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cromatografia

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  • Cromatografa lquida 2

    Tema 12

    CROMATOGRAFIA LIQUIDA

    En este captulo se tratarn diversas formas de cromatografa en las que la fase mvil es un lquido. Potencialmente, la cromatografa lquida (CL) es ms importante que la cromatografa de gases (CG), ya que, cerca del 80 % de los compuestos qumicos no son suficientemente voltiles para separarlos y determinarlos por CG, y en ellos se incluyen una gran variedad de especies de inters industrial, biolgico y ambiental.

    La cromatografa lquida considerada como clsica se lleva a cabo en columnas abiertas y en ella la fase mvil fluye por gravedad (figura 12.1.a.) o mediante la aplicacin de vaco, con un dispositivo como el representado en la figura 12.1.b.

    eluyente

    capa protectora(arena, papel de filtro)

    relleno

    disco de vidrio sinterizado

    vaco

    a) b)

    .

    Figura 12.1. Cromatografa lquida convencional

    ARCFE146555

    ARCFE146555LECTURA

    ARCFE146555

  • Claudio Gonzlez Prez 3

    Tanto en las columnas alimentadas por gravedad, como en las que el proceso se facilita mediante vaco (tambin por bombeo del lquido) el mecanismo de la separacin puede ser de adsorcin, reparto, intercambio inico, en funcin del tamao molecular o dependiendo de la afinidad entre los diferentes solutos y la fase estacionaria, originndose distintos tipos de cromatografa que se considerarn en este captulo.

    La eficacia de las columnas aumenta a medida que disminuye el tamao de las partculas del relleno, si bien, en este caso, la fase mvil fluye con mayor dificultad. Para solucionar las dificultades derivadas del empleo de fases estacionarias de tamaos muy pequeos (entre 3 y 10 Pm), se requiere una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio usadas en cromatografa clsica. Estos procedimientos operativos, relativamente modernos, se denominan como Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR o HPLC), cuyas caractersticas ms importantes se incluirn tambin en este captulo.

    En la parte final del captulo se har una breve descripcin de la cromatografa de lquidos sobre soporte plano (papel y capa fina), pues con estas tcnicas se consigue la resolucin de muchos problemas de forma sencilla y barata. Asimismo, se har referencia a la cromatografa de fluidos supercrticos.

    CROMATOGRAFIA LIQUIDA CONVENCIONAL

    La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo generalmente en columnas de vidrio como las representadas en la figura 12.1. y cuyas dimensiones dependen de la cantidad de material a separar. Como regla de uso comn, la longitud de la columna debe ser, por lo menos, equivalente a diez veces su dimetro, de forma que una columna tpica puede ser de 20 cm de largo y entre 1 y 2 cm de dimetro. Para obtener la mxima eficacia, el relleno de la columna deber estar constituido por partculas de tamaos similares y uniformemente empaquetada, evitando que se formen canales. De este forma, se minimiza la distorsin de las bandas cromatogrficas. Para conseguirlo, la fase estacionaria suele adicionarse a la columna en forma de suspensin con una porcin de la fase mvil, dejando que se asiente lentamente, proceso que se facilita en ocasiones mediante una suave agitacin.

  • Cromatografa lquida 4

    La adicin de la muestra por la parte superior de la columna se har en forma de disolucin concentrada, muy cuidadosamente para no remover la fase estacionaria. Con esta finalidad, suele colocarse en la parte superior de sta una fina capa de arena, lana de vidrio o papel de filtro*.

    CROMATOGRAFIA DE ADSORCION (CLS)

    Las especies qumicas (tomos, molculas, iones) que estn en la capa superficial de un slido no tienen todas sus cargas elctricas compensadas y como consecuencia de ello, presentan fuerzas residuales, o sitios activos, que pueden actuar sobre los componentes del fluido que baa su superficie, originando fenmenos de adsorcin. Las fuerzas responsables de la adsorcin dependen de la naturaleza de la superficie y de la estructura de las especies adsorbidas, ocurriendo la separacin como se indica en el tema 10 ("Mecanismo de las separaciones cromatogrficas").

    Adsorbentes. Aunque se ha utilizado una gran cantidad de slidos como fases estacionarias en CLS, las ms empleadas son la gel de slice y la almina. La gel de slice, (SiO2.xH2O), tambin llamado cido silcico, es un material que se obtiene por precipitacin en medio cido de soluciones de silicato sdico. El rea superficial, el tamao de poro y el pH de la superficie dependen de las condiciones de precipitacin. As, a pH 3.7. la superficie especfica es 830 m2/g, mientras que a pH 5.7, el valor obtenido es 348 m2/g. Los centros activos son los grupos silanol (SiOH) superficiales, espaciados unos de otros aproximadamente 5 , los cuales pueden desactivarse lentamente por adsorcin de agua superficial. Este tipo de agua adsorbida puede eliminarse fcilmente por calefaccin a unos 200 C, con lo que se reactiva el gel, pero si la calefaccin se realiza a temperatura del orden de 400 C, tiene lugar una deshidratacin irreversible con prdida de rea superficial, debido a la eliminacin de una molcula de agua de dos grupos silanol contiguos, producindose un enlace siloxano, que es cromatogrficamente inactivo

