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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Servicio de Microbiología Alimentaria

JORNADAS DE REFERENCIA

ANÁLISIS DE ALIMENTOS

5-7 junio 2013

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE

ALIMENTOS. ACTIVIDADES DE

REFERENCIA.

Mª Carmen Blanco Vidal Jefe del Servicio de Microbiología Alimentaria

Mª Jesús Zamora Escribano Facultativo Especialista

David Pérez Boto Carmen Zigorraga

Laboratorio de Salud Pública de Gipuzkoa

Juan Olmedo Mendicouague Jefe de Sección de Parasitología y Técnicas Especiales

Inmaculada García Laboratorio Normativo de Salud Pública del Gobierno Vasco

Actividades de referencia en el control microbiológico de alimentos. PONENTE: Mª Carmen Blanco Vidal

Nuevas tendencias en las normas ISO relacionadas con el control microbiológico de alimentos. PONENTE: Mª Jesús Zamora Escribano

Tipificación molecular de gérmenes patógenos mediante la técnica de electroforesis en campo pulsado (PFGE). PONENTE: David Pérez Boto

Ejercicios de intercomparación. PONENTE: Carmen Zigorraga

Actividades de referencia para parásitos de origen alimentario. PONENTE: Juan Olmedo Mendicouague

Programa de seguridad microbiológica de la C. A. del País Vasco. PONENTE: Inmaculada García

PROGRAMA 2013

SERVICIO DE MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA

Actividades de referencia en el control microbiológico de alimentos

Ponente: Mª del Carmen Blanco Vidal

PARTICIPACIÓN EN EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN 2012-2013 ORGANIZADOS

POR LR-UE

1. LR-UE Campylobacter

2. LR-UE Salmonella

3. LR-UE E.coli (VTEC)

5. LR-UE contaminantes bacteriológicos

de moluscos bivalvos

6. LR-UE Listeria monocytogenes

7. LR-UE Enterotoxinas estafilocócicas

4. LR-UE Parásitos

ORGANIZACIÓN DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN POR EL CNA EN

2012

Ejercicios de Intercomparación: 8 Nº TOTAL DE LABORATORIOS

PARTICIPANTES

E. coli y Salmonella en moluscos 30

Investigación de Salmonella spp. 43

Investigación de Listeria monocytogenes 40

Recuento de Listeria monocytogenes 40

Recuento de Estafilococos coagulasa positivo 41

Recuento de gérmenes aerobios 41

Investigación de Trichinella spp. 27

Investigación de Enterotoxinas estafilocócicas 15

Organización de Ejercicios de Intercomparación de recuento (NMP) de E.

coli en moluscos

LNR Contaminantes bacteriológicos de moluscos bivalvos. I

Nº laboratorios participantes

MUESTRA A

MUESTRA B

2006 ( Donovan)

24 75% 79%

2007 (Donovan)

27 63% 89%

2009 (ISO 16649-3)

25 80% 81%

2010 (ISO 16649-3)

24 83.3% 75%

2011 (ISO 16649-3)

28 71.4% 71.4%

2012 (ISO 16649-3) 25 92% 100%

ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS PARTICIPANTES

TOTAL (25 laboratorios)

Acreditados por ISO/TS 16649-3:2005 5 laboratorios (4 laboratorios en 2011)

Acreditados por Procedimiento Interno

8 laboratorios

No Acreditados 12 laboratorios (16 laboratorios en 2011)

LNR Contaminantes bacteriológicos de moluscos bivalvos. II

1 laboratorio acreditado

3 laboratorios no participan

Organización de Ejercicio de Intercomparación de recuento (NMP) de E. coli

en moluscos 2012 (ISO 16649-3)

Organización de Ejercicios de Intercomparación de Salmonella en moluscos (

NORMA ISO 6579)


