Árbol de la Biotecnología

¿Cuál es la relación entre Biotecnología y la Genética?

• La Biotecnología moderna considera la aplicación comercial de organismos vivos y sus productos, a través de la manipulación deliberada de sus moléculas de ADN y genes mediante ingeniería genética.

Ingeniería genética

Proteínas recombinantes

Modificación genética de vías

metabólicas

Terapia génica

Animales y plantas

transgénicos

vacunas

Aplicaciones de Ingeniería Aplicaciones de Ingeniería genética para biotecnologíagenética para biotecnología

Temario general

• Bases moleculares de la genética

• Técnicas de Ingeniería Genética

• Aplicaciones de Ingeniería Genética

Proceso de expresión de los genes

= función

= mensaje

=

información

Promotor TerminadorGen

DNA

mRNA

polipéptido

CONCEPTO MOLECULAR DE CONCEPTO MOLECULAR DE GENGEN

RNA polimerasa

Existen 20 aminoácidos Existen 20 aminoácidos naturales que forman las naturales que forman las proteínasproteínas

PROTEÍNA

mRNAmRNA (AGGCUUAGACCGAGU,

etc)

ProteínasProteínas

(Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu, (Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu, etc)etc)

¡ TRADUCCION ¡ TRADUCCION USANDO EL USANDO EL

CODIGO CODIGO GENETICO !GENETICO !

OPERÓN BACTERIANO

• Conjunto de genes vecinos y que se transcriben juntos, bajo la orden de un promotor.

• Todos los genes de un operón participan en una misma vía metabólica.

• Por ejemplo, genes del operón lactosa (codifican para enzimas de la degradación del azúcar lactosa).

Operón bacteriano

1 solo mRNA

-galactosidasa-galactosidasa permeasapermeasa acetilasaacetilasa

Tres proteínas diferentes que participan en la degradación del azúcar lactosa

promotor terminador

Gen 1 gen 2 gen 3

RNA polimerasa

Genes de Genes de eucariontes eucariontes son son interrumpidointerrumpidos por s por secuenciassecuencias no no codificantes codificantes (intrones)(intrones)

Transcripción

mRNA maduro

PROCESO DE EXPRESIÓN GÉNICA: DIFERENCIAS PROCESO DE EXPRESIÓN GÉNICA: DIFERENCIAS ENTRE PROCARIONTES Y EUCARIONTESENTRE PROCARIONTES Y EUCARIONTES

PROCESO DE EXPRESIÓN GÉNICA: DIFERENCIAS ENTRE PROCARIONTES Y

EUCARIONTES

Procariontes• Transcripcion y

traducción en el mismo compartimento

• Transcripción y traducción acopladas

• Genes organizados en operones

• No existen intrones en procariontes

Eucariontes• Transcripción nuclear y

traducción citoplasmática • Transcripción y

traducción separadas en el tiempo

• Genes individuales

• Genes interrumpidos por intrones

Técnicas de Ingeniería Genética

Endonucleasas de restricción

• Son enzimas que rompen el enlace fosfodiéster del DNA (endonucleasas), producidas por bacterias

• Reconocen secuencias de nucleótidos específicas en el DNA, de tamaños que oscilan entre 4 y 8 pares de bases

• Forman parte de un sistema de modificación-restricción de las bacterias , utilizado para defenderse de la invasión de DNA exógeno (restos de DNA, virus, etc)

Endonucleasas de restricción permiten fragmentar el DNA

Secuencias de reconocimiento son palíndromes

Generan extremos cohesivos o romos

Otras enzimas de restricción

ELECTROFORESIS DE DNA: TÉCNICA PARA LA SEPARACIÓN ELECTROFORESIS DE DNA: TÉCNICA PARA LA SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMAÑODE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMAÑO

Electroforesis en geles de agarosa para separar fragmentos de DNA de acuerdo a su tamaño

Los fragmentos mas pequeños migran mas rápido en el gel, los mas grandes lo hacen mas lentamente.

Gel de agarosa

Cámara de electroforesis(-) (+)

Mapa de restricción

Ordenamiento de los sitios de restricción en un fragmento de ADN

Los fragmentos de DNA producidos por corte con una misma enzima de restricción pueden

ser ligados para formar moléculas

de DNA recombinante !!