    SiOH H2O Si

    O Si SiOH

    La almina (Al2O3.x H2O) presenta distintos tipos de interaccin con los solutos, ya que, por una parte, tiene sitios activos cidos en las zonas prximas al Al3+, y centros bsicos en las zonas prximas al O2. La proporcin relativa de centros cidos

    * En ocasiones se utiliza un adaptador de flujo ajustable que se comprime estrechamente contra la parte superior de la fase estacionaria, de modo que no quede espacio para que la muestra y el disolvente se mezclen sobre la columna.

  • Claudio Gonzlez Prez 5

    aumenta con la temperatura de activacin, mientras que la superficie puede desactivarse por adicin de agua.

    Disolventes. En CLS el disolvente compite con los solutos por los centros activos de la fase estacionaria, por lo que la elucin puede describirse como un desplazamiento del soluto por el disolvente. As, cuanto ms intensa sea la interaccin disolvente-fase estacionaria, ms tiempo pasar el soluto en la fase mvil y, en consecuencia, ms rpidamente ser eluido. De hecho, la capacidad relativa de los distintos disolventes para eluir un soluto dado de una columna, es casi independiente de la naturaleza del soluto. Por ello, en la prctica, la variable a controlar en cromatografa de adsorcin, es el disolvente.

    Una serie eluotrpica es una lista de disolventes ordenados conforme a su capacidad relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado. As, en columnas de gel de slice, el poder eluyente disminuye en el orden siguiente:

    agua > metanol > etanol > acetona > acetato de etilo > cloroformo > benceno > tolueno > tetracloruro de carbono > ciclohexano > hexano

    Utilizando series como la citada, es posible seleccionar un disolvente o una mezcla con el poder eluyente adecuado para llevar a cabo una determinada separacin*.

    CROMATOGRAFIA DE REPARTO (CLL)

    En la cromatografa de reparto, la fase estacionaria lquida est retenida por un soporte slido, que deber reunir una serie de caractersticas ya mencionadas en relacin con la cromatografa gas-lquido. Los soportes slidos ms utilizados en CLL son: gel de slice, tierra de diatomeas (Kieselguhr, Celita, etc.) y celulosa, aunque, tambin se han usado otros en menor extensin, como almidn o microbolas de vidrio.

    La mayor dificultad en relacin con el soporte slido, es la presencia de fenmenos de adsorcin, pues, aunque est totalmente cubierto por la fase estacionaria, casi siempre muestra algo de actividad superficial.

    Para la separacin de una gran cantidad de compuestos orgnicos, se utiliza agua como fase estacionaria. Esto hace que como eluyentes se usen lquidos cuya solubilidad en agua sea mnima, tales como cloroformo, tetracloruro de carbono, hidrocarburos, etc. Sin embargo, como no existe sustancia alguna cuya insolubilidad

    * La presencia de impurezas (por ejemplo, metanol en benceno) puede alterar de forma sustancial el poder eluyente de una determinada sustancia. Por ello, es necesario utilizar disolventes lo suficientemente puros.

  • Cromatografa lquida 6

    sea total, siempre, al cabo de cierto tiempo, la fase estacionaria va siendo arrastrada por la fase mvil fuera de la columna. Este problema puede evitarse, o al menos paliarse, mediante una pre-saturacin del eluyente con la fase estacionaria.

    CROMATOGRAFIA DE CAMBIO IONICO (CCI)

    La cromatografa de intercambio inico se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el disolvente y los sitios cargados en la fase estacionaria (ver la figura 10.5.c.). Esta consta de una matriz (R) con grupos funcionales cargados (A) y contraiones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con especies de la misma carga contenidas en la fase mvil (X)

    RA M+ + X+ RAX+ + M+ (intercambio catinico) RA+M + Y RA+Y + M (intercambio aninico)

    La competicin entre los iones de la muestra y el contra-in por un determinado sitio es muy similar a la que existe entre el soluto y el disolvente para los sitios de adsorcin en CLS. De hecho, en ocasiones, se hace referencia a la CCI como cromatografa de adsorcin implicando interaccin electrosttica, si bien, la naturaleza de las fases mvil y estacionaria, as como el tipo de muestras a separar, hace que sea preferible considerarla independientemente de aquella.

    Fases estacionarias. Existe una gran variedad de materiales, orgnicos e inorgnicos, naturales y sintticos, que presentan propiedades adecuadas para el intercambio inico, si bien, normalmente se prefieren sustancias sintticas conocid

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