学校编码：10384 分类号 _______ 密级 ______

学号：24520111153376 UDC _______

硕 士 学 位 论 文

DYRK1A 表达与难治性颞叶癫痫的相关性研究

The correlation research of DYRK1A expression

and refractory temporal lobe epilepsy

王文杰

指导教师姓名：郑维红教授

专 业 名 称：内科学（神内）

论文提交日期：

论文答辩时间：2014 年 5月 7 日

学位授予日期：

答辩委员会主席：潘 超

评 阅 人：________

2014 年 5 月

DYRK1A

表达与难治性颞叶癫痫的相关性研究

王文杰

指导教师

郑维红

教授

厦门大学

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年 月 日

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会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公

开学位论文，均适用上述授权。）

声明人（签名）：

年 月 日

摘 要

I

摘 要

目的：通过氯化锂-匹罗卡品小剂量反复腹腔注射诱导昆明小鼠癫痫持续状态发

作，模拟人类颞叶癫痫动物模型，分析 DYRK1A mRNA在小鼠脑组织中的表达

情况及其与海马硬化形成的相关性，探讨 DYRK1A是否参与难治性颞叶癫痫的

形成，为继续研究 DYRK1A 蛋白与海马硬化发生的相关性提供理论依据。

方法：将清洁级健康雄性昆明小鼠 50只，随机分为正常对照组 16只和致痫组

34只，分别予以生理盐水和氯化锂-匹罗卡品小剂量反复腹腔注射，建立小鼠癫

痫持续状态（SE）；分别观察 24小时和 30天，随机选取 6只为急性致癫组，

慢性致癫组 6只，通过行为学、电生理学、病理学 HE染色方法验证模型的可靠

性，建立人类颞叶癫痫小鼠模型。采用逆转录 PCR方法检测 DYRK1A mRNA 在

小鼠脑组织中的表达水平。

结果：氯化锂-匹罗卡品小剂量反复腹腔注射昆明小鼠共 34只,其中有 22只小鼠

诱发癫痫持续状态（SE），发作达到 Racine标准 IV-V级，剔除 12只发作未达

到 Racine标准 IV-V级者。进入 SE的 22只小鼠中 24小时内死亡的有 5只，SE

后 24小时随机选取 6只入选急性致痫组；24-72小时后死亡的有 3只。其余 8

只小鼠在 24-72小时后进入静止期,观察 30天，随机选取 6只进入慢性致癫组。

6只正常对照组小鼠，腹腔注射生理盐水后未见发作，未见死亡。本研究中，SE

诱发成功率为 64.71 % (22/34),SE后死亡率为 36.36% (8/22),；自发癫痫发作出现

率为 47.06% (8/17)。

病理学 HE染色分析，与正常对照组相比，致癫组海马神经元细胞排列不整齐，

细胞间隙增大，出现肿胀、变性、坏死、崩解，胞体固缩，体积变小，胞浆浓缩

深染，细胞核固缩，核仁不清，死亡细胞胞核裂解，细胞浆消失。

致癫组小鼠模型的脑电监测可见：急性期爆发长程出现的尖活动、棘活动以及不

规则的尖慢复合活动，明显突出于背景脑电活动；慢性期散在出现的、频率慢于

背景活动的慢活动以及痫性放电。

6例正常对照组 DYRK1A mRNA 与β-actin 比值为 0.4830±0.1243；6例急性致

癫组 DYRK1A mRNA 与β -actin 比值为 0.8883±0.0727；6 例慢性致癫组

DYRK1A mRNA 与β-actin比值为 0.7112±0.1216；三组中两两比较差异均有显

摘 要

II

著性统计学意义（P<0.05）。DYRK1A mRNA在三组中的表达情况：急性致癫

组>慢性致癫组>正常对照组。

结论：氯化锂-匹罗卡品诱导昆明小鼠癫痫持续状态后,脑组织中 DYRK1A表达

量较正常对照组增加。

关键词：DYRK1A 难治性颞叶癫痫 海马硬化

Abstract

III

ABSTRACT

Objective: To establish a mice model of human temporal lobe epilepsy , lithium

chloride-pilocarpine can be induced status epilepticus seizures in Kunming mice by

intraperitoneal injection. The analysis of DYRK1A mRNA expression in mice’s brain

tissue is used to investigate whether DYRK1A participate in the formation of

hippocampal sclerosis of intractable temporal lobe epilepsy. By this, we can provide

theoretical basis for the correlation between DYRK1A expression and hippocampal

sclerosis in intractable temporal lobe epilepsy.

