bakterium azospirillum brasilense - … charakterisierung der wechselwirkung von selen mit dem...

Thema:

CHARAKTERISIERUNG DER

WECHSELWIRKUNG VON SELEN MIT DEM

BAKTERIUM AZOSPIRILLUM BRASILENSE

MASTERARBEIT

Zur Erlangung des akademischen Grades

MASTER OF SCIENCE

Studiengang Biotechnologie und Angewandte Ökologie

vorgelegt von:

Anika Maffert

geboren am 01.03.1989 in Herzberg/Elster

eingereicht am:

30.09.2013

Erstgutachter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas Wiegert

Fakultät Mathematik/Naturwissenschaften

Hochschule Zittau/Görlitz

Zweitgutachter: Dr. rer. nat. Manja Vogel

Institut für Ressourcenökologie

Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf e.V.

Z u s a m m e n f a s s u n g S e i t e | II

ZUSAMMENFASSUNG I.

Das Bakterium Azospirillum brasilense gehört zur Gruppe der Plant growth-promoting

rhizobacteria (PGPR) (Kloepper et al. 1991), da es die Fähigkeit besitzt das Wachstum zu

fördern und infolge dessen den Ertrag bestimmter Pflanzen zu erhöhen. Ein natürliches

Habitat der Bakterien ist der Boden. Insbesondere lagert es sich an der Wurzeloberfläche

von Nutzpflanzen, wie beispielsweise Mais, Weizen und Reis, an. Dabei geht das

Bakterium A. brasilense mit den Pflanzen eine symbiotische Bindung ein.

Das Spurenelement Selen (Se), welches in vielen Böden, Gesteinen und Gewässern

vorkommt, ist essentiell für viele Organsimen. Zu beachten ist, dass die Aufnahme von

Selen in höheren Konzentrationen toxisch und im Gegensatz dazu die Aufnahme von nur

geringen Mengen zu einem Selendefizit führen kann. Aufgrund der Toxizität sind die

wasserlöslichen Oxyanionen Selenit (SeO32-

) und Selenat (SeO42-

) von besonderem

ökologischen Interesse. Aus der Literatur ist bekannt, dass einige Bakterienstämme die

Fähigkeit besitzen Selenit und Selenat zu weniger toxischem elementaren Selen (Se(0)) zu

reduzieren. Dieses elementare Selen bildet extra- oder intrazelluläre Nanopartikel aus.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung des Bakteriums

Azospirillum brasilense mit den wasserlöslichen Oxidationsstufen des Selens (Se(IV) und

Se(VI)) unter aeroben Bedingungen untersucht. Dabei wurde die mikrobielle Reduktion

von Selenit durch das Bakterium beobachtet, die Auswirkung der Variation der

Selenitkonzentrationen untersucht und entstandene Se(0)-Nanopartikel charakterisiert. Die

in der Arbeit untersuchten Aspekte, gaben Aufschlüsse über die Toleranzen des

Bakteriums A. brasilense gegenüber Selenat und Selenit. Es wurde gezeigt, dass nur das

Oxyanion Selenit toxisch auf das Bakterium wirkt. Das Selenat wurde während des

Kultivierungszeitraumes nicht in den Metabolismus des Bakteriums aufgenommen.

Durch die Variation der Selenitkonzentrationen von 1 mM bis 5 mM im Medium wurde

herausgefunden, dass A. brasilense Konzentrationen bis 2,5 mM toleriert. Bei einer

Selenitkonzentration von 5 mM konnte nicht eindeutig bestimmt werden, in wie weit das

Bakterium diese Konzentration verträgt.

Z u s a m m e n f a s s u n g S e i t e | III

Die Ergebnisse der Hydrid-Generation Atomabsorptionsspektrometrie (HG-AAS) und der

Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Hochfrequenzplasma (ICP-MS) verdeut-

lichten die zeitliche Abnahme der Selenitkonzentration im Medium und der damit

verbundenen Umsetzung von Selenit zu Se(0)-Nanopartikeln. Die vollständige Umsetzung

des Selenits aus dem Medium erfolgte ca. sieben Tage nach Beginn der Kultivierung bei

einer Selenitkonzentration von 1 mM.

Bei der Kultivierung des Bakteriums in Gegenwart von Selenit konnte festgestellt werden,

dass die Bakterien Nanopartikel produzierten. Diese wurden mittels Lichtmikroskopie und

Rasterelektronenmikroskopie (REM) visualisiert und konnten mittels energiedispersiver

Analyse der Röntgenstrahlung (EDX) als Selen-Schwefel-Gemisch identifiziert werden.

Dabei konnte gezeigt werden, dass die Nanopartikel außerhalb der Bakterienzelle

lokalisiert sind. Mittels Dynamischer Lichtstreuung (DLS) wurde die Partikelgrößen-

verteilung und der damit verbundene durchschnittliche hydrodynamische Partikeldurch-

messer von etwa 400 nm bestimmt. Durch die Zetapotentialmessung wurde ermittelt, dass

die Partikel eine stark negativ-geladene Oberfläche besitzen und somit die Tendenz

aufweisen keine Agglomerate zu bilden, da die Partikel sich aufgrund der Ladung

abstoßen. Die Struktur dieser Selennanopartikel wurde mit Hilfe der Raman-Spektroskopie

untersucht. Dabei wurden Selenketten, Se8-Ringstrukturen und Selen-Schwefel-

Valenzschwingungen ermittelt. Durch Inkubieren der Nanopartikelsuspension bei

unterschiedlichen Temperaturen im Bereich von 35 °C bis 250 °C wurde die Thermo-

stabilität analysiert. Bis 35 °C konnte kein signifikanter Unterschied zur unbehandelten

Probe mittels UV/Vis-Spektroskopie und DLS beobachtet werden. Ab 50 °C agglo-

merierten die Partikel, sodass eine instabile Suspension entstand. Je höher die

Temperaturen stiegen, desto weniger blieb von den Nanopartikeln erhalten. Bei einer

Inkubation bei 250 °C konnten keine Partikel mehr nachgewiesen werden.

Diese Arbeit liefert einen wesentlichen Beitrag für die Aufklärung der Wechselwirkungen

zwischen Mikroorganismen und giftigen Substanzen. Die Umwandlung toxischer Stoffe,

wie beispielsweise Selenit, durch A. brasilense zu weniger toxischen elementaren Selen,

kann für die Wasseraufbereitung oder für die Regenerierung von selenbelasteten Böden

von Nutzen sein. Die Nanopartikel könnten in Industrie (Photovoltaik) und in der Medizin

(Pharmakotherapie) Anwendung finden.

I n h a l t s v e r z e i c h n i s S e i t e | IV

INHALTSVERZEICHNIS II.

ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................... II I.

INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................... IV II.

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................... VI III.

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................... VIII IV.

TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................................ XI V.

1 EINLEITUNG ................................................................................................................. 1 2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN ................................................................................... 3

2.1 Das Bakterium Azospirillum brasilense ............................................................... 3

2.2 Selen ........................................................................................................................ 4 2.2.1 Allgemeines ................................................................................................... 4 2.2.2 Vorkommen ................................................................................................... 5 2.2.3 Verwendung ................................................................................................... 6

3 MATERIAL UND METHODEN ....................................................................................... 7

3.1 Chemikalien ........................................................................................................... 7 3.2 Bakterienstamm..................................................................................................... 8 3.3 Kulturmedien und Lösungen ............................................................................... 8

3.3.1 Azo-Medium zur Kultivierung von Azospirillum brasilense......................... 8

3.3.1.1 Stammlösung für das Azo-Medium ................................................... 9 3.3.1.2 Spurenelementlösung (10-fach) ......................................................... 9

3.3.2 Reagenzien für die Proteinbestimmung ......................................................... 9

3.3.2.1 Lösung A .......................................................................................... 10

3.3.2.2 Lösung B .......................................................................................... 10 3.3.3 Salzlösung zur Isolierung der Nanopartikel ................................................. 10

3.4 Zellaufschlusspuffer/Lagerungspuffer .............................................................. 11 3.4.1 Kaliumphosphatpuffer (0,1 M) .................................................................... 11 3.4.2 PBS-Puffer ................................................................................................... 11

3.4.3 Lysispuffer ................................................................................................... 11

3.5 Methoden .............................................................................................................. 12 3.5.1 Erhaltung der Stammkultur .......................................................................... 12 3.5.2 Kultivierung von A. brasilense .................................................................... 12

3.5.3 Chemische Reduktion von Selenit und Selenat ........................................... 13 3.5.4 Mikrobielle Reduktion von Selenit und Selenat .......................................... 13

3.5.5 Lichtmikroskopie ......................................................................................... 14 3.5.6 Zellaufschluss mittels basischer Verseifung ................................................ 14 3.5.7 Proteinbestimmung ...................................................................................... 14 3.5.8 Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) ........... 16 3.5.9 Hydrid-Generation (Hydridtechnik) Atomabsorptionsspektrometrie

(HG-AAS) .................................................................................................... 16 3.5.10 Isolierung der Nanopartikel ......................................................................... 17 3.5.11 UV/Vis-Spektroskopie ................................................................................. 18 3.5.12 Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der energiedispersiven

Röntgenspektroskopie (REM-EDX) ............................................................ 18

3.5.13 Transmissionselektronenmikroskop in Kombination mit der

energiedispersiven Röntgenspektroskopie (TEM-EDX) ............................. 20

3.5.14 Bestimmung des Zetapotentials ................................................................... 20 3.5.15 Dynamische Lichtstreuung (DLS) ............................................................... 22

I n h a l t s v e r z e i c h n i s S e i t e | V

3.5.16 Raman-Spektroskopie der Nanopartikel ...................................................... 23 3.5.17 Thermostabilitätstest .................................................................................... 23 3.5.18 Bestimmung des Totalen organischen Kohlenstoffgehalts (TOC) .............. 24

4 ERGEBNISSE ............................................................................................................... 26 4.1 Wachstumskurve von A. brasilense ................................................................... 26 4.2 Reduktion von Selenat und Selenit durch das Bakterium A. brasilense ........ 28

4.2.1 Wachstumsverlauf in Gegenwart von Selen ................................................ 30 4.2.2 Messung der Selenit- und Selenatkonzentration .......................................... 33 4.2.3 Einfluss der Konzentration auf die mikrobielle Reduktion von Selenit

und das Wachstum von A. brasilense .......................................................... 36 4.2.4 Wachstumsverlauf des Bakteriums A. brasilense bei unterschiedlichen

Selenitkonzentrationen ................................................................................. 37

4.2.5 Messung der unterschiedlichen Selenitkonzentrationen .............................. 40

4.3 Charakterisierung der Nanopartikel ................................................................. 41 4.3.1 Farbgebung Nanopartikelsuspension nach der Isolierung ........................... 41 4.3.2 Elektronenmikroskopie in Kombination mit der energiedispersiven

Röntgenspektroskopie (EDX) ...................................................................... 44 4.3.3 Bestimmung der Oberflächenladung durch Zetapotentialmessungen ......... 48 4.3.4 Dynamische Lichtstreuung .......................................................................... 49 4.3.5 Raman-Spektroskopie .................................................................................. 54

4.3.6 Thermostabilitätstest .................................................................................... 55 4.3.6.1 UV/Vis-Spektroskopie ..................................................................... 56

4.3.6.2 Dynamische Lichtstreuung............................................................... 58 4.3.6.3 Bestimmung des TOC-Gehaltes ....................................................... 60

5 DISKUSSION ................................................................................................................ 62 5.1 Reduktion von Selenit/Selenat ............................................................................ 62

5.2 Charakterisierung der Nanopartikel ................................................................. 65 6 AUSBLICK ................................................................................................................... 70

7 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................................... 72 8 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ............................................................................... 76 9 DANKSAGUNG ............................................................................................................ 77

A b k ü r z u n g s v e r z e i c h n i s S e i t e | VI

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III.

°C Grad Celsius

A. brasilense Azospirillum brasilense

Azo-Medium Medium für Azospirillum brasilense

BCA Bicinchoninic Acid

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)

c Konzentration

Cu Kupfer

d.nm Durchmesser in nm

DLS Dynamische Lichtstreuung

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

EDX Energy Dispersive X-Ray (Energiedispersive Analyse der

Röntgenstrahlung)

g Fallbeschleunigung

HG-AAS Hydrid-Generation Atomabsorptionsspektrometrie

ICP-MS Inductive Coupled Plasma Mass Spectrometry

(Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem

Hochfrequenzplasma)

K Kontrolle

konz. konzentriert(e)

min. Minute(n)

MW Mittelwert

m/z Verhältnis Masse zu Ladung

N Atomanzahl im Molekül

OD Optische Dichte

pH Negativ dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionenkonzentration

PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)

pI Isoelektrischer Punkt

REM Rasterelektronenmikroskopie

RT Raumtemperatur

S Schwefel

Se Selen

A b k ü r z u n g s v e r z e i c h n i s S e i t e | VII

Se(0) Selen mit der Oxidationsstufe 0

Se(-II) Selen mit der Oxidationsstufe -2

Se(IV) Selen mit der Oxidationsstufe 4

Se(VI) Selen mit der Oxidationsstufe 6

St.Abw. Standardabweichung

t Zeit

td Verdopplungszeit

TEM Transmissionselektronenmikroskopie

TOC Total Organic Carbon (Totaler organischer Kohlenstoff)

TRIS Trishydroxymethylaminomethan

UV Ultraviolett (ultravioletter Spektralbereich)

µ Wachstumsrate

VE-Wasser vollentsalztes Wasser

Vis Visible (sichtbarer Spektralbereich)

x0 OD-Wert am Anfang der exponentiellen Phase

xt OD-Wert am Ende der exponentiellen Phase

A b b i l d u n g s v e r z e i c h n i s S e i t e | VIII

ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV.

