BiotecnologíaLa biotecnología es la tecnología basada en la biología, especialmente usada en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, ciencias forestales y medicina.

Se desarrolla en un enfoque multidisciplinario.

La biotecnología podría definirse como "toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos".

Los inicios de la transformación de alimentosHace 8 mil años, los sumerios y babilonios comenzaron a producir cerveza mientras que los egipcios descubrieron la técnica para elaborar pan de levadura hace 6 mil años.

Alrededor de la misma época se desarrollaron otros procesos para la conservación de alimentos (particularmente en en China) como la fabricación de yogurt, queso, vinagre y vino.

El biólogo Louis Pasteur gracias a cuyos trabajos se comprendió el mecanismo de la fermentación.

En 1798 Edward Jenner, infectaba a la gente con viruela bovina para inducir resistencia a la viruela humana, (vacuna viene de la palabra latina vaccinus que quiere decir "a partir de vacas").

En 1928, Alexander Fleming, descubre la penicilina.

-La Ingeniería Genética es una nueva ciencia que trata de la manipulación de los genes y de sus productos.

Sus métodos de trabajo son también conocidos como técnicas del ADN recombinante.

Las aplicaciones de esta tecnología y, por tanto, sus finalidades entre otras muchas, son:

a)facilitar la prevención de algunas enfermedades.

b)identificación de personas con fines legales.

c)posibilidad de aislar un gen y expresar-sintetizar la proteína que codifica a gran escala.

La Ingeniería Genética nació como consecuencia del descubrimiento de que algunas bacterias resistentes a los fagos tienen unas enzimas que cortan en trozos pequeños las moléculas de ADN extrañas..

Estas enzimas se conocen como

enzimas de restricción o restrictasas (son del tipo de las endonucleasas y se conocen más de 200).

-Las técnicas del ADN recombinante, básicamente, consisten en lo siguiente:a)se toman fragmentos de ADN de distintos organismos y se unen 'in vitro' ('recombinación in vitro'); el ADN que resulta se conoce como ADN recombinante.

b)el ADN recombinante se introduce en otras células (generalmente bacterias), en las cuales se logra la expresión de sus genes

-La Ingeniería Genética utiliza, entre otras técnicas de trabajo:

1) Obtención de fragmentos de ADN que pueden ser estudiados y manipulados. Para ello se utilizan enzimas de restricción y retrotranscriptasas.

2) Clonación génica para la obtención de gran cantidad de fragmentos de ADN. Entre otras se utiliza la técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

PAPEL DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

-Las restrictasas ...

a)se utilizan para obtener ‘fragmentos de restricción’ (pequeños segmentos de ADN), fáciles de analizar y manipular.

b)cortan el ADN por sitios específicos, llamados secuencias de reconocimiento (formadas por cuatro u ocho pares de bases, que, en la bacteria original, están protegidas para evitar que se destruya su propio ADN)

c)estas enzimas ‘tijeras biológicas’, al cortar el ADN, originan segmentos cohesivos (o adhesivos)

d) estos extremos cohesivos pueden unirse a otros fragmentos de ADN para constituir segmentos de ADN objeto de análisis y estudio.

Preparando ADN Recombinante

5’

3’

G

C T T A A

A A T T C

G

G A A T T C

C T T A A G3’

5’

one DNA fragment another DNA fragment

3’

5’

nick

5’

3’

3’

5’

G A A T T C

C T T A A G

nick

G A A T T C

C T T A A G

DNA ligase action

Cromatografía y electroforesis

- Separación de fragmentos de ácidos nucleicos por migración en geles- En electroforesis se aplica una diferencia de potencial eléctrico- Pueden separar fragmentos de mezclas de hasta 20 KbPueden diferenciarse fragmentos de 1000 pb

http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof2.html

Tinción con bromuro de etidio que presenta fluorescencia al ser iluminado con luz ultravioleta

PAPEL DE LAS RETROTRANSCRIPTASAS-Esta técnica se utiliza para obtener fragmentos de ADN, cada uno de los cuales corresponde a un gen estructural, cuando se dispone del ARNm.