Methods: clean healthy male Kunming mice were randomly divided into control

group( 6 )and epileptic group ( 34 ). Epileptic group were established status

epilepticus (SE) by injecting a small dose of lithium chloride-pilocarpine repeatedly

and intraperitonealy . Control group can be injected by saline like this. Kunming mice

were observed in the next 24 hours and 30 days . We randomly selected 6 mice into

acute epileptic group , 6 mice into chronic epileptic group. On the basis of behavioral

observation , electrophysiological , pathological HE staining method , we verified the

reliability of the model and established mice model of human temporal lobe epilepsy .

Reverse transcription PCR method was used to detect DYRK1A mRNA expression

levels in the brain tissue of model mice.

Results: There were 34 Kunming mice, which were be induced into status epilepticus

seizures by intraperitoneal injection of lithium chloride-pilocarpine. 22 Kunming mice

were established status epilepticus (SE) and reached Racine Standard IV-V level,

excluding 12 mice, which didn’t meet Racine standards IV-V level. 5 of 22 mice died

within 24 hours and 3 of 22 mice died within 24-72 hours. In 24 hours after SE, 6

mice were randomly selected into acute epilepsy group; The remaining 8 mice were

observed within 30 days and 6 mice were selected into chronic epilepsy group;6 mice

in the control group were intraperitonealy injected by saline. They were not induced

into any seizure and didn’t die in the next 30 days. In this study , a success rate of

induced SE was 64.71% ( 22 / 34 ) , the mortality rate after SE was 36.36% (8/ 22) ;

spontaneous seizures occurred at the rate of 47.06% ( 8/ 17 ) .

Abstract

IV

Pathology HE staining : in comparison with the control group, hippocampal neurons

of epileptic group arranged irregularly and the gap between neurons increased , with

cell swelling , degeneration, necrosis, disintegration , cell body pyknosis, smaller

volume, cytoplasm condensed hyperchromatic , nucleus pycnosis, unclear nucleoli,

splitting decomposition of dead cell nuclei and cytoplasm.

EEG monitoring of epileptic mice models : in the acute phase , the outbreak of the

long-range sharp activities , sharp spike activity and slow irregular composite activity

was prominent in the background EEG activity ; in the chronic phase, scattered

frequency activities slower than the background slow activity and epileptic discharge

appeared.

In 6 control group, DYRK1A mRNA and β- actin ratio was 0.4830 ± 0.1243; in

6 acute epileptic group, DYRK1A mRNA and β- actin ratio was 0.8883 ± 0.0727;

in 6 chronic epileptic group, DYRK1A mRNA and β -actin ratio was 0.7112 ±

0.1216; The ratio differences between three groups all were statistically significant (P

<0.05). DYRK1A mRNA expression in three groups: acute cause epilepsy group >

chronic epilepsy group > control group.

CONCLUSIONS: Lithium chloride-pilocarpine can be used to induce status

epilepticus (SE) in Kunming mice. In comparison with control group, DYRK1A

expression in brain tissue of SE Kumming mice model increased.

Keywords: DYRK1A;intractable temporal lobe epilepsy;hippocampal sclerosis；

目 录

目录

中文摘要..............................................................................................I

英文摘要.............................................................................................III

第一章 前言................................................................................................1

第二章 难治性颞叶癫痫简介...................................................................3

2.1 难治性癫痫的定义.............................................................................................3

2.2 难治性颞叶癫痫的临床特点.............................................................................4

2.3 难治性颞叶癫痫的病理.....................................................................................5

2.4 难治性颞叶癫痫与海马硬化.............................................................................6

第三章 实验策略及其技术路线...............................................................7

3.1 拟解决的科学问题.............................................................................................7

3.2 研究假说............................................................................................................. 7

3.3 研究方案............................................................................................................. 7

3.4 预期目标............................................................................................................. 8

第四章 材料和方法................................................................................... 9

4.1 实验材料及试剂.................................................................................................9

4.1.1主要仪器....................................................................................................... 9

4.1.2主要试剂..................................................................................................... 10

4.2 实验方法........................................................................................................... 10

