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Cromatografa lquida 2

Tema 12

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

En este captulo se tratarn diversas formas de cromatografa en las que la fase mvil es un lquido. Potencialmente, la cromatografa lquida (CL) es ms importante que la cromatografa de gases (CG), ya que, cerca del 80 % de los compuestos qumicos no son suficientemente voltiles para separarlos y determinarlos por CG, y en ellos se incluyen una gran variedad de especies de inters industrial, biolgico y ambiental.

La cromatografa lquida considerada como clsica se lleva a cabo en columnas abiertas y en ella la fase mvil fluye por gravedad (figura 12.1.a.) o mediante la aplicacin de vaco, con un dispositivo como el representado en la figura 12.1.b.

eluyente

capa protectora(arena, papel de filtro)

relleno

disco de vidrio sinterizado

vaco

a) b)

.

Figura 12.1. Cromatografa lquida convencional

ARCFE146555

ARCFE146555LECTURA

ARCFE146555

Claudio Gonzlez Prez 3

Tanto en las columnas alimentadas por gravedad, como en las que el proceso se facilita mediante vaco (tambin por bombeo del lquido) el mecanismo de la separacin puede ser de adsorcin, reparto, intercambio inico, en funcin del tamao molecular o dependiendo de la afinidad entre los diferentes solutos y la fase estacionaria, originndose distintos tipos de cromatografa que se considerarn en este captulo.

La eficacia de las columnas aumenta a medida que disminuye el tamao de las partculas del relleno, si bien, en este caso, la fase mvil fluye con mayor dificultad. Para solucionar las dificultades derivadas del empleo de fases estacionarias de tamaos muy pequeos (entre 3 y 10 Pm), se requiere una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio usadas en cromatografa clsica. Estos procedimientos operativos, relativamente modernos, se denominan como Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR o HPLC), cuyas caractersticas ms importantes se incluirn tambin en este captulo.

En la parte final del captulo se har una breve descripcin de la cromatografa de lquidos sobre soporte plano (papel y capa fina), pues con estas tcnicas se consigue la resolucin de muchos problemas de forma sencilla y barata. Asimismo, se har referencia a la cromatografa de fluidos supercrticos.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA CONVENCIONAL

La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo generalmente en columnas de vidrio como las representadas en la figura 12.1. y cuyas dimensiones dependen de la cantidad de material a separar. Como regla de uso comn, la longitud de la columna debe ser, por lo menos, equivalente a diez veces su dimetro, de forma que una columna tpica puede ser de 20 cm de largo y entre 1 y 2 cm de dimetro. Para obtener la mxima eficacia, el relleno de la columna deber estar constituido por partculas de tamaos similares y uniformemente empaquetada, evitando que se formen canales. De este forma, se minimiza la distorsin de las bandas cromatogrficas. Para conseguirlo, la fase estacionaria suele adicionarse a la columna en forma de suspensin con una porcin de la fase mvil, dejando que se asiente lentamente, proceso que se facilita en ocasiones mediante una suave agitacin.


La adicin de la muestra por la parte superior de la columna se har en forma de disolucin concentrada, muy cuidadosamente para no remover la fase estacionaria. Con esta finalidad, suele colocarse en la parte superior de sta una fina capa de arena, lana de vidrio o papel de filtro*.

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION (CLS)

Las especies qumicas (tomos, molculas, iones) que estn en la capa superficial de un slido no tienen todas sus cargas elctricas compensadas y como consecuencia de ello, presentan fuerzas residuales, o sitios activos, que pueden actuar sobre los componentes del fluido que baa su superficie, originando fenmenos de adsorcin. Las fuerzas responsables de la adsorcin dependen de la naturaleza de la superficie y de la estructura de las especies adsorbidas, ocurriendo la separacin como se indica en el tema 10 ("Mecanismo de las separaciones cromatogrficas").

Adsorbentes. Aunque se ha utilizado una gran cantidad de slidos como fases estacionarias en CLS, las ms empleadas son la gel de slice y la almina. La gel de slice, (SiO2.xH2O), tambin llamado cido silcico, es un material que se obtiene por precipitacin en medio cido de soluciones de silicato sdico. El rea superficial, el tamao de poro y el pH de la superficie dependen de las condiciones de precipitacin. As, a pH 3.7. la superficie especfica es 830 m2/g, mientras que a pH 5.7, el valor obtenido es 348 m2/g. Los centros activos son los grupos silanol (SiOH) superficiales, espaciados unos de otros aproximadamente 5 , los cuales pueden desactivarse lentamente por adsorcin de agua superficial. Este tipo de agua adsorbida puede eliminarse fcilmente por calefaccin a unos 200 C, con lo que se reactiva el gel, pero si la calefaccin se realiza a temperatura del orden de 400 C, tiene lugar una deshidratacin irreversible con prdida de rea superficial, debido a la eliminacin de una molcula de agua de dos grupos silanol contiguos, producindose un enlace siloxano, que es cromatogrficamente inactivo

SiOH H2O Si

O Si SiOH

La almina (Al2O3.x H2O) presenta distintos tipos de interaccin con los solutos, ya que, por una parte, tiene sitios activos cidos en las zonas prximas al Al3+, y centros bsicos en las zonas prximas al O2. La proporcin relativa de centros cidos

* En ocasiones se utiliza un adaptador de flujo ajustable que se comprime estrechamente contra la parte superior de la fase estacionaria, de modo que no quede espacio para que la muestra y el disolvente se mezclen sobre la columna.


aumenta con la temperatura de activacin, mientras que la superficie puede desactivarse por adicin de agua.

Disolventes. En CLS el disolvente compite con los solutos por los centros activos de la fase estacionaria, por lo que la elucin puede describirse como un desplazamiento del soluto por el disolvente. As, cuanto ms intensa sea la interaccin disolvente-fase estacionaria, ms tiempo pasar el soluto en la fase mvil y, en consecuencia, ms rpidamente ser eluido. De hecho, la capacidad relativa de los distintos disolventes para eluir un soluto dado de una columna, es casi independiente de la naturaleza del soluto. Por ello, en la prctica, la variable a controlar en cromatografa de adsorcin, es el disolvente.

Una serie eluotrpica es una lista de disolventes ordenados conforme a su capacidad relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado. As, en columnas de gel de slice, el poder eluyente disminuye en el orden siguiente:

agua > metanol > etanol > acetona > acetato de etilo > cloroformo > benceno > tolueno > tetracloruro de carbono > ciclohexano > hexano

Utilizando series como la citada, es posible seleccionar un disolvente o una mezcla con el poder eluyente adecuado para llevar a cabo una determinada separacin*.

CROMATOGRAFIA DE REPARTO (CLL)

En la cromatografa de reparto, la fase estacionaria lquida est retenida por un soporte slido, que deber reunir una serie de caractersticas ya mencionadas en relacin con la cromatografa gas-lquido. Los soportes slidos ms utilizados en CLL son: gel de slice, tierra de diatomeas (Kieselguhr, Celita, etc.) y celulosa, aunque, tambin se han usado otros en menor extensin, como almidn o microbolas de vidrio.

La mayor dificultad en relacin con el soporte slido, es la presencia de fenmenos de adsorcin, pues, aunque est totalmente cubierto por la fase estacionaria, casi siempre muestra algo de actividad superficial.

Para la separacin de una gran cantidad de compuestos orgnicos, se utiliza agua como fase estacionaria. Esto hace que como eluyentes se usen lquidos cuya solubilidad en agua sea mnima, tales como cloroformo, tetracloruro de carbono, hidrocarburos, etc. Sin embargo, como no existe sustancia alguna cuya insolubilidad

* La presencia de impurezas (por ejemplo, metanol en benceno) puede alterar de forma sustancial el poder eluyente de una determinada sustancia. Por ello, es necesario utilizar disolventes lo suficientemente puros.


sea total, siempre, al cabo de cierto tiempo, la fase estacionaria va siendo arrastrada por la fase mvil fuera de la columna. Este problema puede evitarse, o al menos paliarse, mediante una pre-saturacin del eluyente con la fase estacionaria.

CROMATOGRAFIA DE CAMBIO IONICO (CCI)

La cromatografa de intercambio inico se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el disolvente y los sitios cargados en la fase estacionaria (ver la figura 10.5.c.). Esta consta de una matriz (R) con grupos funcionales cargados (A) y contraiones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con especies de la misma carga contenidas en la fase mvil (X)

RA M+ + X+ RAX+ + M+ (intercambio catinico) RA+M + Y RA+Y + M (intercambio aninico)

La competicin entre los iones de la muestra y el contra-in por un determinado sitio es muy similar a la que existe entre el soluto y el disolvente para los sitios de adsorcin en CLS. De hecho, en ocasiones, se hace referencia a la CCI como cromatografa de adsorcin implicando interaccin electrosttica, si bien, la naturaleza de las fases mvil y estacionaria, as como el tipo de muestras a separar, hace que sea preferible considerarla independientemente de aquella.

Fases estacionarias. Existe una gran variedad de materiales, orgnicos e inorgnicos, naturales y sintticos, que presentan propiedades adecuadas para el intercambio inico, si bien, normalmente se prefieren sustancias sintticas conocidas como resinas de intercambio inico. Las resinas se preparan introduciendo grupos ionizables en una matriz constituida por un polmero orgnico, de los cuales el ms comn es el poliestireno, obtenido por co-polimerizacin del estireno y del divinil-benceno.

CH=CH2 CH=CH2

CH=CH2Estireno Divinilbenceno

La polimerizacin da como resultado una estructura tridimensional de carcter poroso y si se lleva a cabo en suspensin acuosa se obtienen pequeas esferas con dimetros que van de 0.1 a 0.5 mm. El grado de entrecruzamiento vara con la


proporcin de divinilbenceno, que oscila entre 1 y 16 %*. Por otra parte, los anillos bencnicos pueden modificarse para producir una resina de intercambio catinico, con grupos SO3H o COOH, o una resina aninica, con grupos CH2N+R3 o CH2NR2

CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2

SO3H+

CH CH2 CH CH2 CH CH2

SO3H+

SO3H+SO3H+

Resina de intercambio catinico (cido fuerte)

CH

CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2

CH CH2 CH CH2 CH CH2

Resina de intercambio aninico (base fuerte)CH2N(CH3)3Cl

+ CH2N(CH3)3Cl+

CH2N(CH3)3Cl+CH2N(CH3)3Cl

+

CH

Las resinas de cido sulfnico son intercambiadores de cido fuerte, encontrndose disociados y pudiendo intercambiar protones prcticamente a cualquier valor de pH, mientras que las que contienen grupos COOH el margen de intercambio suele estar limitado entre 5 y 14.

