dung song sieu am trich ly isoflavone

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

O

Tiểu luận môn học Các kỹ thuật hiện đại trong CNTP

Tên đề tài:

Sử dụng sóng siêu âm trích ly

isoflavone

GVHD: PGS TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

HVTH: MAI THỊ HẢI ANH

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGUYỄN NGỌC TÚ ANH

NGUYỄN THỊ NGUYÊN THẢO

NĂM HỌC 2010 - 2011

Sử dụng Sóng siêu âm trích ly Isoflavone

MỞ ĐẦU

Isoflavons là một phytoestrogen có nhiều tiềm năng trong phòng và chữa

bệnh. Có nhiều phương pháp trích ly isoflavones, từ truyền thống đến hiện đại. Sử

dụng sóng siêu âm trong trích ly isoflavons là một kỹ thuật hiện đại góp phần khắc

phục một số nhược điểm của phương pháp truyền thống như giảm lượng dung môi,

giảm thời gian chiết, an toàn và hiệu quả và thân thiện với môi trường hơn so với

phương pháp truyền thống.

Tuy nhiên trích ly bằng sóng siêu âm có nhiều vấn đề cần quan tâm nghiên

cứu để tăng hiệu quả trích ly, đó là các thông số tối ưu ảnh hưởng đến quy trình

như dung môi, tỷ lệ dung môi - mẫu, trạng thái mẫu, nhiệt độ, thời gian ly trích,

nguồn năng lượng sóng siêu âm để đạt hiệu quả cao nhất.

Trang 1


1. 2. GIỚI THIỆU CHUNG

2.1 Sóng siêu âm

2.1.1 Khái niệm

Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử

trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16-

20kHz). Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc hay sóng nén, nghĩa là

trong trường siêu âm các phần tử dao động theo phương cùng với phương truyền

của sóng.

Các thông số của quá trình siêu âm:

- Tần số (Frequency, Hz): là số dao động phần tử thực hiện được trong

1 giây, (Hz).

- Biên độ (Amplitude): biểu thị mức độ thay đổi áp suất (so với áp suất

cân bằng của môi trường) trong quá trình dao động.

- Cường độ (Intensity, W/m2): là năng lượng mà sóng siêu âm truyền

trong một đơn vị thời gian qua một đơn vị diện tích đặt vuông góc với phương

truyền âm. Công thức tính I = P/S; trong đó P là công suất của nguồn âm (W), S là

diện tích miền truyền âm (m2).

- Mức cường độ âm (Sound pressure level, B): là đại lượng được tính

bởi công thức: L = lg(I/Io). Trong đó I là cường độ âm tại điểm cần tính, Io là cường

độ âm chuẩn (âm ứng với tần số f = 1000 Hz) có giá trị là: 10-12 W/m2.

Hình 2.1: Các khoảng tần số của sóng siêu âm

Con người có thể nghe được sóng âm có tần số từ 16 Hz đến 18 kHz. Sóng

siêu âm là tên gọi của những sóng có tần số cao hơn 18 kHz. Giới hạn trên của tần

số sóng siêu âm thường là 5 MHz đối với chất khí và 500 MHz đối với chất lỏng

hay chất rắn. Trong phạm vi ứng dụng, sóng siêu âm được chia ra thành sóng siêu

âm tần số thấp, năng lượng cao (20kHz-100kHz) và sóng siêu âm tần số cao, biên

Trang 2


độ nhỏ (2MHz-10MHz) (Kuldiloke J., 2002).

Sử dụng sóng siêu âm năng lượng cao trong công nghệ thực phẩm ngày càng

được khảo sát tỉ mỉ. Phần lớn các nghiên cứu đều áp dụng tần số sóng trong khoảng

từ 20 kHz đến 40 kHz (Povey M.I.W. and Mason T.J, 1998).

2.1.2 Thiết bị phát sóng siêu âm

Thiết bị phát sóng siêu âm cũng phải gồm có 3 phần tối cần thiết sau:

- Bộ phận chuyển phần lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao

để vận hành bộ phận biến đổi .

- Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những dao

động. Phần lớn thiết bị phát sóng siêu âm ngày nay sử dụng kỹ thuật áp điện. Hình

dạng và kích thước của bộ phận này phụ thuộc vào tần số làm việc, bộ phận 20 kHz

có chiều dài gấp đôi bộ phận 40 kHz. Năng lượng qua bộ biến đổi sẽ chuyển ngược

lại thành bình phương tần số dao động, vì vậy thiết bị năng lượng cao tần số thấp

được chú trọng. Bộ phận biến đổi nối với hệ thống truyền sóng thông qua một thiết

bị phụ (Povey M.I.W. and Mason T.J, 1998).

- Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lòng chất lỏng.

Trong thiết bị phát sóng siêu âm dạng bể, bộ phận biến đổi được gắn ở đáy bể và

truyền trực tiếp dao động vào chất lỏng trong bồn. Tuy nhiên, đối với thiết bị năng

lượng cao (thiết bị dạng thanh/que) dao động được khuyếch đại và truyền vào môi

Trang 3

Hình 2.2. Phạm vi tần số sóng siêu âm

Sóng âm nghe thấySóng siêu âm năng lượng caoPhạm vi sóng mở rộngSóng siêu âm biên độ nhỏ

16 Hz – 18 kHz20 kHz – 100 kHz20 kHz – 2 MHz5 MHz – 10 MHz


trường lỏng nhờ thiết bị trung gian gắn với bộ phận biến đổi. Theo thời gian, đầu

của bộ phận trung gian này có thể bị mòn và bị giảm chiều dài cần thiết vì vậy

người ta phải lắp đầu có thể tháo gỡ được (Povey M.I.W. and Mason T.J, 1998).

2.1.3 Nguyên lý tác động của sóng siêu âm

2.1.3.1. Hiện tượng xâm khí thực

Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và

nén liên tiếp được tạo thành. Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở

rất gần nhau nhờ liên kết hóa học. Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các

phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm trong

chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những

bọt khí nhỏ. Bọt khí trở thành hạt nhân của hiện tượng xâm thực khí, bao gồm bọt

khí ổn định và bọt khí tạm thời (Kuldiloke J., 2002).

Bọt khí ổn định là nguồn gốc của những bong bóng khí nhỏ, kích thước của

chúng dao động nhẹ trong các chu trình kéo và nén. Sau hàng ngàn chu trình, chúng

tăng thêm về kích thước. Trong suốt quá trình dao động, bọt khí ổn định có thể

chuyển thành bọt khí tạm thời. Sóng siêu âm làm rung động những bọt khí này, tạo

nên hiện tượng “ sốc sóng “ và hình thành dòng nhiệt bên trong chất lỏng. Bọt khí

ổn định có thể lôi kéo những bọt khí khác vào trong trường sóng, kết hợp lại với

nhau và tạo thành dòng nhiệt nhỏ (Kuldiloke J., 2002).

Trang 4

Hình 2.3. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh


Các bọt khí tạm thời có kích cỡ thay đổi rất nhanh chóng, chỉ qua vài chu

trình chúng bị vỡ ra. Trong suốt chu trình kéo/nén, bọt khí kéo giãn và kết hợp lại

cho đến khi đạt được cân bằng hơi nước ở bên trong và bên ngoài bọt khí. Diện tích

bề mặt bọt khí trong chu trình kéo lớn hơn trong chu trình nén, vì vậy sự khuyếch tán khí

trong chu trình kéo lớn hơn và kích cỡ bọt khí cũng tăng lên trong mỗi chu trình. Các

bọt khí lớn dần đến một kích cỡ nhất định mà tại đó năng lượng của sóng siêu âm

không đủ để duy trì pha khí khiến các bọt khí nổ tung dữ dội. Khi đó các phân tử va

chạm với nhau mãnh liệt tạo nên hiện tượng “ sốc sóng “ trong lòng chất lỏng, kết

quả là hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao (50000C và 5x104kPa)

với vận tốc rất nhanh 106 oC/s (Kuldiloke J., 2002).