4.2.1 动物分组....................................................................................................10

4.2.2 氯化锂-匹罗卡品致痫小鼠模型的建立...................................................10

4.2.3 小鼠脑电图记录方法................................................................................ 11

4.2.4 冰冻切片的制作........................................................................................ 11

4.2.5 HE染色.......................................................................................................12

4.2.6采用 RT-PCR技术测定正常对照组、急性致痫组、慢性致痫组小鼠海马组织 mRNA的变化................................................................................................ 13

目 录

第五章 结果............................................................................................. 16

5.1 行为学观察....................................................................................................... 16

5.2 脑电图观察....................................................................................................... 16

5.3 模型成功率统计...............................................................................................17

5.4 小鼠海马组织镜下观察...................................................................................17

5.5 对照组，急性致痫组、慢性致痫组 DYRK1A mRNA的表达................... 18

第六章讨论............................................................................................... 20

第七章 结论............................................................................................. 22

参考文献....................................................................................................23

综 述 ......................................................................................................27

缩略词索引............................................................................................... 35

致谢............................................................................................................36

附录...................................................................................................37

Table of Contents

Table of contents

Abstract in Chinese.................................................................................... I

Abstract in English................................................................................III

Chapter 1 Introduction............................................................................. 1

Chapter 2 Introduction of refractory temporal lobe epilepsy.............. 3

2.1 Definition of refractory epilepsy....................................................................... 3

2.2 Clincal feature of refractory temporal lobe epilepsy...................................... 4

2.3 Pathology of refractory temporal lobe epilepsy .............................................5

2.4 Refractory temporal lobe epilepsy and hippocampal sclerosis...................... 6

Chapter 3 Experimental strategy and technology method................... 7

3.1 Scientific problems to be solved........................................................................ 7

3.2 Research Hypothesis ........................................................................................ 7

3.3 Research Programme.........................................................................................7

3.4 Research target................................................................................................... 8

Chapter 4 Materials and Methods........................................................... 9

4.1 Materials and Reagents .....................................................................................9

4.1.1 The main instruments ............................................................................... 9

4.1.2 The main reagents ................................................................................... 10

4.2 Experimental Methods.....................................................................................10

4.2.1 Animal grouping........................................................................................10

4.2.2 Kunming mice epilepsy model induced by lithium chloride-pilocarpie........................................................................................................................... ...10

4.2.3 EEG recording method in mice 17...........................................................11

4.2.4 Production of frozen sections................................................................... 11

Table of Contents

4.2.5 HE staining.................................................................................................12

4.2.6 DRYK1A mRNA expression in Control group and contrast groupMesurded by RT-PCR technique ....................................................................13

Chapter 5 Results...................................................................................16

5.1 Behavior observation of SE mice model.......................................................165.2 EEG observation of SE mice model....................................................................16

5.3 Success rate statistics of SE mice model .....................................................17

5.4 Endoscopic view of mice hippocampus ...................................................... 17

5.5 Results of DRYK1A mRNA expression in control group and contrastgroups..............................................................................................................18

Chapter 6 Discussion..............................................................................20

Chapter 7 Conclusion.............................................................................22

Reference.................................................................................................. 23

Review....................................................................................................... 27

Abbreviation Index.................................................................................35

Ackonwledgement ..................................................................................36

Appendix..................................................................................................37