-Consiste en sintetizar en 'in vitro' el ARNm correspondiente, o bien aislar de la célula el ARNm deseado (hay técnicas para conseguirlo). Entonces, utilizando el ARNm adecuado, mediante transcriptasa inversa, se sintetiza el ADN correspondiente.

http://ametsaskeak.wordpress.com/2008/12/19/describe-brevemente-como-actua-el-virus-en-las-celulas-humanas-adjunta-una-animacion-flash-que-ilustre-la-reproduccion-del-vih/

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (Técnica PCR)

-Caracterísitcas:

a)es una técnica de clonación génica

b)produce muchísimos fragmentos de ADN (‘in vitro’) a velocidad extraordinaria.

c)requiere conocer las secuencias de bases del fragmento de ADN que se pretende replicar (clonar).

                                                                                 

d)con estas secuencias se deben sintetizar cortas

cadenas complementarias de ADN (de unos 20

nucleótidos).

e)estas cortas cadenas funcionarán como cebadores o

‘primers’ de ADN para que actúe la ADN-polimerasa.Se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos.

Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth).

Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras con corrección de errores (Pfu, Vent).

-La técnica PCR se desarrolla así:

a)el fragmento de ADN a replicar se introduce en una disolución que contiene ADNpol.

b)se añaden desoxirribonucleótidos en cantidad y las moléculas de cebador ya sintetizadas.

c)al calentar, se separan las hebras complementarias del fragmento de ADN.

d)al enfriar, se unen los cebadores a las hebras simples de nucleótidos, lo cual es reconocido por la ADN-pol que comienza a añadir nucleótidos formando la hebra complementaria.

e)calentando y enfriando alternativamente la solución, se pueden obtener millones de copias de ADN en períodos de tiempo cortos.

90-95º C

PRIMERDE UNOS 18

NUCLEOTIDOS

VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonado, son los agentes transportadores capaces de introducir el ADN en las células hospedadoras.

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.

Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

Una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN.

El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

•Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d)

•Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo(figura f). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

                  

figura f

                               

figura e

                                      

 

figura d

Cósmidos . 

Son plasmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un fago.

Se construye el cosmido uniendo los tres elementos génicos, y el resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación.

Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.

Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este

sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector.

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.

En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

- TRANSFORMACIÓN

- TRANSDUCCIÓN

Transformación.

Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.

La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

Transducción.

Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas.

El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar.

El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3.

El virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.

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IDENTIFICACIÓN DE UNCLON CON EL FRAGMENTODE ADN DESEADO

APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA.

EN MEDICINA

-Actualmente se sabe que las enfermedades genéticas debidas a un solo gen defectuoso ascienden a más de 4000, de las cuales 345 afectan al cromosoma X.

A título de ejemplo, en el siguiente gráfico anotamos algunas de las enfermedades genéticas y su localización cromosómica:-

-Las aplicaciones se pueden concretar en cuatro aspectos:

1) La producción de sustancias con efectos terapéuticos.Entre estas sustancias podemos citar a título de ejemplos más relevantes:

-Somatostanina (SS) que, segregada por el hipotálamo, inhibe la síntesis de somatotropina (GH) u hormona del crecimiento.

-Insulina que, segregada por el páncreas, regula la concentración de glucosa en sangre.

La producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana

-Somatotropina (GH) que, segregada por la adenohipófisis controla y regula el normal crecimiento (evitando enanismo).

- Interferones, que son proteínas elaboradas por células animales en respuesta a una infección vírica.

-Factor VIII antihemofílico (AHF), es una globulina que estimula a las plaquetas (para la coagulación sanguínea).

-Renina, es una enzima que cuaja la leche, necesaria para la elaboración de quesos (o para algunos fármacos).