Abbildung 1: Reduktion von Selenat zu Selenit und elementaren Selen ........................ 2

Abbildung 2: Bakterium A. brasilense auf festem Nährmedium ................................... 3

Abbildung 3: Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense .......................................... 3

Abbildung 4: Farbgebung nach 1 h Inkubation ............................................................. 15

Abbildung 5: BSA-Eichkurve zur Proteinbestimmung mit dem BCA-Reagenz .......... 15

Abbildung 6: Typische Kurve nach Auftragen des Zetapotentials gegen den pH-Wert

(Malvern Instruments 2007) .................................................................... 22

Abbildung 7: Stahlautoklav mit eingesetzten Teflonbecher ......................................... 24

Abbildung 8: Bestimmungsformen des Kohlenstoffs ................................................... 25

Abbildung 9: Logarithmische Darstellung der Wachstumskurve von A. brasilense .... 26

Abbildung 10: Farbverlauf der Kontrolle ........................................................................ 28

Abbildung 11: Farbverlauf der Selenatkultur .................................................................. 28

Abbildung 12: Farbverlauf der Selenitkultur .................................................................. 28

Abbildung 13: Farbliche Entwicklung der Kontroll-, Selenat- und Selenitkultur nach

sieben Tagen Kultivierung ...................................................................... 29

Abbildung 14: Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense im Kontrollmedium

(ohne Nanopartikel) ................................................................................ 30

Abbildung 15: Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense mit Nanopartikeln im

Selenatansatz (ohne Nanopartikel) .......................................................... 30

Abbildung 16: Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense mit Nanopartikeln im

Selenitansatz ............................................................................................ 30

Abbildung 17: Hellfeldaufnahme der Nanopartikel in der Selenitkultur ........................ 30

Abbildung 18: Logarithmische Darstellung der OD-Werte der Kontroll-, Selenit- und

Selenatkultur ........................................................................................... 31

Abbildung 19: Darstellung der Gesamtzellproteinkonzentration der Kontroll-, Selenit-

und Selenatkultur .................................................................................... 32

Abbildung 20: Vergleich der Messungen der Selenitkonzentrationen der HG-AAS und

der ICP-MS ............................................................................................. 34

Abbildung 21: Zeitlicher Verlauf der Selenkonzentration im Selenit- und

Selenatansatz ........................................................................................... 35

Abbildung 22: Zeitlicher Verlauf der Selenat- und Selenitintensität und den daraus

resultierenden Selennanopartikelanteil ................................................... 36

A b b i l d u n g s v e r z e i c h n i s S e i t e | IX

Abbildung 23: Farbentwicklung nach sieben Tagen bei unterschiedlichen

Selenitkonzentrationen ............................................................................ 37

Abbildung 24: Wachstumskurven der Kontrollkultur und den Ansätzen mit

unterschiedlichen Selenitkonzentrationen ............................................... 37

Abbildung 25: Zeitlicher Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration der

Kontrollkultur und den Ansätzen mit unterschiedlichen


Abbildung 26: Zeitlicher Verlauf der Gesamtselenkonzentration der unterschiedlichen


Abbildung 27: Suspension der isolierten Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz

(Ansatz 1)) ............................................................................................... 42

Abbildung 28: Suspension der isolierten Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz

(Ansatz 2)) ............................................................................................... 42

Abbildung 29: Suspension der isolierten Nanopartikel (2,5 mM-Selenitansatz) ............ 42

Abbildung 30: Suspension der isolierten Nanopartikel (5 mM-Selenitansatz) ............... 42

Abbildung 31: Chemischen Reduktion von Selenit (Bildung von rotem Niederschlag) 43

Abbildung 32: Chemische Reduktion von Selenat (kein Niederschlag) ......................... 43

Abbildung 33: UV/Vis Spektren des chemisch reduzierten Selenits .............................. 43

Abbildung 34: A. brasilense mit Nanopartikeln aus dem Selenitansatz (Methode ohne

Fixierung) ................................................................................................ 44

Abbildung 35: Nanopartikel aus dem Selenitansatz (Methode ohne Fixierung) ............ 44

Abbildung 36: A. brasilense mit Nanopartikeln aus dem Selenitansatz (Fixierung mit

Glutaraldehyd) ......................................................................................... 45

Abbildung 37: EDX-Spektrum der Nanopartikel ............................................................ 45

Abbildung 38: Bakterien ohne Nanopartikel aus dem Selenatansatz (Fixierung mit

Glutaraldehyd) ......................................................................................... 46

Abbildung 39: EDX-Spektrum aus dem Selenatansatz ................................................... 46

Abbildung 40: TEM-Aufnahme der Nanopartikel .......................................................... 47

Abbildung 41: EDX-Spektrum der Nanopartikel ............................................................ 47

Abbildung 42: EDX-Spektrum der von Nanopartikel umgebenden Substanz ................ 48

Abbildung 43: Zetapotentiale aller Nanopartikelsuspensionen der Selenitansätze mit

Mittelwert aller Zetapotentialmessungen mit Standardabweichung ....... 48

Abbildung 44: Partikelgrößenverteilung der 1 mM-Selenitansätze ................................ 49

Abbildung 45: Autokorrelationsfunktion ........................................................................ 51

A b b i l d u n g s v e r z e i c h n i s S e i t e | X

Abbildung 46: Durchschnittliche Partikelgrößen der 1 mM-Selenitansätze ................... 52

Abbildung 47: Durchschnittliche Partikelgrößen der 2,5 mM-Selenitansätze ................ 52

Abbildung 48: Partikelgrößenverteilung der Nanopartikel bei unterschiedlichen


Abbildung 49: Darstellung der durchschnittlichen Partikelgröße aller 1 mM-

Selenitkulturen und Ermittlung des durchschnittlichen Durchmessers .. 54

Abbildung 50: Raman-Spektrum der Nanopartikelsuspension ....................................... 55

Abbildung 51: Aufnahme der Ausgangslösung und der bei unterschiedlich hohen

Temperaturen inkubierten Nanopartikelsuspension ................................ 56

Abbildung 52: UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei unterschiedlichen

Inkubationstemperaturen ......................................................................... 57

Abbildung 53: UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei einer Inkubation von

100 °C und 250 °C .................................................................................. 58

Abbildung 54: Partikelgrößenverteilung der Ausgangslösung und der Proben, die bei

35 °C, 50 °C und 100 °C inkubiert wurden ............................................. 59

Abbildung 55: Grafische Darstellung des TOC-Gehaltes der Nanopartikelsuspension vor

und nach der Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen ............... 60

T a b e l l e n v e r z e i c h n i s S e i t e | XI

TABELLENVERZEICHNIS V.

Tabelle 1: OD-Werte und die jeweiligen Zeiten am Anfang und Ende der

exponentiellen Phase, Wachstumsrate und Verdopplungszeit ................ 27

Tabelle 2: Zeitpunkt und OD-Wert des Maximums der Kontroll-, Selenat- und

Selenitkultur ............................................................................................ 31

Tabelle 3: Zeitpunkt und OD-Wert der Maxima der unterschiedlichen

Selenkonzentrationen .............................................................................. 38

Tabelle 4: Zeitpunkt und Proteinkonzentration der Maxima der unterschiedlichen

Selenkonzentrationen .............................................................................. 39

Tabelle 5: Vergleich der berechneten und mittels ICP-MS gemessenen

Selenitanfangskonzentrationen ............................................................... 40

Tabelle 6: Durchschnittliche Partikeldurchmesser der verschiedenen Ansätze ....... 50

Tabelle 7: Inkubationstemperaturen mit dazugehörigem durchschnittlich

gemessenem Durchmesser ...................................................................... 59

E i n l e i t u n g S e i t e | 1

1 EINLEITUNG

Ein schwerwiegendes Problem für die Umwelt ist die Verschmutzung durch umwelt-

schädigende Substanzen, welche immer mehr auf Aktivitäten der Menschen zurück-

zuführen ist. Die Quellen dafür sind meistens landwirtschaftlich oder industriell

verursachte Eintragspfade. Umweltbiologen und ökologische Risikobewerter beschäftigen

sich mit Schadstoffen, die eine hohe Gefährdung der Umwelt aufweisen, wobei häufig

Stoffe, wie Selen, vernachlässigt werden.

Doch gerade Selen weist ernste langfristige Risiken speziell für die aquatischen

Lebensräume und die damit verbundenen Nahrungspfade auf. Werden diese Lebensräume

mit Selen verschmutzt, so folgt daraus eine Anreicherung in allen mit dem Wasserkreislauf

verbundenen Organismen. Durch Aufnahme von Nahrung, wie zum Beispiel Pflanzen und

Tieren, die auf selenhaltigen Boden vorkommen, nimmt auch der menschliche Körper

unbewusst Selen zu sich. Eine erhöhte Selenkonzentration hat einen negativen Einfluss auf

die menschliche Gesundheit und auch auf die Landwirtschaft. Durch Aufnahme und

Bioakkumulation in den Organismen in den verschiedenen Nahrungsebenen ist ein

gezielter Eingriff für die Unterbrechung der Aufnahme von Selen nicht gewährleistet

(Lemly 2004).

Selen ist in der Natur Bestandteil eines biogeochemischen Zyklus, bei dem mit Hilfe von

mikrobiell ablaufenden Redoxreaktionen jede Oxidationsstufe des Selens erreicht werden

kann. Einige Bakterien nutzen während der Respiration des Kohlenstoffs Selenat und

Selenit als Elektronenakzeptor in ihrem Energiestoffwechsel. Dabei ist zwischen Bakterien

zu unterscheiden, die zum Einen anaerob und zum Anderen aerob die Oxyanionen

reduzieren (Fernández-Martínez 2009). Somit besitzen beispielsweise einige Bakterien die

Fähigkeit Selenat zu ungiftigen elementarem Selen zu reduzieren (Zhang et al. 2003).

Herbel et al. (2003) beschreiben, dass einige Bakterienstämme elementares Selen zu

Selenid reduzieren oder Selenid zu elementaren Selen oxidieren können. Andere wiederum

können elementares Selen oder Selenid zu Selenit oder Selenat oxidieren (Sarathchandra &

Watkinson 1981, Levanony & Bashan 1991, Dowdle & Oremland 1998).

Bis zum heutigen Tage sind 16 Spezies von Bakterien und Archaeen bekannt, bei denen

unter anaeroben Bedingungen organisches Material oder Wasserstoff oxidiert wird, um

Selenoxyanionen zu reduzieren (Stolz & Oremland 1999).

E i n l e i t u n g S e i t e | 2

Eine Besonderheit einiger Bakterienstämme ist es, dass sie in der Lage sind, das giftige

Selenit oder Selenat in Form von Nanopartikeln umzusetzen. Dieser Prozess der Entgiftung

wird als Bioremediation bezeichnet, bei dem Bakterien zur Sanierung des kontaminierten

Bodens oder selenhaltiger Gewässer beitragen können. Es beschreibt die durch

Organismen generierte biologische Umwandlung, um kontaminierte biologische Systeme

zu sanieren (Frankenberger & Arshad 2001). Die Nanopartikel können sich je nach

Bakterienstamm entweder innerhalb oder außerhalb der Zellwand anlagern (Oremland et

al. 2004).

In der vorliegenden Arbeit wird das Bakterium Azospirillum brasilense auf dessen

Fähigkeit untersucht, die toxischen Selenoxyanionen Selenat und Selenit zum weniger

toxischen elementaren Selen zu reduzieren (Abbildung 1). In der Publikation von

Tugarova et al. (2013) wird beschrieben, dass das Bakterium A. brasilense unter aeroben

Bedingungen Selenit zu elementaren Selen unter Bildung von Nanopartikeln reduzieren

kann. Aufbauend auf diesen Aspekt wird in dieser Arbeit untersucht, inwiefern eine

Reduktion von Selenat durch das Bakterium A. brasilense stattfindet. Des Weiteren wird

die Selentoleranz der Bakterien analysiert, indem unterschiedliche Konzentrationen an

Selenit eingesetzt werden. Durch eine Vielzahl angewendeter Methodik werden die von

den Zellen isolierten Nanopartikel charakterisiert.