Hiện tượng xâm thực khí mở đầu cho rất nhiều phản ứng do có sự hình thành

các ion tự do trong dung dịch; thúc đẩy các phản ứng hóa học nhờ có sự trộn lẫn các

chất phản ứng với nhau; tăng cường phản ứng polymer hoá và depolymer hóa bằng

cách phân tán tạm thời các phần tử hay bẻ gãy hoàn toàn các liên kết hóa học trong

chuỗi polymer; tăng hiệu suất đồng hoá; hỗ trợ trích ly các chất tan như enzyme từ

tế bào động vật, thực vật, nấm men hay vi khuẩn; tách virus ra khỏi tế bào bị nhiễm;

loại bỏ các phần tử nhạy cảm bao gồm cả vi sinh vật (Kuldiloke J., 2002).

Trang 5

Hình 2.4. Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí


2.1.3.2 Hiện tượng vi xoáy

Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây nên sự

kích thích mãnh liệt. Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu

âm gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy. Hiện tượng này làm

giảm ranh giới giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự

khuyếch tán ở một vài trường hợp mà khuấy trộn thông thường không đạt được (Kuldiloke

J., 2002).

2.1.4 Các hiệu ứng vật lý và hóa học khi chiếu siêu âm lên hệ chất lỏng

2.1.4.1 Hiện tượng sủi bóng (cavitation): Sóng siêu âm được tạo ra

bằng các dao động cơ học ở tần số cao hơn 15kHz. Khi truyền trong môi trường

lỏng, các phần tử trong trường siêu âm trải qua các chu trình nén (compression) và

duỗi (rarefaction) và những dao động này sẽ lan truyền cho các phần tử kế cận. Khi

năng lượng đủ lớn, tại chu trình duỗi, tương tác giữa các phân tử sẽ vượt quá lực

hấp dẫn nội tại và các lỗ hổng nhỏ trong lòng chất lỏng được hình thành. Hiện

tượng trên còn được gọi là hiện tượng sủi bóng. Những bóng sủi này sẽ lớn dần lên

bởi quá trình khuếch tán một lượng nhỏ các cấu tử khí (hoặc hơi) từ pha lỏng trong

suốt pha dãn nở và không được hấp thụ hoàn toàn trở lại trong quá trình nén.

2.1.4.2 Hiện tượng vỡ bóng

Khi chúng đạt đến một thể tích mà chúng không còn có thể hấp thu được

năng lượng, chúng vỡ ra một cách đột ngột và nhanh chóng. Trong suốt quá trình

vỡ, nhiệt độ và áp suất sẽ tăng lên rất cao (khoảng 4000K và 1000atm). Thể tích

chất lỏng bị gia nhiệt là rất nhỏ và nhiệt nhanh chóng bị tiêu tan, mặc dù nhiệt độ tại

vùng này thì rất cao trong vài s. Mặt khác, nhiệt độ và áp suất cao tạo ra khi nổ

bong bóng sẽ dẫn tới sự tạo thành các gốc tự do như là H và OH.

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành và vỡ bóng

Một số thông số như là tần số và biên độ của sóng siêu âm, nhiệt độ và độ

nhớt của môi trường ảnh hưởng đến mức độ tạo bong bóng khí.

Sự hình thành các lỗ hổng hay bóng khí có thể bị giới hạn ở tần số cao hơn

2,5 MHz. Kích thước bong bóng khí thu được ở tần số thấp hơn 2,5 MHz là tối đa

và do đó những bong bóng khí này sẽ tạo ra năng lượng lớn khi vỡ.

Trang 6


Siêu âm với biên độ cao hơn sẽ hình thành hiện tượng sủi bong bóng với

cường độ mạnh hơn. Bong bóng được hình thành nhanh hơn ở nhiệt độ cao hơn do

tăng áp suất hơi và giảm sức căng. Tuy nhiên sức căng hơi cao hơn sẽ làm yếu đi

cường độ nổ bong bóng.

Độ nhớt của chất lỏng cũng ảnh hưởng đến hiện tượng sủi bong bóng. Trong

môi trường có độ nhớt cao, sự lan truyền của các phần tử trong trường siêu âm bị

cản trở và do đó làm giảm mức độ sủi bong bóng. Trong trường hợp này, siêu âm có

tần số thấp hơn và năng lượng cao hơn có khả năng xuyên thấu vào thực phẩm tốt

hơn là siêu âm có tần số cao hơn.

2.1.5 Ứng dụng của sóng siêu âm

Siêu âm là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong

ngành công nghệ thực phẩm. Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thường

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Có 2 lĩnh vực được ứng dụng chính trong

công nghiệp thực phẩm:

- Siêu âm tần số cao và năng lượng thấp: còn được gọi là siêu âm chuẩn đoán, trong

khoảng tần số 20 – 60 MHz [51]. Phần này được sử dụng như một kỹ thuật phân tích,

không làm phá hủy cấu trúc của mẫu, điều này được ứng dụng để xác định tính chất thực

phẩm, đo tốc độ dòng chảy, kiểm tra bao gói thực phẩm ....(Floros, J. D., 1994).

- Tần số thấp và siêu âm năng lượng cao (2 MHz – 10 MHz): được ứng dụng rộng

rãi như một quá trình hỗ trợ trong hàng loạt các lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí, trích ly,

lọc, đồng hoá, làm mềm thịt, quá trình oxi hoá, quá trình tiệt trùng … (Floros, J. D., 1994).

2.2 Giới thiệu về Isoflavone

2.2.1 Cấu tạo

Hình 2.5: Cấu tạo isoflavone

Trang 7


Bảng 2.1. Danh sách các isoflavone

TÊN R1 R2 R3

Daidzein H H H

Glycitein H OCH3 H

Genistein OH H H

Daidzin H H Glucisyl

Glycitin H OCH3 Glucosyl

Genistin OH H Glucosyl

Acetyl hoặc Malonyl daidzin H HGlucosyl-COCH3 hoặc

Glucosyl-COCH2COOH

Acetyl hoặc Malonyl glycitin H OCH3

Glucosyl-COCH3 hoặc

Glucosyl-COCH2COOH

Acetyl hoặc Malonyl genistin OH HGlucosyl-COCH3 hoặc

Glucosyl-COCH2COOH

2.2.2 Nguồn gốc và tính chất

Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenol có liên quan với

flavonoid (isoflavone và flavonoid khác nhau ở vị trí gắn của vòng benzen). Sự

khác biệt trong cấu tạo phân tử giữa isoflavone và flavones ở vị trí gắn nhóm phenyl

vào gốc chromone (vị trí 3 ở isoflavone và vị trí 2 ở flavones)

Isoflavone có nguồn gốc từ thảo mộc, có nhiều trong đậu nành. Những hợp

chất có thành phần tương tự như isoflavon vẫn được tìm thấy trong một số loài thực

vật như: cỏ 3 lá, cỏ linh lăng, cây dong…nhưng chúng không ăn được. Cho đến nay,

đậu nành là loại thực phẩm duy nhất có chứa chất isoflavone. Đó là lý do tại sao đậu

nành đã thu hút được sự chú ý, tập trung nghiên cứu từ các nhà khoa học.

Cơ chế hoạt động và chức năng isoflavone như những hoocmon nữ và mang

tính lành giúp cơ thể chống lại chứng loãng xương, bệnh tim mạch, và 1 số loại ung

thư. Thường xuyên sử dụng isoflavone làm giảm tỷ lệ các bệnh tiền mãn kinh và

Trang 8

R3O


các triệu chứng mãn kinh khác.