Clonamiento de un gen

• Para clonar un gen o un fragmento de DNA en general, se requiere introducirla en una molécula “vector”.

• Un vector en ingeniería genética, es una molécula que sirve para transportar a otra hasta el interior de una “célula huésped”.

¿Cuáles son los vectores mas comúnmente usados?

• Plasmidos (DNA extracromosomal existente naturalmente en bacterias y levaduras, que se replica autónomamente)

• Virus bacterianos (bacteriófagos), o virus animales.

Los plasmidios son DNA circulares Los plasmidios son DNA circulares extracromosomales que se replican en extracromosomales que se replican en forma autónomaforma autónoma

cromosoma

Uso de vectores para el Uso de vectores para el clonamiento de un fragmento clonamiento de un fragmento de DNAde DNA

Fragmento de DNA en un vector de clonamiento

Al dividirse las células, también se duplica el DNA Al dividirse las células, también se duplica el DNA clonado en el vector, lo que permite clonado en el vector, lo que permite propagarpropagar y y amplificaramplificar la cantidad de DNA clonado la cantidad de DNA clonado

Célula huésped

División celular

Transformación de Transformación de bacterias con DNA bacterias con DNA

plasmidialplasmidial

Sin embargo el procedimiento de transformación no es 100 % eficiente, por lo tanto se requiere un método para

seleccionar e identificar las bacterias realmente transformadas con el plasmidio

12 h a 37 ºC

Crecimiento de colonias de bacterias resistentes al antibiótico, que por lo tanto tienen el plasmidio

Clonamiento de DNA en

un plasmidio

Origen de replicación

Gen de resistencia a ampicilina

Gen de resistencia a tetraciclina

Sitios de corte por enzimas de restricción

Características de un vector de clonamientoCaracterísticas de un vector de clonamiento

Usos de un DNA recombinante

Generar copias de un gen o fragmento de DNA

•Construir bancos de genes

•Secuención

•Mutagénesis

•Terapia génica

Producir la proteína producto de un gen clonado

•Estudiar la proteína

•Producción de proteínas recombinantes para biotecnología (hormonas, vacunas, enzimas de uso industrial, etc)

Bacteriófagos como Bacteriófagos como vectores de clonamientovectores de clonamiento

CELULAS USADAS COMO HUESPEDES CELULAS USADAS COMO HUESPEDES DE CLONAMIENTODE CLONAMIENTO

1.  Células procariontes:       Ventajas: crecimiento rápido, cultivo barato,

fisiología y genética bien conocida.      Ej: Escherichia coli, Bacillus subtilis 2.        Células eucariontes:       Ventajas: estas células realizan modificaciones

post-traduccionales (ej. Fosforilaciones y glicosilaciones) que son importantes para la actividad de muchas proteínas de eucariontes.

      Ej. Levaduras, hongos, células de mamíferos en cultivo, células de insecto en cultivo.

Formas de introducir DNA Formas de introducir DNA exógeno en células huespedexógeno en células huesped

• Transformación por electroporación en bacterias y en células eucariontes

• Infección en el caso de vectores virales

• Biobalística en el caso de plantas

• Fusión de liposomas en eucariontes

• Microinyección directa al núcleo

El problema: ¿Cómo es posible identificar y aislar un gen determinado

desde un genoma que contiene miles de genes?

Gen X

Desnaturación de DNADesnaturación de DNA

Hibridización de DNA: Hibridización de DNA: Dos moléculas de Dos moléculas de ácidos nucleicos de una hebra que ácidos nucleicos de una hebra que tienen secuencias complementarias tienen secuencias complementarias puedenpueden hibridizar: hibridizar: formando un formando un complejo de doble hebra establecomplejo de doble hebra estable. .

¿ Qué características debe ¿ Qué características debe tener una sonda de Ácidos tener una sonda de Ácidos

Nucleicos ?Nucleicos ?

• Una sonda debe tener complementariedad de bases con el DNA blanco

• Puede ser de un organismo relacionado - una sonda heteróloga.