SeO4

2-

(Selenat)

SeO32-

(Selenit)

Se0

(Elementares Selen)

Lösliches Se

(toxisch) Unlösliches Se

(weniger toxisch)

Mikrobielle Reduktion durch

A.brasliense

Mikrobielle Reduktion durch

A.brasliense

Charakterisierung der

Nanopartikel: • Zetapotential

• Dynamische

Lichtstreuung

• Thermostabilität

• UV/Vis-Spektroskopie

• Totale Kohlenstoffgehalt

Abbildung 1: Reduktion von Selenat zu Selenit und elementaren Selen

T h e o r e t i s c h e G r u n d l a g e n S e i t e | 3

2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN

2.1 DAS BAKTERIUM AZOSPIRILLUM BRASILENSE

Die Bakterien der Gattung Azospirillum (Abbildung 2 und Abbildung 3) gehören zu der

phylogenetischen Gruppe der α-Proteobacteria, sind gram-negativ und zählen zu den Plant

growth-promoting rhizobacteria (PGPR) (Kloepper et al. 1991), da die Bakterien die

Fähigkeit besitzen das Wachstum und den Ertrag von Pflanzen zu fördern. Dies geschieht

durch die Ausscheidung von Phytohormonen (z.B. Indolessigsäure) durch das Bakterium

und bewirkt bei Pflanzen eine morphologische Veränderung der Wurzeloberfläche, in dem

mehr Wurzelhaare gebildet werden. Es kommt zu einer Vergrößerung der Oberfläche,

welche zu einer besseren Aufnahme von Nährstoffen und Wasser aus dem Boden führt und

schließlich ein erhöhtes Streckwachstum verursacht (Bloemberg & Lugtenberg 2001). In

Folge dessen kann es zu einer Steigerung der Ertragsausbeute von 5 bis 30 % kommen.

Aufgrund dieser Ertragssteigerung setzt der Mensch in der Landwirtschaft Azospirillen als

Bestandteil in ökologischen Düngern ein (Okon & Labanderagonzalez 1994).

Abbildung 2: Bakterium A. brasilense auf

festem Nährmedium

Abbildung 3: Mikroskopische Aufnahme von

A. brasilense

Bakterien der Gattung Azospirillum, insbesondere A. brasilense, gehören zu der am

meisten studierten Rhizobakterien und sind dafür bekannt Symbiose mit höheren Pflanzen

einzugehen (Bashan & de-Bashan 2010). A. brasilense gilt als fakultativ endophytisches

Bakterium, da es auch außerhalb der Wurzel leben kann. Einige Bakterienstämme dieser

Gattung konnten von Pflanzenwurzeln aus gemäßigten bis subtropischen Gegenden isoliert

werden (Rothballer et al. 2003).


Dabei ist besonders A. brasilense von großer Bedeutung, da das Bakterium vermehrt an

den Wurzeln von Nutzpflanzen, wie Mais (Gafny et al. 1986), Weizen (Bashan et al.

1986), Reis (Murty & Ladha 1987), Tomaten, Pfeffer, Baumwolle und Sojabohnen

(Bashan et al. 1991, Levanony & Bashan 1991), vorkommt.

Eine weitere wichtige Charakteristik der Rhizobakterien ist es, dass sie die Fähigkeit

besitzen atmosphärischen Stickstoff zu binden. Dies spielt jedoch eine untergeordnete

Rolle bei Azospirillum brasilense (Patriquin et al. 1983).

2.2 SELEN

2.2.1 Allgemeines

Selen wurde als neues Element im Jahre 1817 von Jöns Jacob Berzelius entdeckt. Bei dem

Versuch Schwefel aus einem schwefelhaltigen Felsen zu isolieren, entstand eine

ungewöhnliche Rotfärbung. Berzelius benannte den Stoff „Selenium“, abgeleitet von der

griechischen Mondgöttin Selene, in Anlehnung an das schon früher entdeckte Tellur

(„Erde“) (Berzelius 1817, Berzelius 1818, Lide 1994).

Selen ist ein Nichtmetall mit der Ordnungszahl 34 und einer relativen Atommasse von

78,96 u. Selen ist chemisch verwandt mit anderen Stoffen der 16. Gruppe. Diese Gruppe

der Chalkogene enthält neben Selen auch Sauerstoff, Schwefel, Tellur und Polonium. In

der Natur sind vier verschiedene Oxidationsstufen vorzufinden: (-II), (0), (IV) und (VI).

Dabei liegen Selenit (SO32-

) und Selenat (SO4

2-) als lösliche Oxyanionen (AxOy

z−) vor. Die

Oxyanionen zeigen eine erhöhte Löslichkeit und Mobilität mit steigendem pH-Wert, im

Gegensatz zu Metallen, die ein entgegengesetztes Verhalten zeigen (Chapman et al. 2010).

Neben diesen anorganischen Formen des Selens gibt es auch nicht-flüchtige Selenide

(Se (–II)), wie zum Beispiel Selenocystein (21. Aminosäure), die am meisten

vorkommende Selenspezies im mensch-lichen Körper (Fernández-Martínez 2009). Das

Auftreten der verschiedenen Spezies des Selens leitet sich von den physikalisch-

chemischen Eigenschaften ab. Die Oxyanionen Selenit und Selenat kommen vorwiegend

in wässrigen Lösungen oder in belüfteten basischen Böden vor. Im Gegensatz dazu finden

sich unlöslichen Selenide und das elementare Selen meist in minder belüfteten sauren

Böden vor, welche reich an organischem Material sind.


Selen besitzt sowohl einen toxischen als auch einen nützlichen Charakter. Dabei ist die

Konzentrationsspanne zwischen Selenmangel (< 40 µg/Tag) und einer Selenvergiftung

(> 400 µg/Tag) sehr gering (Levander & Burk 2006). Ein Selendefizit steht in Verbindung

mit Leber,- Muskel- und Herzerkrankungen. Somit stellt das Spurenelement Selen in der

Ernährung einen essentiellen Nährstoff, aber auch ein Gift dar (Schwarz & Foltz 1957).

2.2.2 Vorkommen

Sowohl in Steinen, verschiedenen Böden, als auch in Wasser und Luft kommt Selen vor

und gilt somit als weitverbreitete Komponente. Der Umweltqualitätsstandard für die

Wasserqualität besagt, dass ≤ 0,01 mg/l Selen enthalten sein dürfen. Im Gegensatz dazu

befindet sich in Industrieabwässern ein Selengehalt von ≤ 0,1 mg/l (McNeal &

Balistrieri 1989, Soda 2009). Weitere anthropogene Quellen des Seleneintrags in die

Atmosphäre sind die Kohle- und Erdölverbrennung, aber auch während der Extraktion und

Verarbeitung verschiedener Elemente (Kupfer, Zink, Uran, etc.) entsteht Selen (Fernández-

Martínez 2009). Erhöhte Selenwerte im Boden wurden in den Ländern China (Wang &

Gao 2001), Indien (Dhillon & Dhillon 2003), Irland (Seby et al. 1997) und den USA

(Presser 1994) festgestellt. Durch die zunehmende Verwendung von Selen in den

industriellen und medizinischen Bereichen gelangt es in das Abwassersystem und somit in

dem gesamten Wasserkreislauf. Dies stellt einen weiteren Eintragspfad von Selen in die

Umwelt dar.

Die primäre natürliche Selenquelle stellt die Verwitterung von Gesteinen dar, insbesondere

tonhaltige Gesteine, die eine höhere Konzentration an Selen enthalten. Ein weiterer

Eintragspfad ergibt sich durch vulkanische Aktivitäten, bei dem Selen in die Atmosphäre

freigegeben wird (McNeal & Balistrieri 1989).

Im Pflanzenreich kommt Selen besonders in Pflanzen, beispielsweise im Knoblauch vor,

bei den es als Se-Methylselenocystein vorliegt. Pflanzen nehmen Selen in Abhängigkeit

vom Selengehalt des Standortes des Organismus auf. Wenige Pflanzen, beispielsweise der

Gattung Astragalus, besitzen sogar die Fähigkeit Selen zu akkumulieren, weshalb sie auch

als „Selen-Hyperakkumulatoren“ bezeichnet werden (Virupaks & Shrift 1965).


2.2.3 Verwendung

Selen ist von großem Interesse für die Photovoltaikindustrie aufgrund der halbleitenden

Eigenschaften bei Raumtemperatur (RT) und der ausgeprägten Photoleitung. Folge dessen

kommt Selen als hochreine Chemikalie bei der Entwicklung von Solarzellen zum Einsatz

(Kausch & Matschullat 2005, Neukirchen 2009).

Aufgrund der unterschiedlichen Farbgebung von Selen wird es in der Glasindustrie zum

Färben von Fenstergläsern und zum Entfärben des Grüntons von Flaschenglas verwendet

(Kausch & Matschullat 2005).

Neue Studien belegen, dass sich Selennanopartikel positiv in der Pharmakotherapie

auswirken. Von der Verwendung von sogenannten „Subnanopartikeln“ (0,4 – 1 nm) wurde

viel in medizinischen Bereichen berichtet. So rufen diese Anti-Tumor-Effekte hervor

(Miyagi et al. 2003), werden als Anti-Leukämie-Mittel (Sieber 2003) oder als Antioxidans

(Gao et al. 2002) verwendet.

M a t e r i a l u n d M e t h o d e n S e i t e | 7

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 CHEMIKALIEN

Stoff Hersteller; Lot.-Nr.

Agar (Difco™) BD; 2363441

Ammoniumsulfat (NH4)2SO4 Merck; A0080411044

1. Biotin (C10H16N2O3S) Sigma; 019K1769

Bovine Serum Albumin (BSA) Merck; K2881118645

Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 · 2 H2O) Merck; A862982745

Eisen(II)-Sulfat-Heptahydrat (FeSO4 · 7 H2O) Merck; TA886265046

1. D-(+)-Glucose, wasserfrei (C6H12O6) Roth; 290158205

Glutaraldehyd (C5H8O2) Serva; PO90341

Hefeextrakt BD; 0344732

Hydroxylamin-Hydrochlorid (NH4OCl) Merck; S22427741

Kaliumchlorid (KCl) Roth; 071167621

di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Merck; A880404803

Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) Calbiochem; B32851

Kupfersulfat-Heptahydrat (CuSO4 · 5 H2O) Merck; A866453618

Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 · 7 H2O) Merck; A972786844

Mangan(II)-Sulfat-Monohydrat (MnSO4 · H2O) Merck; 3837841634

Natriumcarbonat, wasserfrei (Na2CO3) Roth; 042178778

Natriumchlorid (NaCl) Roth; 202186415

Natriumhydrogenphosphat (NaHCO3) Roth; 192185982

Natriumhyrdogenphosphat-Dihydrat (NaHCO3 · 2 H2O) Roth; 44837953

Natriumhydroxid (NaOH) Merck; B0160998743

di-Natrium-Molybdat-Dihydrat (Na2MoO4 · 2 H2O) Merck; A854221520

Natriumtartrat-Dihydrat (C₄H₄Na₂O₆ · 2H₂O) Aldrich; 06619TH-259

Trishydroxymethylaminomethan (TRIS) (C4H11NO3) Roth; 172182199

Salzsäure (HCl) Roth; 211867465

Natriumselenit (Na2SeO3) Applichem; 1Y008059

Natriumselenat (Na2SeO4) Sigma; 13555558


3.2 BAKTERIENSTAMM

Für diese Arbeit wurde der Bakterienstamm Azospirillum brasilense (DSMZ 1843)

verwendet.

3.3 KULTURMEDIEN UND LÖSUNGEN

Alle unter sterilen Bedingungen stattfindenden Arbeiten wurden an der Sterilbank Heraeus

Instruments des Typs „Hera Safe“ durchgeführt. Die für die Kulturmedien oder anderen

Lösungen abzuwiegenden Mengen wurden entweder an der Feinwaage „LA 129 S“ der

Firma Sartorius oder an der Waage (ab 1 g) der Firma Kern (Typ 510) abgewogen. Für das

Einstellen der pH-Werte wurde das pH-Meter der Firma WTW des Typs pH 540, MultiCal

verwendet. Mit Hilfe verschiedener Konzentrationen einer verdünnten Natriumhydroxid-

lösung (0,01 M; 0,1 M; 1 M; 10 M) und einer verdünnten Salzsäure (0,01 M; 0,1 M; 1 M;

10 M) wurde der gewünschte pH-Wert eingestellt.

3.3.1 Azo-Medium zur Kultivierung von Azospirillum brasilense

Das Medium für das Bakterium A. brasilense wird nach der Vorschrift der Deutschen

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (DSMZ 2007) hergestellt.

Dieses Medium ist speziell auf das verwendete Bakterium abgestimmt und wird in der

vorliegenden Arbeit weitergehend als Azo-Medium bezeichnet.

Stammlösung 950 ml

Spurenelementlösung (10-fach konzentriert) 1 ml

Na-Malat-Lösung (20%-ig) 25 ml

Glucose-Lösung (20%-ig) 25 ml

Biotin 500 µl

pH 7,1

Für das Medium wurde ein Volumen von 1 l angesetzt. Dazu wurde zunächst die

Stammlösung (Kapitel 3.3.1.1) hergestellt und nach vollständigem Lösen der Substanzen

in vollentsalztem Wasser (VE-Wasser) bei 121 °C 30 Minuten autoklaviert (Hiclave™,

HV-25).