En cuanto a las resinas aninicas, las que contienen compuestos de amonio cuaternario son bases fuertes, mientras que las constituidas por aminas se comportan como bases dbiles. Tanto unas como otras suelen emplearse en forma de cloruros, en lugar de hidrxidos, debido a la mayor estabilidad de aquellos.

Desde el punto de vista prctico, es importante considerar el grado de accesibilidad de los iones contenidos en la fase mvil a los centros de intercambio. En este sentido, las resinas con bajo nivel de entrecruzamiento hacen posible que el equilibrio de intercambio se establezca rpidamente, mientras que si el nivel de * El grado de formacin de enlaces cruzados se indica con la notacin "XN" despus del nombre de la resina. As, una resina Dowex 1X4 contiene 4 % de divinilbenceno.


entrecruzamiento es alto, ello significa tamaos pequeos para los poros, con lo que la resina se hace ms selectiva para los iones pequeos. En este caso, la resina presenta mayor capacidad de intercambio y selectividad, pero tiempos de equilibrio ms elevados.

Selectividad de las resinas. Considrese una resina catinica con el in intercambiable H+ en contacto con una disolucin conteniendo el in monovalente M+. Se establece el siguiente equilibrio de intercambio:

R H+ + M+ R M+ + H+

donde R representa la matriz de la resina. La constante de equilibrio, llamada coeficiente de distribucin o coeficiente de selectividad viene expresada por,

Kd =M+ R H

+

M+ H+ R

donde [M+]R y [H+]R representan las concentraciones de M+ y de H+ en la resina*. La constante Kd representa la afinidad de la resina por los iones M+, respecto a los iones H+ (en este caso), de forma que cuanto mayor sea el valor de Kd, mayor ser la tendencia a retener los iones M+.

Mecanismo de las separaciones. Cuando una pequea cantidad de disolucin conteniendo iones M+ se pone en contacto con una resina como la mencionada anteriormente y se lava con agua, todos los iones M+ reemplazarn a los iones H+ y quedarn fijados en la parte superior de la columna formando una banda adsorbida sobre la fase estacionaria. Si Kd es grande, la banda ser estrecha y concentrada, mientras que si es pequea, la banda ser amplia y difusa.

Para desplazar la banda de iones M+ adsorbidos a lo largo de la columna, es evidente que no puede utilizarse agua, pero s puede hacerse con un cido o con una disolucin que contenga otro catin. La velocidad a la que se desplazar la banda de iones M+ depende del pH del eluyente y del valor de Kd, de forma que dos iones con diferentes afinidades para la resina (diferentes valores de Kd) se desplazarn a diferente velocidad y podr tener lugar la separacin correspondiente.

* Cuando las disoluciones se apartan del comportamiento ideal las concentraciones debern reemplazarse por las correspondientes actividades.


En solucin acuosa diluida, la afinidad de los cationes para la resina aumenta con la carga, y, a igualdad de carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del in hidratado, de forma que puede escribirse la siguiente secuencia:

Na+(ac) < Ca2+(ac) < Al3+(ac) < Th4+(ac) Li+(ac) < Na+(ac) < K+(ac)

Mg2+(ac) < Ca2+(ac) < Sr2+(ac) < Ba2+(ac)

En el caso de las resinas aninicas, en soluciones acuosas diluidas la afinidad de los aniones depende de su grado de polarizacin. En general, los aniones polivalentes tienen mayor afinidad que los monovalentes y entre aniones de la misma carga, los de mayor tamao presentan mayor afinidad,

Cl < CN < Br < NO3 < I


Las molculas de soluto que tienen dimetros significativamente menores que los poros pueden penetrar en ellos y, de esta manera, ser retenidos durante un cierto tiempo, mientras que las molculas que son ms grandes que el tamao medio de los poros del relleno son excluidas, y, de esta forma, no se retienen, siendo eluidas en primer lugar (figura 12.2.). Entre estos dos extremos existirn molculas de tamao intermedio, cuya penetracin media en los poros depende de su tamao y cuyo avance a lo largo de la columna ser algo retardado.

fase estacionaria porosamolculas grandes (K=0)molculas pequeas

.

.

Figura 12.2. Separacin por cromatografa de exclusin molecular.

En el captulo 10 se dedujo la ecuacin

VR = VM + K VS

donde VR es el volumen de retencin, VM el volumen muerto, VS el volumen de fase estacionaria y K la constante de distribucin. En cromatografa de exclusin molecular, VM se denomina generalmente volumen intersticial, Vo, y representa el volumen de fase mvil que est en el exterior de la matriz porosa, mientras que VS es el volumen de fluido contenido en los poros de la matriz, y suele representarse por Vi. Reagrupando la ecuacin anterior, se obtiene*,

* La constante K se sustituye frecuentemente por una constante alternativa Kpr, definida por

Kpr =VR VoVt Vo

Si el material de que est constituida la matriz no ocupara volumen, Vi = Vt Vo, (Vt=volumen total de la columna). Sin embargo, como sto no es as, Vt Vo ser mayor que Vi, aunque Vi es proporcional a Vt Vo, puesto que el lquido dentro de las partculas ocupa una fraccin constante del volumen de ellas.


K =VR VM

VS=

VR VoVi

La constante K caracteriza el comportamiento de un soluto en lo referente a su retencin. Si K=0, el soluto en cuestin es totalmente excluido (VR=Vo), mientras que para las molculas pequeas que penetran libremente en el gel, K=1 (VR=Vo+Vi). Las molculas de tamao intermedio que pueden penetrar en algn grado en el gel, pero no libremente, presentan valores de K que oscilan entre 0 y 1.

Las sustancias susceptibles de ser separadas por un determinado tipo de matriz se obtienen a partir de una curva de calibrado como la indicada en la figura 12.3., donde se ha representado el peso molecular (Mr) frente a VR.

Figura 12.3. Curva de calibrado y cromatograma de exclusin molecular.

Las molculas cuyos tamaos sean mayores que el lmite de exclusin no son retenidas por la columna y se eluyen todas juntas, igual que aquellas cuyos tamaos sean inferiores al lmite de permeabilidad.

El fraccionamiento tiene lugar en la zona de permeabilidad selectiva, situada entre ambos lmites, originndose picos que corresponden a solutos individuales. La seleccin de un gel para llevar a cabo la separacin de una determinada mezcla de sustancias se har de forma que sus pesos moleculares incidan en la zona recta del calibrado*. Comercialmente se dispone de un gran nmero de geles con diferentes * Debido a que el peso molecular no est directamente relacionado con el tamao y la forma de las molculas, es necesario indicar, junto con los mrgenes de fraccionamiento, el tipo de molculas que se ha utilizado para las determinaciones.


mrgenes de fraccionamiento. En la figura 12.4. se muestran las curvas de calibrado de algunos.

Los efectos de la adsorcin sobre la superficie de las partculas de gel normalmente suelen ignorarse, de forma que esta cromatografa puede considerarse como un tipo de cromatografa de reparto, donde las fases mvil y estacionaria tienen la misma composicin, ya que sta puede considerarse que es el lquido contenido en el interior de los poros, y aquella el resto de lquido contenido en la columna.

10 3

10 4

10 5

10 6

10 7

Mr

V R

I

II

IIIIV

Figura 12.4. Curvas de calibrado para determinados geles.

Tipos de geles. El gel deber ser una sustancia qumicamente inerte, mecnicamente estable, con un tamao de partcula uniforme y con estructura de poros perfectamente reproducible. Posiblemente, los dos tipos de materiales ms utilizados sean los geles de dextranos con enlaces cruzados y los de poli-acrilamida.

En los geles de dextrano, el material de partida, dextrano, es un polisacrido lineal, en el que las molculas de glucosa estn unidas mediante enlacesD1,6. La unin entre unas y otras cadenas se produce mediante puentes de glicerilo entre grupos hidroxilo, originndose la siguiente estructura:

OCH 2

HO

HO HO

O

CH 2

HO

HO HO

O

HO

HO HO

O CH 2

O

O

O

HO

HO

O

CH 2

HO

HHO

O

O

O

O

OH

H 2 CO

O

OH

El producto resultante, comercializado con el nombre de Sephadex G, es insoluble en agua, pero hidroflico, debido a los grupos OH residuales, lo cual hace


que al ponerlo en solucin es acuosas el gel se hinche, reteniendo entre 1 y 20 mL de agua por gramo de resina seca. En disolventes no polares nicamente tiene lugar un ligero hinchamiento, por lo que estas sustancias se utilizan casi exclusivamente en medio acuoso.

Los geles de poliacrilamida, comercializados con el nombre de Bio-Gel P, se preparan por copolimerizacin de la acrilamida con N,N'-metilenbisacrilamida y su estructura puede representarse as:

.

CH 2 =CHCONH 2 (CH 2 =CHCNH) 2 CH 2

O=

Acrilamida NN'-metilenbisacrilamida

CONH 2

CONHCH 2

CONH 2CH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CH

CH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 C H

CONH

CONH

CONH

CH 2CONH

CONH 2

CONH 2

CONH

CH 2

CONH

CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCH 2 CHCONH 2

CONHCONH

Los geles de poliacrilamida se comportan de forma similar a los geles de dextrano, si bien son menos resistentes a los lcalis y los grupos amida pueden hidrolizarse a cidos carboxlicos cuando se ponen en contacto con disolventes de pH extremos.

Los materiales descritos no son los nicos que se utilizan en cromatografa de exclusin molecular. Los hay de naturaleza inorgnica, como la gel de slice y el vidrio poroso y otros de naturaleza orgnica como los co-polmeros de estirenodivinilbenceno que se describieron en relacin con la C C I. Estos polmeros (sin los grupos sulfnicos) se hinchan en disolventes como el tolueno o el cloruro de metileno, y forman fases tiles para la cromatografa de macromolculas que son solubles en disolventes orgnicos.

