UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E FARMACOLOGIACURSO DE FARMÁCIA

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

TERESINA, 2013

Nas indústrias químicas, farmacêuticas, alimentícias, refinarias, petroquímicas, laboratórios de análises clínicas, ambiental e forense entre outras, frequentemente é necessário separar, isolar, purificar, identificar e quantificar os componentes de misturas muitas vezes bastante complexas.

IMPORTÂNCIA DA CROMATOGRAFIA

Velocidade

Poder de resolução

Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 – 10-15g)

Simplicidade da técnica

VISÃO GERAL DE CROMATOGRAFIA

O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.

Tal separação dá-se através da migração da amostra através de uma fase estacionária por intermédio de um fluido (fase móvel).

Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da fase estacionária.

O equilíbrio de distribuição determina a velocidade com a qual cada componente migra através do sistema.

DESCRIÇÃO GERAL DE HPLC

A amostra é dissolvida em um solvente apropriado e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE)

Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades

As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.

Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.

COMPARATIVO HPLC / CG

INSTRUMENTAÇÃO EM HPLCDIAGRAMA DE UM CROMATÓGRAFO A LÍQUIDO

O cromatógrafo a líquido é constituído dos seguintes componentes:

1. Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel2. Sistema de introdução de amostra3. Sistema analítico: coluna cromatográfica e termostato4. Sistema de detecção (um ou mais detectores)5. Sistema de registro e tratamento de dados.

DIAGRAMA DETALHADO DE UM HPLC

FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC

RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL

CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 1:

A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor e coluna, logo é necessário filtração antes de armazenar a fase móvel no reservatório.

A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel. Usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e 0,45 μm), celulose (0,22 μm ) ou TEFLON (1 e 1,5 μm)

CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 2:

A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de bolhas no processo de separação o que pode interferir no desempenho da análise.

As técnicas de degaseificação são:

UltrasomRefluxo com resistência de aquecimentoVácuo (trompa d’água)Purga com HélioUso de membrana semipermeável e vácuo online.

BOMBA

CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS

Leva a fase móvel desde o reservatório até a coluna

Alta reprodutibilidade e exatidãoVazão contínua sem pulso de 0,01ml /min -

10ml /minVazão constante independentemente da

pressãoAlta resistência à corrosão – inércia química

a solventes comunsOpera a altas pressões (6000 psi)

CONSIDERAÇÕES IMPORTANTESVazão constante é essencial para qualquer separação

por HPLC. Alta pressão é necessária para impulsionar o solvente através da coluna cromatográfica vencendo a enorme resistência imposta pela fase estacionária.

Preferencialmente devem operar com programação de vazão e deve ser possível a interrupção do processo em pressões fora dos limites máximos e mínimos pré-estabelecidos.

É importante introduzir fatores de correção de compressibilidade para a fase móvel utilizada ainda que os líquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrário, a vazão real pode diferir da selecionada.

BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE

BOMBEAMENTO ISOCRÁTICOA composição da fase móvel é mantida constante

durante toda análise cromatográfica.Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamento necessário

para uma análise isocrática.

BOMBEAMENTO POR GRADIENTE

Alguma análises necessitam alteração da composição da fase móvel, sem alteração da vazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise e/ou melhorar a separação dos componentes da amostra.

O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão.

No caso de baixa pressão utiliza-se uma única bomba e a seleção do solvente a ser utilizado dá-se através de válvula de múltiplas vias controladas pelo software do sistema.

Já no caso do bombeamento de alta pressão, cada solvente tem uma bomba específica.

A figura ilustra o equipamento necessário para o a análise por gradiente a baixa e alta pressão.

INJETORSISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRAEm HPLC, a injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas

especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20μl. A figura abaixo, mostra um esquema de uma válvula típica nas posições de carga e de injeção.

A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta e a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção.

COLUNAS CROMATOGRÁFICASCOLUNAS ANALÍTICAS E PRE-COLUNAS

A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço e resistentes a altas pressões(até 500 atm)

Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente sílica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 μm (em alguns casos, até de1 μm) de diâmetro médio.

Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são relativamente curtas e de paredes espessas.

COMPRIMENTO: 3 – 60 cmDIÂMETRO INTERNO: 0,2 – 8 mm

As colunas normais apresentam diâmetro interno variando de 4 – 6 mm e comprimento que depende da granulometria da fase estacionária como mostra a tabela abaixo.

COLUNAS CROMATOGRÁFICASCOLUNAS ANALÍTICAS – CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES:

Como o tempo de retenção depende da temperatura, as colunas devem ser mantidas termostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para a separação.

Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficiência, estão sendo introduzidas colunas de diâmetro interno de 1 – 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxos menores o que resulta em diminuição substancial do custo de operação e aumento de sensibilidade como ilustrado na figura abaixo.

PRÉ-COLUNAS (GUARD COLUMNS)SEMPRE USE PRÉ-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA

DA COLUNA ANALÍTICA

CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS: Protege a coluna analítica contra contaminações químicas Mesmo material de empacotamento da coluna Comprimento Típico: 25 mm Descartáveis

O uso de pré-colunas é de importância vital para a vida útil da coluna analítica.

A filtração da fase móvel e da amostra nem sempre são suficientes para a eliminação de impurezas prejudiciais à coluna.

Pode acontecer “retenção irreversível”, ou seja, a afinidade do contaminante pela coluna é tão grande que ele não elui, ficando retido nos primeiros centímetros do empacotamento. pode provocar perda da eficiência, aumento de pressão e cauda nos picos. Com o uso da pré-coluna, o contaminante não atingirá a coluna analítica.