Nach Abkühlen der Stammlösung wurde die sterile Spurenelementlösung mit dem sterilen

Biotin zu dem Medium gegeben. Die Natrium-Malat-Lösung und die Glucose-Lösung

wurden sterilfiltriert und zu dem Medium hinzugeführt.

3.3.1.1 Stammlösung für das Azo-Medium

Die Stammlösung für das Azo-Medium (Kapitel 3.3.1) setzt sich wie folgt zusammen.

CaCl2 · 2 H2O 0,02 g

Hefeextrakt 0,05 g

K2HPO4 0,25 g

MgSO4 · 7 H2O 0,20 g

NaCl 0,10 g

(NH4)2SO4 1,00 g

VE-H2O

950 ml

3.3.1.2 Spurenelementlösung (10-fach)

Die Spurenelementlösung (10-fach) für das Azo-Medium wurde aus folgenden Substanzen

zusammengesetzt:

FeSO4

· 7 H2O 0,1 g

MnSO4

· H2O 0,02 g

Na2MoO4 · 2 H2O 0,01 g

VE-H2O ad 10 ml

3.3.2 Reagenzien für die Proteinbestimmung

Für die Proteinbestimmung wurde die Lösung C erst kurz vor der Anwendung frisch

hergestellt. Diese Lösung wurde in einem Verhältnis von 50:1 aus den Lösungen A und

Lösung B angesetzt.


3.3.2.1 Lösung A

BCA 1 g

Na2CO3 1,49 g

C4H4Na2O6 · 2 H2O 0,19 g

NaOH 0,4 g

NaHCO3 0,96 g

VE-H2O

50 ml

pH 11,25 mit 5 N NaOH

VE-H2O

ad 100 ml

3.3.2.2 Lösung B

CuSO4 · 5 H2O 1 g

VE-H2O

25 ml

3.3.3 Salzlösung zur Isolierung der Nanopartikel

NaCl 17,5 g

KCl 0,74 g

MgSO4 · 7 H2O 12,3 g

TRIS 0,15 g

VE-H2O

ad 1000 ml

pH 7,5


3.4 ZELLAUFSCHLUSSPUFFER/LAGERUNGSPUFFER

3.4.1 Kaliumphosphatpuffer (0,1 M)

Kaliumphosphat-Lösung (mono-Kalium-Salz) 16 ml

KH2PO4 2,72 g

VE-H2O 100 ml

Kaliumphosphat-Lösung (di-Kalium-Salz) 84 ml

K2HPO4 3,48 g

VE-H2O 100 ml

VE-H2O 100 ml

pH 7,5

3.4.2 PBS-Puffer

NaCl 0,8 g

KCl 0,02 g

NaHCO3 · 2 H2O 0,18 g

KH2PO4 0,024 g

VE-H2O ad 100 ml

pH 7,4

3.4.3 Lysispuffer

NaCl 9 g

NaOH 12 g

VE-H2O ad 1000 ml


3.5 METHODEN

3.5.1 Erhaltung der Stammkultur

Die Stammkultur von A. brasilense wurde auf einem festen Nährboden, bestehend aus

Azo-Medium (Kapitel 3.3.1) mit 1,5 % Agar, kultiviert. Zur Erhaltung dieser, wurde

einmal monatlich 1 bis 2 cm der Kultur mit einer sterilen Impföse aufgenommen und auf

eine frische Kulturplatte ausgestrichen. Die Kulturplatte wurde anschließend bei

Raumtemperatur gelagert.

3.5.2 Kultivierung von A. brasilense

Um eine Vorkultur des Bakteriums A. brasilense herzustellen wurden 1 bis 2 cm der

Kultur mit einer sterilen Impföse von dem festen Nährboden aufgenommen und in einem

mit 30 ml flüssigen Azo-Medium befüllten Erlenmeyerkolben überführt. Die Inkubation

erfolgte über Nacht im Wärmeraum bei 30 °C auf dem Schüttler der Firma Sartorius (Typ

Certomat MO II) mit 100 Umdrehungen pro Minute (rpm).

Die Kultivierung von A. brasilense erfolgte in Erlenmeyerkolben mit 100 ml Azo-Medium

ebenfalls bei 30 °C, 100 rpm unter aeroben Bedingungen. Der Wachstumsverlauf der

Zellkultur wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von

600 nm mittels Photometer der Firma Pharmacia Biotech (Typ: Ultrospec 1000) verfolgt.

Die Berechnung der Wachstumskonstanten (μ) in der exponentiellen Phase des Wachstums

erfolgt nach Formel 1 (F. 1) und die der Verdopplungszeit der Zellmasse (td) nach der

Formel 2 (F. 2).

F. 1

F. 2


3.5.3 Chemische Reduktion von Selenit und Selenat

Um Selenat bzw. Selenit chemisch zu reduzieren wurden 100 µl einer 100 mM-Selenit-

und 100 µl einer 100 mM-Selenatlösung in je ein Reaktionsgefäß gegeben und mit je

600 µl VE-Wasser verdünnt.

Anschließend wurden je 200 µl Hydroxylamin (100 mM) hinzu pipettiert. Das durch die

chemische Reduzierung entstandene elementare Selen wird mit dem mikrobiell reduzierten

verglichen. Dabei wird auf Farbe und Form der Partikel und Absorption, welches mit Hilfe

der UV/Vis-Spektroskopie (Kapitel 3.5.11) untersucht wird, eingegangen.

3.5.4 Mikrobielle Reduktion von Selenit und Selenat

Zur Untersuchung der mikrobiellen Reduktion von Selenat und Selenit durch A. brasilense

erfolgte die Kultivierung der Zellen mit Selen, wie in Kapitel 3.5.2 beschrieben. Die

Ansätze wurden aus der Vorkultur so angeimpft, bis sich eine OD600nm von 0,25 einstellt.

Je nach zu untersuchender Selenat- (1 mM) oder Selenitkonzentration (1 mM bis 5 mM)

wurde ein entsprechendes Volumen aus den 100 mM-Stammlösungen in das Kultur-

medium überführt.

Insgesamt gab es je 2 Ansätze mit Selenat und je 2 mit Selenit. Zusätzlich wurden 3

Kontrollansätze mitgeführt:

Kontrolle 1: Medium + Bakterien

Kontrolle 2: Medium + Selenit

Kontrolle 3: Medium + Selenat

Die Probenentnahme (zweimal täglich) erstreckte sich über einen Zeitraum von 7 bis

10 Tagen. Der Wachstumsverlauf während der Kultivierung wurde durch Messung der

Optischen Dichte bei 600 nm, sowie der Bestimmung des Gesamtproteingehalts verfolgt.

Außerdem wurde der pH-Wert im Medium zu den Probezeitpunkten gemessen. Der

Selengehalt wurde mittels ICP-MS (Kapitel 3.5.8) und HG-AAS (Kapitel 3.5.9) ermittelt.

Dabei wurden 5 ml der jeweiligen Kultur abgenommen und bei 10.000 x g für 10 min

zentrifugiert. Jeweils 2 ml des Überstandes wurden auf zwei Reaktionsgefäße aufgeteilt.

Die Probe, die für die Messung mittels ICP-MS bestimmt war, wurde mit 20 µl

konzentrierter Salpetersäure versetzt. Die andere Probe wurde weiterverwendet für die

HG-AAS. Die Lagerung bis zur Messung erfolgte im Tiefkühlschrank.


3.5.5 Lichtmikroskopie

Für die optische Untersuchung wurde das Lichtmikroskop Olympus (BX 61) mit einer

1000-fachen Vergrößerung verwendet. Hierbei wurden die Bakterien mittels Phasen-

kontrastaufnahme untersucht, während die Nanopartikel im Hellfeld sichtbar gemacht

wurden.

3.5.6 Zellaufschluss mittels basischer Verseifung

Eine weitere Kontrolle des Zellwachstums ist die Ermittlung der Gesamtzell-

proteinkonzentration. Dafür müssen die Zellen der entnommen Proben zunächst mittels

basischer Verseifung aufgeschlossen werden.

Dazu wurden die Zellen durch Zentrifugation 10 min bei 10.000 x g (Centrifuge 5804 R,

Eppendorf) vom Medium getrennt. Das Zellpellet wurde mit 500 µl Lysispuffer

(Kapitel 3.4.3) resuspendiert (Scientific Industries, Vortex-Genie 2), für 10 min im

Heizblock bei 90 °C inkubiert und erneut zentrifugiert. Vom Überstand wurde 50 µl

entnommen und im Anschluss die Proteinkonzentration durch das Bicinchoninic Acid

(BCA) Protein Assay (Kapitel 3.5.7) bestimmt.

3.5.7 Proteinbestimmung

Für die Proteinbestimmung wurde das Prinzip des Bicinchoninic Acid (BCA) Protein

Assays verwendet, welches auf der Bildung eines Kupfer2+

-Proteinkomplexes unter

basischen Bedingungen beruht (Biuret-Reaktion). Nachdem sich der Komplex gebildet hat,

kommt es zur Reduktion von Cu2+

zu Cu+. Durch die anschließende Chelatbildung von

zwei Molekülen BCA mit einem Cu+-Ion verfärbt sich die Lösung blau-violett

(Abbildung 4). Die Konzentration des gebildeten Farbstoffes wurde durch Messung der

Absorption bei 562 nm mit dem Plattenreader µQuant der Firma Bio-Tek Instruments, inc.

gemessen. Die Höhe der Reduktion des Kupfers ist dabei proportional zu der Menge an

Protein (Smith et al. 1985).


Abbildung 4: Farbgebung nach 1 h Inkubation

Nachdem jeweils 50 µl des Überstandes der Probe entnommen wurde (Kapitel 3.5.6),

konnten 950 µl der Reagenz C (Kapitel 3.3.2) hinzugegeben werden. Als Blank- bzw.

Referenzlösung wurden bei jeder Messung Lysispuffer und Rinderserumalbumin

(1 mg/ml) in einem Konzentrationsbereich von 100 bis 800 µg/ml mitgeführt. Die Proben

wurden für eine Stunde bei RT inkubiert und für die Messung (Doppelbestimmung) der

Absorption im Plattenreader jeweils 200 µl in ein Well der Mikrotiterplatte (Greiner,

bio-one-PS Microplate) überführt. Anhand der Eichgerade (Abbildung 5) wurde die

Proteinkonzentration ermittelt.

y = 3884,5x - 912,9R² = 0,9972

-50

150

350

550

750

950

1150

0,22 0,27 0,32 0,37 0,42 0,47

BS

A-K

on

zen

tra

tio

n [

µg

/ml]

OD562nmEichgerade Linear (Eichgerade)

Abbildung 5: BSA-Eichkurve zur Proteinbestimmung mit dem BCA-Reagenz


3.5.8 Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS)

Die Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS, inductively-

coupled-plasma massspectrometry) ist ein Verfahren der Spurenelementanalytik, bei dem

der Gesamtgehalt an Selen in den Proben ermittelt wird.

Die flüssigen Proben werden über ein Zerstäubersystem als feine Tropfen in das induktiv

gekoppelte Argonplasma überführt und bei einer Temperatur von ca. 5000 °C ionisiert.

Dieses Plasma wird durch einen hochfrequenten Strom in ionisiertem Argon induziert. Die

geladenen Molekülfraktionen werden beschleunigt und über ein Linsensystem in das

Hochvakuum des Massenspektrometers überführt. Die Ionenoptik fokussiert den

Ionenstrahl, der in einem Magnetfeld, dem Quadrupol-Massenspektrometer, eingebracht ist

und die Moleküle abhängig von ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis auftrennt. Dem

entsprechend erfolgt eine Einteilung der Probemoleküle nach Molekülmasse. Die Ionen

werden mit Hilfe eines ladungssensitiven Detektors analysiert. Da jedes Element

mindestens ein Isotop aufweist und dessen Masse bei keinem natürlichen Isotop eines

anderen Elements auftritt, ist die Masse eine charakteristische Eigenschaft der Elemente

(Schmidt & Gebel 2000, Less et al. 2008).

Die Messung der Proben wurde an dem Institut für Ressourcenökologie mit dem Gerät der

Firma Perkin Elmer des Typs SCIEX Elan 9000 durch Frau Aline Ritter durchgeführt.

3.5.9 Hydrid-Generation (Hydridtechnik) Atomabsorptionsspektrometrie

(HG-AAS)

Mit Hilfe der Hydridtechnik können Metalle analysiert werden, die flüchtige Hydride

bilden, wozu Arsen, Bismuth, Antimon, Eisen und auch Selen zählen. Bevor die Probe

analysiert werden kann, muss sie in ionogener Form vorliegen. Um dies zu realisieren,

wurde die Probe chemisch vorbehandelt durch Verdünnung mit 3 %-iger Salzsäure, welche

auch gleichzeitig zum Verdünnen der Kalibrierlösung verwendet wurde. Diese Salzsäure

dient als Trägerlösung. Als Reduktionsmittel dient ein Gemisch aus 0,2 %-igem Natrium-

bortetrahydrid und 0,05 %-iger Natriumhydroxidlösung in Wasser.