Aplicaciones. La aplicacin ms simple de la CEM es la separacin de dos grupos de sustancias con pesos moleculares muy diferentes. Es posible le eliminacin de especies de bajo peso molecular de disoluciones que contengan molculas grandes, mediante el paso a travs de una columna de filtracin en gel. La tcnica, conocida como desalinizacin, es til, por ejemplo, para la separacin de hemoglobina y cloruro sdico. Asimismo, es posible el fraccionamiento de mezclas ms o menos complejas de


diferentes materiales, como pptidos, cidos nucleicos, enzimas, polisacridos, etc. Por otra parte, la tcnica puede usarse con fines analticos o a escala preparativa.

Otra aplicacin de la CEM es la determinacin de pesos moleculares comparando los volmenes de elucin de patrones. Sin embargo, debe considerarse que molculas con el mismo peso molecular pero distinta forma exhiben diferentes caractersticas de elucin.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD (CA)

La cromatografa de afinidad es, desde el punto de vista experimental, una tcnica que generalmente se usa con fines preparativos ms que analticos. Se ha convertido en una herramienta importante en la investigacin biomdica y consiste bsicamente en lo siguiente: una especie (un ligando bio-especfico) que interaccione con un solo soluto de una mezcla compleja se une covalentemente a la matriz de la fase estacionaria de una columna (figura 12.5.a.). Cuando la mezcla se hace pasar a travs de la columna, nicamente el mencionado soluto queda retenido, siendo eliminados por lavado todos los dems (figura 12.5.b.), despus de lo cual, el nico soluto retenido se eluye mediante el cambio de las condiciones experimentales al debilitar lo suficiente el enlace gel-ligando (figura 12.5.c).

elucin

c)

matrizestacionaria

ligando bioespecfico

mezcla

a) b)lavado

.

Figura 12.5. Representacin esquemtica de la cromatografa de afinidad.

La matriz deber estar constituida por partculas de tamao uniforme, porosas, inertes y estables. Con esta finalidad, en muchas ocasiones, se utilizan geles de dextrano, geles de poliacrilamida, celulosa, vidrio poroso y, muy frecuentemente, las Sepharosas, que es el nombre comercial de la agarosa con enlaces cruzados*. La unin entre el ligando y la matriz normalmente se hace a travs de los grupos OH de sta, y debe poder realizarse en condiciones suaves, por lo que se hace necesario activar la matriz. * La agarosa es un polisacrido de galactosa y anhidrogalactosa. Es un componente del agar que se obtiene de un tipo de algas marinas.


La activacin de la matriz puede llevarse a cabo por reaccin con bromuro de ciangeno, con lo que se forma un imido-carbonato,

+ CNBr C=NH + HBrOH

OH

O

O

imidocarbonato

En una etapa posterior, el ligando reacciona con la matriz activada para originar el material con que se llenar la columna cromatogrfica.

OH

O

O

OCNHproteinaNH=

C=NH + H2Nproteina

Con frecuencia, el ligando est situado demasiado cerca de la matriz, lo cual dificulta o impide su asociacin con la especie a retener, especialmente si se trata de macromolculas (figura 12.6.a). Este problema se resuelva por va qumica con los denominados "brazos de extensin", que son simplemente cadenas de hidrocarburos situados entre la matriz y el ligando (figura 12.6.b.)

a) b)

.

.

Figura 12.6. "Brazo de extensin" en cromatografa de afinidad.

Casi todas las aplicaciones de la cromatografa de afinidad inciden en el campo de la Bioqumica, donde se utilizan las interacciones especficas en las que estn implicados enzimas y sustratos o coenzimas, anticuerpos y antgenos, receptores y hormonas, etc. Hay que mencionar que esta forma de cromatografa es la nica en la que se disea la fase estacionaria para que interacte con un soluto particular.


CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (CLAR o HPLC)

Los avances obtenidos en el desarrollo de la instrumentacin cientfica consiguieron que al final de la dcada de 1960 fuese posible el anlisis de mezclas complejas por cromatografa de gases en cuestin de minutos o incluso segundos, pudindose detectar, en las condiciones ms favorables, cantidades de sustancias del orden de los nano-gramos, y algunas veces de los pico-gramos. Sin embargo, para muestras no voltiles, la cromatografa lquida clsica, a pesar de haber demostrado un gran poder de separacin, no alcanzaba la eficiencia y la sensibilidad de la CG, ya que, en muchas ocasiones, era necesario invertir horas para la elucin, recoger fracciones de forma manual conteniendo miligramos o gramos de material eluido y utilizar litros de disolvente. Era, pues, necesario lograr que la CL proporcionase unas prestaciones similares a las logradas con la CG. Para ello, tena que acelerarse, automatizarse y adaptarse a muestras mucho ms pequeas. Como consecuencia de los esfuerzos efectuados en estas direcciones, surgi la moderna Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR o HPLC*)

PRINCIPIOS BASICOS

El primer aspecto considerado en orden a optimizar la CL fue incrementar la velocidad de la fase mvil, lo cual puede hacerse sin demasiados problemas mediante la utilizacin de bombas adecuadas y conexiones de tubos que impidan fugas, al estar sometido el lquido a presiones elevadas. Sin embargo, con fases estacionarias convencionales, el empleo de altas velocidades de fase mvil implica una prdida de resolucin. Para mejorar sta, se hace necesario modificar el empaquetamiento de la fase estacionaria, lo cual se considerar seguidamente en conexin con la ecuacin de van Deemter,

H = A + Bu + C u

que, aunque desarrollada para cromatografa en fase gaseosa, es razonable considerar que el ensanchamiento de las bandas en CL se debe al mismo tipo de factores.

La resolucin en cromatografa lquida se mejora al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria, lo cual, en primer lugar, reduce el trmino A de la

* Ya se indic en el captulo 10 que las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominacin inglesa High Performance Liquid Chromatography, si bien, en algunos artculos las mencionadas siglas significa "alta presin", High Pressure.


ecuacin de van Deemter, ya que las trayectorias seguidas por la fase mvil son ms uniformes en el caso de partculas de menor tamao.

En relacin con la difusin longitudinal, B/u, este trmino es importante en cromatografa de gases, pero como la difusin es mucho ms lenta en los lquidos, el ensanchamiento de las bandas por este motivo en CL solo es significativo cuando la velocidad de flujo es excesivamente lenta.

El trmino de resistencia a la transferencia de masa, Cu, es fundamental, ya que, con velocidades de flujo elevadas, se conseguirn bajas resoluciones, al menos que la transferencia de solutos entre las fases mvil y estacionaria sea muy rpida. A esto colabora decisivamente la reduccin del tamao de las partculas de la fase estacionaria. Los materiales que normalmente se utilizan en cromatografa lquida convencional estn constituidos por partculas de tamao relativamente grande (150 Pm ms) y con poros profundos, como se representa en la figura 12.7.a. Estos poros se llenan con porciones estancadas de fase mvil y es posible que las molculas de soluto penetren en ellos a una profundidad tal que su regreso por difusin al lquido mvil sea lento. Esto es favorable en CL convencional, que trabaja con lentas velocidades de flujo, pero cuando se opera con velocidades de flujo elevadas, se origina un ensanchamiento de bandas excesivamente grande.

poroprofundo

150 Pm

porosuperficial

50 Pm

porosuperficial

5 Pm

al detector

al detector

al detector

1-2 Pm

Dimetro de partcula 150 Pm 40-70 Pm 5-10 PmLongitud de la columna 50-200 cm 50-100 cm 10-50 cmDimetro de la columna 20-30 mm 1-3 mm 2-6 mmPresin 1 atm. 30-50 atms. 100-200 atms.

a b c

Figura 12.7. Columnas y fases estacionarias en CL. a) CL convencional. b) HPLC con partculas peliculares. c) HPLC con partculas microporosas.


Los primeros intentos satisfactorios para mejorar las prestaciones en el sentido indicado, condujeron a la utilizacin de fases estacionarias de partculas peliculares, constituidas por partculas esfricas de un material slido no poroso (frecuentemente bolitas de vidrio de unos 40 Pm de dimetro) recubiertas de una capa superficial porosa y de espesor muy pequeo (entre 1 y 3 Pm ). Esta capa puede ser gel de slice, almina o geles de poliamida (figura 12.7.b.). De esta forma, la presencia de poros superficiales facilita considerablemente el proceso de transferencia de masa. Sin embargo, debido al pequeo espesor de la pelcula porosa, el volumen de la fase estacionaria, VS, es pequeo, por lo que este tipo de columnas no resultan adecuadas para cromatografa preparativa.

En poca relativamente reciente se ha incrementado el uso de una nueva generacin de materiales de partculas micro-porosas con tamaos inferiores a 30 Pm y que son totalmente porosos (figura 12.7.c.). Estas fases estacionarias no pueden conseguirse mediante simple pulverizacin, ya que de esta forma se obtienen partculas muy irregulares, sino que requieren la utilizacin de una tecnologa diferente. En cualquier caso, tanto con partculas peliculares como con partculas micro-porosas, el precio a pagar es la elevada resistencia al flujo. Por ello, es necesario utilizar presiones elevadas para forzar el paso de lquido a travs de la columna. Normalmente, se requieren presiones que pueden llegar a ser de hasta 200 atmsferas para velocidades de flujo de 0.5 a 5 mL/min.

La utilizacin de columnas de pequeo dimetro presenta ciertas ventajas, sobre todo en anlisis de trazas, si bien, aunque la reduccin del dimetro de la columna a niveles capilares tambin aumenta la resolucin, tales columnas no son de uso comn en HPLC.

INSTRUMENTACION

Los componentes bsicos de un sistema para HPLC se han representado esquemticamente en la figura 12.8. y son:

* Depsitos para la fase mvil. * Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase mvil. * Dispositivo para la introduccin de la muestra. * Columna cromatogrfica. * Detector. * Sistema para el tratamiento de datos y registrador.


Como algunas fases mviles usadas en HPLC pueden ser qumicamente activas, como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estn fabricados con materiales resistentes a esos posibles ataques. La mayora de las partes del cromatgrafo en contacto con la fase mvil suelen estar fabricadas con acero inoxidable, previamente pasivado con cido ntrico 6 M, de forma que en esas condiciones, su superficie es resistente al ataque de la mayora de los disolventes, con excepcin del cido clorhdrico. Las mayores ventajas del acero residen en su coste relativamente bajo, la facilidad para construir con l los distintos componentes y la resistencia mecnica, lo que permite operar a presiones muy elevadas.