Ao perceber os sintomas de contaminação (os mais comuns são aumento de pressão e elevação no nível de ruído), substitui a pré-coluna, que em média custa 10 vezes menos que a coluna analítica.

DETECTORESO detector é um dispositivo conectado na saída da

coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado.

Um detector ideal deve possuir as seguintes características:•Alta Sensibilidade•Estabilidade: Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não devem alterar o sinal•Reprodutibilidade•Resposta Linear: A resposta do detector deve variar linearmente com a concentração do analito numa extensa faixa de concentração•Resposta rápida aos analitos•Não contribuir para o alargamento do pico•Confiabilidade•Facilidade de manuseio•Não destrutivoCondição necessária para cromatografia preparativa•SeletividadeHabilidade relativa de um detector medir um composto e não outro.

TIPOS DE DETECTORES

Os principais detectores utilizados em HPLC são:

Índice de refração

Espectrofotometria UV-Visível

Fluorescência

Eletroquímico

Espectrometria de massa LC/MS

ÍNDICE DE REFRAÇÃONo momento da passagem do analito pelo detector, pode

ocorrer uma alteração do índice de refração. Essa alteração em relação ao valor da fase móvel livre de analito é detectada.

A detecção só é possível quando o índice de refração do analito é diferente do IR da fase móvel.

Esse detector é normalmente utilizado quando os analitos não absorvem na região de comprimento de onda do UV-VIS.

Apresenta as seguintes desvantagens: baixa sensibilidade não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR

varia com a composição da fase móvel) temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a

temperatura)

APLICAÇÃO Análises de carbohidratos e açúcares em geral.

ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS)

Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo detector.

É um detector seletivo pois só detecta os compostos que absorvem no comprimento de onda em que o detector for ajustado.

É o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substâncias absorvem radiação UV. Exemplos de substâncias são: olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações C=O, C=S, N=O.

CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES: A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda

selecionado A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de

impurezas podem absorver intensamente no comprimento de onda utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC

TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Fotométricos – comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm Espectrofotométricos – comprimento de onda variável: 00nm

a190nm

DETECTORES ELETROQUÍMICOSBaseia-se na possibilidade de muitos compostos serem

oxidados ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico.

Em um processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e um potencial suficientemente elevado é aplicado provocando uma reação de oxidação ou redução gerando uma corrente que é medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é proporcional a concentração do composto.

TIPOS DE DETECTORESAmperométrico

O elemento flui pela superfície do eletrodo onde uma fração das espécies eletroativas é oxidada ou reduzida (15-20%).

Coulométrico O elemento flui através de um eletrodo de grafite poroso

onde praticamente 100% das espécies eletroativas são oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade é muito maior (10-15mol = fentomol)

AQUISIÇÃO DE DADOS

Atualmente utilizam-se softwares que permitem:

Processar os dados de cromatograma

Armazenar e registrar

Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna

PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

Uma série de parâmetros cromatográficos são importantes para serem utilizados na identificação dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatográfico e auxiliar na otimização do processo de separação.

Os parâmetros cromatográficos a serem considerados são: TEMPO DE RETENÇÃO FATOR DE SEPARAÇÃO NÚMERO DE PRATOS RESOLUÇÃO

TEMPO DE RETENÇÃO

Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, (tr), de uma substância ao tempodecorrido do instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo do pico.

Na análise cromatográfica, mantido constantes a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, o tempo de retenção é constante.

NÚMERO DE PRATOS

Número indicativo da performance da coluna. É a medida da largura do pico em relação ao seu tempo de retenção. É o parâmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatográfico.

RESOLUÇÃOFornece uma medida quantitativa da habilidade

da coluna em separar duas substâncias.

FASE MÓVEL

ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC

O sucesso da separação cromatográfica só é possível se for aplicada uma FM correta a uma FE conveniente.

A escolha da composição da FM leva em conta vários fatores, tais como:Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade,

partição e adsorção e, portanto, a separaçãoPropriedades físicas que afetam a possibilidade de

detecção dos componentesPropriedades físicas que dificultam o manuseio das

bombas, detectores e colunaPropriedades que afetam a segurança (toxicidade e

inflamabilidade)Custo

SELEÇÃO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO

ANÁLISE QUALITATIVA

A análise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificação dos analitos de interesse.

Existem dois casos a serem considerados para análise qualitativa com HPLC:

Análise Qualitativa em Controle de qualidade

Análise Qualitativa em identificações não rotineiras

Análise Qualitativa em Controle de qualidadeÉ normalmente efetuada através da comparação do

tempo de retenção ou retenção relativa dos analitos de interesse com esses parâmetros de padrões. Tais análises são realizadas com metodologias já estabelecidas.

É fundamental o controle e monitoramento das condições analíticas para evitar conclusões errôneas.

Análise qualitativa em identificações não rotineirasNeste caso é importante conhecer o máximo da

história da amostra e utilizar detectores que auxiliam a identificação da estrutura do composto, como detector de espectrometria de massa.

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR Vários softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no

desenvolvimento de método de análise por HPLC. São softwares caros, mas o investimento permite uma economia

para as Empresas, pois cada método é desenvolvido em pouco tempo.

Dependendo da experiência em cromatografia e da complexidade da amostra, um método desenvolvido manualmente (método convencional), pode levar um mês ou mais.

Com um desses programas eletrônicos, o método pode ser desenvolvido em algumas horas ou poucos dias.

ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS:

DRY-LAB 2000 PLUS (Rheodyne) – www.molnar-institut.com/www.rheodyne.comCHROMSWORD AUTO - (Hitachi – Agilent – Iris) – www.chromsword-auto.comACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE – www.acdlabs.comPOPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography – BISCHOFFCHROMATOGRAPHY – www.poplc.def