Zuerst wurde der Selenstandard (10 µg/ml) 1:100 verdünnt und je 10 µl, 50 µl, 100 µl,

150 µl und 200 µl entnommen und jeweils auf 10 ml mit 3 %-iger Salzsäure aufgefüllt.

http://www.google.de/url?sa=t&rct=j&q=icp-ms&source=web&cd=1&cad=rja&ved=0CEcQFjAA&url=http%3A%2F%2Fde.wikipedia.org%2Fwiki%2FMassenspektrometrie_mit_induktiv_gekoppeltem_Plasma&ei=YovmUdHcKcHChAfl4YDgCA&usg=AFQjCNEt_tToPk9q1LTV2V77vb2gqL34YA&bvm=bv.49405654,d.bGE


Anschließend wurden die Proben präpariert, indem sie 1:10.000 mit 3 %-iger Salzsäure

verdünnt wurden. Nachdem die Zugabe des Reduktionsmittels erfolgte, reagiert es mit der

Säure und setzte Wasserstoff frei. Dieser Wasserstoff reduziert die Metallionen zum

gasförmigen Hydrid. Der Inertgasstrom aus Argon spült das Hydrid in die bis ca. 1000 °C

aufheizbare Quarzküvette, in der Selen chemisch zersetzt wird. Bei der Hydridtechnik ist

darauf zu achten, dass Störsubstanzen und Begleitstoff als gasförmiges Hydrid mit Hilfe

von Argon abgetrennt werden.

Die Atomabsorptionsspektrometrie wurde am Institut für Ressourcenökologie des HZDRs

mit dem „Atomic Absorption Spektrometer 4100“ der Firma Perkin Elmer durch die

Mitarbeiterin Aline Ritter durchgeführt.

3.5.10 Isolierung der Nanopartikel

Zur Isolierung der Se(0)-Nanopartikel wurde eine modifizierte Methode nach Oremland

(Oremland et al. 2004) verwendet.

Von den Kulturansätzen, bei denen mikroskopisch Nanopartikel sichtbar waren, wurden

jeweils 40 ml entnommen und in ein 50 ml Polypropylen-Röhrchen gegeben. Diese

Zellsuspension wurde mittels Ultraschallfinger (Branson, Digital Sonifier W-250 D) bei

50 %-iger Intensität zwei Minuten homogenisiert. Anschließend wurde die Probe

30 Minuten (Eppendorf, Centrifuge 5804 R) bei 1500 x g zentrifugiert. Nach dem

Zentrifugieren folgten drei Waschschritte, bei denen der Überstand verworfen wurde und

das Pellet jeweils mit 0,5 M Natriumchloridlösung, 0,5 M Saccharoselösung und einer

Salzlösung (Kapitel 3.3.3) gewaschen und anschließend nach jedem Schritt erneut mit dem

Ultraschallfinger behandelt und zentrifugiert wurde. Nach der Zentrifugation wurden

35 ml, der mit Eiweißlysozym versetzten Salzlösung, hinzugegeben und bei Raum-

temperatur 19 h inkubiert.

Am folgenden Tag wurden die lysierten Zellen erneut mit dem Ultraschallfinger behandelt

und bei 9000 x g für 15 min zentrifugiert. Die Trennung der Selennanopartikel von den

Zellen bzw. Zellbestandteilen erfolgte durch weitere 4 Waschschritte (Salzlösung (Kapitel

3.3.3), 0,25 M NaOH, 0,1 M NaOH und 10 mM Na2HPO4) bei denen der Überstand

verworfen wurde und das Pellet jeweils mit der entsprechenden Lösung resuspendiert

wurde.


Nach jedem dieser Waschschritte erfolgte eine Behandlung mit dem Ultraschallfinger, eine

Inkubation von 1,5 h und die Zenrifugation. Die gereinigten Nanopartikel wurden in VE-

Wasser resuspendiert.

3.5.11 UV/Vis-Spektroskopie

Die UV/Vis-Spektroskopie beruht auf dem Prinzip, dass Elektronen in einem Molekül

durch elektromagnetische Strahlung auf höhere, im Grundzustand des Moleküls, nicht

besetzte Energieniveaus angehoben werden. Dabei wird die elektromagnetische Strahlung

absorbiert und im Wellenbereich des ultravioletten Lichts (UV-Bereich, =170 bis

400 nm) oder im Bereich des sichtbaren Lichts (Vis-Bereich, =400 nm bis 800 nm)

gemessen (Hädener & Kaufmann 2006, Less et al. 2008).

Bei der UV/Vis-Spektroskopie wird die Absorption der UV- oder der Vis-Strahlung durch

einem in Lösung vorliegenden Analyten bestimmt. Dabei wird die Probe mit

polychromatischen Licht beleuchtet, welches transmittiert und schließlich spektral

aufgespalten wird. Die Absorption berechnet sich dann aus der Differenz zwischen den

Werten der Referenz (in diesem Fall VE-Wasser) und der Probe.

Die UV/Vis–Spektren wurden mit Hilfe des Spektrometers des Typs Lambda 750 der

Firma Perkin Elmer unter Verwendung von Quarzküvetten mit Schichtdicke 1 cm

aufgenommen.

3.5.12 Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der

energiedispersiven Röntgenspektroskopie (REM-EDX)

Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie kann eine plastische dreidimensionale

Darstellung von Oberflächen sichtbar gemacht werden. Das Prinzip dieser Art der

Mikroskopie beruht darauf, dass ein Elektronenstrahl auf die zu untersuchende Probe

fokussiert wird, der durch Wechselwirkung mit der Probe sogenannte sekundäre

Elektronen an der Oberfläche des Präparates erzeugt. Dabei geben Löcher und Spalten

weniger sekundäre Elektronen ab und erscheinen dunkel. Runde Erhebungen hingegen

geben mehr sekundäre Elektronen ab und wirken dem entsprechend heller (Raven et al.

2000).


Von den Zellkulturen in denen lichtmikroskopisch Nanopartikel sichtbar waren, wurden

zweimal je 1 ml entnommen und bei 10.000 x g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und mit dem Pellet wurde weitergearbeitet.

Die Probenpräparation erfolgte nach zwei unterschiedlichen Methoden. Dabei wurde zum

Einen mit Glutaraldehyd gearbeitet, wo durch Vernetzung der Proteine Zellstrukturen

fixiert wurden. Somit lassen sich die Zellen besser abbilden. Zum Anderen verwendete

man eine Methode ohne Glutaraldehyd, da hierbei ein „Verkleben“ der Zellen vermieden

wird und somit eine gute Darstellung der Nanopartikel erhält.

Bei der ersten Methode wurde das Pellet zweimal mit PBS (Phosphatgepufferte

Salzlösung) gewaschen, zentrifugiert und der Überstand verworfen. Danach folgte die

Fixierung in 1,5 ml 2 % Glutaraldehyd in PBS für 1 h. Nach dem Zentrifugieren, wird es

erneut zweimal mit Reinstwasser gewaschen, zentrifugiert, der Überstand verworfen und in

1,5 ml Reinstwasser resuspendiert und im Ultraschallbad für 3 min behandelt.

Bei der zweiten Methode wurde auf das Waschen mit PBS und die Fixierung mit

Glutaraldehyd verzichtet. Die Waschschritte mit Reinstwasser wurden in gleicher Weise

durchgeführt wie bei der 1. Methode.

Zum Aufbringen der Proben wurden Siliziumplättchen (0,5 x 0,5 cm) mit Hilfe von

Leitsilber, dem Methylisobutylketon, auf einem Stiftprobenteller fixiert. Danach wurden

10 µl der jeweiligen Probe auf das Plättchen gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur

getrocknet.

Zusätzlich zum REM wurde eine energiedispersive Röntgenspektroskopiemessung (EDX)

durchgeführt, welche eine Identifizierung der Elementzusammensetzung erlaubt. Dabei

wurde die Probe mit Elektronen beschossen, wodurch die Probenatome angeregt werden.

Die Elektronen der inneren Schalen werden auf ein höheres Energieniveau angehoben. Die

bei dem Zurückfallen der Elektronen in den Grundzustand entstandene Energiedifferenz

tritt in Form von Röntgenstrahlung auf. Diese ist charakteristisch für Elemente.

Die REM-EDX-Untersuchungen wurden vom Institut für Ionenstrahlphysik des HZDRs

mit dem Mikroskop „REM Zeiss EVO 50“ durch die Mitarbeiterin Elfi Christalle

durchgeführt.

http://de.wikipedia.org/wiki/Energiedispersive_R%C3%B6ntgenspektroskopie


3.5.13 Transmissionselektronenmikroskop in Kombination mit der

energiedispersiven Röntgenspektroskopie (TEM-EDX)

Das Prinzip des Transmissionselektronenmikroskops beruht auf einem ähnlichen Prinzip

wie des Lichtmikroskops, jedoch wird statt einer Lichtquelle eine Strahlungsquelle

verwendet, die das Objekt mit schnellen Elektronenstrahlen durchstrahlt. Aus der

Strahlungsquelle, einer beheizten Feldemissionskathode, treten Elektronen aus, die durch

Anlegen einer Beschleunigungsspannung ihre kinetische Energie erhalten. Während ein

Teil der Elektronen ohne Beeinflussung durch die Probe hindurch tritt, kommt ein anderer

Teil in Wechselwirkung mit dem Kern der Probenatome. Die Elektronenstrahlen, die das

Objekt passieren, hinterlassen auf einem darunter liegenden Fluoreszenzschirm

Kontrastspuren. Dabei erscheinen „elektronentransparente Gebiete“ hell, „elektronendichte

Gebiete entgegen dunkel.

Bei biologischen Proben liegt die Auflösung bei 2 nm und ist damit 100 mal besser als bei

einem Lichtmikroskop (Raven et al. 2000)

Zur Probenpräparation wurden 5 µl einer Nanopartikelsuspension (resuspendiert in

VE-Wasser) auf ein Kupfernetz pipettiert, welches mit einem Formvar/Kohle-Film

beschichtet war.

Zusätzlich zur Bildgebung wurde die Elementzusammensetzung mittels EDX bestimmt

(Kapitel 3.5.12). Die TEM-EDX-Untersuchung wurde durch Herrn Dr. René Hübner

(Institut für Ionenstrahlphysik des HZDRs) an dem Gerät der Firma FEI des Typs „Titan

80-300“ durchgeführt.

3.5.14 Bestimmung des Zetapotentials

Das Zetapotential gibt Informationen über die physikalische Stabilität von Dispersionen

und bestimmt die Wechselwirkung von dispergierten Partikeln mit Substanzen aus dem

Dispersionsmedium.

Jedes Teilchen ist von einer flüssigen Schicht umgeben, die aus zwei Phasen besteht. Zum

Einen eine innere Region, die Sternschicht und zum Anderen eine äußere, diffuse Schicht.

Bei der Sternschicht sind die Ionen stark gebunden, wo hingegen die Ionen bei der diffusen

Schicht weniger fest gebunden sind. Aufgrund der elektrophoretischen Bewegung der


Teilchen und den dabei entstehenden Reibungskräften kommt es zum Abstreifen der

diffusen Schicht.

Dadurch kommt es zur Entfernung der Gegenionen, womit das Teilchen seine Neutralität

verliert und nun in einem geladenen Zustand vorliegt und sich zur entgegengesetzt

geladenen Elektrode bewegt. Durch Messen der Partikelgeschwindigkeit kann die

Nettoladung des Partikels und die Abhängigkeit seines Oberflächenpotenzials zur

umgebenden Phase berechnet werden. Diese Nettoladung wird als Zetapotential gemessen.

Wenn alle Teilchen in der Suspension ein großes negatives oder positives Zetapotential

besitzen, dann neigen sie dazu, sich gegenseitig abzustoßen, in Folge dessen kommt es

nicht zum Ausflocken.

Das Zetapotential ist abhängig vom pH-Wert. Daher stellt der pH-Wert einen wichtigen

Faktor bei der Bestimmung des Zetapotentials dar. Je basischer die Suspension, desto eher

neigt das Partikel dazu eine negative Ladung anzunehmen. Durch Zugabe der Säure wurde

erreicht, dass ein Punkt erreicht wird, an dem die negative Ladung neutralisiert ist. Die

Konzentrationsverhältnisse, bei denen das Zetapotential null ist, bezeichnet man als

isoelektrischen Punkt. Um diese Abhängigkeit darzustellen wurde die Nanopartikel-

suspension 1:100 mit einer 0,1 M NaCl-Lösung verdünnt. Anschließend erfolgte die

Einstellung der pH-Werte in dem Bereich 1 bis 7. Um eine statistische Sicherheit zu

erzielen, wurden 10 Messungen pro pH-Wert gemessen. Daraus wurde ein Mittelwert mit

der jeweiligen Standardabweichung berechnet. Beim Auftragen des Zetapotentials gegen

den pH-Wert entsteht eine Kurve, vergleichbar mit Abbildung 6.