He

Disolvente

Bomba

Introduccin de la muestra

Columna

Detector

Registro

.

.

Figura 12.8. Componentes bsicos de un sistema para HPLC.

En cromatografa de gases se haca necesario un control bastante estricto de la temperatura de trabajo. Sin embargo, en cromatografa lquida, este control no suele ser tan necesario, debido a que la transmisin de calor del soluto entre las fases mvil y estacionaria es mucho ms pequea. Por ello, los cambios en la temperatura ejercen menos influencia sobre el grado de retencin y la resolucin. Esto hace que en muchas aplicaciones no sea necesario un control estricto de esta variable y las columnas trabajen a temperatura ambiente. De cualquier forma, es posible el control de la temperatura mediante el empleo de hornos que la regulan desde la del ambiente hasta 150 C, o bien mediante el encamisado de la columna.


CARACTERISTICAS DE LAS FASES MOVILES Y SISTEMAS DE ELUCION

Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil (y las tuberas que la conduzcan) tienen que ser inertes, esto es, el disolvente no deber extraer especie alguna del material con que estn construidos. Generalmente se usan botellas de vidrio y tubos de tefln, provistos stos ltimos de un sistema de filtros para eliminar cualquier partcula que pueda contener la fase mvil.

Los disolventes ms utilizados en HPLC suelen ser agua, disoluciones tampn acuosas y disolventes orgnicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas. En cualquier caso, todos los disolventes debern ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y desgasificados. Esto puede llevarse a cabo por filtracin a vaco a travs de filtros de 0.220.45Pm, o mediante el burbujeo con un gas inerte muy poco soluble, como nitrgeno o helio. La des-gasificacin reduce la posibilidad de formacin de burbujas en la vlvulas de las bombas y en los detectores. Asimismo, es importante porque se reduce el ruido de fondo cuando se utiliza un detector ultravioleta, y porque se evita la interferencia del oxgeno disuelto en la deteccin fluorimtrica. Adems, es fundamental cuando se utiliza elucin por gradiente en fase inversa, especialmente con gradientes de presin baja, ya que de esta forma se evita la formacin de burbujas de aire cuando se mezclan el agua y el disolvente orgnico.

Aunque la separacin de muchas mezclas se lleva a cabo utilizando un disolvente de composicin constante (elucin isocrtica), en ocasiones se usa la elucin por gradiente, en la cual se cambia la composicin de la fase mvil durante el desarrollo del cromatograma. Con ello se consigue aumentar la eficiencia de la separacin, con unos efectos similares a los producidos por la programacin de temperatura en cromatografa de gases. El esquema representado en la figura 12.8. corresponde a un sistema de este tipo con dos disolventes.

SISTEMAS DE BOMBEO

Como consecuencia de las elevadas presiones de trabajo, debido al pequeo tamao de las partculas de la fase estacionaria, es necesario utilizar bombas que proporcionen un flujo aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo usados en HPLC debern reunir las siguientes caractersticas:

* Estar construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados.


* Suministrar un flujo de eluyente libre de pulsaciones, en el margen comprendido entre 0.1 y 10 mL/min con una precisin del 0.5 %.

* Generar presiones superiores a 6000 psi (lb/in2)*.

La mayor parte de los sistemas de HPLC utilizan las denominadas bombas recprocas, cuyo principio de funcionamiento se ilustra en la figura 12.9.

Estas bombas consisten en un pistn de zafiro situado en el interior de una cmara de volumen reducido (35400 PL) que, alternativamente succiona eluyente contenido en un depsito a baja presin y lo impulsa hacia la columna a presin alta, mediante un sistema de vlvulas como el representado esquemticamente en la figura 12.9. Con este dispositivo se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante, pudindose adaptar fcilmente a la tcnica de elucin con gradiente, debido a su pequeo volumen interno. Sin embargo, producen un flujo pulsante que se ha de amortiguar convenientemente, para lo cual se utiliza en ocasiones un sistema constituido por dos pistones.

Vlvula de salida

Vlvula de entrada

Eluyente

Pistn

Figura 12.9. Principio de funcionamiento de una bomba recproca.

Las bombas de desplazamiento se utilizan mucho menos que las anteriores y bsicamente consisten en una cmara relativamente grande equipada con un mecanismo de tornillo (figura 12.10.). Suministran un flujo libre de pulsaciones, pero presentan el inconveniente de su capacidad limitada (#250 mL).

* Las presiones que se generan en HPLC, a pesar de ser muy elevadas, no constituyen peligro de explosin, debido a la incompresibilidad de los lquidos. Unicamente, si el disolvente es inflamable, existir riesgo de incendio como consecuencia de la rotura de algn componente.


Vlvulade entrada

Vlvulade salida

ColumnaEluyente

Cmara conteniendoeluyente

Figura 12.10. Bomba de desplazamiento.

Las bombas neumticas hacen uso de la presin de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase mvil. Estas bombas son muy sencillas y no provocan pulsaciones, si bien, estn limitadas a presiones relativamente bajas.

INTRODUCCION DE LA MUESTRA

La introduccin de las muestras en la columna cromatogrfica es frecuentemente el factor controlante de la reproducibilidad de las medidas. Los volmenes a inyectar debern ser pequeos, para evitar la sobrecarga de la columna y se ha de introducir la muestra sin despresurizar el sistema.

La forma ms simple de inyectar la muestra es utilizar un diafragma ("septum") anlogo al utilizado en cromatografa de gases (ver la figura 11.3.a.), si bien este sistema est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi.

El mtodo ms utilizado en HPLC consiste en usar vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, como el representado en la figura 10.17 (Captulo 10) y, ms esquemticamente, en la figura 12.11.

Bomba

Columna

Bucle

Jeringa

Entrada demuestra

Bomba

Columna

a) b)

.

Figura 12.11. Vlvula de inyeccin. a) Llenado. b) Inyeccin.


En la posicin de llenado (figura 12.11.a.), la fase mvil pasa directamente a la columna, y la muestra se introduce en el bucle mediante una micro-jeringa. Una vez lleno el bucle, se gira la vlvula a la posicin de inyeccin (figura 12.11.b.) en la que la fase mvil impulsa la muestra hasta la columna. Un inconveniente que presenta este sistema es que la precisin de la inyeccin vara con el tamao del bucle.

COLUMNAS, FASES ESTACIONARIAS Y FASES MOVILES

Las caractersticas fsicas de las columnas usadas en HPLC (longitud, dimetro) se han indicado anteriormente (ver figura 12.7.), as como los tamaos de las partculas que constituyen la fase estacionaria (partculas peliculares, partculas micro-porosas). En cuanto a la resolucin, lo normal es operar con columnas que tienen entre 40000 y 60000 platos tericos por metro.

Cromatografa de adsorcin

Las nicas sustancias usadas como fase estacionaria en este tipo de cromatografa son la gel de slice y la almina, siendo aquella la preferida en casi todas las aplicaciones.

Como ya se indic en relacin con la CLS convencional, la gel de slice presenta gran actividad superficial, debido a la presencia de grupos silanol, los cuales pueden interaccionar con grupos funcionales polares presentes en las molculas de soluto, tales como alcoholes, aminas, cetonas y cidos carboxlicos.

La desactivacin de la gel de slice tiene lugar por hidratacin, pudindose distinguir entre agua dbilmente unida, y que puede eliminarse fcilmente por calefaccin o por extraccin, agua enlazada ms fuertemente y agua presente como OH en grupos silanol contguos, y que nicamente puede eliminarse por calefaccin fuerte. En los dos primeros casos, la deshidratacin es reversible, mientras que en el ltimo, es irreversible.

El tamao de los poros superficiales influye sobre el proceso de deshidratacin. As, puede considerarse que la superficie interna de los poros est recubierta de grupos hidroxilo. Si se trata de poros anchos, la prdida de agua tiene lugar a 110 C, originndose grupos siloxano, poco importantes cromatogrficamente, y que pueden re-hidratarse con facilidad (figura 12.12.a.). Si, por el contrario, se trata de poros estrechos, la deshidratacin puede transcurrir como se representa en la figura


12.12.b., en cuyo caso, el proceso es irreversible y conduce a una prdida efectiva de rea superficial debida al entrecruzamiento producido.

'H2O

a) Poros anchos

'

b) Poros estrechos

Si OHSi OH Si

SiO

SiOHHO

Si Si O Si

Figura 12.12. Tamao de poro y deshidratacin.

La composicin de la fase mvil es prcticamente la nica variable que puede utilizarse para optimizar las separaciones de mezclas de solutos. Como se indic en relacin con la cromatografa de adsorcin convencional, una serie eluotrpica es un listado de disolventes ordenados segn su capacidad relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado. Una forma de cuantificar la fuerza de los disolvente es utilizar el parmetro denominado fuerza eluyente, Ho, que se define como la energa de adsorcin del disolvente por unidad de rea. Sin embargo, con frecuencia, un disolvente solo no resulta adecuado para una determinada separacin, recurrindose en estos casos a mezclas binarias o ternarias, con objeto de encontrar la ms adecuada en cuanto a su fuerza eluyente. Para ello, puede utilizarse el tanteo, si bien, es ms conveniente usar ciertos mtodos que se han desarrollado con esa finalidad.

Por otra parte, para la resolucin de determinadas mezclas, en ocasiones, es necesario llevar a cabo una elucin por gradiente, en lugar de hacerlo isocrticamente.

Cromatografa de reparto

En cromatografa de reparto, las fases mvil y estacionaria deben seleccionarse de forma que la solubilidad recproca sea mnima. Sin embargo, por muy distintos que sean dos lquidos, siempre sern algo miscibles y, por ello, la fase mvil deber presaturarse con la fase estacionaria antes de ponerse ambas en contacto dentro de la columna. Esta pre-saturacin puede efectuarse simplemente por agitacin de ambas


hasta que se equilibren, si bien, suele ser preferible utilizar una pre-columna situada antes del sistema de introduccin de las muestras. La pre-columna deber contener un relleno de gran rea superficial, tal como gel de slice, recubierto con una cantidad relativamente grande (30-40%) de la sustancia usada como fase estacionaria. Sin embargo, cuando la fuerza del disolvente es lo bastante elevada para disolver cantidades apreciables de fase estacionaria, la pre-saturacin se hace difcil. Por otra parte, evidentemente, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide utilizar la tcnica de la elucin con gradiente.