-Celulasa, enzima hidrolítica de la celulosa, es utilizada en algunos preparados digestivos.

-Vacunas recombinantes, como la de la hepatitis B.

El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial.

Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética.

Como la mayoría de los factores antigénicos son proteinas lo que se hace es clonar el gen de la proteina correspondiente.

2) El diagnóstico de enfermedades hereditarias.Para ello se utilizan técnicas como la amniocentesis, basadas en la extración de células amnióticas del feto.

Se pueden diagnosticar enfermedades como la hemofilia, la anemia falciforme, la diastrofia muscular y otras, que son debidas a mutaciones genéticas.

Se utilizan sondas que son genes defectuosos marcados para comprobar si se hibridan con el ADN procedente del cultivo

                                                                                  

3) La identificación de genes humanos específicos.Se trata de localizar e identificar el gen responsable de una enfermedad que se sabe que es hereditaria.

Aunque es un problema tan arduo como el de 'encontrar una aguja en un pajar', se ha logrado algún éxito como es el caso de la identificación de la fibrosis quística (enfermedad, sobre todo, pulmonar).

4) La terapia génica.

La terapia génica está siendo considerada la cuarta revolución de la medicina (después de las medidas de salud pública, la anestesia, y las vacunas y antibióticos).

Para su aplicación se siguen dos estrategias:

a)Insertar una copia sana de un gen en las células del paciente con una enfermedad genética, para compensar el efecto del gen defectuoso (esto se consiguió con unaniña que tenía una inmunodeficiencia grave).

b)Introducir un gen especialmente diseñado para que proporcione una nueva característica a las células (por ejemplo, introducir en linfocitos un gen que produzca un inhibidor del virus del sida en pacientes afectados por el VIH).

EN AGRICULTURA

-En el ámbito de la agricultura siempre se ha pretendido obtener plantas cultivables, cuyos rendimientos sean óptimos.

Desde hace muchos años se utilizan los conocimientos de la Genética, aunque muchas veces de una forma inadvertida, y en este sentido deben entenderse los procesos de selección génica realizados provocando cruces y originando poliploidías, para luego seleccionar aquellas plantas de buenos resultados y multiplicarlas asexualmente, formando clones con ellas.

-La aplicación de técnicas de Ingeniería Genética están dando resultados espectaculares en la obtención de plantas transgénicas, es decir, plantas a las que se ha introducido ADN clonado (recombinante) y que lo han incorporado a su genoma de forma estable.

Los principales caracteres conseguidos en las plantas transgénicas, son:

a)resistencia a herbicidas, a insectos y enfermedades microbianas.

b)incremento del rendimiento fotosintético.

c)mejora en la calidad de los productos agrícolas.Las primeras plantas obtenidas mediante estas

técnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas después de haber sido cosechados.

Biología de Agrobacterium tumefaciens

Esta bacteria, presente en el suelo, es patógena de muchas plantas a las que produce un tumor conocido como "agalla de cuello". Durante el contacto con las células vegetales la bacteria transfiere a las células vegetales un plásmido llamado Ti (inductor de tumores).

Este plásmido se integra en el ADN del cromosoma de la célula vegetal.

Este fenómeno natural es empleado para utilizar a la bacteria Agrobacterium tumefaciens como vector de los genes que se desean introducir en una célula vegetal, con lo que se transforma dicha célula, la cual puede regenerar, por micropropagación, una planta entera que será transgénica.

PLANTAS TRANSGÉNICAS

· Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas.

Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas.

Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt) dañina para las larvas de muchos insectos, de modo que no pueden desarrollarse sobre las plantas transgénicas con este gen.

· Incremento del rendimiento fotosintético Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente. · Mejora en la calidad de los productos agrícolas Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes. · Síntesis de productos de interés comercial Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables · Asimilación de nitrógeno atmosférico Aunque no hay resultados, se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno.