Die Zetapotential-Messungen wurden am Zetasizer der Firma Malvern Instruments (Typ:

Nano-ZS) mit der Kapillarzelle „TDS 1060“ ebenfalls von der Firma Malvern Instruments

gemessen.


3.5.15 Dynamische Lichtstreuung (DLS)

Um die Partikelgröße zu identifizieren bzw. eine Partikelgrößenverteilung aufzustellen

wurde die Methode der dynamischen Lichtstreuung (DLS) verwendet, welche auch häufig

als Photonenkorrelationsspektroskopie (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) bezeichnet

wird. Bei der dynamischen Lichtstreuung wird das Streulicht eines Lasers an einer

suspendierten Probe analysiert. Durch die Bewegung der Teilchen im Lichtstrahl kommt es

bei der Intensität des Lichtes zu Fluktuationen. Mit Hilfe dieser Fluktuation kann der

Diffusionskoeffizient der Teilchen, welcher Aufschluss über den hydrodynamischen

Radius bzw. den Stokes-Teilchendurchmesser gibt. Das heißt, es wird der Durchmesser

einer hypothetischen Kugel gemessen, die mit der gleichen Geschwindigkeit wie das zu

analysierende Partikel diffundiert. Je größer ein Teilchen ist, desto langsamer bewegt es

sich und desto kleiner ist sein Diffusionskoeffizient. Das gemessene Signal bei der

Fluktuation zeigt ein charakteristisches Rauschverhalten, aus dessen zeitlichen Verlauf die

Bewegungsgeschwindigkeit des Teilchens ermittelt werden kann. Dies wird in einer

Autokorrelationsfunktion der Intensität dargestellt.

In einem gewissen Zeitintervall werden Bilder von dieser Bewegung aufgenommen, womit

die Geschwindigkeit des Partikels und die damit verbundene Größe berechnet werden

konnte (Pingoud & Urbank 1997).

2 4 6 8 10 12 pH

60

40

20

0

-20

-40

-60

Z

etap

ote

nti

al (

mV

)

IEP

Abbildung 6: Typische Kurve nach Auftragen des Zetapotentials

gegen den pH-Wert (Malvern Instruments 2007)


3.5.16 Raman-Spektroskopie der Nanopartikel

Die Raman-Spektroskopie ist eine Methode um die Molekülschwingungen und -rotationen

eines Stoffes zu analysieren. Durch Bestrahlen der Flüssigkeit mit monochromatischem

Licht (z.B. Argon-Laser) mit einer Wellenlänge von 488 nm kommt es zu einer

Durchstrahlung der Probe. Nur ein geringer Teil des Lichtes wird ungerichtet gestreut. Ein

noch geringerer Anteil des eingestrahlten Lichtes tritt ebenfalls in alle Richtungen aus,

besitzt jedoch eine Frequenzverteilung. Diese entsteht durch Absorption und Reemission,

welche mit Schwingungsanregung oder -löschung verbunden sind. Mit Hilfe eines

photoelektronischen Detektors kann die spektral zerlegte Streustrahlung gemessen werden.

Als Folge der Wechselwirkung zwischen Materie und elektromagnetischer Strahlung folgt

somit der Raman-Effekt. Das Raman-Spektrum ist ein Emissions-Spektrum (Hesse et al.

2005). Bei der Raman-Spektroskopie wird in einem Wellenzahlbereich von 0 cm-1

bis

8000 cm-1

gemessen.

Nachdem 3 µl der Nanopartikelsuspension auf den Quarzobjektträger aufgetragen wurde,

konnte das Raman-Spektrum mit Hilfe der Mitarbeiterin Sophia Kostudis des Helmholtz-

Instituts Freiberg für Ressourcentechnologie des HZDR mit dem Gerät RFS100/S der

Firma Bruker aufgenommen werden.

3.5.17 Thermostabilitätstest

Bei diesem Testverfahren wurde die Thermostabilität der isolierten Nanopartikel

untersucht. Um vergleichende Aussagen treffen zu können, wurde vor und nach dem

Erhitzen ein UV/Vis-Spektrum (Kapitel 3.5.11) aufgenommen und die Partikelgrößen-

verteilung mittels dynamischer Lichtstreuung (Kapitel 3.5.15) untersucht. Des Weiteren

wurde der TOC-Gehalt der Nanopartikel bestimmt (Kapitel 3.5.18).

Für dieses Testverfahren wurde ein Edelstahlautoklav verwendet, in dem ein Teflonbecher

eingesetzt ist (Abbildung 7). Nach Zugabe von 5 ml Nanopartikelsuspension (Nanopartikel

in VE-Wasser) wurde der Autoklav mittels Schraubdeckel fest verschlossen, so dass keine

Flüssigkeit verloren gehen kann. Anschließend wurde der Stahlautoklav bei 50 °C, 100 °C

und 250 °C für 24 h im Muffelofen erhitzt und die Proben nach dem Abkühlen erneut mit

den oben genannten Methoden untersucht. Die Temperierung für 24 h bei 35 °C wurde

mittels eines temperierten Wasserbades realisiert.


Abbildung 7: Stahlautoklav mit eingesetzten Teflonbecher

3.5.18 Bestimmung des Totalen organischen Kohlenstoffgehalts (TOC)

Zur Bestimmung des Kohlenstoffgehalts (TC-Total Carbon) werden sogenannte Summen-

parameter verwendet. Darunter zählen der gesamte anorganische Kohlenstoffgehalt

(TIC - Total Inorganic Carbon) und der gesamte organische Kohlenstoffgehalt

(TOC - Total Organic Carbon). Dabei wurde beim TOC zwischen dem Anteil an gelösten

organischen Kohlenstoff (DOC -Dissolved Organic Carbon), dem partikulären organischen

Kohlenstoff (POC - Particulate Organic Carbon) und dem flüchtigen organisch

gebundenen Kohlenstoff (VOC - Volatile Organic Carbon) unterschieden (Abbildung 8).

Der DOC-, POC- und VOC-Wert spielen jedoch eine untergeordnete Rolle, da nur der

gesamte organische Kohlenstoff betrachtet wird.

Die Bestimmung des TOC-Gehaltes, der in VE-Wasser suspendierten Nanopartikel, soll

Aufschluss über das Vorhandensein organischer Substanzen liefern.


Abbildung 8: Bestimmungsformen des Kohlenstoffs

Der TOC-Gehalt wird mit Hilfe des Differenzverfahrens bestimmt. Dabei wird zunächst

die Gesamtheit aller Kohlenstoffverbindungen (TC) gemessen und anschließend den Anteil

an anorganischer Kohlenstoffverbindungen (TIC) ermittelt. Den TOC-Gehalt erhält man

durch Subtraktion des TICs vom TC.

Die TOC-Untersuchungen wurden vom Institut für Ressourcenökologie mit dem „multi

N/C 2100 S“ der Firma Analytik Jena durch die Mitarbeiterin Carola Eckardt

durchgeführt.

TC

(Gesamtkohlenstoff)

TOC

(Gesamter organischer Kohlenstoff)

DOC

(Gelöster organischer Kohlenstoff)

POC

(Partikulärer organischer Kohlenstoff)

VOC

(Organisch gebundener Kohlenstoff)

TIC

(Gesamter anorganischer Kohlenstoff)

E r g e b n i s s e S e i t e | 26

4 ERGEBNISSE

4.1 WACHSTUMSKURVE VON A. BRASILENSE

Durch Aufnehmen der Wachstumskurve des Bakteriums A. brasilense wird das Wachstum

und die Vermehrung der Zellkultur beobachtet. Dabei wird das Wachstumsverhalten unter

normalen Wachstumsbedingungen charakterisiert. Somit kann später, bei Einwirkung von

Stressfaktoren, ein Vergleich zum Wachstumsverhalten gezogen werden. Da die Anzahl

der Bakterien durch Zellteilung ansteigt, kommt es zu einer Trübung der Kultur, welche

mittels Messung der Optischen Dichte bei 600 nm erfasst und quantitativ bestimmt werden

kann. In Abbildung 9 ist eine repräsentative Wachstumskurve unter aeroben Bedingungen

dargestellt.

Am Anfang der Kultivierung ist eine geringe lag-Phase bis 2 h erkennbar. Diese

Anlaufphase wird von den Bakterien benötigt, um ihren Stoffwechsel an die veränderten

Umgebungsbedingungen anzupassen.

In dem Zeitraum 2 bis 10 h ist ein exponentielles Wachstum der Zellen zu erkennen, wobei

hier eine Teilung der Bakterienzellen in gleichen Zeitabständen stattfindet. Nach der

Abbildung 9: Logarithmische Darstellung der Wachstumskurve von A. brasilense

0

0

1

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Lo

ga

rit

hm

isch

er

OD

60

0n

m-W

ert

Zeit (h)

Bakterienkultur

lag-P

has

e

Exponen

tiel

le

Phas

e

Über

gan

gs-

phas

e

Sta

tionär

e

Phas

e Bestimmung von µ und t

d


exponentiellen Phase folgt eine Übergangsphase, bevor die stationäre Phase bei 23,5 h

beginnt. In der stationären Phase bleibt der Biomassegehalt konstant. Anhand der Werte

der exponentiellen Phase der Wachstumskurve kann die Wachstumsrate µ und die

Verdopplungszeit td berechnet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Bis zu einem Zeitpunkt von ca. 30 h ist ein stetiges Wachstum zu erkennen und erreicht

hier das Maximum mit einer Optischen Dichte von etwa 3,4.

Tabelle 1: OD-Werte und die jeweiligen Zeiten am Anfang und Ende der exponentiellen Phase,

Wachstumsrate und Verdopplungszeit

Parameter Bakterienkultur

x0 0,110

xt 0,810

t 9,67 h

t0 2,00 h

µ 0,26 h-1

td 2,67 h

Im folgenden Kapitel wird der Einfluss der Selenoxyanionen auf das Bakterium

A. brasilense untersucht. Dazu wurde eine Anzahl von Methoden verwendet, um das

Wachstumsverhalten in Gegenwart von Selenit und Selenat zu beschreiben und die

Veränderungen der Selenkonzentrationen im Medium zu verdeutlichen. Mit Hilfe des

Lichtmikroskops wurden Bakterien und Nanopartikel sichtbar gemacht. Zur besseren

Charakterisierung, der durch mikrobielle Reduktion von Selenit gebildeten Nanopartikel,

wurden diese, wie in Kapitel 3.5.10 beschrieben, von den Bakterienzellen isoliert. Bei den

Nanopartikeln wurden die Partikelgrößenverteilung, die Oberflächenladung und die

Thermostabilität untersucht. Dazu wurde die Oberflächenladung durch das Zetapotential

bestimmt, die Größenverteilung durch die dynamische Lichtstreuung gemessen, und die

Thermostabilität der Nanopartikelsuspension nach Erhitzen mittels UV/Vis und

TOC-Messung näher beschrieben.


4.2 REDUKTION VON SELENAT UND SELENIT DURCH DAS BAKTERIUM

A. BRASILENSE

Bei diesem Versuch wurde das Bakterium A. brasilense auf dessen Fähigkeit Selenit und

Selenat zu elementarem Selen zu reduzieren, untersucht. Um den Einfluss der toxischen

Selenoxyanionen auf das Wachstum von A. brasilense verfolgen zu können, wurden die

optische Dichte bei 600 nm, die Gesamtzellproteinkonzentration sowie der pH-Wert

gemessen. Um den zeitlichen Verlauf der Selenit- und Selenatkonzentration und den

daraus resultierenden produzierten Anteil an elementarem Selen zu ermitteln, wurden

ICP-MS- und HG-AAS-Messungen durchgeführt. Weitere Untersuchungen fanden mittels

Lichtmikroskopie statt.

Während der Kultivierung gab es farbliche Auffälligkeiten zwischen den Selenit-, Selenat-

und Kontrollansätzen, dessen farbliche Verläufe in Abbildung 10, Abbildung 11 und

Abbildung 12 zusammenfassend dargestellt sind.

Abbildung 10: Farbverlauf

der Kontrolle


der Selenatkultur


der Selenitkultur

Zusätzlich zu der normalen Kontrolle, in der lediglich die Bakterien ohne Zusatz von

Selenit oder Selenat enthalten waren, wurden zwei weitere Kontrollen angesetzt, die

lediglich aus Medium und Selenit oder Selenat bestanden. Diese Kulturen blieben während

der gesamten Kultivierung klar und farblos.

Kontrolle

Selenat

Selenat

Selenit

6.Tag

1.Tag

7.Tag


Am Ende der Kultivierung mit Bakterien wurden diese Unterschiede in der farblichen

Entwicklung gut sichtbar (Abbildung 13).

Abbildung 13: Farbliche Entwicklung der Kontroll-, Selenat- und Selenitkultur nach sieben Tagen

Kultivierung

Es ist zu erkennen, dass die Farbverläufe bei der Kontrollkultur und bei dem Selenat-

Ansatz identisch sind. Nach Zugabe des Selenats bleibt die Selenatkultur weiß und trüb.