Cromatografa de fase enlazada (CFE)

Las limitaciones mencionadas que presenta la cromatografa de reparto encontrar pares de lquidos inmiscibles, pre-saturacin de la fase mvil e imposibilidad de la elucin por gradiente pueden superarse con la cromatografa de fases enlazadas. En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte slido, el cual casi siempre est constituido por micropartculas de gel de slice, cuyos dimetros oscilan entre 3 y 10 Pm. Los grupos OH pueden ser silanizados por reaccin con organocloro u organoalcoxisilanos para formar enlaces siloxano estables

Si OH + ClSiRCH3

CH3

CH3

CH3SiOSiR+ HCl

As, por ejemplo, con octadecilclorosilano, el proceso es,

Si OHCH3

CH3

+ C18H37Si(CH3)2Cl SiOSiC18H37

Los grupos silanol residuales que no hayan reaccionado es necesario desactivarlos, lo cual suele hacerse con clorotrimetilsilano.

Considerando las polaridades relativas de las fases mvil y estacionaria, se distinguen, como ya se mencion, dos tipos de cromatografa. En la cromatografa en fase normal, la fase estacionaria es polar, utilizndose como tales, rellenos en los que R en la estructura del siloxano puede ser un grupo ciano (C2H4CN), diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (C3H6NH2) y dimetilamino [C3H6N(CH3)2]. La elucin se lleva a cabo con disolventes no polares, como etilter, cloroformo o n-hexano. Operando en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que es el ms soluble en la fase mvil, y un aumento de la polaridad de sta, hace disminuir el tiempo de elucin.


En la cromatografa en fase inversa, que es la utilizada en la mayora de las aplicaciones, la fase estacionaria es no polar, tratndose frecuentemente de hidrocarburos tales como C8 (n-octilo) C18 (n-octadecilo). Los tiempos de retencin aumentan al hacerlo la longitud de la cadena de la fase enlazada. Para una determinada fase, en esta modalidad de fase inversa, los componentes ms polares aparecen primero y un aumento de polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de elucin. Los grupos de hidrocarburos de cadena larga se alinean unos junto a otros, perpendicularmente a la superficie de la partcula, originando una estructura semejante a la de un cepillo. La elucin se lleva a cabo con una fase mvil de polaridad elevada, como disoluciones acuosas conteniendo metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano.

La principal limitacin de estas fases enlazadas con base silcea reside en que el pH del eluyente debe estar comprendido entre 2 y 8, para evitar la hidrlisis de la fase estacionaria. El mecanismo de retencin por las fases enlazadas no est suficientemente claro. Para algunos, el proceso es anlogo al que tiene lugar en la cromatografa convencional lquido-lquido, si bien, parece que simultneamente puede participar tambin un mecanismo de adsorcin.

En cromatografa lquida, la seleccin de la columna y de la fase mvil para la separacin de una mezcla determinada es un problema ms complicado que en cromatografa de gases, ya que en aquella, los componentes de la muestra interaccionan con ambas fases, mvil y estacionaria, mientras que en CG la fase mvil nicamente se comporta como portador de los componentes a travs de la columna.

Para elegir una columna puede utilizarse la norma siguiente: la polaridad de la fase estacionaria debe ser bastante similar a la de los analitos, y para la elucin se utiliza entonces una fase mvil con una polaridad considerablemente distinta. Esta norma tiene el inconveniente de que si la diferencia de polaridades es muy grande, los tiempos de retencin pueden ser excesivamente largos. Tambin podra utilizarse una fase estacionaria cuya polaridad fuese muy diferente a las de la fase mvil y los componentes de la muestra, si bien, en este caso, los tiempos de retencin podran ser demasiado cortos. En la prctica, se suele elegir la fase estacionaria de una manera general, y seguidamente seleccionar la fase mvil empricamente, despus de realizar una serie de ensayos.

Adems de los tipos de cromatografa mencionados, se han desarrollado fases estacionarias para separaciones por HPLC mediante los mecanismos de intercambio inico, exclusin molecular, as como fases quirales para la resolucin de enantimeros. Esta cromatografa quiral implica un proceso de derivatizacin pre-columna en el cual los componentes D- y L- de una mezcla racmica reaccionan con un


compuesto puro pticamente activo para originar una mezcla de diastereoismeros, la cual puede resolverse por HPLC, en fase normal o inversa.

En las pginas anteriores se ha hecho referencia a todo un conjunto de tipos distintos de HPLC y de fases estacionarias. El problema que se presenta en la prctica es: cual de ellos se elegir para una determinada mezcla?. En este sentido, puede decirse que en la mayora de los casos se utiliza un mtodo conocido, por haber sido previamente publicado. Si esto no es as, o no se dispone de la columna requerida, puede utilizarse en plan orientativo el cuadro representado en la tabla 12.1., si bien, hay que tener en cuenta que suele haber varias formas posibles para separar los componentes de una mezcla dada.

Tabla 12.1. Guia simplificada para la eleccin del tipo de HPLC.

Solubilidad Compuesto Cromatografa Fase

estacionaria

agua inico C C I

Peso molecular no inico C F E normal ciano, amino

< 2000 CH3OH C F E normal ciano, amino, diol

CHCl3 C. Adsorcin slice

hexano C F E inversa C8, C18, fenil,

ciano

Solubilidad Compuesto Tamao Cromatografa

inico

C C I

Peso molecular agua no inico < 30 nm C F E inversa

>2000 30-400 nm C E M

disolventes < 30 nm C F E inversa

orgnicos 30-400 nm C E M


DETECTORES

En HPLC no existen detectores de uso tan general como lo son el de conductividad trmica o el de ionizacin de llama para cromatografa de gases. Por ello, se utilizan distintos tipos de sistemas de deteccin que pueden clasificarse de la forma siguiente:

Conductividad

Indice de refraccinPropiedad de la disolucin

ElectroqumicosFluorescenciaAbsorbancia ultravioleta

Propiedad del soluto

Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a una propiedad fsica o fsico-qumica del soluto, y que generalmente no la presenta la fase mvil. Estos detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Por su parte, los detectores basados en una propiedad de la disolucin comparan el cambio global de alguna propiedad fsica de la fase mvil con y sin soluto eluido. Estos detectores responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.

Un detector ideal en HPLC deber reunir las siguientes caractersticas*: * Sensibilidad elevada. * Buena estabilidad y reproducibilidad. * Amplio margen de respuesta lineal. * Pequeo tiempo de respuesta, independiente de la velocidad de flujo.

* Pequeo volumen muerto, para minimizar el ensanchamiento de las bandas cromatogrficas. * Insensible a cambios en la presin y la temperatura. * Respuesta independiente de la composicin de la fase mvil. * No destructivo.

* Muchas de las caractersticas coinciden con las indicadas para los detectores relacionados con la cromatografa de gases.


Los detectores que seguidamente se resean no cumplen todas las caractersticas anteriores, pero, sin embargo, resultan adecuados para la mayora de las aplicaciones rutinarias en HPLC. Se presentan en orden decreciente en cuanto a la frecuencia de su uso.

Detectores de absorbancia ultravioleta

Los detectores de absorbancia ultravioleta (tambin visible) son los ms utilizados en HPLC. Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin, cuyos principios se indican en el captulo 3. Para adaptar un espectrofotmetro convencional a medidas en HPLC, la modificacin ms importante es disear adecuadamente la clula de flujo. Esta deber contener un volumen mnimo (entre 1 y 10 L) y ser capaz de soportar presiones de varias atmsferas. En la figura 12.13. se muestra esquemticamente una de estas clulas, diseada en forma de Z.

De lacolumna

hQ Detector

Desecho Figura 12.13. Clula de flujo para HPLC.

El detector ultravioleta ms sencillo utiliza la emisin intensa a 254 nm de una lmpara de mercurio y la deteccin a una sola longitud de onda. Se estima que casi las dos terceras partes de los solutos orgnicos analizados por HPLC presentan absorcin a esa longitud de onda, especialmente los compuestos aromticos, los cuales tienen absortividades molares del orden de 104.

En instrumentos ms verstiles se utiliza una lmpara de deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de onda variable. Cuando los picos estn suficientemente separados, se puede elegir una longitud de onda para cada pico, si bien, cuando se desean obtener los espectros completos con fines de identificacin, puede pararse el flujo durante el tiempo necesario para efectuar el barrido de longitudes de onda, o bien, utilizar algn sistema de barrido rpido, como el que se menciona seguidamente.

Los detectores espectrofotomtricos ms potentes son los que utilizan un montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa


por el detector. En estos dispositivos, toda la radiacin procedente de la fuente (lmpara de deuterio) se hace pasar a travs de la muestra, en lugar de seleccionar previamente una radiacin determinada con un monocromador como en espectrofotometra convencional (figura 12.14.).

La radiacin emergente de la clula de flujo se dispersa por una red de difraccin hologrfica en radiaciones monocromticas que se focalizan simultneamente sobre un conjunto de fotodiodos constituido por varios centenares de elementos fotosensibles y dispuestos linealmente. Cuando la radiacin transmitida incide sobre los fotodiodos, se genera una seal elctrica que se procesa para dar datos de absorbancia, que representados en funcin de la longitud de onda detectada por cada uno de los fotodiodos origina el correspondiente espectro de absorcin. Este proceso puede repetirse muchas veces por segundo, por lo que pueden generarse una gran cantidad de datos experimentales durante el tiempo que la muestra pasa por la clula.

UV

Visible

Fotodiodos

Red halogrfica

Clula de flujo

Lmpara de deuterio

Figura 12.14. Dispositivo de fotodiodos.

Los datos de absorbancia se representan en funcin de la longitud de onda y del tiempo, con lo que se obtienen grficos como el representado en la figura 12.15., donde se muestra el mapa espectral correspondiente a la separacin de los compuestos 1, 2 y 3 por HPLC.

A

O , nm

12

3

tiempo

Figura 12.15. Espectros de una separacin por HPLC con dispositivo de fotodiodos.


Detectores de fluorescencia

Un cierto nmero de compuestos qumicos tienen propiedades fluorescentes, esto es, pueden absorber radiacin electromagntica de una determinada longitud de onda y emitir radiacin fluorescente a longitud de onda ms larga. Como se coment en el captulo 4, son compuestos tpicamente fluorescentes aquellos sistemas cclicos con un alto grado de conjugacin. Tal es el caso de hidrocarburos aromticos polinucleares, quinolenas, esteroides, alcaloides, etc.

