Analisi di tossine algali tramitecromatografia liquida/spettrometria di massa

e-mail: sara.bogialli@uniroma1.itSara Bogialli, Antonio Di Corcia

Università di Roma,“La Sapienza”Dipartimento di ChimicaPiazza Aldo Moro, 5

00185 Roma

I CIANOBATTERI POTENZIALMENTE TOSSICI: IMPLICAZIONI SANITARIE E GESTIONE DEL RISCHIODipartimento Ambiente e connessa Prevenzione Primaria

Roma, 15 novembre 2007

2

SPETTROMETRIA DI MASSA: PERCHE’?

Quando c’è necessità di risposte affidabili

sulla presenza di contaminanti

Sviluppo di metodi basati su LC/MS tandem per l’analisi di tossine algali

“ I metodi basati soltanto sull’analisi cromatografica, senza l’uso di un rivelatore spettrometrico, non sono utilizzabili come metodi di conferma”

(Dir. 2002/657/CE)

3

H

HCH3

H

CH3

H

H

NH

CH3

HO

NH

COOHH

N

O

CH3

CH2

NH

O

CH3

H

R1

O

R2

O

NH

H CH3

COOHH

CH3

O

(5) Adda

(6) D-Glu (7) N-metildeidroalanina (Mdha)

(1) D-Ala

(3) D-eritro-ββββ-metilAsp

CIANOTOSSINE SELEZIONATE

4

Adda (3) D-Glu (iso) (4)

N -methyldehydrobutyricacid (Mdhb) (5)

Arg (2)D-erythro- ββββ -methylAsp (1)

COOH

H

C H3

O

CH 3

H

CH 3HN H

O

O

C H3

O

NNH

O

H

CH 3

N H

H

H

CH3

H

CH 3H

H

N H

NH 2

N H

O

NH

H COOH

Nodularina

(STANDARD INTERNO PER L’ANALISI DI ACQUA DI LAGO)

CIANOTOSSINE SELEZIONATE

5

CylindrospermopsinaAnatossna-a

CIANOTOSSINE SELEZIONATE

6

0,5 L acqua di lago

EXTRACELLULARE TOTALE

4°C -18°C

0,45 µm FASCIA NERA

ESTRAZIONE DI MCs DA ACQUA: SPE

7

a) 0,5 L acqua di lago (0,5 g GCB)

• evaporazione a 50evaporazione a 50°°CC

•• ricostituzione delricostituzione delresiduoresiduo

•• iniezione 50/250 iniezione 50/250 estratto finaleestratto finale

b) RI-ESTRAZIONE DEGLI ANALITI

Eluizione in back-flushing:

1 mL CH3OH + 4 mL CH2Cl2/CH3OH (80:20 v/v)

10 mmol/L TFA

PROCEDURA DI ESTRAZIONE PER MCs: SPE

Procedura utile per MC-LW

SI AGGIUNGE LA NODULARINACOME COMPOSTO DI CONTROLLO

PER L’ESTRAZIONE (QC o SS)