% resultados satisfactorios

2006 24 100 %

2007 27 100 %

2009 30 97%

2010 24 96%

2011 31 100 %

2012 26 100%

LNR Contaminantes bacteriológicos de moluscos bivalvos. III

Organización por el CNA - VII Ejercicio de Intercomparación

Año Nº

laboratorios participantes

Tipo de alimento

% resultados satisfactorios

2006 47 P. Cárnicos 98%

2007 53 Leche 96 %

2008 53 P. Cárnicos 100 %

2009 49 Leche 100%

2010 39 P. lácteos 97,4%

2011 46 P. lácteos 100%

2012 43 P. lácteos 100%

LNR Salmonella spp

Métodos utilizados por los 43 Laboratorios participantes en el Ejercicio

de Intercomparación Salmonella spp. 2012

LNR Salmonella spp

NORMA ISO 6579 33

P.I. BASADO EN NORMA ISO 6579 2

ISO + PCR BAX 2

ISO + VIDAS 2

MÉTODO VIDAS 2

NO INFORMAN 2

TOTAL 43

CNA. Organización de Ejercicios Intercomparación

2006 2007 2009 2010 2011 2012

Tipo de muestra

Productos

lácteos

Productos lácteos (GSC)

Productos Lácteos (GSC)

Productos Lácteos

Productos Lácteos

Productos

Lácteos


42 51 48 34 43 40

Muestras Resultados

2006 Resultados

2007 Resultados

2009 Resultados

2010 Resultados

2011 Resultados

2012

A 95 %

satisfactorios 100%

satisfactorios 97,9 %

satisfactorios 91,2%

satisfactorios

97,8 %

satisfactorios

100% satisfactorios

B 100 %

satisfactorios 100 %

satisfactorios 100 %

satisfactorios

VI E.I. Detección de Listeria monocytogenes

ESTADO DE ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS

PARTICIPANTES E.I. 2012 Listeria monocytogenes

LNR Listeria monocytogenes

Detección de Listeria monocytogenes (40 Participantes)

IMPLANTADO ACREDITADO

NORMA UNE-EN-ISO 11290-1 5 5

PROCEDIMIENTO INTERNO BASADO EN NORMA UNE-EN-ISO 11290-1 6 18

OTROS MÉTODOS (VIDAS, ALOA ONE DAY) 2 4

TOTAL 13 27

CNA. ORGANIZACIÓN DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN

2010 2011 2012

Número de Laboratorios participantes

26 44 40

Resultados Satisfactorios 24 (92,3 %) 39 (88,6%) 31 (77,5%)

Resultados Cuestionables 1 (3,8 %) 2 ( 4,5%) 3 (7,5%)

Resultados No Satisfactorios 1 (3,8 %) 3 (6,8%) 6 (15%)

E.I. Recuento de Listeria monocytogenes

ESTADO DE ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS

PARTICIPANTES E.I. 2012 Listeria monocytogenes

LNR Listeria monocytogenes

Recuento de Listeria monocytogenes (40 Participantes)


NORMA UNE-EN-ISO 11290-2 8 4

PROCEDIMIENTO INTERNO BASADO EN NORMA UNE-EN-ISO 11290-2 7 16

OTROS MÉTODOS (ALOA COUNT, Rapid L.

mono) 1 4

TOTAL 16 24

LNR ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVO

CNA. ORGANIZACIÓN EJERCICIO INTERCOMPARACIÓN Recuento Estafilococos coagulasa positivo

(Norma ISO 6888)

2010 2011 2012

Número de Laboratorios participantes.