Para detectar las especies fluorescentes en HPLC se utilizan dispositivos semejantes en diseo a los fluormetros y espectrofluormetros que se describieron en el tema 4. En ellos, el detector se coloca perpendicularmente a la direccin del haz de radiacin de excitacin (figura 12.16.), la cual suele originarse por una lmpara de xenn o deuterio y seleccionar la longitud de onda adecuada mediante los correspondientes filtros.

Fuente deradiacin Filtros deexcitacin

Clula de flujo

Filtros de emisin

Detector (fotomultiplicador)

.

Figura 12.16. Diagrama esquemtico de un detector de fluorescencia.

Los detectores de fluorescencia se caracterizan por ser especialmente sensibles, si bien, responden solo a la limitada gama de analitos que tienen propiedades fluorescentes. Con objeto de incrementar su aplicabilidad, es posible comunicar fluorescencia a determinados analitos mediante el uso de reactivos apropiados. Esta derivatizacin puede realizarse en la muestra antes de la columna, si bien, lo normal es llevar a cabo una derivatizacin poscolumna. Este proceso puede llevarse a cabo en un dispositivo como el representado esquemticamente en la figura 12.17., donde el reactivo derivatizante se aade continuamente al flujo que sale de la columna. Con frecuencia, la reaccin qumica entre el reactivo y el analito necesita un cierto tiempo para que ocurra, por lo cual suele colocarse un bucle entre el punto de insercin del reactivo y el detector.


Columna

Bomba

Reactivo

Bucle

Bao de agua

Detector

.

.

Figura 12.17. Derivatizacin poscolumna.

Detectores electroqumicos

La deteccin electroqumica ofrece ciertas ventajas respecto a otros mtodos de deteccin, en orden a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos orgnicos. En este sentido, cualquier especie capaz de ser oxidada o reducida sobre un electrodo es susceptible de deteccin por via electroqumica en una variedad de matrices, como medioambientales, farmacuticas y qumicas. As, por ejemplo, fenoles, aminas, perxidos y mercaptanos pueden detectarse por oxidacin, mientras que hidrocarburos no saturados, cetonas, aldehidos y nitrocompuestos aromticos pueden ponerse de manifiesto mediante procesos de reduccin. Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad son la amperometra, voltamperometra y culombimetra*.

La configuracin bsica de un detector electroqumico se representa en la figura 12.18., y consta de un dispositivo en el que se incluyen un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y uno auxiliar.

En el detector amperomtrico se aplica un determinado potencial al electrodo de trabajo y se mide la intensidad de la corriente resultante de la reaccin electroqumica que ocurra en dicho electrodo. La superficie de este electrodo suele ser muy pequea (menor de 0.5 cm2), por lo que la electrlisis del analito es incompleta. Cuando se usan electrodos de gran rea superficial, puede tener lugar una reaccin cuantitativa sobre el electrodo, y entonces se tiene la deteccin * En algunos textos se incluye tambien la conductimetra dentro de este apartado, si bien, los detectores de conductividad suelen tratarse de forma independiente.


culombimtrica. Por su parte, la deteccin voltamperomtrica (incluida la polarogrfica) implica la aplicacin de un potencial variable al electrodo de trabajo seguida de la medida de la intensidad de la corriente resultante de la reaccin electrdica.

Electrodode referencia

Electrodode trabajo

Electrodoauxiliar

Figura 12.18. Configuracin bsica de un detector electroqumico.

De las tres tcnicas mencionadas, la ms utilizada en la prctica es la amperometra. La polarografa se utiliza poco, debido a las dificultades para construir clulas de pequeo volumen para el electrodo de gotas de mercurio, as como las limitaciones de dicho electrodo para operar en la zona andica (ver "Caractersticas del electrodo de gotas de mercurio" en el tema 9).

Los electrodos ms utilizados para la deteccin amperomtrica son los siguientes: como electrodo de referencia se usan casi exclusivamente el de Ag-AgCl y el de calomelanos, mientras que los electrodos auxiliares suelen ser de platino o de carbn vtreo. En algunas clulas, el capilar de acero inoxidable usado para conectar la columna cromatogrfica a la clula puede servir como electrodo auxiliar. En cuanto a los electrodos de trabajo, se han utilizado una amplia variedad de materiales. Para procesos de reduccin se usa fundamentalmente mercurio, mientras que para oxidaciones el material ms empleado es el carbn, en sus distintas variedades de pasta de carbn, carbn vtreo, grafito piroltico o fibra de carbn. El oro y el platino tambin pueden usarse en procesos andicos.


En general, los detectores electroqumicos son relativamente simples y muy sensibles para determinados analitos, pudindose medir fcilmente corrientes del orden de los nano-amperios. La intensidad de la corriente es proporcional a la concentracin en varios rdenes de magnitud, si bien, se requieren disolventes acuosos u otros disolventes polares que contengan electrolitos disueltos, y, adems, en ocasiones, deben estar rigurosamente exentos de oxgeno.

Detectores de ndice de refraccin

El detector de ndice de refraccin es, posiblemente, el que ms se aproxima al detector universal ideal, ya que, en principio, el ndice de refraccin (IR) de la fase mvil deber modificarse por la presencia de cualquier soluto que tenga un ndice de refraccin diferente de ella. Por ello, la comparacin del IR de la fase mvil pura con el de los efluentes que salen de la columna cromatogrfica, indicar la presencia de cualquier soluto eluido.

El principal inconveniente de este tipo de detectores es que son muy sensibles a los cambios de temperatura, la cual debe ser controlada con fluctuaciones de 0.0001 C. Por otra parte, no resultan adecuados para trabajar con la modalidad de elucin por gradiente.

Detectores de conductividad

Los detectores de conductividad son los ms utilizados cuando los solutos eluidos son inicos, como, por ejemplo, cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por cromatografa de cambio inico.

La medida de la conductividad de los lquidos se lleva a cabo normalmente aplicando un potencial elctrico entre dos electrodos, lo cual origina un movimiento de los aniones y cationes presentes en el seno de la disolucin. La resistencia (o la conductividad) de la disolucin contenida entre los dos electrodos depende de la naturaleza y concentracin de las especies inicas presentes. Generalmente se opera con corriente alterna, con un dispositivo experimental como el que se muestra esquemticamente en la figura 12.19., donde la clula de conductividad se coloca en una de las ramas de un puente de Wheatstone.


C.A.

R1

R2

Rs

Clula de conductividad

.

Figura 12.19. Detector de conductividad.

Los detectores de conductividad son simples, baratos, robustos y de prolongada duracin. Asimismo, pueden tener una sensibilidad elevada y responden proporcionalmente a los cambios de concentracin de especies inicas. Sin embargo, su principal limitacin proviene de que la elevada conductividad de los componentes de las fases mviles usadas en cromatografa inica tiende a enmascarar la de los analitos, reduciendo la sensibilidad. Este inconveniente se resolvi mediante el uso de columnas supresoras colocadas inmediatamente despus de la columna cromatogrfica. En ellas, se transforman los iones del disolvente en especies moleculares poco disociadas, sin alterar los iones del analito*.

APLICACIONES

La cromatografa lquida de alta resolucin es una tcnica extraordinariamente verstil, como lo prueba la amplia variedad de mezclas que pueden separarse con ella. Posiblemente es la tcnica instrumental ms importante en relacin con anlisis farmacutico y de alimentos. As-mismo, desempea un papel importante en estudios fornsicos, ambientales y bioqumicos.

Adems de las aplicaciones mencionadas en pginas anteriores en relacin con la cromatografa lquida convencional, se citan seguidamente algunos ejemplos caractersticos. * Para la separacin de cationes, cuando se usa HCl como eluyente, la columna supresora es una resina aninica en forma de hidrxido, con lo que el Cl queda retenido por la resina y los H+, con los OH forman H2O,

H+ + Cl + ROH(s) > RCl(s) + H2O En la separacin de aniones, muchas veces se utiliza carbonato o bicarbonato sdico como eluyente. En este caso, la columna supresora contiene la forma cida de una resina catnica, con lo que se forma H2CO3 muy poco disociado,

Na+ + HCO3 + RH+(s) > RNa+ + H2CO3


La cromatografa en fase normal se utiliza extensamente para el anlisis de sustancias que son solubles en disolventes no polares, tales como vitaminas, pigmentos, aceites esenciales, aditivos no polares en distintos productos comerciales y formulaciones farmacuticas. As-mismo, uno de los usos ms importantes de esta modalidad de cromatografa es la separacin de ismeros.

La cromatografa en fase inversa, y particularmente la de fase enlazada, es, sin duda, la ms ampliamente utilizada. Se calcula que el 75 % de las separaciones por HPLC se llevan a cabo por dicha tcnica. En la industria farmacutica sus aplicaciones se centran, entre otras, en el anlisis de vitaminas, E-bloqueantes, alcaloides, esteroides, tetraciclinas, prostaglandinas, etc. As-mismo, es utilizada para el anlisis de especies biolgicamente activas, como aminocidos, protenas y cidos nucleicos.

Por ltimo, mencionar que otro campo de accin de la tcnica es el anlisis de muestras medioambientales, como pesticidas y herbicidas, incluyendo paracuat, dicuat, carbamato y compuestos organofosforados, as como distintos polutantes, tales como hidrocarburos poliaromticos fenolicos y aldehidos/cetonas.


CROMATOGRAFIA PLANA

La cromatografa plana es un tipo de cromatografa lquida en la que la fase estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una columna. Existen dos tcnicas de cromatografa plana: cromatografa en papel (CP) y cromatografa de capa fina (CCF). Aunque la CP precede en 1015 aos a la CCF, ha sido ampliamente superada por sta, debido a su mayor rapidez, versatilidad y reproducibilidad.

