EXPOSICIÓN

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO

A) MEDIDAS DE MASA BACTERIANA

Determinación Del Peso Húmedo

Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de

las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de

muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y

contribuye al peso total de la masa.

La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células

bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el

5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso

húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular

luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos

(como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden

atravesar las paredes bacterianas.

Se utiliza una centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se

determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía

depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del

empaquetamiento, etc.

Determinación Del Peso Seco

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una

suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso

constante.

Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del

orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias.

Método de cuantificación utilizado en cultivos de gran densidad sobre todo para hongos y

levaduras, como los cultivos se someten a varios procesos (filtración, lavado, secado) se

pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación.

La desventaja de éste método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse

por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede

recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad

relativa alta.

2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser

pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen

representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es

difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg

de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

Método Turbidimétrico

La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada

o transmitida a través de un cultivo bacteriano.

Cuantas más células estén presentes, mayor será la luz dispersada, y por lo tanto mayor

será la turbidez.

La dispersión de la luz es proporcional a la masa del cultivo.

Un método muy rápido y útil de obtener estimaciones del número de células son las

medidas de turbidez.

La turbidez puede medirse con aparatos como el nefelómetro.

Nefelómetro: Es un instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido. Esto lo

hace empleando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente

luminosa. La densidad de partículas es entonces una función de la luz reflejada por las

partículas a la fotocelda.

Cuanta más luz se refleje en una determinada muestra mayor será la densidad de

partículas. La densidad de partículas depende de las propiedades de las partículas como

su forma, color y reflectividad.

La unidad de turbidez para un nefelómetro calibrado se llama Unidad de Turbidez

Nefelométrica, NTU o UTN.

Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente

calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen

1% de BaCl2 + cantidades crecientes de H2 SO4al 1%, por lo tanto en cada tubo se

origina un precipitado de Ba SO4, el que da origen a la turbidez, la cual se relaciona con

un número de células/ mL.

Inconveniente: es un método poco preciso, que sólo se emplea cuando no hace falta

exactitud. Ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.

MEDICIÓN DE LA TURBIDEZ: MÉTODOS ESPECTOFOTOMÉTRICOS

TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% u.f.c/ml

1 0,1 9,9 3,0x108

2 0,2 9,8 6,0x108

3 0,3 9,7 9,0x108

4 0,4 9,6 1,2x109

5 0,5 9,5 1,5x109

6 0,6 9,4 1,8x109

7 0,7 9,3 2,1x109

8 0,8 9,2 2,4x109

9 0,9 9,1 2.7x109

10 1,0 9,0 3,0x109

B) MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS

1. Recuento Total De Células

El número de células de una población se puede determinar contando una muestra con el

microscopio mediante el método de recuento directo, el cual se puede hacer de dos formas:

- En muestras secas sobre el porta o

- En muestras líquidas.

Con las muestras se deben usar cámaras de conteo especiales, como la Cámara De Recuento De

Petroff-Hauser, que son portas excavadas modificados, sobre cuya superficie de vidrio está

marcada una rejilla con pequeños cuadrados de área conocida.

Cámara De Recuento De Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una

graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

- Excavación con 0.02 mm de profundidad

- Área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes.

- Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.

- O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

Tipo de cuadro

Area

[cm2]

Volumen

[ml]

Factor

[1/Volumen]

Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104

Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106

Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del

microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas. Se anota el

número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de

establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml

Este método tiene la ventaja de ser muy rápido y económico.

El recuento directo por microscopia es un método rápido para conocer el número de células,

pero presenta ciertas limitaciones:

No se distinguen células vivas de las muertas.

Las células que son pequeñas son difíciles de ver en el microscopio y algunas se pueden perder

en el microscopio.

Si una suspensión tiene menos de 106 células bacterianas por mililitro es posible que no se

vean bacterias en el campo del microscopio.

2. Recuento De Células Viables

Una célula viable es aquella capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia.

El método que usualmente se utiliza para realizar una determinación de células viables se

basa en contar el número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un

medio sólido adecuado.

Por esta razón el recuento de células viables también se llama “Recuento en placa o recuento

de colonias”.

En este recuento se supone que cada célula viable puede formar una colonia.

Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para células viables: el método de extensión en

placa y el método de vertido en placa.

En el método de extensión en placa

- Un cierto volumen de cultivo diluido, que no suele ser superior a 0.1 ml, se extiende sobre

la superficie de una placa con medio sólido utilizando una asa estéril de extensión.

- La placa se incuba después hasta que aparecen las colonias y se cuenta su número.

- Para esto es importante que la superficie del medio este seca, de modo que el líquido de la

muestra se pueda absorber.

- No se suelen usar volúmenes mayores de 0,1 ml porque el exceso de líquido no es

absorbido, y puede ser la causa de que las colonias se unan al formarse, dificultando su

recuento.

En el método del vertido en placa o método de vaciado en placa

- Se pipetea un volumen conocido (normalmente 0,1-1,0 ml) de cultivo en una placa petri

estéril

- Sobre la que se añade el medio con agar fundido y se mezcla bien mediante un suave

movimiento giratorio de la placa sobre la superficie de la mesa, antes de dejar que se

solidifique.

- Como la muestra se mezcla con el medio fundido, se pueden usar volúmenes de inoculo

mayores que en el método de recuento por extensión.

- Sin embargo, para poder hacer uso de este método, el organismo que se cuenta debe ser

capaz de resistir brevemente la temperatura del agar fundido a 45ºC, sin perder su

viabilidad.

3.

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Dilución De Las Suspensiones Celulares Antes De La Siembra En La Placa

En los métodos anteriormente mencionados, es importante que el numero de colonias que

aparezcan en las placas no sea demasiado grande, ya que en placas muy atestadas algunas

colonias se podrían fusionar, provocando cálculos erróneos. También es importante que el

numero de colonias no sea demasiado bajo para que el cálculo sea estadísticamente significativo.

