TEMA 3. Algunas aplicaciones de la biotecnología genética a la biotecnología alimentaria

1- Diagnóstico de patologías hereditarias con repercusión sobre la cantidad o calidad de los productos

2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos

3- Identificación genética individual, racial o específica

4- Detección de microorganismos en alimentos

5- Detección de transgénicos

OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) : Base de datos de genes y enfermedades

hereditarias en 137 especies animales

11. . DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS HEREDITARIASDIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS HEREDITARIAS

Total Caracteres

567 408 298 223 205 202 188 72 59 593 2815

Caracteresmendelianos

204 119 66 37 88 79 81 11 21 117 773

Caracteres Mendelianos(mutación conocida)

150 70 37 15 24 25 28 8 7 52 416

Potenciales modelos caracteres humanos

268 137 151 75 104 75 40 29 38 255 1172

DOG VACA GATO CERDO CABALLO

OVEJA POLLO

CABRA

CONEJO OTROS TOTAL

Malignant hyperthermia (Phene ID 1193, Group 000621) in Sus scrofa

Possible human homologue (MIM number) 145600 180901 Symbol PSSCross Species SummaryMalignant hyperthermia. A progressive increase in body temperature, muscle rigidity and metabolic acidosis, leading to rapid death.SummaryIn pigs, malignant hyperthermia (MH) leads to rapid post-mortem changes in muscle, resulting in pale soft exudative (PSE) meat. MH can be triggered by a minor stress, such as loading, transport, sexual intercourse, high ambient temperature, or exposure to the anaesthetic halothane. Susceptibility to halothane-induced MH is an autosomal recessive trait in pigs. Together, sudden death syndrome and PSE constitute porcine stress syndrome (PSS), which became a major economic problem in many countries in the 1970s. In part, this was due to strong selection for increased leanness, which is associated with susceptibility to PSS. In 1991, a major breakthrough occurred when a Canadian research team led by David MacLennan (Fujii et al., 1991) showed that MH is due to a base substitution (C-T) in the 1843rd nucleotide of the gene for the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. The base substitution causes an amino-acid substitution (arginine - cysteine) in the 615th position of the calcium release channel, resulting in altered calcium flow. A PCR genotyping test based on the causative mutation has been used extensively in many countries, leading to the elimination of the mutation from many herds.

Species Specific Name Porcine Stress SyndromeGenetic TestVarious PCR genotyping tests have been devised, all based on detection of an RFLP resulting from the causative base substitution.Single Locus yesCharacterised at a molecular level Yes

SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

El Síndrome Estrés Porcino (PSS) es una enfermedad hereditaria, que presenta un modelo de herencia recesiva

SINTOMAS

TaquicardiaRigidez muscular

Aumento progresivo de la temperatura corporalMuerte

LESIONES

Hipertrofia muscularEdema pulmonar

CARNES PSE (pale, soft, exhudative)- palidas, blandas y exhudativas-

CARNES DFD (dark, firm, dry) – dura, seca y oscura

Característica Carne PSE Carne DFD

Glucólisis, descenso pH muy rápidoLentamente y

parcial

Valor pH < 5,8 >6,2 (también pH)

Color pálida oscura

Consistencia blanda densa, pegajosa

Capacidad de enlace de agua

baja elevada

Pérdida de líquidos alta baja

Conservación reducida reducida

Dureza menor mayor

CARACTERÍSTICAS CARNES EN ANIMALES CON PSS

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

Mutación en el gen de RYR-l: Receptor de la ryanodina- Gen para la liberación del calcio en el músculo esquelético -

Sustitución C-T en el nucleótido 1843

Sustitución arginina–cisteina en al posición 615

C/C: Individuos sanos y no portadores

C/T: Individuos sanos y portadoresT/T: Individuos enfermos

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO PCR/RFLPs

Alelo C

PCR 199bp

Alelo T 165bp 34bp

BsiHKA I

199bp

Existen genes que determinan el Existen genes que determinan el sexo y que tiene una secuencia sexo y que tiene una secuencia

distinta en machos o en hembrasdistinta en machos o en hembrasImportante determinar el sexo del embrión para los Importante determinar el sexo del embrión para los

programas MOET = ovulación múltiple y programas MOET = ovulación múltiple y transferencia de embriones, pero también el origen transferencia de embriones, pero también el origen

de determinados productos en los que la de determinados productos en los que la características y el valor economico pueden variar características y el valor economico pueden variar

según el sexosegún el sexo

2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos

GENES RELACIONADOS CON LA GRASA

DAGT 1 en vacuno: tiene una gran influencia en

la cantidad de grasa en la leche

G G A A

grasa en la leche

Grasa en la leche

SI ANALIZAMOS EL ADN DE LOS INDIVIDUOS PODREMOS SELECCIONAR DIRECTAMENTE POR EL

GENOTIPO

Más genes interesantes…

HAY OTROS GENES DE INTERES RELACIONADOS CON CARACTERES

PRODUCTIVOS K-Caseína - mayor rendimiento en la producción

de queso

IGF2 – Desarrollo muscular y depósitos grasos

RYR 1 – Desarrollo muscular e hipertermia maligna Síndrome de estrés porcino (SSP)