En cromatografa plana, la muestra se aplica en forma de gota sobre una lmina o superficie plana. Despus de evaporado el disolvente, la lmina se coloca verticalmente en una cmara cerrada con su extremo sumergido en el eluyente elegido (fase mvil), pero no la muestra (figura 12.20.a.). La fase mvil percola a travs de la fase estacionaria por capilaridad y desplaza los componentes de la muestra a distinta velocidad, teniendo lugar la separacin. Una vez que el disolvente ha pasado a travs de la mitad o de las dos terceras partes de la longitud de la lmina, se saca sta de la cmara y se seca, ponindose de manifiesto la presencia de las especies separadas por los procedimientos que se indicarn ms adelante. El cromatograma est constituido por un conjunto de manchas que corresponden a los componentes separados (figura 12.20.b.)

Lmina plana

Muestra Eluyente

.

Componente A

Componente B

Componente C

Aplicacinde la muestra

Frente deldisolvente

Compuestode referencia

dw

dR

dM

a) b)

dP

Figura 12.20. Cromatografa plana. a) Cmara cromatogrfica. b) Cromatograma.


PRINCIPIOS BASICOS

Casi todos los parmetros y ecuaciones desarrolladas para la cromatografa lquida en columna pueden aplicarse, con ligeras modificaciones, a la cromatografa plana, si bien, en sta, la caracterizacin de los componentes separados se lleva a cabo por el denominado factor de retardo, RF, definido por*,

RF =distancia recorrida por el soluto (centro de la mancha)

distancia recorrida por el frente del disolvente =dRdM

Los valores de RF pueden variar desde 1, para los analitos que no se retrasen, hasta valores prximos a cero. Estos valores pueden ayudar a la identificacin de una determinada especie, si bien, la coincidencia en los RF no deber tomarse como prueba inequvoca de identificacin, debido al gran nmero de variables que pueden influir, como pequeas diferencias en la composicin de la fase mvil, temperatura, tamao de la cmara, naturaleza de la mezcla, etc.

Con objeto de minimizar las diferencias entre los valores de los RF debidas a los factores mencionados, se ha propuesto utilizar el parmetro Rx, definido por,

Rx =distancia recorrida por el solutodistancia recorrida por un patrn =

dRdP

En cualquier caso, a pesar de la coincidencia en los valores de Rx, la identificacin plena de un compuesto deber hacerse de forma especfica, con tcnicas auxiliares, como espectroscopia IR, espectrometra de masas, RMN, etc.

El factor de retencin o factor de capacidad viene definido por,

k' =t' RtM

En cromatografa plana, t'R, (tiempo realmente invertido en la retencin de un soluto por la fase estacionaria) es proporcional a la distancia recorrida por el frente del disolvente menos la distancia recorrida por el soluto,

t'R = cte. (dM dR)

Por su parte, tM (tiempo de residencia del soluto en la fase mvil) ser proporcional a la distancia recorrida por el soluto

* En realidad, el valor de RF observado es un poco ms pequeo que el verdadero RF termodinmico, el cual puede obtenerse multiplicando el observado por un factor que vara entre 1.0 y 1.6.


tM = cte. dR

por lo que,

k' =cte. dM dR

cte. dR=

1 RFRF

Anlogamente a lo enunciado de forma general (ver tema 10), el nmero de platos tericos, N, puede obtenerse por la expresin:

N = 16dRdW

2

donde dW es la anchura de la gota.

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (CCF)

Las separaciones por cromatografa de capa fina se llevan a cabo en placas de vidrio o plstico recubiertas con una capa delgada de partculas finamente divididas que contienen la fase estacionaria. Aunque descubierta muchos aos antes, las primeras aplicaciones de la CCF datan de 1951, al utilizar esta tcnica para el aislamiento e identificacin de los componentes de zumos de naranja y pomelo.

Histricamente, el desarrollo de la CCF ha estado relacionado con el anlisis de alimentos, si bien, se utiliza tambin ampliamente en la industria farmacutica para la determinacin de la pureza de frmacos, as como en laboratorios clnicos y en la propia industria qumica. Por otra parte, el hecho de que las fases mvil y estacionaria, as como muchas de sus aplicaciones, sean similares a las de la cromatografa lquida en columna, hace que la CCF se utilice en muchas ocasiones como gua para desarrollar las condiciones ptimas para separaciones cromatogrficas en columna. La rapidez y el bajo coste de los ensayos de capa fina representan ventajas importantes. Respecto a la cromatografa en papel, la CCF presenta la importante ventaja de su mayor velocidad y, en muchos casos, mejor resolucin.

Fases estacionarias

Las propiedades generales de los adsorbentes (fases estacionarias) utilizables en CCF son similares a las descritas para la cromatografa de adsorcin en columna. Generalmente se utilizan partculas cuyo tamao oscila entre 10 y 25 Pm. En este sentido, es preciso indicar que, mientras que en una columna, un material muy finamente pulverizado resulta inadecuado, por no permitir altas velocidades de flujo, en capa fina, un tamao de grano pequeo, adems de facilitar el flujo, incrementa considerablemente la resolucin.


Tradicionalmente, los materiales ms usados como fase estacionaria han sido gel de slice, almina, celita, poliamida y celulosa, si bien, en poca relativamente reciente, el tipo de materiales usados con esta finalidad se ha extendido considerablemente, tanto para operar en fase normal, como en fase inversa o enlazada, anlogamente a lo que sucede en HPLC.

La gel de slice es la sustancia ms empleada en CCF. Se trata, como ya se

coment en relacin con otros tipos de cromatografa, de una fase estacionaria inorgnica de caractersticas polares, y a la que es necesario activar por calefaccin previa a su uso. Con frecuencia se adiciona CaSO4.1/2H2O con objeto de facilitar la adherencia, designndose entonces con el sufijo "G". Esta fase estacionaria resulta adecuada para separar numerosas sustancias, tales como aminocidos, alcaloides, azcares, cidos grasos, lpidos, aceites esenciales, esteroides, as como tambin cationes y aniones inorgnicos.

El mecanismo predominante con esta fase estacionaria es la adsorcin, siendo posible la separacin de sustancias hidroflicas neutras, cidas y bsicas eligiendo convenientemente el eluyente. Este es el modo de separacin considerado como normal. Sin embargo, puede operarse tambin en fase inversa, para lo cual puede recurrirse a impregnar el soporte con hidrocarburos de cadena larga, tales como parafinas o aceite de silicona. Estos materiales resultan adecuados para el anlisis de sustancias lipoflicas, tales como grasas y ceras, esteroides y vitaminas liposolubles, etc. As-mismo, pueden formarse fases enlazadas de forma anloga a lo indicado para HPLC.

Otro adsorbente polar, tambin muy utilizado, es la almina. Para obtener resultados reproducibles y separaciones ptimas, es necesario proceder a su activacin, con objeto de controlar la cantidad de agua adsorbida, la cual bloquea los centros activos. Dicha activacin normalmente se lleva a cabo calentando a unos 125-150 C durante un tiempo determinado.

La celita es un material diatomceo altamente poroso y de gran rea superficial, si bien, su poder de adsorcin es pequeo. Este es el motivo por el que se utiliza en menor extensin que la gel de slice y la almina. Sin embargo, es muy usado como soporte slido para fases estacionarias en cromatografa de reparto.


Un cierto nmero de poliamidas, como policaprolactama y nylon 66 pueden manufacturarse como fases estacionarias para CCF. Estas sustancias resultan particularmente tiles para la separacin de compuestos relacionados con los fenoles, al producirse la interaccin entre los solutos y la fase estacionaria por medio de enlaces de hidrgeno.

Para la preparacin de las placas, el material que constituye la fase estacionaria se dispone en forma de suspensin (en agua o en otro disolvente) y se extiende sobre una lmina de vidrio o de plstico, que puede ser rgido o flexible. Es fundamental que la capa sea lo ms uniforme posible, para lo cual suelen utilizarse dispositivos como el representado en la figura 12.21.

Fase estacionaria(suspensin)

Placas sin recubrir

Placas recubiertascon la fase estacionaria

.

.

Figura 12.21. Preparacin de placas para CCF.

El espesor de las pelculas usadas para trabajos analticos suele ser de 0.2 a 0.3 mm, mientras que en cromatografa preparativa el espesor puede variar entre 2 y 10 mm. Una vez extendida la fase estacionaria, la placa se seca al aire y se activa por calefaccin a 110 C.

Uno de los aspectos ms crticos de la CCF es la aplicacin de la muestra. Esta suele hacerse por contacto entre la placa y un tubo capilar que contiene la muestra en disolucin, a 1 2 cm del extremo. La aplicacin de la muestra deber hacerse con sumo cuidado, al objeto de no perturbar la capa de adsorbente.

Fases mviles

Un disolvente adecuado para utilizarlo en CCF deber reunir las siguientes caractersticas:

* Inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria.


* Pureza elevada. * Adecuada viscosidad y tensin superficial. * Punto de ebullicin bajo, para facilitar el secado de las placas. * Barato, de baja inflamabilidad y toxicidad.

La eleccin del disolvente, o mezclas de disolventes, adecuados para una determinada separacin es fundamentalmente emprica, si bien, pueden utilizarse, en funcin de las caractersticas de los compuestos a separar, las series eluotrpicas, ya mencionadas anteriormente.

Desarrollo del cromatograma

Una vez preparada la placa y aplicadas las muestras, se coloca en una cmara cerrada (para operar en atmsfera saturada de vapor del disolvente) como se indica en la figura 12.20.a. y se espera a que el disolvente haya pasado a travs de la mitad o de las dos terceras partes de la placa. Adems de la modalidad ascendente, representada en la mencionada figura, pueden tambin utilizarse las modalidades descendente (figura 12.22.a.), bidimensional (figura 12.22.b.) o radial (figura 12.22.c.).

La modalidad bidimensional se utiliza cuando se trata de grupos de compuestos de estructura qumica y propiedades similares, tales como aminocidos, con valores de RF demasiado prximos para que la separacin unidireccional proporcione resultados satisfactorios. En esta modalidad, la muestra se aplica de forma normal y se desarrolla segn la direccin 1 (ver la figura 12.22.b.), en contacto con un disolvente determinado. A continuacin, se espera a que se seque y se eluye con un segundo disolvente en la direccin 2.

2

1

Aplicacinde la muestra

Eluyente

Placa

a) b) c)

.

.

Figura 12.22. Cromatografa de capa fina. a) Descendente. b) Bidimensional. c) Radial.


En la forma radial, la muestra se aplica en el centro de la placa, que normalmente tiene forma de disco, y el disolvente se introduce por un orificio a travs de una mecha sumergida en el depsito que lo contiene. A medida que se desarrolla el cromatograma, se van formando una serie de crculos como los representados en la figura 12.22.c.).