Erst am 2. Tag beginnen beide Kulturen leicht orange-rot zu werden. Am Ende des

Versuches ist bei beiden eine kaminrote Färbung wahrzunehmen. Unterschiede in der

Farbentwicklung sind bei der Selenitkultur (Abbildung 12) zu beobachten. Schon kurze

Zeit (10 min) nach Zugabe des Selenits ist ein Farbumschlag zu orange-rot erkennbar. Am

6. Tag nimmt die Selenitkultur einen intensiven dunklen Orangeton an. Diese Farbe

verändert sich bis zum 7. Tag insofern, dass diese in einen orange-roten Farbton übergeht.

Die Bakterien wurden mit Hilfe der Lichtmikroskopie auf die Morphologie der Zellen mit

und ohne Selen analysiert. Aufgrund der Farbänderung wurden die Veränderungen einer

möglichen Bildung von Nanopartikeln während der Kultivierung verfolgt.

Beim Betrachten der Kulturen wurden sowohl in Selenit- und Selenatkulturen, als auch in

der Kontrollkultur Bakterien gut sichtbar. Dabei wurde kein Unterschied zwischen den

Selenit-, Selenat- und Kontrollkulturen bezüglich der Zellform und -größe der Bakterien

festgestellt. Bei der Phasenkontrastaufnahme (Abbildung 14, Abbildung 15 und

Abbildung 16) konnten die Nanopartikel nur bei den Selenitansätzen festgestellt werden.

Bei den Selenitansätzen wurden sphärische Partikel wahrgenommen, die laut Literatur,

aufgrund der Färbung der Kultur, Selennanopartikel sein könnten (Oremland et al. 2004).

Mittels Hellfeldaufnahme wurden diese Partikel hervorgehoben (Abbildung 17). In den

Aufnahmen der Kontrolle (Abbildung 14) und der Selenatkultur (Abbildung 15) kann

ausschließlich das Vorhandensein der Bakterien beobachtet werden.

Kontrollen Selenitansätze Selenatansätze

Medium +

Bakerien

Medium +

Se(IV)

Medium +

Se(VI)



A. brasilense im Kontrollmedium (ohne

Nanopartikel)


A. brasilense mit Nanopartikeln im

Selenatansatz (ohne Nanopartikel)


A. brasilense mit Nanopartikeln im

Selenitansatz

Abbildung 17: Hellfeldaufnahme der

Nanopartikel in der Selenitkultur

4.2.1 Wachstumsverlauf in Gegenwart von Selen

Die Wachstumskurven von A. brasilense in Gegenwart von Selenat und Selenit sind in

Abbildung 18 dargestellt. Dabei wurden jeweils 2 Kulturen mit 1 mM Selenit und mit

1 mM Selenat versetzt und eine Kontrolle mitgeführt. In der Darstellung wird sichtbar,

dass die Bakterienkulturen mit Selenat einen identischen Wachstumsverlauf zeigen, wie

die Kontrollkultur.


0

1

25

0 1 2 3 4 5 6 7

OD

60

0n

m(l

og

ari

thm

isch

)

Zeit (d)

Selenit (Ansatz 1) Selenat (Ansatz 1) Kontrolle

Selenit (Ansatz 2) Selenat (Ansatz 2)

Abbildung 18: Logarithmische Darstellung der OD-Werte der Kontroll-, Selenit- und Selenatkultur

Die OD-Werte der Kontrollkultur und der Kulturen mit Selenat steigen stetig bis zum

Beenden des Versuchs nach sieben Tagen. Nach Überwinden der Anlaufphase gehen diese

in die exponentielle Phase über, in der die Kulturen ähnliche Wachstumsraten besitzen.

Beim Betrachten des Verlaufs der OD-Werte der Selenitansätze ist zu erkennen, dass nach

einer geringen Wachstumsphase bis 4 h eine lange lag-Phase im Zeitraum von vier

Stunden bis drei Tagen folgt. Anschließend beginnt die exponentielle Phase, welche bis

zum Versuchsende andauert.

Tabelle 2 zeigt die Mittelwerte (MW) des maximalen OD-Wertes zu dem entsprechenden

Zeitpunkt. Dabei wird sichtbar, dass alle Ansätze ähnliche Maxima aufweisen. Die

Kulturen mit Selen erreichen das Maximum nach 6,5 Tagen mit einer OD von 4,3 bei dem

Selenatansatz und 4,7 bei dem Selenitansatz. Die Kontrolle weist 12 h zuvor ein Maximum

bei 4,7 auf.

Tabelle 2: Zeitpunkt und OD-Wert des Maximums der Kontroll-, Selenat- und Selenitkultur

Zeit

Ansatz 1

(d)

Zeit

Ansatz 2

(d)

MW der

Zeit (d)

OD-

Wert

Ansatz 1

OD-

Wert

Ansatz 2

MW

OD-

Wert

Kontrolle 5,85 5,85 4,69 4,7

Selenat 5,85 6,85 6,35 3,80 4,72 4,3

Selenit 5,85 6,85 6,35 5,17 4,14 4,7


Die optische Dichte bei 600 nm erfasst sowohl die Absorption durch Bakterienzellen als

auch die gebildeten Nanopartikel. Dies kann zu einer Überschätzung der Zelldichte in den

Selenitkulturen führen. Um zusätzliche Informationen über das Zellwachstum zu erlangen,

wurde der Gesamtzellproteingehalt bestimmt. In der Abbildung 19 ist der nicht-

logarithmische Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration gegenüber der Zeit dargestellt.

Beim Vergleich der Selenit- und Selenatansätze wird sichtbar, dass die Bakterienkulturen

mit 1 mM Selenat im zeitlichen Verlauf eine ähnliche Proteinkonzentration aufweisen wie

die Kontrollkultur. Die Verläufe der Proteinkonzentration zeigen Gemeinsamkeiten mit

den OD-Werten in Abbildung 18. Große Unterschiede werden bei den Selenitansätzen

sichtbar, die erst nach einer längeren lag-Phase einen Anstieg in der Gesamtzell-

proteinkonzentration und somit in der Zelldichte zeigen. Die Selenitansätze weisen im

Vergleich zu der Selenat- und Kontrollkultur eine höhere Proteinkonzentration auf und

dem entsprechend auch eine höhere Zellzahl.

-20

480

980

1480

1980

2480

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Pro

tein

ko

nze

ntr

ati

on

[µ

g/m

l]

Zeit (h)

Selenit (Ansatz 1) Selenat (Ansatz 1) Kontrolle

Selenit (Ansatz 2) Selenat (Ansatz 2)

Abbildung 19: Darstellung der Gesamtzellproteinkonzentration der Kontroll-, Selenit- und

Selenatkultur

Die Proteinkonzentration der Kontrollkultur steigt ab der ersten Messung bis 147 h

(sechs Tage) auf eine Konzentration von 868 µg/ml an und nimmt von diesem Zeitpunkt

an ab.


Der erste Selenatansatz weist im gesamten Verlauf eine niedrigere Proteinkonzentration als

Ansatz 2 auf. Aufgrund der geringen Unterschiede und des gleichen Verlaufes der

Proteinkonzentration werden die folgenden Konzentrationen als Durchschnittswert aus

beiden Ansätzen angegeben. Der Anfangswert beider Selenatansätze von durchschnittlich

157 µg/ml liegt höher als bei der Kontrollkultur. Von da an nimmt die Konzentration bis

68,5 h einen Wert von durchschnittlich 762 µg/ml an. Die Gesamtzellprotein-

konzentrationen der beiden 1 mM-Selenitansätze bleiben bis 74,5 h konstant mit einem

Wert von 167 µg/ml. Ab diesem Zeitpunkt weisen die Kulturen eine unterschiedliche

Proteinkonzentration auf. Der erste Selenitansatz zeigt eine erhöhte Gesamtzell-

proteinkonzentration (bei sechs Tagen eine Proteinkonzentration von 2348 µg/ml). Die

zweite 1 mM-Selenitkultur beginnt ab 140,5 h zu steigen bis auf eine Proteinkonzentration

von 967 µg/ml bis zum Beenden der Versuchsreihe.

Weitere Untersuchungen wurden durch Messen des pH-Wertes während des gesamten

Versuches durchgeführt. Dabei wurde ein Zusammenhang zwischen dem Zellwachstum

und dem pH-Wert sichtbar. Mit steigendem pH-Wert erhöhten sich die OD600nm-Werte und

die gemessene Gesamtzellproteinkonzentration.

Die Kontroll- und Selenatkultur begannen bei einem pH-Wert von 7,6 ± 0,2, welcher

innerhalb von 74,5 h auf 8,6 ± 0,2 anstieg. Bei den Selenitansätzen startete der pH-Wert

bei 7,8 und erreichte nach 52 h sein Maximum bei 8,7. Die gemessenen erhöhten

pH-Werte korrelieren mit den Werten der optischen Dichte und spiegeln somit ebenfalls

den Wachstumsverlauf der Kulturen wieder.

4.2.2 Messung der Selenit- und Selenatkonzentration

Der Einfluss des Wachstums von A. brasilense auf den Selenat- und Selenitgehalt in den

Zellkulturen wurde mit Hilfe der ICP-MS und HG-AAS bestimmt. Dabei kann mittels der

HG-AAS ausschließlich der Selenitgehalt bestimmt werden, weshalb keine Proben der

Selenatkultivierung gemessen wurden. Aus Abbildung 20 geht hervor, dass die

Konzentration an Selenit im Laufe der Kultivierung von A. brasilense abnimmt. Dabei

werden die Ergebnisse der HG-AAS und ICP-MS der Proben der Selenitansätze

gegenübergestellt.


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7

Ko

nze

ntr

ati

on

[m

g/l

]

Zeit (d)

Selenit (1) (HG-AAS) Selenit (2) (HG-AAS)

Selenit (1) (ICP-MS) Selenit (2) (ICP-MS)

Abbildung 20: Vergleich der Messungen der Selenitkonzentrationen der HG-AAS und der ICP-MS

Die HG-AAS-Ergebnisse verdeutlichen, dass am Anfang beim ersten Selenitansatz eine

Konzentration von 81,5 mg/l und beim zweiten eine von 80 mg/l im Überstand aufzufinden

ist. Dies entspricht in etwa 100 % der theoretisch eingesetzten Selenit-konzentration. Bei

beiden Selenitansätzen ist ab dem 3. Tag eine Abnahme der Selenitkonzentration zu

verzeichnen, sodass man nach sieben Tagen bei dem ersten Selenitansatz einen Wert 0,3

mg/l und bei dem zweiten Ansatz eine Endkonzentration von 4 mg/l erhält. Dies entspricht

einer Abnahme des Selenits im Überstand nahe 100 %.

Zur Überprüfung, dass Selenit von Bakterien umgesetzt wurde, wurde eine weitere

Kontrolle angesetzt, die ebenfalls eine Woche untersucht wurde. Diese Kontrolle (ohne

Zusatz von Bakterien), besteht lediglich aus Selenit und Medium. Während des

Messungszeitraumes wurde eine konstante Selenitkonzentration im Medium gemessen.

Somit ist eine Oxidation oder Reduktion des Selenits ausschließlich durch Bakterien

möglich.

Vergleicht man die Ergebnisse der Selenitansätze der HG-AAS mit denen der ICP-MS, so

kann festgestellt werden, dass die Werte fast identisch sind. Damit wird bestätigt, dass die

in der ICP-MS gemessene Selenkonzentration der theoretischen Selenitkonzentration

entspricht. Am Ende des 2. Tages und am Anfang des 3. Tages wurden bei der HG-AAS

Werte gemessen, die nicht zu erklären sind. Diese Fehlwerte können nun durch

Bestätigung der Selenkonzentration bei der ICP-MS vernachlässigt werden.

In Abbildung 21 ist die zeitliche Änderung der Gesamtselenkonzentration des Überstandes

der Bakterienkultur dargestellt.


Die berechnete Selenkonzentration im Überstand am Anfang des Versuchsansatzes beträgt

79 mg/l. Die Werte der Selenatansätze liegen über diesem berechneten Wert und haben im

Durchschnitt eine Selenkonzentration von 85 mg/l. Diese Konzentration bleibt bei beiden

Selenatansätzen über den gesamten Messzeitraum relativ konstant. Lediglich bei den

Selenitansätzen sind Unterschiede in Bezug auf die berechnete Selenkonzentration und den

Selenatansätzen zu verzeichnen. Im Durchschnitt beginnen beide Ansätze mit einer

Konzentration von 77 mg/l, die drei Tage gehalten wird. Ab diesem Zeitpunkt beginnt die

Selenkonzentration abzunehmen. Dabei verläuft die Abnahme des Selens aus dem

Überstand beim 1. Selenitansatz, schneller als beim 2. Ansatz. Ein extremer Abfall der

Selenkonzentration wurde beim 2. Ansatz ab dem 6. Tag gemessen. Am Ende der

Messreihe wurde beim 1.Selenitansatz eine Abnahme des Selens von 97,4 % und beim

zweiten von 93,9 % verzeichnet.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Ko

nzen

tra

tion

[m

g/l

]

Zeit (d)

Selenitansatz (1) Selenatansatz (1) Konzentration 1 mM

Selenitansatz (2) Selenatansatz (2)

Abbildung 21: Zeitlicher Verlauf der Selenkonzentration im Selenit- und Selenatansatz

Aufgrund dessen, dass bei der Messung mittels HG-AAS ausschließlich die

Selenitkonzentration und bei der ICP-MS der Gesamtselengehalt bestimmt wurde, kann

daraus die Se(0)-Konzentration in Form von Nanopartikeln berechnet werden. Dieser

Zusammenhang wird in Abbildung 22 dargestellt.