8

PRESTAZIONI DEL METODO DI ESTRAZIONE

96 ± 6MC-LW

102 ± 5MC-LA

100 ± 5MC-LR

98 ± 6MC-YR

102 ± 8NOD

99 ± 6MC-RR

Resa diestrazione, %

Composto

0,5 L di ACQUA DI LAGO n=4 100 ng/L

•Applicabile ad acqua potabile e di lago•Volumi da 0,5-2 L •Indipendente dalle

concentrazioni di tossine

METODO DI ESTRAZIONE AFFIDABILE E ROBUSTO

9

CYL e ANA-a NELLE ACQUE

5 mL campione + IS

filtrazione

0.5 mL iniettati direttamente all’apparato LC/MS/MS

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

411

10,24

11,04

11,04

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00Time0

100

%

0

100

%

0

100

MRM of 3 Channels ES+416 > 336

416 > 194652

159 > 142

1,40e5

MRM of 3 Channels ES+

MRM of 3 Channels ES+

%

A

B

C

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

411

10,24

11,04

11,04

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00Time0

100

%

0

100

%

0

100

MRM of 3 Channels ES+MRM of 3 Channels ES+416 > 336

416 > 194652

159 > 142

1,40e5

MRM of 3 Channels ES+MRM of 3 Channels ES+

MRM of 3 Channels ES+MRM of 3 Channels ES+

%

A

B

C

Acqua di lago contaminata con 1000 ng/L CYL

IS

CYL

CYL

LOQ = 300 ng/L

10

CYL e ANA-a NELLE ACQUE

5 mL campione + IS

filtrazione

0.5 mL iniettati direttamente all’apparato LC/MS/MS

Acqua di lago contaminata con 50ng/L

di ANA-aLOQ 13ng/L

11

Sistema di separazione

cromatografica

Sorgente di ioni

Analizzatore di massa

Rivelatore

Presentazione del segnale

Elaboratore di segnale

Campione

A B C

m/z

LC/MS

12

MRM MODE

13

MRM MODE

14

MRM MODE

15

Modalità di acquisizione ESI+, MRM

Scelta di due transizioniper ciascun analita

Adda

m/z 135

N H

C H3

C H3

CH3

O

C H O H

H++

+

N H

C H3

C H3

CH3

O

C H33

O H

+

O C H3

++

[M+2H]2+

ANALISI LC/MS/MS

16

PRECURSOR ION SCAN

OCH3

++OCH3

++ Ar

Ar

Ar

O C H3

++

IDENTIFICAZIONE MCs IN FULL-SCAN

Collision cellQ1 Q3

17

PRECURSOR ION SCAN inj 50/500 RETINATA ALBANO

450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100m/z0

100

%

2: Parents of 135ES+ 981

[M+H]+

inj 50/500 RETINATA ALBANO

450 452 454 456 458 460 462 464 466 468 470 472 474 476 478 480 482 484 486 488 490 492 494 496 498 500 502 504 506m/z0

100

%

1: Parents of 135ES+ 491

[M+2H]2+

Demetil-MC-LR(Albano,dicembre 2004)

MC-LR [M+H]+ 995MC-YR

00,00,00,inj 50/500 RETINATA ALBANO

5,40 5,60 5,80 6,00 6,20 6,40 6,60 6,80 7,00 7,20 7,40 7,60 7,80 8,00 8,20 8,40 8,60 8,80 9,00 9,20 9,40 9,60

Time0

100

%

0

100

%

2: Parents of 135ES+ 6,956,34

1: Parents of 135ES+ 6,96

6,32

?

?

Full-scanbicarica

Full-scanmonocarica

18

MeOH

ACN

ISOMERI Dem-MC-RR

470 475 480 485 490 495 500 505 510 515 520 525 530 535 540m/z

0

100

%

470 475 480 485 490 495 500 505 510 515 520 525 530 535 540m/z

0

%

512.5

513

513.5

Eluizione a gradiente

Quantificazione: stessa risposta

molare

19

CROMATOGRAMMA MCs 50 ng/L

4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00Time0

100

%

0

100

%

MC-RR

MC -YR

MC-LR

IS

MC -LA

MC-LW

0

100

%

0

100

%

0

100

%

-

-

0

100

%

4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00Time0

100

%

0

100

%

MC-RRMC-RR

MC -YR

MC-LR

IS

MC -LA

MC-LW

0

100

%

0

100

%

0

100

%

-

-

0

100

% È possibile quantificare le MCs a conc.comprese tra

2 ng/L (MC-RR)

e 9 ng/L (MC-LW)

0.5 L acqua di lago contaminata con 50 ng/L MCs(20 volte inferiore al limite di

attenzione OMS)

20

MONITORAGGIO LAGHI DI ALBANO E VICO

centro sup.-5 m-10 m-15 m-20 m-25 m-30 m

Specie algali presenti nei laghi : Planktothrix rubescens (MCs)

Cylindrospermopsis raciborskii , Albano (CYL)

21

MONITORAGGIO LAGHI DI ALBANO E VICO

Progetto in Collaborazione con

Università di Roma Tre e Regione Lazio

22

CYL ALBANO

Cylindrospermopsis raciborskii fioritura estiva (2004)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

sup. -5 -10 -15 -20 -25 -30

m

[CY

L],

ug/L

SETTEMBRE OTTOBRE NOVEMBRE

Dato mancante

23

ALBANO: PROFILO DI PRODUZIONE MCs

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

sup. -5 -10 -15 -20 -25 -30

PROFONDITA' [m]

C [u

g/L]

MC-YR Dem MC-RR Dem MC-LR

Albano aprile 2005, contenuto totale

Microcistine rivelate:

1. Dem-MC-RR (2 isomeri)

2. MC-RR

3. MC-YR

4. Dem-MC-LR

24

VICO: CAMPIONE DI POZZO

00,02-Feb-200700,25/250 500 ml VICO DICEMBRE POZZO 5 F.N.+ 25 ng NOD(SURR) +7.5 ng IS B.E.crom.come MCTESSU614