38 43 41

Resultados Satisfactorios 31 (81,6 %) 42 ( 97,7%) 41 (100%)

Resultados No satisfactorios

7 (18,4 %) 1 (2,3%) 0 (0%)

ESTADO DE ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS DE

CONTROL OFICIAL. CUESTIONARIO 2013

Recuento de Estafilococos coagualasa positivo


NORMA UNE-EN-ISO 6888 10 15

PRODECIMIENTO INTERNO BASADO EN NORMA UNE-EN-ISO 6888 9 12

TEMPO 0 1

AFNOR V 08 057 0 2

Otros métodos 3 0

TOTAL 22 30

LNR ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVO

ACREDITACIÓN DE LOS LABORATORIOS PARA DETECCIÓN DE ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS

LNR ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS

MÉTODOS Nº

LABORATORIOS ACREDITADOS

Nº LABORATORIOS

NO ACREDITADOS

Método del LR-UE v5 VIDAS 5 2

RIDASCREEN 1 1

Protocolo VIDAS BioMrieux 1 5

7 8

Recuento de aerobios mesófilos

CNA. ORGANIZACIÓN EJERCICIO INTERCOMPARACIÓN Recuento de aerobios mesófilos totales a 30ºC

(método, Norma ISO 4833)

2010 2011 2012

Número de Laboratorios 37 44 41

Resultados Satisfactorios 36 (97,3 %) 43 ( 97,7%) 38 (92,7%)

Resultados No satisfactorios

1 (2,7 %) 1 (2,3%) 1 (2,3%)

2012 Misión DG SANCO 2012/6431: Producción y comercialización de carne de ave de corral y derivados. 5 marzo 2012

Misión DG SANCO 2012/6335: Evaluar los controles oficiales en preparados para lactantes,

preparados de continuación y alimentos infantiles, incluida la cadena de suministro. 16 abril

2012.

Misión DG SANCO 2012/6368: Control sobre criterios de seguridad alimentaria y de Higiene de

los Procesos (Reglamento 2073/2005). 26 noviembre - 7 diciembre 2012.

2013 Misión DG SANCO 2013/6672: Control sobre Productos de la Pesca y Agua de Bebida. 21 mayo -

31 mayo 2013.

FVO Misión DG (SANCO) 2013/6837. Perfil País. 30 de mayo 2013.

VISITAS INSPECCION: FVO- DG SANCO

ORGANIZACIÓN DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN PREVISTOS PARA

EL 2013

EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN Nº TOTAL DE LABORATORIOS

SOLICITANTES

E. Coli y Salmonella en moluscos 32

Investigación de Salmonella spp. 50

Investigación de Listeria monocytogenes 42

Recuento de Listeria monocytogenes. 41

Recuento de gérmenes aerobios 39

Recuento de Estafilococos coagulasa positivo 49

Investigación de Trichinella spp. 29

Investigación de Enterotoxinas estafilocócicas 16

LABORATORIOS DE CONTROL OFICIAL. Reg (CE). 882/2004

Métodos analíticos de referencia. Anexo I- Reg (CE). 2073/2005

Laboratorios acreditados conforme a la Norma ISO 17025

Participación en ejercicios de intercomparación

LNR: Seguimiento adecuado de los participantes en los ejercicios de intercomparación

MODIFICACIONES DEL REGLAMENTO 2073

•Fresas congeladas: Origen China. Norovirus y Hepatitis A •Hojas de cilantro, albahaca, menta: Origen Tailandia. Salmonella

Reglamento de ejecución (UE) nº 1235/2012 de la Comisión de 19 de diciembre de 2012 . Intensificación de los controles oficiales de las importaciones de piensos de origen animal

• E. coli STEC: ISO/TS 13136:2012

• Salmonella

Reglamento (UE) nº 209/2013 de la Comisión de 11 de marzo de 2013. Criterios microbiológicos para los brotes y las normas de muestreo para los canales de aves de corral y la carne fresca de aves de corral

NUEVAS NORMAS ISO PARA PATÓGENOS EN ALIMENTOS

Vibrio

• ISO/TS 21872-1:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. Part 1. Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholera.

ISO/TS 21872-2:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. Part 2. Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholera.

E. coli VTEC / STEC

• ISO/TS 13136:2012. Microbiology of food and animal feed. Real time polimerasa chain reaction (PCR) based method for the detection of food-borne pathogen. Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O103 and O145 serogroups.

Virus

• ISO/TS 15216-1:2013. Microbiology of food and animal feed. Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. Part 1: Method for quantification.