Theo đánh giá của Branca và Lorenzetti đề nghị sử dụng 50 - 110mg

isoflavone mỗi ngày từ 6 - 12 tháng cải thiện chất lượng xương.

3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY ISOFLAVON

3.1 Phương pháp cổ điển

Các kỹ thuật truyền thống sử dụng soxhlet, Shaking, stirring là những kỹ

thuật phổ biến được sử dụng để ly trích isoflavon.

Các yếu tố ảnh hưởng:

Dung môi: Theo nghiên cứu của Eldridge (1982) sử dụng dung môi MeOH

và EtOH và etylacetate và MeCN với đậu nành tách béo để trích ly isoflavones.

Theo đánh giá này 80% MeOH sẽ cho hiệu quả trích ly isflovones là cao nhất và

hầu hết là được tái sinh được isoflavon.

Thời gian ly trích hiệu quả là 4h, tỉ lệ dung môi: mẫu thì nó sẽ khác nhau từ

14:1 - 45:1 một khi điều kiện ly trích được thiết lập phương pháp này được sử dụng

để xác định hàm lương isflavones từ bột đậu nành, protein concentrates và isolate.

Một nghiên cứu đi tiên phong bởi Murphy (1981) đã so sánh những dung

môi khác nhau như MeOH, ACE, MeCN và chloroform-MeOH kết quả đã chỉ ra

rằng với dung môi tinh khiết thì nó sẽ làm tăng hiệu quả trích ly tổng hàm lượng

isoflavones chủ yếu (Gi, Ge, Di và De) và theo nghiên cứu này thì MeCN cùng với

nước hoặc acid thì cho hiệu quả trích ly cao hơn những dung môi còn lại.

Theo Murphy thì 80% methanol và 83% acid acetonitrile trở thành dung môi

được sử dụng phổ biến trong việc ly trích isoflavones.

Phương pháp này được phát triển bởi Murphy và nó phụ thuộc vào lượng

mẫu thể tích dung môi lượng nước thêm vào và kỹ thuật khuầy đảo .

Theo Song et al cùng cộng sự (1998) đã đánh giá lại phương pháp của

Murphy và báo cáo rằng việc sử dụng nước thêm vào acid HCl và MeCN làm tăng

khả năng phục hồi isoflavones đối với hầu hết thực phẩm từ đậu nành thì 7ml nước

thì cho hiệu quả lớn nhất trong việc trích ly sử dụng một tỉ lệ dung môi và mẫu cao

Trang 9


hơn 6ml/g những điều tra này trên mầm đậu nành (có hàm lượng isoflavones cao

trên 10mg/g ).

Theo Achouri (2005) nghiên cứu ly trích isoflavon từ đậu nành tách béo

(DSM) và protein đậu nành isolate (PSI) kết luận rằng :

DSM: 80%MeCN thì làm tăng hiệu quả ly trích malonyl isoflavon và

aglycones, 80% MeOH có hiệu quả hơn trong việc ly trích glucoside.

SPI:80% EtOH cho hiệu quả trích ly aglycon cao nhất.

EtOH: hiệu quả ly trích cao, ít độc, thân thiện với môi trường, giá thành rẻ

Số lần trích ly: càng tăng thì hiệu quả càng cao. Ví dụ với mẫu DSM tăng từ

65% đấn 74% sau 5 lần ly trích , SPI: 107 đến 147%

Nhiệt độ: theo Barnes và cộng sự (1994) sử dụng ly trích ispoflavon ở 600C,

khi tăng nhiệt độ lên 800C tăng tốc độ ly trích.

Coward cùng cộng sự (1998) đã đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên việc ly

trích isoflavones từ thức ăn từ đậu nành. Isoflavones β-glucoside conjugates được ly

trích bởi dung môi là 80% MeOH tại các khoảng nhiệt độ phòng, 4 0C và ở 800C,

thời gian từ 2- 72 giờ bằng việc đảo trôn hoặc lắc rung.

40C: cho nồng độ malonyl glucosides cao nhất và nồng độ β-glucoside

conjugates thấp nhất

800C: có sự chuyển hóa từ malonyl glucosides conjugate thành β-glucoside

conjugates, tuy nhiên tổng lượng isoflavons trích ly được vẫn không thay đổi.

3.2 Phương pháp hiện đại

3.2.1 Kỹ thuật trích ly bằng sóng siêu âm (Ultrasound-assisted extraction UAF)

sẽ được trình bày chi tiết ở mục 3.

3.2.2 Kỹ thuật trích ly bằng vi sóng

Là những nguồn sóng có chiều dài bước sóng từ 1mm đến 1m, hoặc từ tần số

300 MHz đến 300GHz ly trích bằng sóng siêu âm dựa vào nguồn năng lượng hấp

thụ bởi các phân tử hóa học có cực.

Hiệu quả của phương pháp sử dụng vi sóng phụ thuộc vào các yếu tố:

Trang 10


Tính chất dung môi

Vật liệu mẫu

Thành phần được ly trích

Kỹ thuật này được sử dụng gần đây trong một vài trường hợp như trích ly

isoflavon từ đậu nành hay các loại đậu, sắn dây. Hiệu quả ly trích isoflavon từ đậu

nành bằng vi sóng được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2. Kỹ thuật trích ly isoflavones từ đậu nành bằng vi sóng

Theo Rostangno et al và công sự, trích ly isoflavon từ đậu nành phụ thuộc

các yếu tố:

Loại dung môi

Nhiệt độ

Thể tích dung môi

Chuẩn bị mẫu

Thời gian ly trích

a. Dung môi: tinh khiết, MeOH, EtOH, và nước

Trang 11


b. Lượng dung môi: dưới 50% EtOH, 50% MeOH. 50% EtOH trích ly

tổng lượng isoflavon cao nhất, lượng nước sử dụng thấp hơn 50% làm giảm hiệu

quả trích ly.

c. Tỷ lệ mẫu:dung môi: 0,5:25(g/ml) hiệu qủa cao nhất

d. Kích cỡ mẫu: nhỏ tốt hơn

e. Thời gian trích ly: khoảng 20 phút

f. Hiệu suất : khoảng 75%-95%

Theo nghiên cứu gần đây của Careri et al và cộng sự (2007) đã nghiên cứu

việc thủy phân mẫu kết hợp với sử dụng sóng siêu âm. Việc thủy phân mẫu trước

khi sử dụng vi sóng giúp ổn định mẫu có thể ly trích được gần như hầu hết lượng

isoflavon có trong mẫu.

Nhìn chung việc sử dụng vi sóng để trích ly isoflavon cho hiệu quả cao khi

kết hợp với việc thủy phân mẫu. Tuy nhiên cần nghiên cứu các thông số trong quá

trình ổn định như áp lực sử dụng và một số vấn đề liên quan như ẩm độ, hoạt động

của enzyme β-glucosidase, kích cỡ mẫu.

3.2.3 Kỹ thuật chiết lỏng cao áp (PLE)

Là phương pháp kết hợp nhiệt độ tăng cao (50 – 200OC) và áp suất (100 –

140atm) với các dung môi lỏng (không đạt điểm tới hạn) để tiến hành trích ly nhanh

và hiệu quả các chất cần phân tích từ các cơ chất mẫu rắn và nửa rắn. Nhiệt độ cao

làm cho độ hòa tan và tốc độ khuếch tán các cơ chất trong mẫu tăng cao, trong khi

đó áp suất cao giữ cho dung môi dưới điểm sôi tạo điều kiện cho dung môi xâm

nhập vào cơ chất mẫu rắn dễ dàng hơn.

Kỹ thuật này có những tên gọi khác nhau, như trích ly dung môi tăng tốc

(ASE), trích ly lỏng cao áp (PLE), và trích ly dung môi cao áp (PSE).