PRKAG 3 – Aumenta la cantidad de glucógeno del músculo en un 70% y el desarrollo muscular

MIOSTATINA –Hipertrofia muscular o doble musculatura

GEN DE LA MIOSTATINA PERDIDA DE FUNCIÓN DEL GEN GENERA UN

FENOTIPO SIMILAR EN LAS TRES ESPECIES DE MAMÍFEROSHipertrofia muscular

“ CULONES “

Fotografías obtenidas de Fotografías obtenidas de Genome research (Womack, Genome research (Womack, 2005)2005)

- mayor rendimiento a la canal- mayor proporción de músculo - menor proporción de hueso - mucha menor proporción de grasa

AUTENTIFICACIÓNAUTENTIFICACIÓN

3. IDENTIFICACIÓN GENÉTICA3. IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

TRAZABILIDADTRAZABILIDAD

En ambos casos se trata de utilizar los marcadores del DNA con diferentes propósitos:

1.- Identificación individuos en diferentes etapas del proceso productivo (de la granja a la mesa)- Verificación de otros sistemas de identificación- Sistema trazabilidad

2.- Identificación de origen genético (raza). Verificación denominaciones de origen o marcas de calidad

3.- Identificación de especies. Identificación de especies en mezclas o sustituciones

Seguridad Seguridad alimentariaalimentaria

Crisis de las vacas locas, Crisis de las vacas locas, listeriosis, dioxinas, etclisteriosis, dioxinas, etc

PREOCUPACIÓN CRECIENTE ENTRE LOS CONSUMIDORESPREOCUPACIÓN CRECIENTE ENTRE LOS CONSUMIDORES

OBLIGATORIEDAD DE OBLIGATORIEDAD DE ESTABLECIMIENTO DE UN ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA SISTEMA

DE TRAZABILIDADDE TRAZABILIDAD

¿ Qué significa TRAZABILIDAD Qué significa TRAZABILIDAD ?

“Establecimiento de un sistema que permita identificar un animal y poder llevar a cabo el seguimiento de sus

movimientos a lo largo de toda su vida desde el nacimiento hasta la llegada de su

carne hasta el consumidor”

Sistema de trazabilidad genéticaSistema de trazabilidad genética

Sistema basado en el análisis del ADNSistema basado en el análisis del ADN

FUNDAMENTO: FUNDAMENTO: Los animales presentan diferencias en su ADN,

a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones.

Como media, 1 de cada 1000 bases del ADN Como media, 1 de cada 1000 bases del ADN (de los 3.000.000.000) es diferente entre (de los 3.000.000.000) es diferente entre

animalesanimales

SISTEMA FIABLE Y REPETIBLESISTEMA FIABLE Y REPETIBLELa información genética contenida en las La información genética contenida en las células es igual en todas las partes del células es igual en todas las partes del

cuerpo del animal y no varía con el tiempocuerpo del animal y no varía con el tiempo

Marcadores utilizados :

MICROSATÉLITES

SNPs

IDENTIFICACIÓN DE ORIGEN RACIAL

CONTROL DE CALIDAD Ejemplo: productos derivados de cerdo ibérico

(UTILIZACIÓN DE MARCADORES ESPECÍFICOS DE RAZA)

ANÁLISIS DE LOS GENES MC1R Y Pink PCR/RFLPs

MC1R- Receptor de la melanocortina 1

Pink

Genes que determinan el color de la capa

MC1R y Pink presentan alelos fijados en la raza Duroc que no aparecen en poblaciones de cerdo ibérico

Datos obtenidos de Fernández et al 2003

> Demanda > Demanda de productos de calidadde productos de calidad

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES

Autentificación

Fraudes económicos

Razones filosóficas y religiosas

Cuestiones legales

C/Pt Pt O Pv Pll C PtC/Pt Pt O Pv Pll C Pt

Identificación de especies mediante RAPDs

Aplicable a la detección de fraudes en patés

Identificación de especies mediante RAPDs

310 pb 290 pb

750 pb

340 pb

Caprino Ovino Bovino

Aplicable a carne o a quesos

Identificación de especie mediante amplificación de fragmento específico de

porcino( Patente LAGENBIO- Universidad de Zaragoza )

b o cp cv pll pv pt e -

Muestras sanguíneas de diferentes especies- solamente se amplifica en cerdo

Pietrain Chato Murciano Landrace Large White

AMPLIFICACIÓN DEL FRAGMENTO ESPECÍFICO DE CERDO EN DIFERENTES RAZAS

Cuantificación

1% 5% 10% 25% 50% 75% 100%

Nos permite demostrar no solo que hay presencia de cerdo, sino en que proporción en una mezcla.