• ISO/TS 15216-2:2013. Microbiology of food and animal feed. Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. Part 2: Method for qualitative detection.


Nuevas tendencias en las normas ISO relacionadas

con el control microbiológico de alimentos

PONENTE: María Jesús Zamora Escribano

NOMENCLATURA

• 3 subtipos

• Stx1a, Stx1c, Stx1d Stx1

• 7 subtipos

• Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, Stx2g

Stx2

Se establecen dos tipos de Shiga-toxinas Stx o Verotoxinas VTX

Ejercicios intercomparación LRUE

Número

Ejercicio Año Muestra Objetivo Resultado

1º 2007 Cepas Estudio genes virulencia Satisfactorio

2º 2008 Cepas Estudio genes virulencia Satisfactorio

3º 2009 Esponjas muestras de

superficie

Estudio genes virulencia y

principales serogrupos Satisfactorio

4º 2010 Leche Estudio genes virulencia y


5º 2010 Cepas Estudio genes virulencia y


6º 2011 Cepas SUBTIPADO Satisfactorio

7º 2011 Espinacas frescas Estudio genes virulencia y


8º 2012 Agua Estudio genes virulencia y


9º 2012 Semillas Estudio genes virulencia y


Modificaciones relativas STEC/VTEC

Publicación en Nov. de 2012 de la Norma ISO/TS 13136 : 2012

Microbiology of food and animal feed Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens.

Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups.

Modificación del Reglamento (EC) Nº 2073/2005 marzo de 2013 -1 de julio de 2013

Matriz Brotes semillas. Productos durante su vida útil

Ausencia en 25 gramos

E. coli (STEC/VTEC) productor de Shiga toxinas O157, O26, O111, O103, O145 y O104:H4

CEN/ISO TS 13136 y procedimiento del Laboratorio de Referencia de la Unión

Europea para Escherichia coli Verotoxigenica (VTEC), para detectar el serotipo O104:H4. )

Norma ISO 13136

Es una norma que se aplica para la detección de E.coli STEC/VTEC : Productos destinados a consumo humano y la alimentación de animales Muestras ambientales en el área de manipulación y producción alimentaria

Muestras ambientales en el área de producción primaria.

Norma ISO 13136

OBJETIVO : La detección de los genes de virulencia que codifican las Stx asociados a E.coli STEC/VTEC : stx1 y stx2. La detección se realiza mediante Tiempo Real. La detección de los genes asociados a los principales serogrupos asociados a E.coli STEC/VTEC :O157, O111, O26, O103 y O145 y el gen que codifica la intimina, eae. La detección se realiza mediante Tiempo Real. Confirmación del resultado de las colonias aisladas de aquellas muestras con resultado stx positivo y/o alguno o algunos de los otros genes descritos en el método.

1. Enriquecimiento de la muestra

2. Extracción del ácido nucleico

3. Detección de los genes de virulencia

4. Detección de los genes del serogrupo (5)

5. Aislamiento de E.coli VTEC/STEC de las

muestras con resultado stx positivo

FASES DEL MÉTODO

1. Fase de enriquecimiento

Para muestras con elevada cantidad de flora

acompañantente TSB + Acriflavina/Novobiocina

Para muestras con bacterias estresadas APT

Se incuban las muestras entre 18-24 h/37

C

1

C

FASES DEL MÉTODO

FASES DEL MÉTODO

2. Fase de Extracción del ADN

Del sobrenadante del cultivo centrifugado se realiza la

extracción el ADN de las muestras y de los controles. La

extracción se realiza empleando un Kit comercial.

Los controles empleados son los obtenidos de cepas

positivas para cada uno de los genes analizados, una

cepa negativa y un control interno de amplificación.