PLE được sử dụng trong nhiều trường hợp trích ly isoflavone từ đậu nành,

thực phẩm từ đậu nành và các cơ chất khác (sắn dây,…)

Ưu nhược điểm của PLE:

Ưu điểm: nhiệt độ trích ly cao làm tăng độ hòa tan, tốc độ khuếch tán của các

Trang 12


hợp chất trong mẫu ra dung môi.

Áp suất cao cho phép dung môi duy trì ở trạng thái lỏng ở nhiệt độ cao và

làm tăng sự xâm nhập của dung môi vào trong cơ chất mẫu.

Nhược điểm: nhiệt độ sử dụng cao hơn so với các phương pháp thông thường

và do đó làm giảm phẩm chất hoặc làm biến đổi chất lượng của isoflavone trong

quá trình trích ly.

Chỉ trích ly nhanh và hiệu quả từ cơ chất mẫu là rắn hoặc bán rắn.

3.2.4 Kỹ thuật trích ly siêu tới hạn

Tổng quan

Kỹ thuật trích ly chất lỏng siêu tới hạn (SFE) là quy trình tách một hợp chất

(chất chiết) từ những hợp chất khác (chất ban đầu) dùng những chất lỏng siêu tới

hạn như một dung môi tách. Chất lỏng siêu tới hạn là chất có nhiệt độ và áp suất

trên điểm nhiệt độ tới hạn của nó. Chúng có thể đâm xuyên qua hầu hết những mẫu

vật liệu thực vật như khí ga, do bởi hệ số khuếch tán ánh sáng cao và độ nhớt của

chúng thấp. Nó là dạng trung gian giữa thể rắn và thể lỏng. Thêm nữa, gần tới điểm

tới hạn, những thay đổi nhỏ về nhiệt độ và áp suất dẫn đến những thay đổi lớn về tỷ

trọng, cho phép nhiều đặc tính cũng bị thay đổi và để thu nhận chất chiết có tính

chọn lọc. Tác nhân chiết thường được dùng phổ biến nhất là CO2, bởi chi phí và

độc tính của nó thấp và dễ dàng đạt được thông số tới hạn là 31,1 ◦C/74,8 atm.

Hơn nữa, CO2 là chất vô cực có thể hòa tan các chất vô cực và hòa tan các hợp chất

có cực ở mức độ vừa phải. Sự thêm vào của chất hỗ trợ có cực ( ví dụ như MeOH)

để CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là cách đơn giản và hiệu quả nhất để làm thay đổi tính

có cực của CO2 dựa trên các chất lỏng để làm tăng sự hòa tan của các chất cần phân

tích. Các chất hỗ trợ cũng có thể khắc phục những tương tác giữa chất cần phân

tích và chất ban đầu, bằng cách tăng hiệu suất trích ly của các hợp chất hữu cơ có

cực.

Nguyên tắc

Một hệ thống SFE tiêu biểu gồm một bơm áp lực lớn dẫn chất lỏng và một

buồng trích ly chứa mẫu mà nó giúp duy trì áp lực và nhiệt độ chính xác (hình I.1).

Trang 13


Dung môi hữu cơ (cũng có thể gọi là chất hỗ trợ) có thể được thêm vào chất lỏng để

làm tăng khả năng hòa tan; khi đó có thể sử dụng các đường ống nối lại nhau hay

thêm vào một bơm phụ. Bởi sự bất lợi của các đường ống này ( thiếu sự linh hoạt

trong sử dụng dung môi và tỉ lệ chất hỗ trợ thay đổi trong suốt đường ống), việc

dùng bơm phụ tốt hơn mặc dù chi phí đầu tư ban đầu cao hơn.

SFE có thể thực hiện bằng phương pháp động hoặc tĩnh. Áp lực trong hệ

thống được duy trì bởi sự cố định hay thay đổi, tiếp đó làm cho áp suất không phụ

thuộc vào dòng chảy. Cuối chu trình, chất lỏng được giảm áp và các chất phân tích

được chứa trong dung môi hữu cơ. Các điều kiện như dung môi, nhiệt độ đóng vai

trò quan trọng đầu tiên đảm bảo sự thu hiệu quả các hợp chất chiết. Vì có nhiều

thông số ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly , SFE cho phép mức độ chọn lọc cao. Mặc

dù, ở khía cạnh khác, điều này làm cho mức độ tối ưu hóa hoàn tooàn kém và khó

khăn trong việc vận hành.

Hình 2.6: Nguyên lý hoạt động của hệ thống SFE và các thông số ảnh hưởng

Các phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn để trích ly isoflavon từ đậu nành

Mặc dù SFE là một trong những kỹ thuật trích ly isoflavon phức tạp nhất do

nhiều có nhiều biến đổi và sự tương tác giữa các chất với nhau, mà có thể ảnh

hưởng đến hiệu quả, một số nhà nghiên cứu đã ứng dụng thành công SFE để chiết

tách isoflavon từ các dạng khác nhau của đậu nành như bột, mầm và bánh đậu

nành, chẳng hạn như: Mẫu dùng để đánh giá phương pháp là hạt đậu nành sấy thăng

hoa, loại isoflavon là Gi-Ge-De, điều kiện trích ly: chu trình động kéo dài 20 phút,

Trang 14


chu kỳ tĩnh 10 phút, tốc độ lưu lượng CO2 1ml/phút, thời gian trích ly 90 phút, đá

trap loại ODS, dung môi sấy: 1,5ml MeOH, tốc độ dòng khí sấy 0,5 ml/phút, trọng

lượng mẫu 1g, buồng trích 10ml, chất hỗ trợ 70%EtOH, nồng độ chất hỗ trợ 10mol

%.

Ở hầu hết các phương pháp và kỹ thuật hiện đại, tính chất ổn định của

isoflavon dưới những điều kiện chiết tách khác nhau cho tới bây giờ vẫn chưa được

nghiên cứu. Đây là một điều hết sức quan trọng vì kỹ thuật này thường sử dụng

nhiệt độ tương đối cao. Những yếu tố cơ bản có tính ổn định của các kỹ thuật trước

đó có lẽ ứng dụng cho SFE và do đó có thể cân nhắc các biến đổi trong một mặt

nào đó của isoflavon trong suốt quá trình chiết tách. Do đó, việc đánh giá tính chất

ổn định của isoflavon trong các điều kiện SFE khác nhau, chẳng hạn như nhiệt độ,

thời gian, số lượng và loại chất bổ trợ thì cần một cách cấp bách.

Cho đến nay, các phương pháp chiết tách chỉ phát triển ở một mức độ giới hạn

mà thôi, Chandra et al. đã kiểm tra một số lượng có hạn các điều kiện với áp suất ,

số lượng và loại chất bổ trợ khác nhau trong việc chiết tách một số loại isoflavon

(De và Ge) từ các nguồn đậu nành khác nhau. Việc đánh giá các điều kiện trích ly

cho thấy ở 50 ◦C, 600 atm và 20% EtOH chiết suất được số lượng isoflavon cao

nhất (gần 93%). Đáng lưu ý là sự phát triển của phương pháp này biểu diễn những

tiêu chuẩn khác nhau trên giấy lọc đã vắt cạn mà nó được trích ly sau đó bằng SC-

CO2. Những điều kiện được đánh giá cao nhất đó là dùng phương pháp chiết tách

De và Ge từ miso, tàu hũ, và món ăn từ đậu nành và bột từ đậu nành dùng với các

mẫu từ 2 đến 10g. Mặc dù có những khắc phục lớn, nhưng phương pháp này bị gới

hạn bởi những điều kiện về xác định số lượng isoflavon.