第一章 前 言

1

第一章 前言

癫痫是一种神经系统常见疾病，我国约有 700万以上癫痫患者，每年新发的

病例为 65-70万，约 25%为难治性癫痫（intractable epilepsy, IE）,我国难治性癫

痫患者至少 150万以上[1]。颞叶癫痫( temporal lobe epilepsy，TLE) 是常见的一型

药物难治性癫痫，其反复发作可导致记忆力下降，生活能力缺失，死亡率增加等

一系列不良事件的发生，故深入研究难治性颞叶癫痫的发病机制意义重大。

DYRK1A是一种脯氨酸/精氨酸指导的丝氨酸/苏氨酸磷酸化蛋白激酶，正常

水平的 DYRK1A表达在神经系统发育过程中发挥着关键作用[2; 3]。然而，高表达

的 DYRK1A则可以通过磷酸化 Tau蛋白、淀粉样前体蛋白、调节细胞生长凋亡

等机制引起神经元变性、死亡、神经纤维缠结、改变突触的可塑性等病理变化，

在神经系统变性疾病起着重大的致病作用[4]。研究表明：高表达 DYRK1A可通

过磷酸化 Thr212,Ser 202,Ser 404等位点诱导 Tau蛋白磷酸化，促使 Tau蛋白酸

化，促使 Tau 蛋白生物活性下降和自我聚合及纤维化在糖原合酶激酶-3β

（Glycogen Synthase Kinase -3β）、ATK和 SRp55的参与下，导致异常过度磷

酸化 Tau蛋白，一方面，可导致 Tau蛋白微管组装功能丧失和隔离正常的 Tau

蛋白及其它微管相关蛋白[5-8]；另一方面，可诱导 Tau蛋白自我聚合形成神经纤

维缠结[5]。最终导致神经元变性、死亡、改变突触可塑性。不仅如此，神经病理

学和分子生物学研究表明：细胞核高度表达 DYRK1A可通过磷酸化 Ser227、

Ser234和 Ser238位点导致可变性剪切因子外显子 10缺陷，从而改变可变性剪切

因子在细胞核内的分布，选择性促使 3R-Tau蛋白水平增高[7]。而维持正常的神

经功能需相等水平的 3-Tau蛋白和 4-Tau蛋白[9]，这种异常的 3R/4R Tau蛋白比

例可以改变细胞骨架和形成神经系统变性的病理改变。神经系统变性疾病后期往

往都是伴随癫痫发作，从病理改变角度看，海马硬化与神经系统变性疾病均有神

经元变性、坏死、突触重塑等病理改变，这些似乎提示神经系统变性疾病与癫痫

存在某种内在联系。通过研究难治性颞叶癫痫患者海马组织表明：海马硬化中可

见高表达磷酸化的 Tau蛋白，磷酸化的 Tau蛋白可通过诱导苔藓纤维异常生长，

形成苔藓纤维的出芽，并与下位突触形成新的突触联系导致突触重塑参与难治性

癫痫的发生发展[10]。此外，DYRK1A 过表达也参与与脑组织中网络结构的重塑。

第一章 前 言

2

同时，DS患者也伴随有癫痫的发作，难治性颞叶癫痫患者也存在记忆力下降，

智能改变等，这两种疾病有一些共同的临床表现。目前国内外关于 DYRK1A的

研究主要集中在其对神经变性疾病的致病作用，包括阿尔海默病、Down综合征

和 Pick病等[11; 12]，关于其在癫痫中的报道仍未看到。因此，我们推测 DYRK1A

表达可能与癫痫的发病机制有一定的关系。本研究从 mRNA水平来检测颞叶癫

痫模型小鼠脑组织中 DYRK1A表达，在癫痫发作的不同时间点研究颞叶癫痫小

鼠模型中脑组织 DYRK1A 的 mRNA表达情况。

第一章 前 言

3

第二章 难治性颞叶癫痫简介

2.1 难治性癫痫的定义

癫痫( epilepsy) 是中枢神经系统常见慢性疾病，临床以反复发作性、短暂性、

刻板性的中枢神经系统功能丧失为特征，其电生理表现为脑部神经元过度同步放

电，每次发作称为痫样发作[13]。癫痫患者总体预后良好，用目前的治疗方法，人

类能够控制 80%左右的癫痫发作。通过 3-5年的努力，大多数患者停药或者减量

以后可以终身不再发病，但仍有 20%左右的癫痫患者对目前的治疗无效，这部分

癫痫称为难治性癫痫。广义的难治性癫痫指用目前所有的治疗方法“仍然不能阻

止其继续发作的癫痫”或“与治疗前比较发作没有明显减少的癫痫”；狭义的难

治性癫痫指耐药性癫痫。本文中所提到的难治性癫痫，一般为狭义的概念。难治