En la práctica, el número de colonias por placa oscila entre 30 y 300.

Para obtener el número apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra.

Como raramente se sabe de antemano el número de células viables, normalmente se hace más

de una dilución. Es común usar varias diluciones decimales de la muestra.

Para hacer una dilución de 10-1 se mezclan 0,5 ml de la muestra con 4,5 ml de diluyente o 1

ml de la muestra con 9 ml del

diluyente. Si se necesita una

dilución de 10-2, se puede mezclar 0,05 ml de la muestra con 4,95 ml del diluyente o 0,1 ml

con 9,9 ml.

Por otra parte, una dilución 10-2 se puede hacer de modo seriado haciendo sucesivamente dos

diluciones de tipo 10-1.

En la mayoría de casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la dilución final

que se desea, por ejemplo si se requiere una dilución 10-6, se puede lograr haciendo tres

diluciones sucesivas de 10-2 o seis sucesivas de 10-1.

El líquido usado para hacer las diluciones es importante y lo mejor es que sea idéntico al

líquido utilizado para preparar el medio solidificado, aunque por economía, es posible usar

soluciones estériles de sales inorgánicas o un amortiguador de fosfatos.

Cuando se hacen diluciones es importante que se utilice una pipeta diferente para cada

dilución, aun cuando sea de la misma muestra.

8.4.4 Recuento directo

Un recuento directo es un recuento de las células individuales de una población microbiana. El recuento

directo puede hacerse visualmente, utilizando un microscopio y un porta especial denominado cámara de

recuento. Existen muchos tipos de cámaras de recuento, pero la cámara de Petroff-Hauser, llamada así

en honor de los que la desarrollaron, tal vez sea la más utilizada en los laboratorios de microbiología

(Figura 8.8). Todas las cámaras de recuento poseen una profundidad conocida y tienen marcados unos

cuadrados de dimensiones también conocidas. De esta manera, cada cuadrado que observamos al

microscopio representa un volumen determinado de líquido; por ejemplo, un microlitro (0,001 µl). Se

puede calcular cuántas células están presentes en 1 ml o en cualquier otro volumen del cultivo, contando

las células de varios cuadrados y haciendo la media. Puesto que las células vivas y las muertas tienen un

aspecto parecido observadas al microscopio, el recuento directo es un recuento total de células.

El recuento directo también puede hacerse electrónicamente, con un instrumento denominado contador

Coulter. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan

bien como el medio en el que están suspendidas. Se coloca en una cámara del contador un volumen

determinado del cultivo y se hace pasar a través de un pequeño poro (de unos 15 µm de diámetro) a otra

cámara, mediante una bomba de vacío. El poro forma parte de un circuito eléctrico, de manera que cada

vez que pasa una célula a través del mismo, la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la

célula es detectada electrónicamente en el contador.

Los dos métodos principales de recuento directo - microscópico y recuento electrónico - dan resultados

semejantes, pero se usan en situaciones muy diferentes. El recuento microscópico no requiere de un

equipo caro, tan sólo se necesita una cámara de recuento, no muy cara, además del microscopio óptico

que existe en cualquier laboratorio de microbiología. Pero es un proceso tedioso y lento. Por el contrario,

el recuento electrónico requiere un equipo caro, pero es muy rápido y preciso, si las células son las únicas

partículas presentes (el recuento electrónico también se usa en los laboratorios clínicos para contar las

células sanguíneas). El recuento microscópico es necesario si la muestra contiene partículas extrañas,

como células sanguíneas o fragmentos de suelo. Una persona que realiza un recuento microscópico puede

discriminar entre las células microbianas y las partículas extrañas, pero si tienen aproximadamente el

mismo tamaño, el contador electrónico las contará como células.

 

Figura 8.8 Recuento microscópico directo. La cámara de recuento de Petroff-Hauser se usa, junto a un

microscopio, para realizar un recuento directo de células. Consta de un porta que tiene unos pocillos

superíiciales (de 0,02 mm de profundidad). En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2,

dividida en 25 cuadrados grandes, cada uno de los cuales está dividido en 16 cuadrados más pequeños. De

esta manera, el volumen total de la rejilla es de 0,02 (un quinceavo) mm3, y cada cuadrado grande es un

veinticincoavo de esta cantidad.

 8.4.5 Recuento en placa

Para realizar un recuento en placa se utilizan los métodos de extensión o de vertido en placa, empleados

para cultivar los microorganismos, que se describieron en el Capítulo 3. La técnica consiste en diluir de

manera seriada, generalmente diez veces por cada dilución, una muestra del cultivo y luego sembrar una

pequeña cantidad de cada dilución en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusión. A

continuación, la placa debe ser incubada en las condiciones adecuadas. Una vez que se han formado

colonias visibles, generalmente después de un día, se seleccionan para el recuento de colonias las placas

en las que éstas están bien separadas. Las placas que tienen entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena

relación entre la rapidez del recuento y la precisión en el resultado obtenido. El número de colonias de

una placa, junto con la dilución de la muestra que se inoculó en ella, nos permite calcular la concentración

de células presente en la muestra original (Figura 8.9). El recuento en placa es un recuento de viables, Se

basa en el principio de que una única célula viable originará una colonia visible, cuando se siembre en

una placa de agar.

La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas

condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva. Ademas, el

recuento en placa no requiere un equipo complicado. Un inconveniente es que el recuento en placa es

lento y tedioso y no es muy preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de

colonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya que disminuye el error

debido al muestreo.

 

Figura 8.9 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer

lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se

mezclan adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo,

1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la

superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en

placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas,

las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.