

OHP- O

O

O

OPH

-O

O

N+NH2

O

N+

NH 2

OH

ニコチンアミド補酵素の安定化戦略 13/19

ADP ribose

nicotinamide

Retention time (min)

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 5 10 15 20 25 30

NAD+

Inte

nsity

(μU

)

Possible decomposition products of NAD+

AMP, ADP, ATP ADP ribose Adenine Adenosine Nicotinate Nicotinamide Nicotinamide mononucleotide (NMN) Nicotinic acid mononucleotide (NaMN) Deamino NAD+

NAD +

Nicotinamide

ADP ribose Time (h)

Conc

entr

atio

n (m

M)

NAD+熱分解産物の同定

NAD +

ADP ribose

Nicotinamide

14/19

Synthetic Metabolic Engineering; SME

N

O-

O

OH OH

OOP-O

O

O-N+

O-

O

N

NH2

O

Nicotinamide Nicotinate Nicotiniate

mononucleotide

H2O NH3 PPi PPi

NH3

H2O

Amidase Nicotinate PR transferase

N(a)MN adenyltransferase

NAD+ synthetase

ADP-ribose

ATP

N

NN

N

NH2

O

OHOH

OP-O

O

O

OH OH

OOP-O

O

N+

NH2

O

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)

Pyrophospho- kinase

Ribose-5P

ADP-ribose pyrophosphatase

N

NN

N

NH2

O

OHOH

OP-O

O

O

OH OH

OOP-O

O

N+

O-

O

Adenylate (AMP)

AMP ATP

ATP AMP

Deamino NAD+

PRPP

ATP AMP

2×ADP 2× ATP

PolyPn PolyPn-2

Adenylate kinase

PolyP kinase

In vitro代謝工学によるNAD+サルベージ合成経路の構築 15/19

HPLC analysis

400 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0) 60 mM NH4Cl 10 mM MgCl2

1.0 mM Polyphosphate BsNADS enzyme solution TtNMNAT enzyme solution TtNAPRT enzyme solution TtRPK enzyme solution TtADPRP enzyme solution AcNAmase enzyme solution TtADK enzyme solution TtPPK enzyme solution 4.0 mM NAD+

3.0 mM ATP 0.2 mM Nicotinamide 0.2 mM ADP-ribose

Reaction Mixture

Incubation at 60oC

18/20

1 2 3 4 5 6

2

3

4

NAD

+ (m

M)

with enzymes

without enzymes

Incubation time (h)

0 0

In vitro代謝工学によるNAD+サルベージ合成経路の構築 16/19

期待される用途

各種代謝産物のオンデマンド生産 ・部位特異的ラベル化物質等を含む研究用試薬製造など ・細胞内含有量が低い代謝産物の高収率生産

環境・食品・生体試料中の微量物質の分析 ・酵素を用いた診断・分析試薬 ・環境モニタリング ・バイオマーカー測定

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本技術に関する知的財産権

発明の名称： ＮＡＤ＋の製造方法及びＮＡＤ＋製造用形質転換体セット

出願番号： 特願2015-33843 出願人： 独立行政法人科学技術振興機構

発明者： 本田孝祐、跡見晴幸

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大阪大学

コーディネーター 鍵谷 圭 ＴＥＬ ０６－６８７９－４２０６ ＦＡＸ ０６－６８７９－４２０８ e-mail contact＠uic.osaka-u.ac.jp

お問い合わせ先

かぎや けい

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