Sau đó, Rostagno et al. đã đánh giá cách dùng CO2 siêu tới hạn trong chiết

tách isoflavon từ hạt đậu nành (Gi, Ge and De) sử dụng nhiệt độ, áp suất và nồng độ

chất bổ trợ khác nhau. Số lượng lớn nhất của Gi and Ge thu được tại 70 ◦C/200

bar/10mol%, trong khi đó số lượng lớn nhất của De thu được tại 50 ◦C/360

bar/10mol%. Trong phương pháp chiết tách của Gi và Ge thì ảnh hưởng của nhiệt

độ được theo dõi hơn cả trong khi ở phương pháp chiết tách của De thì yếu tố áp lực

lại được chú trọng hơn cả. Sự tương tác giữa nhiệt độ và áp lực cũng được theo dõi

Trang 15


trong quá trình chiết tách isoflavon. Sự giảm hiệu suất chiết tách do tăng nhiệt độ có

thể được giải thích do sự giảm tỉ trọng chất lỏng siêu tới hạn, trong khi đó sự giảm

hiệu quả chiết tách do tăng áp suất có thể được cho là do sự giảm hệ số khuếch tán

của chất lỏng, mà có thể gây ra sự tương tác với mẫu. Mặc dù vậy, đáng lưu ý rằng

tính chất ổn đinh của isoflavon không đạt tới được, chỉ có glucoside (Gi) và

aglycones thì ổn định và malonyl glucoside thì không xác định được. Do việc điều

chỉnh nhiệt độ cao vừa phải tạo sự thoái biến trong suốt quá trình chiết tách điều đó

ảnh hưởng đến kết quả đạt được sau này. Có những tác giả đã đưa ra đề nghị rằng

sự thủy phân enzyme của Di có lẽ xuất hiện trong quá trình chiết tách và ảnh hưởng

đến những kết quả sau này, bởi nhiệt độ chiết thích hợp nhất là 50◦C gần với nhiệt

độ tối ưu cho hoạt động của glucosidase.

Gần đây, Kao et al. đã thay đổi những điều kiện thí nghiệm được đánh giá khả

quan bởi Rostagno et al. [118] đó là dùng 70% EtOH như một chất hỗ trợ thay vì

70% MeOH và nghiên cứu một phạm vi tương tự của nhiệt độ và áp suất cho SFE

của isoflavone (tất cả gồm 12 công thức hóa học chính hiện diện trong hạt đậu

nành) từ bánh làm từ đậu nành. Mặt quan trọng của phương thức này , bên cạnh sự

phục hồi lớn (87,3% khi được so sánh với sự trích ly bằng ly tâm), đó là số lượng

taats cả các dạng cấu tạo hóa học của isoflavon vì đó là báo cáo đầu tiên của việc sử

dụng những chất lỏng siêu tới hạn cho việc ly trích malonyl và acetyl isoflavone.

Những kết quả cho thấy số lượng lớn nhất của malonyl glucoside và glucoside thu

được tại 60◦C và 350 bar, trong khi ở một mức độ cao của acetyl glucoside và

aglycone là sản xuất tại 80◦C và 350 bar. Số lượng cao nhất của isoflavone tổng thu

được ở 60◦C/350 bar, có thể dẫn đến nồng độ khả quan của malonyl and glucosides

trong mẫu. Mặc dù một sự hỗ trợ khác được sử dụng đến đó là sự tương tác của

nhiệt độ và áp suất giống nhau như Rostagno et al. [118] đã báo cáo.

Mặc dù, khi trong hầu hết các nghiên cứu, tính ổn định không được đánh giá

và những kết quả có thể bị ảnh hưởng sự thoái biến của malonyl và glucoside

isoflavone tới các dạng acetyl and aglycone tương ứng. Có những tác giả đã cho

rằng, mặc dù dùng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nấu và nướng, sự thoái hóa vẫn có thể

xuất hiện có sự kết hợp với áp suất. Tổng số malonyl glucoside giảm sau khi tăng

nhiệt độ trích ly, mà đòi hỏi phải có sự hòa tan của các dạng cấu tạo hóa học này

Trang 16


hoặc có sự biến đổi acetyl glucoside, glucoside hay aglycone, mà điều này có lẽ

giải thích những số lượng cao nhất thu được tại 80◦C.

Araujo et al. [cũng đã kiểm tra các điều kiện nhiệt độ, áp suất, chất hỗ trợ và

nồng độ chất hỗ trợ khác nhau cho SFE của De và Ge từ mầm hạt đậu nành sau khi

thủy phân. Lượng isoflavon cao nhất thu được của phương pháp này tại 60 ◦C, 380

bar sử dụng phương pháp trích ly động và tĩnh ba chu kỳ trong 15 phút với sự thêm

vào 10 mol% của 80% MeCN. Hơn nữa, những chất hỗ trợ và sự khác nhau về áp

suất có những tác động có ý nghĩa tới hiệu quả trích ly. Không có isoflavon nào mà

không được trích ly với các chất hỗ trợ và ảnh hưởng nổi bật của của áp suất trong

lượng thu được từ 2 loại isoflavon này (De và Ge) được cho là do sự giảm áp suất

hơi thích hợp và tăng tỉ trọng của chất lỏng và động học của của các hợp chất từ

mẫu ban đầu. Khi tăng áp suất sự hấp thụ diễn ra nhanh hơn và sự hòa tan tốt hơn

điều đó có giá trị cho việc trích ly. Họ cũng khảo sát xu hướng giống nhau bởi

Rostagno et al., đó là việc nâng cao lượng chất trích ly bằng cách tăng áp suất phụ

thuộc vào nhiệt độ với sự tương quan giữu áp suất và nhiệt độ. Hơn nữa, những

khác biệt chính của các chất hỗ trợ thử nghiệm. Dùng 80% MeOH, 80% EtOH and

80% MeCN như chất hỗ trợ, một lượng có liên quan đến aglycone được trích ly

theo lần lượt 9.61%, 11.27% và 25.65% khi được so sánh với việc khuấy tương ứng.

Rõ ràng, dùng phương thức đề nghị là 80% MeCN thì hiệu quả hơn 80% EtOH và

80% MeOH.

Một cách tiếp cận khác là sử dụng SC-CO2 trước đây để làm giàu hay làm sạch

mẫu chất nền với isoflavon bằng cách chuyển các hợp chất từ chất nền, như bài báo

cáo của Yu et al., ở đây đưa ra các mầm đậu nành được tách dầu bởi SC-CO2 và

được dùng để sản xuất protein đậu nành giàu isoflavone.

Một trong những giới hạn của nghiên cứu này là việc dùng chiến lược cùng

một thời điểm để đánh giá khách quan các điều kiện trích ly mà các chất lỏng siêu

tới hạn không được đề cập nhiều, do đó có nhiều sự khác biệt và tương tác mà

chúng ảnh hưởng đến hiệu suất hơn là các kỹ thuật trích ly khác. Bước tiến tốt nhất

đó là việc sử dụng SC-CO2 nhưng chỉ mới dung trong thí nghiệm, nó thích hợp cho

các điều kiện trích ly.

Trang 17


Có nhiều ảnh hưởng khác nhau đến việc trích ly dung SFE, không chỉ gồm áp

lực, nhiệt độ, loại và số lượng chất hỗ trợ mà còn có các yếu tố khác như các chu

trình động và tĩnh học, tốc độ dòng CO2, cấu tạo đá trap, dung môi sấy và tốc độ

sấy… Cấu tạo đá trap và các điều kiện tách rửa (dung môi, tốc độ dòng chảy và

nhiệt độ) cho đến nay chưa được nghiên cứu và có lẽ cúng ảnh hưởng đến sự tách

lấy isoflavon và cần được đầu tư trong tương lai. Mẫu cũng là nhân tố quan trọng

bởi kích thước hạt và những tương tác với chất nền (ví dụ tương tác với hoạt tính

của glucosidase). Các thành phần của mẫu như dầu có thể cản trở việc trích ly các

hợp chất mà phụ thuộc vào tỉ trọng chất lỏng. Hơn nữa, những điều kiện trích ly có

thể có những tác động lớn đến một thông số trích ly nào đó, và những khác nhau

trong việc trích ly có chọn lọc nên được nghiên cứu kỹ tạo nên hiệu quả trích ly cao

nhất. Vì vậy, nhiều nghiên cứu vẫn cần định rõ tiềm năng của các chất lỏng siêu tới

hạn trong việc trích ly isoflavon từ hạt đậu nành và các thực phẩm từ đậu nành.