EN ANIMALES

-En animales, la aplicación de las técnicas de la Ingeniería Genética persiguen los objetivos siguientes:

a)favorecer la investigación biomédica para estudiar la fisiología de los genes y la biología del desarrollo.

b)mejorar la productividad o la resistencia a las enfermedades de animales útiles para los hombres.

c)producción de proteínas de valor farmacológico.

La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica.

Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a la primera división , producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la linea germinal (gametos).

La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas:

Transgénesis por microinyección de zigotos Desde que en 1982 se obtuviera un ratón transgénico, la producción de animales transgénicas es cada vez más cotidiana, existiendo ya animales transgénicos de las siguientes especies: ratón, rata, conejo, cerdo, vaca, cabra y oveja.

CLONACIÓN DE ANIMALES

El principio de la clonación está en la obtención de organismos idénticos genéticamente, y por tanto morfológic y fisiológicamente, como lo son dos gemelos univitelinos.

Esto ha sido el sueño de muchos ganaderos, que han deseado que todo su ganado tuviera las cualidades de algún ejemplar especialmente bueno.

Se pueden utilizar dos métodos para conseguir clones de animales:

Por DISGREGACIÓN DE CÉLULAS EMBRIONARIAS.Se basa en el mismo principio por el que nacen gemelos de forma natural.Se pueden separar las células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un individuo completo.

Por TRANSFERENCIA NUCLEAR. Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro,y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto.

Obtención de una cerda transgénica

Un gen híbrido que contiene el gen humano que codifica la síntesis de una proteína de interés biológico junto con el promotor del gen que codifica una proteína de la leche de rata, se introducen por microinyección en un óvulo de cerda fecundado. El desarrollo de ese óvulo da lugar a un animal transgénico que tiene en todas sus células el gen híbrido. Debido al promotor elegido, ese gen solamente se expresa en la glándula mamaria de la cerda induciendo la producción de la proteina humana en la leche.

Esto es lo que se hizo con la oveja Tracy en 1992, la primera oveja que produjo una proteina humana, la alfa-antitripsina bajo la dirección del promotor ovino de la beta-lactoglobulina.

Dicha proteina se produce en una cantidad de 35 g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar.

Lo mismo se ha hecho para la famosa cerda Genie, que fabrica en su leche la proteina C humana que controla la coagulación sanguinea y es necesaria para los hemofílicos.

Frente a los múltiples beneficios que ofrece este campo, se encuentran algunos problemas que puede presentar la aplicación de la Ingeniería Genética:

· Problemas sanitarios. Pueden aparecer nuevos microorganismos patógenos que provoquen enfermedades desconocidas, o el uso de fármacos de diseño provoquen efectos secundarios no deseados.

· Problemas ecológicos. La liberación de nuevos organismos en el ambiente puede provocar la desaparición de especies contra las cuales se lucha, con consecuencias aún desconocidas, ya que cumplen una función en la cadena trófica de la naturaleza.

· Problemas sociales y políticos. Las aplicaciones de la Biotecnología en el campo de la producción industrial, agrícola y ganadera, pueden crear diferencias aún más grandes entre países ricos y pobres.

El sondeo génico en personas puede llevar a consecuencias nefastas en la contratación laboral, por ejemplo, y atenta contra la intimidad a que tiene derecho toda persona.

· Problemas éticos y morales. La experimentación en la especie humana puede atentar contra la dignidad de la misma. Poder conocer y modificar el patrimonio genético humano puede ser una puerta abierta al eugenismo. En el campo de la Terapia Génica es defendible este procedimiento cuando se utilice en células somáticas para corregir enfermedades. En la línea germinal se pide su prohibición en todo aquello que sea recomponer un programa genético humano. Los trabajos con embriones humanos con fines puramente experimentales se consideran un atentado a la dignidad de la especie humana.

Por todo ello, es preciso que los conocimientos y avances en Ingeniería Genética se consideren patrimonio de la

humanidad, y que los Organismos Internacionales