3 y 4. Detección de los genes mediante tiempo real

Amplificación empleando primers y

sondas específicas para detectar el

ADN presente en la muestra

Interpretación de los resultados

FASES DEL MÉTODO

ESQUEMA DE PROCEDIMIENTO de SCREENING

Muestra g / ml

9 x ml TSB + N/A

APT

Enriquecimiento 18 h-24h a 37 °C ± 1 °C

Porción del cultivo (1ml), purificación de DNA y PCR tiempo real de los genes stx y eae

Aislamiento de las colonias

Pos para stx

Neg stx Pos para stx y eae. Estudio serogrupo

CONFIRMACIÓN

ESQUEMA PROCEDIMIENTO DE CONFIRMACIÓN

Aislar las colonias en medio sólido desde el medio de enriquecimiento

Seleccionar 50 colonias típicas de E.coli y hacer pooles de 10 colonias

PCR Tiempo Real para detectar stx y eae

Seleccionar colonias positivas y analizar cada una por PCR tiempo real de los genes stx y eae

Identificación de las colonias positivas y determinación del serogrupo (PCR o aglutinación)

RESULTADO FINAL LRUE

Interpretacion de los resultados

• Muestras negativas no se ha detectado la presencia de los genes stx en la muestra analizada.

• Muestras sospechosas o presuntamente positivas aquellas muestras en la que no se han aislado las colonias pero se ha detectado:

La presencia de los genes stx

La presencia de los genes stx y eae

La presencia de los genes stx , eae y uno de los 5 serogrupos estudiados.

• Muestras positivas aquellas muestras que resultan positivas para stx en el screening de PCR y se han aislado las colonias. Pueden ser:

Positivas para los genes stx

Positivas para los genes stx y eae

Positivas para los genes stx, eae y uno de los 5 serogrupos estudiados.

RESULTADOS

Gen Limite detección

Nºcopias/reacción Sensibilidad %

stx1 5 94,7

stx2 5 94

rfbE / O157 1 94,2

wbdI / O111 5 94

Wzx / O26 5 97,7

Ihp / O145 5 99,6

SENSIBILIDAD Y LÍMITE DE DETECCIÓN


Tipificación molecular de gérmenes patógenos

mediante la técnica de electroforesis en campo

pulsado (PFGE)

PONENTE: David Pérez Boto

Tipificación de microorganismos

Métodos de tipificación disponibles •Fenotípicos: Basados en características expresadas por las bacterias: serología, fagotipificación, biotipificación,…

•Genotípicos: Basados en características del material genético (secuencia)

Definición: Caracterización de la variación intraespecie. Permite la diferenciación

de aislamientos dentro de una misma especie.

Van Belkum 2007 Clin. Microbiol. Infect

Tipificación de microorganismos

Características de los métodos de tipificación 1. Tipabilidad: Proporción de cepas que pueden ser asignadas a un tipo por un

método determinado 2. Poder de discriminación: Capacidad de discriminar entre cepas no relacionadas 3. Reproductibilidad: Proporción de cepas tipificadas de la misma forma tras

ensayos repetidos 4. Concordancia epidemiológica: Congruencia con los datos epidemiológicos

existentes 5. Automatización: Reducción de errores en los métodos

Idéntico material

genético

Variaciones: •Mutaciones

•Inserciones

•Deleciones

•Recombinaciones

Métodos genotípicos disponibles:

•Basados en tamaños de fragmentos de

ADN (tipo fingerprint):

PCR-RFLP, RAPD, AFLP, PFGE,..

•Basados en la secuencia del ADN:

MLST, MLVA, secuencia genes

individuales (porA, flaA, etc..)

Cepa parental

División binaria

Métodos genotípicos

Comparación de dos cepas

PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis. 1983 Schwartz y Cantor

ADN: Carga negativa

Electroforesis convencional: No

podemos resolver entre

fragmentos de más de ~50 Kb

PFGE: La dirección del campo eléctrico aplicado

en la electroforesis no es unidireccional, sino

que experimenta variaciones en su orientación

en periodos de tiempo (pulsos) que aumentan

progresivamente con el tiempo

ADN

http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/method/PFGE_animated.gif

http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/method/PFGE_animated.gif

Genoma intacto (sin cortes)

•Lisis bacteriana

•Lavados

Suspensión bacteria Matriz de

agarosa

Enzima de restricción:

Cortes en el ADN (sitios

poco frecuentes)

Cultivo puro

Tinción ADN.