4. SỬ DỤNG SÓNG SIÊU ÂM TRÍCH LY ISOFLAVONE

4.1. Quy trình trích ly (lấy ví dụ từ đậu nành)

Hình 2.7: Sơ đồ trích ly isoflavones từ đậu nành

Thuyết minh quy trình:

Trang 18

UAE


Từ mẫu có nguồn gốc từ đậu nành qua một số khâu xử lý mẫu: đồng hóa,

nghiền, sấy, lạnh đông (đối với dạng mẫu lỏng: nước uống từ đậu nành,…),thủy

phân…ta thu được mẫu nguyên liệu đem trích ly.

Trích ly: có thể sử dụng các phương pháp truyền thống hoặc hiện đại đã nêu

trên, sản phẩm sau khi trích ly sẽ qua một số khâu xử lý như: ly tâm, lọc, cô đặc,

thủy phân, chiết lỏng cao áp,…

Sản phẩm sau khi tinh sạch được phân tích, định lượng bằng một số phương

pháp: GC/GC-MS, HPLC/HPLC-MS,…

Ở đây ta tìm hiểu hiệu quả quá trình trích ly bằng sóng siêu âm:

Hiệu quả trích ly các hợp chất khi sử dụng sóng siêu âm tăng lên là nhờ sự

tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng truyền qua. Dưới tác dụng của sóng,

các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí nổ vỡ, tạo nên

hiện tượng “sốc sóng”. Khi sự nổ vỡ của các bọt khí ở gần bề mặt pha rắn, xảy sự

mất đối xứng, sinh ra tia dung môi có tốc độ cao vào thành tế bào, do đó làm tăng

sự xâm nhập của dung môi vào tế bào và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và

pha lỏng. Điều này làm tăng sự truyền khối và phá vỡ cấu trúc tế bào. Sự nổ vỡ của

các bọt khí làm tăng sự thoát ra của các chất nội bào vào dung dịch. Sử dụng nhiệt

độ cao trong kĩ thuật UAE có thể làm tăng hiệu quả trích ly vì nó làm tăng sự hình

thành và nổ vỡ các bọt khí.

Một vài thông số, cũng giống như trong các kĩ thuật truyền thống, có thể ảnh

hưởng đến hiệu quả trích ly các chất khi sử dụng sóng siêu âm như: sự phân cực và

lượng dung môi, khối lượng và loại mẫu, thời gian trích ly và 1 số thông số của

sóng siêu âm như: tần số, cường độ, số dao động sẽ ảnh hưởng lớn đến động lực

trích ly.

UAE được sử dụng để trích ly isoflavone từ hạt đậu nành, thực phẩm chế

biến từ đậu và từ nhiều nguồn cơ chất khác như đậu phụng, cỏ ba lá, rễ và cây sắn

dây, rễ cây Hoàng kỳ, rễ cam thảo…

Một trong những nghiên cứu đầu tiên về trích ly isoflavone từ đậu được thực

hiện bởi Rostagno. Các yếu tố được khảo sát như dung môi, nhiệt độ, lượng mẫu và

Trang 19


thời gian, những thông số quan trọng nhất là dung môi (lượng nước), nhiệt độ và

thời gian trích ly.

Các yếu tố ảnh hưởng

4.1.1. Nguyên liệu

Tùy thuộc tính chất (nguyên liệu màng tế bào, chất nguyên sinh, một số tạp

chất), trạng thái rắn lỏng, cách thức chuẩn bị mẫu nguyên liệu (kích thước) sẽ ảnh

hưởng rất lớn đến kết quả trích ly.

Chẳng hạn, đối với kích thước vật liệu, quá trình trích ly xảy ra chủ yếu do

thẩm thấu và khuếch tán nên kích thước vật liệu càng nhỏ, diện tích tiếp xúc càng

lớn và hiệu quả trích ly càng cao. Nguyên liệu phải được xay nhỏ đến mức thích

hợp để dung môi có điều kiện tiếp xúc trực tiếp với thành tế bào một cách dễ dàng,

thúc đẩy quá trình chiết xuất nhanh chóng và nâng cao hiệu xuất chiết.

Bảng so sánh kỹ thuật trích ly dưới đây cũng cho ta thấy điều này. Đối với

mẫu dạng mảnh (soy bits) khi sử dụng UAE lượng trích ly đạt được thấp hơn nhiều

so với khi mẫu dạng bột (soy flour).

4.1.2. Dung môi

Lựa chọn dung môi trích ly: dung môi trích ly là các dung môi hoà tan được

hợp chất cần trích ly. Khả năng đó của dung môi lại phụ thuộc một vài tính chất của

nó như độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt...

Các isoflavone các hợp chất phân cực, nên chủ yếu sử dụng dung môi phân

Trang 20

Bảng 2.3. So sánh các kỹ thuật trích ly


cực như nước, ethanol, methanol, dd acid loãng…

Các tài liệu công bố thường sử dụng một số dung môi như: MeCN, EtOH,

MeOH, ACE …

Trong đó một số nghiên cứu đã so sánh và cho các kết quả:

Một trong những nghiên cứu đầu tiên về trích ly isoflavone từ đậu được thực

hiện bởi Rostagno. Các yếu tố được khảo sát như dung môi, nhiệt độ, lượng mẫu và

thời gian, những thông số quan trọng nhất là dung môi (lượng nước), nhiệt độ và

thời gian trích ly. Hiệu quả trích ly tăng khi sử dụng sóng siêu âm, tuy nhiên cũng

còn phụ thuộc vào dung môi sử dụng. 50% EtOH, 50% MeOH, 40% MeCN đạt

được tổng lượng iso flavone cao nhất. Dung môi thích hợp nhất cho từng loại iso

flavone thì còn phụ thuộc vào cấu tạo hóa học của nó. Nói chung thì cho tất cả các

loại thì hiệu quả trích ly cao nhất khi khi sử dụng dung môi với 40-60% lượng

nước.

Achouri so sánh 3 dung môi: 80%MeCN + HCl 0,1N; 80% MeOH; 80%

EtOH để trích ly các cơ chất khác nhau (đậu tách béo, protein đậu nành) và thấy

rằng 80% MeOH và 80% EtOH trích ly được lượng isoflavone cao nhất từ cả hai

mẫu nguyên liệu. Quan sát thấy rằng sử dụng siêu âm để trích ly 15 phút nhiều bằng

5 lần trích ly bằng phương pháp lắc (tổng thời gian là 10h) (Hình dưới). Đây là theo

dõi quan trọng, vì MeCN là một dung môi được sử dụng phổ biến trong kĩ thuật

trích ly truyền thống, điều này chứng tỏ không sử dụng dung môi này cho trích ly

bằng sóng siêu âm.

Trang 21


Hình 2.8: Ảnh hưởng của sóng siêu âm và việc rung lắc (sau 5 lần trích ly)

lên tổng hàm lượng isoflavone từ SM và SPI với 3 loại dung môi khác nhau.

Gần đây, Bajer so sánh dung môi nguyên chất MeOH, MeCN, và ACE để

trích ly De và Ge từ bột đậu nành. MeCN cho lượng cao nhất và được nghiên cứu

thêm khi bổ sung 0-50% nước và 60% MeCN cho kết quả tốt nhất.