CASO PRACTICO.Identificación de especies por sustitución

•Denuncia de venta de cordero en lugar de cabrito en Navidad 08•Utilización de RAPDs •Recepción en el laboratorio: muestra de carne

Cabra 1 Cabra 2Muestra

problemaMuestr

aproble

ma

Oveja 1 Oveja 2 vaca

SOLUCIÓN: LA MUESTRA PROBLEMA ES CORDERO Y NO CABRITO

4.- DETECCIÓN DE MICRORGANISMOS EN ALIMENTOS

-Imprescindible en la Seguridad alimentaria

- En los Estados Unidos se dan aproximadamente 76 millones de casos de intoxicación alimentaria (26.000 casos por cada 100.000 habitantes),5 de los que:350.000 son hospitalizados (111 por 100.000 hab.) 5.000 mueren (1,7 por 100.000 hab.)

- Salmonella , Listeria , Toxoplasma, Campilobacter, E.coli O157 son los agentes màs frecuentes en las infecciones causadas por alimentos

Tests genéticos aplicados a la detección de microorganismos

- Se aplica la técnica de PCR

- Se basa en la identificación de un fragmento de DNA específico del microrganismo contaminante

Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas

• Deterioran los alimentos

• Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación

VENTAJAS VENTAJAS

1.1.Sensibilidad Sensibilidad 2.2.Especificidad Especificidad 3.3.Capacidad de procesamiento de gran número de muestrasCapacidad de procesamiento de gran número de muestras

Detección rápida de bacterias productoras de exopolisacáridos del tipo beta-glucano. El uso de este método podría permitir la prevención del ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados estos polisacáridos (especialmente la sidra).

Detección gen gtf mediante PCR

DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos):

DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades)

Microrganismos Trastorno Posible producto Método

que ocasiona portadorAcrobacter spp

Bacillus cereus

Campilobacter spp

Clostridium botulinum

Clostridium perfringens

E.Coli

Listeria spp

Salmonella spp

Shigella spp

Vibrio cholera

Yersinia enterocolitica

Diarrea

Diarrea, vómitos

Diarrea

Botulismo, vómitos

Diarrea, dolor abd.

Diarrea, colitis

Listeriosis

Gastroenteritis

Fiebre , calambres

Cólera

Yersiniosis

Carne de aves

Arroz, prod. Lacteos Y cárnicos

Aves, cerdo , res y Leche cruda

Pescado, miel, latas

Carne de res y aves,Salsas

Carne y productosLácteos

Pate, leche, queso, carneMariscos, ensalada de col

Leche, huevo crudo, carnede res y ave

Mayonesa, vegetales crudosLeche y aves

Ostras crudas, pescado

Leche, tofu, canales de cerdo

RAPD-PCR

PCR

PCR múltiple

PCR anidado

PCR duplex

PCR múltipleRT- PCR

PCR-múltiple RT- PCRRT- PCR

PCR simple

RT- PCR

RT- PCR

EXISTEN KITS COMERCIALESEXISTEN KITS COMERCIALES

BAX (Qualicom, USA) Salmonella

Listeria

E.Coli O157:H7

PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella

Listeria

TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella

Listeria

E.Coli O 157

VENTAJAS DE LA TÉCNICA DE PCR EN LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS

- Rapidez- Simplicidad (disponibilidad de Kits comerciales)- Alta sensibilidad ( permite diferenciar cepas)- PCR cuantitativo permite la cuantificación del nivel de patógenos

+ + + + + - -

Presencia de banda - Diagnóstico +Ausencia de banda - Diagnóstico -

PCR

ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO

(Directiva 2001/18/CE)

Cualquier organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético ha sido

modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento ni en la

recombinación natural

5.- Detección de transgénicos

ETIQUETADO

-La UE “reconoce el derecho de los consumidores a la información y el etiquetado como herramienta para una elección responsable”

- La obligatoriedad del etiquetado se regula en los reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2003

- El etiquetado indicando la presencia de un OMG es obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad de OMG presente

Creación de plantas transgénicas

Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1%

Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes

Mediante técnica PCR

DETECCIÓN POR PCR DE MAÍZ TRANSGÉNICO