性癫痫( refractory epilepsy),也称为顽固性癫痫( intractable epilepsy):是指临床经

过迁延、对抗癫痫药物( AEDs)治疗反应差的一组癫痫病人，即 3 种一线药物采

用“最理想”的剂量单独或合并使用 2 年以上仍有癫痫发作[14]。难治性癫痫约

占癫痫治疗人数的 20% ～ 30%。难治的癫痫按其难治的程度可分为: I 型: 用 3

种以上一线抗癫痫药物单用，在有效治疗期间，合理治疗，仍有发作或已被实践

证实是耐药的癫痫和癫痫综合征;Ⅱ型: 用 3 种以上一线抗癫痫药物单和联合用

药，在有效治疗期间，合理治疗，仍有发作或已被实践所证实是耐药的癫痫或癫

痫综合征; III型: 用目前抗癫痫药物，在有效治疗期间，合理用药，仍有发作或

已被实践证实是耐药的癫痫和癫痫综合征”[15]。临床上将难治性癫痫分为医源性

及真正难治性两种。前者是由于医生诊断错误、癫痫发作分型不正确、未选用合

适的抗癫痫药物治疗或虽选药正确但剂量不足等因素，导致癫痫发作未能控制;

后者指诊断正确，选药合适、剂量及血药浓度适宜但癫痫仍反复发作[16]。我国每

年新诊断的难治性癫痫患者 20 万～100 万，因预后差、常伴精神运动智能障碍、

致残率和致死率高，严重威肋着患者身心健康和生活质量[17]。在儿童，大多数难

治性癫痫属于 Lennox-Gastaut 综合征、婴儿痉挛、婴儿严重肌阵挛癫痫、大田

原综合征以及其他由于弥漫性脑损害、进行性脑退化性疾患或低癫痫阈值区的结

第一章 前 言

4

构性脑损害伴发癫痫。在成人，一份欧洲的调查发现,难治性癫痫发病原因依次

是海马硬化 (HS:33.7%),长期癫痫相关性肿瘤 (LEAT:25.1%),皮质发展畸形

(MCDs:15.5%),血管畸形(5.7%),双重病理性疾病(5.2%),神经胶质疤痕(4.9%)和脑

炎(1.6%),以及没有病变(8%)[18]。目前认为颞叶内侧硬化引起的发作常常为“难治

性”，频繁的临床发作特别是全身强直阵挛发作也提示治疗的预后差，易发展为

难治性癫痫。

2.2 难治性颞叶癫痫的临床特点

颞叶癫痫( temporal lobe epilepsy，TLE) 是常见的一型药物难治性癫痫，约

占药物难治性癫痫的 60% ～ 80% 左右。随着电生理技术的进步, 1989年,国际

抗癫痫联盟分类框架分为两个亚型:颞叶内侧癫痫（MTLE)和颞叶外侧(LTLE)。

自 1993年“MTLE综合症”的建议[19],它已经被广泛的研究和普遍接受。然而,

研究“LTLE综合症”仍质疑。颞叶癫痫具有异质性。癫痫发作均起源于同一部

位（颞叶），但是不同的类型有不同的病因、 发病年龄、预后以及对药物或手

术治疗的反应。根据解剖学定位和发作起源于颞叶外侧或内侧，广义上颞叶癫痫

分为两类，即内侧颞叶癫痫和外侧颞叶癫痫，而内侧颞叶癫痫（占 2/3）比外侧

颞叶癫痫更常见，其中海马性癫痫是最常见的类型，很可能构成具有明确病理的

一种疾病而不是一个综合征，其他内侧型或者外侧型颞叶癫痫的病因包括良性或

恶性肿瘤、病毒感染、其他感染和寄生虫病、脑血管病，皮质发育畸形，外伤以

及其他脑损伤等[20]。同时，还有特发性和遗传性颞叶癫痫。通常可以通过发作的

表现区别内外侧颞叶癫痫，但脑内其他部位起源的发作由于传导到颞叶，也可表

现为类似的症状。国际抗癫痫联盟建议将颞叶癫痫分为：边缘叶癫痫和新皮质癫

痫（即外侧颞叶癫痫）；边缘叶癫痫可分为伴海马硬化的内侧颞叶癫痫和根据特

定病因确定的内侧颞叶癫痫。目前认为伴有海马硬化的内侧颞叶癫痫

（MTLE-HS）是最常见的难治性颞叶癫痫。近些年，随着癫痫外科技术的开展，

MTLE-HS的研究报道越来越多，但这些报道大多来源于药物难治性的病例，所

以可能并不能代表完整的颞叶癫痫。

MTLE-HS的临床特征包括早期的刺激性损伤史（通常为复杂的发热性惊厥,

中枢神经系统感染或头伤),紧跟其后的一个持久的潜伏期,最后是难治性慢性癫

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