Lin và Giusti mô tả sự ảnh hưởng của tính phân cực dung môi và axit về hiệu

quả trích ly của isoflavones từ đậu nành. Các tác giả tiến hành trích ly với sáu dung

môi khác nhau phương pháp là một sự kết hợp của ba cực và hai mức độ acid hóa

(83% ACN, 83% axit hóa ACN, 80% MeOH, 80% axit hóa MeOH, 58% ACN, và

58% axit hóa ACN). Dung môi axit hóa đã được chuẩn bị bởi 2ml trộn là 0,1 N HCl

với 12 ml dung môi. Các tác giả đã chỉ ra rằng các dung môi có tính phân cực cao

(Chỉ số phân cực, P '= 6,7-7,4) cung cấp hàm lượng isoflavones trích ly cao hơn từ

đậu nành. Tính axít hóa trong các dung môi chuyển isoflavone liên kết thành

aglycones tương ứng. Việc sử dụng các dung môi có tính axit nên tránh nếu mục

đích của nghiên cứu là định lượng và đánh giá hoạt tính sinh học và sinh khả dụng

của các hình thức khác nhau của isoflavone liên kết. Trong số sáu dung môi nghiên

cứu, các tác giả quan sát thấy rằng 58% acetonitrile không bị axit hóa cung cấp hàm

lượng isoflavones cao nhất mà không thay đổi cấu trúc liên kết của chúng

Trang 22


So sánh phương pháp trích ly truyền thống và trích ly có sử dụng sóng siêu

âm để trích ly isoflavone từ bã rễ cây sắn dây:

Ethanol là dung môi trích ly, nó thường được sử dụng để trích ly các hợp

chất thực phẩm vì nó an toàn cho sức khỏe. Và theo kết quả nghiên cứu dung môi

với 80% ethanol và 20% nước cho hiệu quả trích ly cao nhất.

Bảng 2.4. ảnh hưởng của thời gian trích ly với sự khác nhau về thành

phần dung môi đến sản lượng isoflavone trong phương pháp truyền thống và

phương pháp sử dụng sóng siêu âm

Việc sử dụng ethanol-nước là dung môi trích ly vì sự liên quan đến độ phân

cực, sự trưởng nở mô tế bào thực vật và tăng hấp thụ sóng siêu âm. Điều kiện tối ưu

trích ly là 3 h khi sử dụng sóng siêu âm 40kHz ở 800C. Áp dụng sóng siêu âm ở

800C, dung môi nước-ethanol làm tăng lượng chất trích ly được gấp 3 lần so với khi

không áp dụng ở 250C và 1,6 lần ở 800C. Lượng cực đại thu được là 7,28g

isoflavone từ 100g bột rễ thải khi sử dụng song siêu âm với dung môi ethanol-nước

(80:20) ở 800C trong thời gian 6h.

Sự thay đổi hóa học của isoflavones có thể xảy ra trong qui trình trích ly. Cần

có một dung môi đặc biệt để sự chuyển đổi là ít nhất.

Nồng độ β-glucosides và acetyl glucosides có thể được tăng lên hoặc bị giảm

bớt trong quy trình, aglycones có thể tăng lên vì đó là hệ quả của sự chuyển đổi hóa

học. Một lượng lớn những hợp chất hóa học đạt được này không có nghĩa là đạt

được hiệu quả trích ly cao mà đó chỉ là kết quả của sự chuyển đổi hóa học. Vì vậy

thật khó để xác định dung môi hiệu quả nhất cho sự trích ly β-glucosides, acetyl

glucosides và aglycones bằng cách so sánh lượng chất thu được thông thường.

Malonyl isoflavone là dạng hợp chất hóa học dễ bị giảm phẩm chất, vì thế nếu đạt

Trang 23


được một lượng lớn malonyl isoflavone trong nguyên liệu được trích ly chứng tỏ

hiệu quả trích ly của dung môi cao, cũng như là quá trình ngăn ngừa những chuyển

đổi hóa học tốt hoặc là cả hai điều này. Trong trường hợp không xác định được

lượng malonyl glucosides thì lựa chọn tốt nhất là xác định tính ổn định của nó trong

suốt quy trình xử lí.

Nói về dung môi thì thường được nói về mặt thuận lợi và không thuận lợi. Ví

dụ: MeCN thường thường có thể trích li được nhiều isoflavone hơn MeOH và

EtOH, tuy nhiên, giá thành cao, độc, tính thân thiện với môi trường thấp hơn MeOH

và EtOH.

4.1.3. Kỹ thuật trích ly

Nhiệt độ và thời gian:

Nhiệt độ trích ly có mối liên hệ với hiệu quả trích ly: Nhiệt độ tăng thì làm

tăng lượng isoflavone thu được. Tuy nhiên, nhiều hợp chất isoflavone không bền

nhiệt và có thể bị giảm chất lượng trong suốt quá trình trích ly đó, điều này ảnh

hưởng trực tiếp đến các hoạt tính sinh học của isoflavone.Ngoài ra, nhiệt độ cao còn

tăng trích li protein, pectin, là những thành phần tạo bọt. Theo thống kê ở một số

nghiên cứu thì thấy rằng khoảng nhiệt độ cho trích ly isoflavone thường từ (40-

800C). ví dụ: trích ly isoflavone từ mẫu nước uống đậu nành (hình 2.9 ), ở 450C cho

lượng cao nhất.

Hình 2.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả

trích ly isoflavone từ thức uống từ đậu nành

Tuy nhiên cần lưu ý để lựa chọn nhiệt độ phù hợp tránh làm oxi hóa chất cần

tách.

Thông thường, các phương pháp cho thấy đạt được nhanh và trích ly đủ số

lượng trong 20 phút. Để kiểm tra số lượng thu được, kết quả được lặp lại 5 lần để so

Trang 24

Bảng : Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến trích ly isoflavone từ nước uống đậu nành


sánh mà không có sai khác. Hầu hết (80-90%) isoflavone trong bột đậu được trích

ly trong 10 phút. (Griffith và Collison). Kéo dài thời gian trích ly 30 phút làm giảm

một lượng isoflavone.

Rostagno quan sát sự giảm hiệu quả trích ly khi lượng nước cao >60%, nó

được cho là do làm tăng các sản phẩm của rễ hòa tan vào nước dưới tác dụng của

sóng siêu âm. Với báo cáo này, có sự giảm nhẹ lượng isoflavone tổng số đạt được

khi trích ly 30 phút với 50% EtOH ở 600C so với khi trích ly trong 20 phút. Achouri

cũng có kết luận tương tự, ông quan sát và trong trường hợp này, tổng lượng

isoflavone giảm nếu trích ly từ 15-30 và 60 phút. Như vầy, nên trích ly với thời gian

ngắn khi sử dụng sóng siêu âm.

Số lần trích ly

Tùy thuộc vào mẫu nguyên liệu và phương pháp trích ly, số lần trích ly sẽ ảnh

hưởng đến lượng isoflavone thu được. Chẳng hạn, theo nghiên cứu của Allaoua

Achouri, Joyce Irene Boye *, Denis Belanger về ảnh hưởng của số lần trích ly

isoflavone trong đậu nành:

Tổng lượng isoflavones sau một lần trích ly (E1) bằng dung môi được đưa ra

ở hình 2.

Lặp lại trích ly 5 lần tăng được lượng isoflavone mỗi loại 56%, 61%, 56%,

53%, 42%, 54%, 100%, 60% và 83% ở mẫu SM cho daidzin, glycitin, genistin,

daidzein, glycitein, genistein, malonyldaidzin, malonyl-glycitin and malonyl-

genistin, (Bảng dưới). Đối với mẫu SPI cũng vậy.