Captura de

imagen y

análisis

Separación de

fragmentos

Electroforesis

16-30 horas

Esquema general del método de PFGE

Pulsotipos

Lisozima

Proteinasa K

Generación de fragmentos de ADN genómico

de tamaños 20-600 Kb.

10-30 bandas

Análisis de los pulsotipos que se generan en la técnica de PFGE

Aislamiento de

Listeria

monocytogenes

Ejemplo práctico de uso de PFGE

•Pruebas bioquímicas

•Serotipificación (Aglutinación o PCRm)

Serotipado: Todas 1/2a

¿Es la cepa aislada en el

enfermo, en la comida y en el

lugar de procesado del

alimento la causante?

No podemos afirmarlo hasta

tipificar genotipicamente la

cepa …


Tipificación por PFGE

A

B

C

A B C M

100% semejanza


Tipificación por PFGE

A

B

C

A B C M Cepas A y B:

alimento y sitio

de procesado:

100% semejanza

Cepa C

(enfermo): No

guarda relación

con las

anteriores. El

alimento no es

causante de la

listeriosis


Ventajas:

•Elevado poder de discriminación

•Reproductibilidad alta

•Elevada tipabilidad. Utilidad en brotes

•Aplicable a la mayoría de bacterias

•Screening completo del genoma

Desventajas:

•Duración del método

•Poca automatización. Múltiples pasos

•Discriminación no es absoluta

•Equipamiento/Coste

•Comparación interlaboratorios

Conclusiones

Ventajas y desventajas de la técnica de PFGE frente a otros

métodos de tipificación


Ejercicios de intercomparación

PONENTE: Carmen Zigorraga


Actividades de referencia para parásitos de origen alimentario

PONENTE: Juan Olmedo Mendicouague

•Envío de Material de Referencia a los Laboratorios de Control Oficial. •Confirmación y aislamiento de muestras de suidos y équidos positivas a triquina y tipificación molecular de las mismas. •Participación en los Ejercicios de Intercomparación organizados por el LCR para parásitos. •Organización del tercer Ejercicio de Intercomparación de triquina en España. •Asistencia y participación en el Workshop anual de los LNRs organizada por el LCR en Roma. •Validación de nuevo método de detección de Anisakis mediante digestión clorhidropépsica.

Actividades del LNR para zoonosis parasitarias transmitidas por

los alimentos

Jornadas de Referencia. CNA. 2013. Majadahonda. Madrid

Resultados del ejercicio de intercomparación de detección de larvas de triquina

mediante el método de referencia Reglamento CE 2075/05

• Laboratorios participantes: 27

• Muestras de carne picada de cerdo cargadas con larvas vivas.

• 5 muestras por envío: 1 sin cargar y 4 cargadas.

• Evaluación del ejercicio cualitativa.

• Resultados correctos 24 laboratorios.

• Falsos negativos: 2 laboratorios.

Brotes y casos de triquinelosis humana en España (CNE)

AÑO BROTES CASOS HUMANOS

2008 1 43

2009 4 18

2010 2 17

2011 3 33

2012 2 23

• Resultados :

• Total: 22 muestras (jabalíes)

• No detectado: 2 muestras

• T. spiralis: 11 muestras

• T. britovi: 9 muestras

Confirmación, aislamiento y tipificación de muestras de Trichinella 2010 por Multiplex PCR


Foto: Gabriel Jiménez

• Temporada de caza 2006-07: 171 muestras





Publicación Ley 17/2011 de 5 de julio de seguridad alimentaria y nutrición




Resumen muestras analizadas por LNR para el aislamiento e identificación de larvas de triquina a nivel de especie

Gracias por su atención

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