2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 3: MRM of 6 Channels ES+ TIC

4,36e4

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 2: MRM of 9 Channels ES+ TIC

1,71e3

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ Sum

1,12e3

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ 512,5 > 134,8

493

Dem-MC-RR

NODULARINA (SURROGATO)

IS

00,02-Feb-200700,25/250 500 ml VICO DICEMBRE POZZO 5 F.N.+ 25 ng NOD(SURR) +7.5 ng IS B.E.crom.come MCTESSU614

2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 3: MRM of 6 Channels ES+ TIC

4,36e4

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 2: MRM of 9 Channels ES+ TIC

1,71e3

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ Sum

1,12e3

MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ 512,5 > 134,8

493

Dem-MC-RR

NODULARINA (SURROGATO)

IS

pozzo 5 campionato a dicembre 2006. Il campione risulta contaminato da dem-MC-RR (~ 4 ng/L).

QC ESTRAZIONE

QC DETECTOR

25

1 g

5 g

ESTRAZIONE DA CAMPIONI DI PESCE: MSPD

FORNOGC

POMPA HPLC

26

COLONNA C-18FASI MOBILI

H20 10 mM HCOOHACN 10 mM HCOOH

ACQUISIZIONE IN MODALITA’MRM (Multi Reaction Monitoring),

IONOZZAZIONE POSITIVA

ESTRAZIONE DA CAMPIONI DI PESCE: MSPD

27

0

10

20

30

40

50

60

70

80

ANA MC-RR NOD MC-YR MC-LR MC-LA MC-LW

RE

CO

VE

RY

(%

)

60°C 80°C 100°C

ESTRAZIONE CON MSPD + HOT WATER

Condizioni di estrazione:4 mL H2O 10 mM HCl 80°C

3.863 (4)51 (4)MC-LW

3.172 (9)50 (8)MC-LA

4.071 (9)49 (7)MC-LR

3.976 (9)51 (8)MC-YR

1.680 (5)45 (8)NOD

1.662 (6)41 (3)MC -RR

0.574 (5)38 (10)ANA-a

LOQ, ng/gH2O (pH 2)H2OComposto

Applicabile a 4 diversi tipi di pesce di lago (persico, carassio, muggine e trota)

28

Omogenizzazione del campione

Estr. con solventi organici

e centrif.

Purificazione degli estratti ⇒⇒⇒⇒ SPE

Evap. e concentr. degli estratti

Ridissoluzione degli estratti

Iniezione nel sistema LC/MS

ANALISI DI CONFERMA TESSUTI:TEMPI

Preparazione del campione (MSPD)

Estrazione con acqua (HWE)

Iniezione diretta e analisi LC/MS

29

Tutti i bianchi presentano un composto incognitocon lo stesso ione molecolare, stesso pattern di

frammentazione e tempo di ritenzione vicino a quelloall’anatossina-a.

Falso positivo dell’anatossina-a

COMPOSTO INCOGNITO FENILALANINA

ANA-a IN CAMPIONI BIOLOGICI

30

O

NH2

OH

CONFRONTO ANA-a E Phe

52.8%27%10.5%9.7%165.234Ana-a

13.4%50%34.4%2.2%165.191Phe

166 >>>> 149166 >>>> 131166 >>>> 107166 >>>>91

Transizioni, (m/z) e abbondanze relativeMassa esatta,

(m/z)Composto

CH3

O

NH

31

ANA-a NEL PESCE

32

CONCLUSIONI

•Sviluppo di un metodo specifico e sensibile per la determinazione di MCs a livelli di pochi ppt nelle acque

•Sviluppo di un metodo specifico e rapido per la determinazione di MCs e ANA-a a livelli di pochi ppb in 4 diversi tipi di pesce

•Iniezione diretta di CYL e ANA-a con LOQ di 300 ppt e 50 pptnelle acque

•Possibilità di determinare MCs di cui non si possiedono gli standard

•Monitoraggio del lago di Albano e Vico: si evidenza la presenza di 4 varianti di MCs e CYL, con concentrazioni totali superiori al

limite di attenzione per MC-LR

33

RINGRAZIAMENTI

1. Bogialli, S. et al. Environ. Sci. Technol., 2006, 40, 29172. Bogialli, S. et al. J. Chromatogr A,. 2006, 1122, 1803. Bogialli, S. et al. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 6586

Pubblicazioni

Gruppo di lavoro Prof. Di Corcia