Otra forma de obtener una sonda: Otra forma de obtener una sonda: Traducción reversa de la secuencia de Traducción reversa de la secuencia de

aminoácidos de una proteínaaminoácidos de una proteína

Hibridización de DNAHibridización de DNA

Sonda de DNA marcada

Marcación radiactiva de DNA Marcación radiactiva de DNA

para generar para generar ““sondassondas”

Desnaturación (90-100ºC)

+

Rx de síntesis de DNA (DNA polimerasadATP, dGTP, dTTP, dCTP (32P)** * *

* * *

partidor

* * *SONDA+

““Southern blottingSouthern blotting””

La técnica de Southern blot La técnica de Southern blot sirve para identificar genessirve para identificar genes

Electroforesis de DNA genómico de diferentes cepas de Clamydomona

Resultado de la hibridización del DNA con una sonda para un gen X

Resultado: sólo algunas de estas cepas tienen el gen X

El problema: ¿Cómo es posible identificar y aislar un gen determinado

desde un genoma que contiene miles de genes?

Gen X

Clonamiento de un gen X desde un genoma

Genoteca: conjunto de clones que contienen la totalidad de un genoma

Cada colonia representa un clon de bacterias genéticamente idénticas.

Cada colonia es un conjunto de bacterias que tienen el mismo fragmento del genoma clonado

Genoteca

Reacción de hibridización

Sonda radiactiva

autorradiografía

Identificación de un clon que Identificación de un clon que contiene el gen de interéscontiene el gen de interés

Genotecas de cDNA:Genotecas de cDNA:Se usan para clonar genes de Se usan para clonar genes de organismos eucariontes, para organismos eucariontes, para aislar sólo las partes aislar sólo las partes codificantes de genes codificantes de genes (exones).(exones).

Creación de una genoteca Creación de una genoteca de cDNAde cDNA

Métodos de secuenciaciónMétodos de secuenciación

• Basados en la reacción de síntesis de DNA por una DNA polimerasa en presencia de un partidor.

• Objetivo: determinar la secuencia de nucleótidos en el DNA.

• En la síntesis se incorpora desoxinucleótidos (dNTP).

• Uso de un análogo de nucleótido didesoxinucleótidos (ddNTP).

• Análisis de los productos de la reacción mediante electroforesis en acrilamida

didesoxinucleótido

Partidor marcado radiactivamente

Identificación de la secuencia del DNA clonado

ACGTGGAGCATGGTCATTAACGTAACGATCGATCGAGGCATGCG

Predicción de la secuencia de aminoácidos, de acuerdo al código genético

DNA clonado

Comparación con secuencias almacenadas en los bancos de datos

¿ Hay similitud con otras proteínas que tengan la función de la proteína de interés?

No Si Expresión para producir la proteína

El DNA clonado, ¿es o no el gen que me interesa?

Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)

Fragmento que se desea aislar

Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)

Si el gen que que quiero aislar está en el DNA cromosomal

REQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE REQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE PCRPCR

• Una secuencia de DNA "blanco".• Dos oligonucleótidos sintéticos,

complementarios a los extremos del DNA blanco que se desea amplificar

• Una enzima DNA polimerasa termoestable• Los cuatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP,

dGTP, dTTP).

´5'

3'

3'

5'

Aplicaciones de la técnica Aplicaciones de la técnica de PCRde PCR

1. Aislamiento de genes DNA para aplicaciones en clonamiento

2. Diagnóstico de infecciones virales, bacterianas o parasitarias

3. Diagnóstico de enfermedades genéticas,4. Identificación de individuos,5. Análisis forense,6. Monitoreo ambiental

APLICACIÓN DE PCR EN MEDICINA FORENSE

Un vector de expresión: usado Un vector de expresión: usado para producir proteínas para producir proteínas

recombinantesrecombinantes

operador

Tu gen favorito

Por qué se requiere un sistema con promotor regulado?

La sobreexpresión de una proteína impone un estrés metabólico a las células, bajando la velocidad de crecimiento.Algunas proteínas recombinantes pueden ser “tóxicas” para las bacterias. Por lo tanto, se requiere separar la

fase de crecimiento de las células huéspedes de la fase de expresión del gen heterólogo.

El sistema de control del operón LAC El sistema de control del operón LAC (Promotor/Operador) es uno de los (Promotor/Operador) es uno de los

mas usados para la expresión mas usados para la expresión regulada de PRregulada de PR

PLAC OLAC Tu gen favorito Terminador

Prot recombinante

tiempo

N d

e cé

ls/m

l

IPTG

IPTG = Isopropil -D galactósido

Análogo de la lactosa