Localizacin de las sustancias separadas

La localizacin de las sustancias separadas sobre la placa puede hacerse directamente si dichas sustancias son coloreadas. Para sustancias incoloras, es necesario utilizar distintos mtodos qumicos o fsicos.

Mtodos qumicos. Estos mtodos implican una reaccin qumica, que puede ser especfica para algn determinado componente, o general. Dentro de estas ltimas, se utiliza el vapor de yodo, el cual se adsorbe reversiblemente sobre una gran cantidad de sustancias, originando puntos oscuros en las zonas donde existe un compuesto en la placa. Otro reactivo de aplicacin bastante general es el cido sulfrico concentrado, el cual, pulverizado sobre una placa de slice, permite visualizar las sustancias orgnicas despus de haber calentado la placa en una estufa. Asimismo, la fluorescena origina color amarillo-verdoso con una gran cantidad de sustancias orgnicas, y la ninhidrina se utiliza para detectar aminocidos.

Mtodos fsicos. El mtodo fsico ms comn para la deteccin en CCF es la radiacin ultravioleta, en combinacin con un indicador fluorescente. La placa contiene un material fluorescente cuya emisin (a 254 nm) es inhibida por la mayora de los solutos. Una vez evaporado el disolvente, se ilumina la placa con radiacin ultravioleta en un cuarto oscuro. Las manchas de soluto se ven ms oscuras, mientras que el resto de la placa es brillante.

Aplicaciones

En anlisis cualitativo, la identificacin de las sustancias separadas se basa en los valores de los RF con respecto a patrones cuyo cromatograma se ha desarrollado en las mismas condiciones. De todas formas, a pesar de la coincidencia en los valores de RF, siempre se necesita una confirmacin, lo cual puede hacerse repitiendo el ensayo con distintas fases mviles y estacionarias, as como tambin con distintos reactivos de revelado. En ltima instancia, puede recurrirse a raspar la mancha,


disolver el analito y proceder a su identificacin por RMN, espectrometra de masas o espectroscopia infrarroja.

La comparacin del rea de la mancha del patrn con la del analito permite hacer una estimacin semicuantitativa de la cantidad presente. Otros procedimientos cuantitativos implican la utilizacin de un densitmetro, as como proceder de forma anloga a la indicada para fines cualitativos, extrayendo el analito y determinarlo por algn mtodo qumico o fsico adecuado.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL (CP)

La tcnica es extraordinariamente simple, ya que utiliza una tira de papel de filtro, por ejemplo, Whatman No 1, como medio para las separaciones. Actualmente, la CP no se utiliza demasiado, debido al desarrollo alcanzado por otras tcnicas cromatogrficas, especialmente la CCF, CG y HPLC.

El mecanismo que interviene en la cromatografa en papel es fundamentalmente

de reparto, donde la fase estacionaria es al agua adsorbida sobre las molculas de celulosa del papel. Sin embargo, la misin del papel es realmente ms compleja que actuar simplemente como soporte de la fase estacionaria, ya que, al parecer, la adsorcin de los componentes de la fase mvil y de los solutos, as como efectos de cambio inico, tambin toman parte en el proceso de separacin.

El papel utilizado puede ser, en principio, papel de filtro estndar, si bien,

existen en el comercio papeles especiales para CP. Estos papeles estn fabricados con una porosidad y espesor determinados, as como con muy bajo contenido de restos metlicos. El desarrollo del cromatograma debe hacerse, en estos papeles, en una determinada direccin. Asimismo, deben conservarse en condiciones de humedad controlada y en lugares exentos de humos o vapores que puedan adsorberse sobre las fibras de celulosa y alterar las separaciones.

Si las sustancias a separar son apreciablemente solubles en agua, puede ser conveniente impregnar el papel en un medio no acuoso para que acte como fase estacionaria. En esta modalidad de cromatografa en fase inversa, la fase mvil no tiene por qu ser necesariamente agua, si bien, el eluyente usado suele contenerla en determinada proporcin.

La eleccin de la fase mvil en CP es esencialmente emprica. Normalmente se utilizan mezclas, consistentes en un compuesto orgnico, agua y otras especies, tales


como cidos, bases o agentes complejantes que modifiquen la solubilidad de los componentes de la muestra. Las sustancias polares, que son ms solubles en agua que en lquidos orgnicos, se desplazarn muy lentamente si se utiliza un eluyente totalmente anhidro, por lo que deber aadirse algo de agua. As, por ejemplo, el n-butanol no es un buen eluyente para aminocidos polares, al menos que est saturado con agua. Si se aade tambin cido actico, entonces puede aumentarse la cantidad de agua y la mezcla ternaria resultante incrementa considerablemente la solubilidad y la movilidad de los aminocidos.

Muchos iones inorgnicos se separan en forma de complejos o de quelatos apreciablemente solubles en lquidos orgnicos. As, por ejemplo, los complejos clorurados de hierro son muy solubles en acetona, mientras que el niquel no. Consecuentemente, podrn separarse hierro y nquel con este disolvente.

En la cmara cromatogrfica deber mantenerse una atmsfera saturada de

vapor del disolvente, con objeto de evitar la evaporacin del disolvente, ya que si sta se produce, el aporte de fase mvil al frente del disolvente puede ser insuficiente para su desplazamiento a travs del papel.

Las tcnicas para desarrollar el cromatograma son similares a las empleadas en

CCF, esto es, ascendente, descendente, bidimensional y radial. La muestra, disuelta en un disolvente voltil, se aplica al papel con un capilar, una microjeringa o una micropipeta. Su tamao deber ser de unos 2 mm de dimetro y la cantidad de muestra comprendida entre 10 y 50 Pg. El disolvente se elimina por evaporacin (por ejemplo, con un secador de pelo) y si la muestra es muy diluida se aplican varias gotas, evaporando el disolvente despus de cada aplicacin. En la figura 12.23. se muestran algunos sistemas para desarrollar los cromatogramas en CP.

Figura 12.23. C omatografa en papel. a) Ascendente. b) Descendente. r


La mayora de las tcnicas usadas para la localizacin de las sustancias separadas en CCF pueden aplicarse a la cromatografa en papel, excepto, evidentemente, aquellas que impliquen el uso de reactivos que puedan atacar al papel, como el cido sulfrico concentrado. Sin embargo, la deteccin sobre papel es menos sensible que en capa fina, debido a que las manchas se muestran generalmente ms difusas.

Aunque se coment que en las ltimas dcadas, en muchas aplicaciones, la CP ha sido sustituida por la CCF, an se sigue utilizando aquella, no solo con fines didcticos, por su simplicidad, sino para separaciones de ciertas muestras clnicas y bioqumicas ( por ejemplo, azcares y aminocidos en orina), as como en otras aplicaciones analticas generales.


CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS (CFS)

En esta tcnica, la fase mvil es un fluido a temperatura y presin superiores a la crtica. En la figura 12.24. se muestra el diagrama de fases para el CO2 puro, donde se indican los estados de agregacin (slido, lquido, gas) para cualquier combinacin presin-temperatura.

10

20

30

40

50

60

70

80

80 60 40 20 0 20 40

Slido

Lquido

Gas

Punto triple (56.4 C, 5.11 atms.)

Punto crtico(31.3C, 72.9 atms.)

Zonasupercrtica

P, atms.

t, C

Figura 12.24. Diagrama de fases para el CO2.

A lo largo de cada una de las lneas del diagrama existe un equilibrio entre las fases adyacentes, esto es, coexisten ambas fases, mientras que en el punto triple, coexisten en equilibrio las tres fases, slida, lquida y gaseosa. Cuando se cruza alguna de las lneas resulta un cambio de fase, como consecuencia de lo cual se produce un cambio brusco en las propiedades fsicas (densidad, viscosidad, difusividad, etc.). Sin embargo, por encima del punto crtico (caracterizado por una presin y un temperatura definidas) solo existe una fase, cualquiera que sea la presin. Esa fase se llama fluido supercrtico. Las propiedades fsicas del fluido en esas condiciones son intermedias entre las del gas y el lquido, y varan gradualmente (no bruscamente) al desplazarse dentro de esa zona.


El empleo de fluidos supercrticos como fase mvil presenta ciertas ventajas sobre la utilizacin de fases gaseosas o lquidas, debido a lo siguiente: en CG la separacin depende fundamentalmente de la volatilidad, por lo que si un analito no tiene una presin de vapor suficientemente elevada o si es trmicamente inestable, en principio, la tcnica no resulta adecuada para su separacin. En HPLC y en CFS, la volatilidad del analito no constituye un prerrequisito, mientras que la separacin est condicionada por diferencias de afinidad para la fase mvil y la fase estacionaria, de forma que, para una columna dada, modificando la composicin de la fase mvil se influye sobre las separaciones. Una caracterstica nica de la CFS es que la afinidad de la fase mvil para un analito es tambin funcin de la densidad, y sta se puede variar prcticamente a voluntad sin ms que modificar la presin. As, es posible la elucin de compuestos que difieren ampliamente en los factores de capacidad simplemente variando la presin.

En HPLC, la fuerza eluotrpica se modifica operando con elucin por gradiente y en CG por aumento de la temperatura. En CFS este efecto se logra variando la densidad del disolvente. Adems, la CFS es ms rpida y con mayor poder de resolucin que la cromatografa lquida, debido a los mayores coeficientes de difusin de los solutos en los fluidos supercrticos que en los lquidos, si bien, son menores que en los gases. Sin embargo, la CFS no resulta adecuada para los sistemas de polaridad elevada y particularmente los sistemas acuosos son difciles de manejar, sobre todo por los elevados valores que presentan sus constantes crticas.

Hasta la fecha, la fase mvil ms utilizada para este tipo de cromatografa es el dixido de carbono, debido a su temperatura crtica relativamente baja. Adems no es txico y es compatible con el detector de ionizacin de llama empleado en CG. Por otra parte, el CO2 presenta un amplio margen de densidad en las condiciones normales de operacin, lo cual proporciona una gran versatilidad para optimizar las condiciones de operacin. Otra ventaja es que puede obtenerse comercialmente en un alto grado de pureza y es relativamente barato. Sin embargo, los compuestos muy polares y los de peso molecular elevado tienen bajas solubil

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