Lần trích ly thứ hai hầu hết sản lượng isoflavones nhiều như lần thứ nhất, và

sau lần trích ly thư năm tổng lượng tăng lên xấp xỉ 123%, 119%, 120%, 128%,

89%, 101%, 101%, 153% và 142% cho từng loại tương ứng daidzin, glycitin,

genistin, daidzein, glycitein, genistein, malonyl-daidzin, malonylglycitin và

malonyl-genistin.

Với các dung môi được sử dụng, lượng isoflavones tổng số sau năm lần trích

ly (so sánh với chỉ sau một lần) thì tăng 74%, 69% và 65% đối với mẫu SM; 147%,

103% và 107% đối với mẫu SPI, sử dụng dung môi acetonitrile, methanol và

Trang 25


ethanol.

Hình 2. 10:Tổng lượng isoflavone trong mẫu bột đậu nành (SM) và protein đậu

nành (SPI) sau một lần trích ly (E1) và năm lần trích ly (E5)

Những kết quả này khẳng định rằng một lần trích ly isoflavones được đề cập như

phương pháp nêu trên thì nồng độ isoflavones trích ly được thấp hơn định lượng .

Sự khác nhau về sản lượng isoflavones trích ly được ở mẫu SM và SPI thì rất thú vị.

Với mẫu giàu protein (SPI), sau 1 lần trích ly chỉ đạt 41% isoflavone so với 58% ở

mẫu có hàm lượng protein thấp (SM), sử dụng dung môi ACN–HCl. Điều này có

thể do tương tác của protein–polyphenol trong mẫu SPI. Trong bài báo (Boye,

1999) nói rằng có rất nhiều sự tương tác bao gồm liên kết hydrogen, ionic và liên

kết cộng hóa trị và chủ yếu là tương tác kị nước với hợp chất protein–polyphenol.

Nhứng sự tương tác này bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi nhiệt độ, pH, nồng độ

muối...

Bảng 2.5 : Ảnh hưởng của số lần trích ly đến lượng các isoflavone từ mẫu bột

Trang 26


đậu và protein đậu nành sử dụng 3 dung môi

Công suất siêu âm:

Dựa vào kết quả nghiên cứu của XU Huaneng, ZHANG Yingxin và HE

Chaohong, ta thấy, công suất điện đầu vào càng cao thì hàm lượng trích ly

isoflavone đạt được càng cao (hình minh họa).

Trang 27


Hình 2.11 Ảnh hưởng của công suất điện đến hiệu quả trích ly isoflavone

Khuấy trộn:

Trích ly lỏng – rắn là cần thiết cho sự phân đoạn các cấu tử từ nguyên liệu tự

nhiên. Nhưng hiệu suất trích ly lỏng – rắn rất thấp bởi vì tốc độ truyền khối thấp. Sự

khuấy đảo thường được dung để làm tăng tốc độ truyền khối nhưng tác động của sự

khuấy đảo lên quá trình truyền khối rất giới hạn. Nguyên nhân chính là tốc độ trích

ly được kiểm soát không chỉ bởi tốc độ truyền khối trong màng lỏng quanh mẫu trái

cây mà còn bởi tốc độ khuếch tán bên trong. Kết quả là, sự khuấy không ảnh hưởng

đến tốc độ trích ly khi trở lực truyền khối trong màng lỏng giảm đến một phạm vi

nào đó tốc độ trích ly chỉ bị kiểm soát bởi sự khuếch tán bên trong.

Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi : tỷ lệ nguyên liệu : dung môi càng nhỏ thì hiệu

quả quá trình trích càng cao. Tuy nhiên, cần thiết phải nghiên cứu nhiều tỉ lệ nguyên

liệu : dung môi (SSR) thấp hơn để xác định SSR mà tại đó nó không tăng nữa ở các

mức độ trích ly. Điều này đảm bảo việc sử dụng dung môi tiết kiệm nhất và hiệu

quả nhất.

Ngoài ra tùy theo chất cụ thể mà còn nhiều yếu tố khác: PH, sử dụng chất

kháng oxy hóa hỗ trợ, nhiệt độ nguyên liệu…

5. KẾT LUẬN

Tóm lại có nhiều phương pháp trích ly các loại isoflavone, đối với phương

pháp truyền thống có một số nhược điểm sau:

Trang 28


+ Sử dụng một lượng dung môi lớn, thường độc, và chi phí cao.

+ Thời gian chiết kéo dài, độ chọn lọc không cao.

+ Trích ly với nhiệt độ cao và thời gian kéo dài ảnh hưởng chất lượng sản phẩm.

Các phương pháp hiện đại có nhiều ưu điểm hơn hẳn phương pháp truyền thống.

+ Giảm lượng dung môi sử dụng, giảm phế thải.

+ Dung môi xanh, độ chọn lọc cao, dễ thu hồi.

+ Giảm thời gian chiết.

+ An toàn, hiệu quả, dễ tự động.

+ Có thể kết hợp các phương pháp phân tích trực tuyến.

Qua những tìm hiểu, ta thấy UAE là phương pháp đầy triển vọng với hiệu suất

trích ly cao được minh chứng rõ ràng qua bảng tham khảo về việc so sánh các kỹ

thuật trích ly isoflavone từ các sản phẩm đậu nành (đặc biệt hiệu quả cao đới với

dạng bột) dưới đây.

Bảng 2.6: So sánh hiệu quả trích ly isoflavone của các phương pháp

Kĩ thuật trích li isoflavone từ đậu nành và thực phẩm chế biến từ đậu sử dụng

sóng siêu âm cho hiệu quả tốt, có thể trích ly được lượng cao, thời gian chưa đầy 30

phút từ nhiều loại mẫu khác nhau với những dung môi thông thường. Rõ ràng, nhiệt

độ cao thời gian trích ly sẽ ngắn và tỉ lệ nước ở mức trung bình cho đến mức cao

trong dung môi cần thiết cho hiệu quả trích ly.

Trang 29


So với một số kỹ thuật như PLE và SFE, những phương pháp này cho những

sản phẩm trích ly tương đối sạch không cần phải lọc sau đó, trong khi sử dụng UAE

bước lọc là yêu cầu.

Chất lượng của isoflavone thu được sau quá trình trích ly:

Sự ổn định isoflavone trong suốt quá trình trích ly sử dụng UAE dường như

chưa được nghiên cứu nhiều tại thời điểm này. Một lượng lớn dung môi, bản chất

dung môi, thời gian trích ly dài, nhiệt độ cao đều có thể ảnh hưởng làm biến đổi các

dạng isoflavone. Ví dụ: Sự thay đổi hóa học của isoflavones có thể xảy ra trong qui

trình trích ly. Cần có 1 dung môi đặc biệt để sự chuyển đổi là ít nhất.

Nồng độ β-glucosides và acetyl glucosides có thể được tăng lên hoặc bị giảm

bớt trong quy trình, aglycones có thể tăng lên vì đó là hệ quả của sự chuyển đổi hóa

học. Một lượng lớn những hợp chất hóa học đạt được này không có nghĩa là đạt

được hiệu quả trích ly cao mà đó chỉ là kết quả của sự chuyển đổi hóa học. Vì vậy

thật khó để xác định dung môi hiệu quả nhất cho sự trích ly β-glucosides, acetyl

glucosides và aglycones bằng cách so sánh lượng chất thu được thông thường.

Malonyl isoflavone là dạng hợp chất hóa học dễ bị giảm phẩm chất, vì thế nếu đạt

được một lượng lớn Malonyl isoflavone trong nguyên liệu được trích ly chứng tỏ

hiệu quả trích ly của dung môi cao, cũng như là quá trình ngăn ngừa những chuyển

đổi hóa học tốt hoặc là cả hai điều này.

Ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ, cường độ sóng và tần số lên sự ổn định

isoflavone trong UAE và cách để tránh những biến đổi về chất lượng cần được

nghiên cứu chi tiết hơn trong tương lai.

Trang 30


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 31

dung song sieu am trich ly isoflavone

Documents