In der Darstellung wurde der Mittelwert aus beiden Selenat- und der Selenitansätzen der

ICP-MS-Messung, aufgrund ihres ähnlichen Verlaufes, verwendet.

Nach ungefähr drei Tagen, beginnen die Bakterien das Selenit aus dem Überstand zu

reduzieren und die Nanopartikel zu produzieren. Dies stimmt sehr gut mit den

lichtmikroskopischen Beobachtung (Kapitel 4.2) überein. Diese Nanopartikel bestehen

vermutlich aus elementarem Selen. Nach etwa sieben Tagen entstand ein prozentualer

Anteil von 95,6 % der Se(0)-Nanopartikel durch Reduktion des Selenits aus dem Medium.

Abbildung 22: Zeitlicher Verlauf der Selenat- und Selenitintensität und den daraus resultierenden

Selennanopartikelanteil

4.2.3 Einfluss der Konzentration auf die mikrobielle Reduktion von Selenit

und das Wachstum von A. brasilense

Wie in Kapitel 4.2 beschrieben, besitzt das Bakterium A. brasilense die Fähigkeit Selenit

zu elementaren Se(0) zu reduzieren. Da in bisherigen Versuchen ausschließlich mit

1 mM-Selenitansätzen gearbeitet wurde, wurde in einem weiteren Versuch die Toleranz

des Bakteriums gegenüber unterschiedlich hohen Selenitkonzentrationen (1 mM, 2,5 mM

und 5 mM) untersucht. In Abbildung 23 sind die Kulturen mit unterschiedlichen

Selenitkonzentrationen nach sieben Tagen dargestellt. Das Wachstumsverhalten wurde

mittels OD600nm und der Gesamtzellproteinkonzentration (OD562nm) bestimmt.

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Pro

zen

tuale

r A

nte

il d

es S

e-G

ehalt

s

(%)

Zeit (d)

MW Selenat (ICP-MS) MW Selenit (ICP-MS) Nanopartikel


Mögliche Änderungen der Selenkonzentrationen wurden durch die ICP-MS und HG-AAS

untersucht.

4.2.4 Wachstumsverlauf des Bakteriums A. brasilense bei unterschiedlichen

Selenitkonzentrationen

Das Wachstum der Bakterien in den unterschiedlich hoch konzentrierten

Selenitkonzentrationen (1 mM, 2,5 mM und 5 mM) wurde mittels Photometer bei einer

Wellenlänge 600 nm verfolgt. Die zeitlich aufgenommenen Wachstumskurven sind in

Abbildung 24 dargestellt.

0

1

20

0 2 4 6 8 10

Log

ari

thm

isch

er O

D6

00

nm

-Wer

t

Zeit (d)

Kontrolle 1 mM MW 2,5 mM MW 5 mM (Ansatz 1) 5 mM (Ansatz 2)

Abbildung 24: Wachstumskurven der Kontrollkultur und den Ansätzen mit unterschiedlichen


Die Kontrollkultur (Bakterienkultur ohne Selenit) zeigt das bekannte Wachstumsverhalten.

Am 5. Tag wird bei der Kontrolle ein OD600-Maximum von 5 gemessen, welches bis zum

Beenden des Versuches konstant bleibt.

Kontrolle 1 mM-Selenitsätze 2,5 mM-Selenitansätze 5 mM-Selenitansätze

Abbildung 23: Farbentwicklung nach sieben Tagen bei unterschiedlichen Selenitkonzentrationen


Da die beiden Ansätze der 1 mM- und 2,5 mM-Selenitkonzentration einen ähnlichen

Verlauf aufwiesen, wurden diese Wachstumskurven gemittelt. Bei den beiden

5 mM-Selenitansätzen gab es große Unterschiede bezüglich des Wachstumsverhaltens,

weshalb auf eine Mittelung der Werte verzichtet wird. Dies gilt ebenfalls für die Kurven

zur Bestimmung der Gesamtzellproteinkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit.

Im Gegensatz zu der Kontrollkultur gibt es bei allen Selenitansätzen eine lag-Phase von

drei Tagen. Ab dem 3. Tag beginnen die Bakterien, mit Ausnahme des zweiten

5 mM-Selenitansatzes, mit dem Wachstum.

Beim Betrachten der Maxima der Kurven (Tabelle 3) wurde ermittelt, dass im

Durchschnitt die Bakterien im 1 mM-Ansatz schneller wachsen und zwischen dem 6. und

7. Tag ein Maximum von durchschnittlich 3,1 (OD600nm) erreichen. Mit steigender

Selenitkonzentration wird das Maximum zu einem späteren Zeitpunkt mit einem

geringeren OD-Wert erreicht. So wurde bei einer Konzentration von 2,5 mM bei 10 Tagen

ein durchschnittlicher OD-Wert von 2,9 und bei der 5 mM-Selenitkonzentration ebenfalls

bei 10 Tagen eine Optische Dichte von 1,10.

Tabelle 3: Zeitpunkt und OD-Wert der Maxima der unterschiedlichen Selenkonzentrationen

Selenitkonzentration

Zeit

Ansatz 1

(d)

Zeit

Ansatz 2

(d)

MW

der Zeit

(d)

OD-

Wert

Ansatz

1

OD-

Wert

Ansatz

2

MW

OD-

Wert

Kontrolle 4,91 4,9 3,30 3,3

1 mM 6,17 6,91 6,5 4,08 2,07 3,1

2,5 mM 9,97 9,97 10 2,70 3,17 2,9

5 mM 9,97 9,97 10 2,06 0,14 1,1

In Abbildung 25 wurden der zeitliche Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration bei

unterschiedlich hohen Selenitkonzentrationen gegenübergestellt. Die Maxima der

verschiedenen Ansätze und deren Proteinkonzentration wurden in Tabelle 4 angegeben.


-100

400

900

1400

1900

2400

0 2 4 6 8 10

Ko

nze

ntr

ati

on

[µ

g/m

l]

Zeit (d)

Kontrolle 1 mM-Selenitansatz 2,5 mM-Selenitansatz 5 mM Selenit (Ansatz 1) 5 mM Selenit (Ansatz 2)

Abbildung 25: Zeitlicher Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration der Kontrollkultur und den

Ansätzen mit unterschiedlichen Selenitkonzentrationen

Tabelle 4: Zeitpunkt und Proteinkonzentration der Maxima der unterschiedlichen

Selenkonzentrationen

Zeit Ansatz

1 (d)

Zeit

Ansatz 2

(d)

MW der

Zeit (d)

c

Ansatz 1

[µg/ml]

c

Ansatz 2

[µg/ml]

MW

c

[µg/ml]

Kontrolle 4,91 4,9 1030,4 1030

1 mM 6,91 6,91 6,9 1775,6 706,3 1241

2,5 mM 9,97 9,97 10 918,0 1082,5 1000

5 mM 9,97 9,97 10 0 704,4 321

Die Kontrollkultur startet mit einer Gesamtzellproteinkonzentration von 31 µg/ml und

erhöht sich kontinuierlich bis diese am 5. Tag ein Maximum bei 1030 µg/ml erreicht

Danach nimmt die Konzentration bis auf einen Wert von 788 g/ml am 10. Tag ab.

Die 1 mM-Selenitkulturen beginnen am 5. Tag mit der Erhöhung der Proteinkonzentration,

die bis zum 7. Tag ansteigt. Hierbei wird eine Gesamtzellproteinkonzentration von

1241 µg/ml erreicht. Bei den 2,5 mM-Ansätzen ist die lag-Phase nach ca. 3-4 Tagen

beendet. Von da an steigt die Proteinkonzentration bis zum 10. Tag auf einen Wert von

1000 g/ml an. Die Verläufe der Gesamtzellproteinkonzentrationen der 5 mM-Selenit-

kulturen unterscheiden sich wesentlich im Verlauf. Während der eine 5 mM-Ansatz vom

3. bis zum 7. Tag ansteigt und dort sein Maximum erreicht, ist bei dem anderen

5 mM-Ansatz keine Zunahme der Proteinkonzentration zuerkennen.


Daraus ist zu schlussfolgern, dass keine wachstumsfähigen Bakterien mehr im Medium

enthalten sind. Aufgrund dessen wurde für weitere Untersuchungen nur mit dem zweiten

5 mM-Selenitansatz gearbeitet.

4.2.5 Messung der unterschiedlichen Selenitkonzentrationen

Um die Selenitkonzentrationen während der gesamten Kultivierung analysieren zu können

wurde zum Einen der Selenitgehalt mittels HG-AAS und zum Anderen der Gesamtselen-

gehalt mit Hilfe der ICP-MS gemessen. Wie in Kapitel 4.2.2 gezeigt werden konnte,

entspricht der gemessene Gesamtselengehalt dem der mittels HG-AAS ermittelte

Selenitgehalt. Daher wird auf die Darstellung der HG-AAS-Ergebnisse verzichtet.

Tabelle 5 zeigt die mittels ICP-MS gemessenen Anfangskonzentrationen der unter-

schiedlichen Selenitkonzentrationen im Vergleich zu den theoretischen Selenit-

konzentrationen. Diese stimmen bei allen Selenitkonzentrationen annähernd überein. In

Abbildung 26 sind die Messergebnisse der ICP-MS dargestellt.

Tabelle 5: Vergleich der berechneten und mittels ICP-MS gemessenen Selenitanfangskonzentrationen

Berechnete Konzentration [mg/l] Gemessene Anfangskonzentration [mg/l]

1 mM 79,0 70,8

2,5 mM 197,4 199,5

5 mM 394,8 404,0

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 2 4 6 8 10

Sel

en-K

on

zen

trati

on

[m

g/l

]

Zeit (d)

1 mM 2,5 mM 5 mM

Konzentration 1 mM Konzentration 2,5 mM Konzentration 5 mM

Abbildung 26: Zeitlicher Verlauf der Gesamtselenkonzentration der unterschiedlichen



Bei dem 1 mM-Selenitansatz wurde am Anfang ein Durchschnittswert von 71 mg/l

ermittelt. Diese Konzentration bleibt bei beiden Ansätzen bis zum 3. Tag konstant.

Zwischen dem 3. und 5. Tag beginnt die Abnahme der Gesamtselenkonzentration, welche

bis zum 7. Tag auf einen durchschnittlichen Wert von 34 mg/l sinkt. Dies entspricht einer

Verringerung von 52 %. Von diesem Zeitpunkt an bleibt die Konzentration konstant. Bei

den 2,5 mM-Selenitansätzen bleiben die Konzentration bei beiden Ansätzen bis zum 7. Tag

konstant. Von da an sinkt die Gesamtselenkonzentration und verringert die Konzentration

um durchschnittlich 23,4 %. Bei dem 5 mM-Selenitansatz wurde ein Anfangswert von

404 mg/l gemessen, welcher über den gesamten Messungszeitraum relativ konstant blieb.

Die Ergebnisse zeigen, dass mit steigender Selenitkonzentration die Reduzierung des

Selenits aus dem Medium verzögert wird und ein vollständiger Umsatz im untersuchten

Zeitraum somit nicht beobachtet werden konnte.

4.3 CHARAKTERISIERUNG DER NANOPARTIKEL

4.3.1 Farbgebung Nanopartikelsuspension nach der Isolierung

Nach der Isolierung der Nanopartikel entsteht nach Zugabe von VE-Wasser eine kaminrote

Suspension (Abbildung 27). Wenn es große Unterschiede im Wachstumsverhalten und

dem damit verbundenen Fortschritt der Selenitreduktion gab, wie zum Beispiel beim ersten

und zweiten Ansatz der 1 mM-Selenitkultur, spiegelte sich das auch in den isolierten

Suspensionen wieder.

Die Ergebnisse der HG-AAS sowie der ICP-MS lieferten Aussagen darüber, dass bei dem

ersten 1 mM-Selenitansatz eine schnellere Abnahme des Selenits aus dem Überstand und

damit eine erhöhte Bildung von Nanopartikel zu beobachten war (Kapitel 4.2.2). Dies

wurde auch nach der Isolierung sichtbar. Der zweite 1 mM-Selenitansatz zeigt gegenüber

dem 2. Ansatz eine schwach rote Farbe, was auf eine geringe Anzahl an Nanopartikel

zurückzuführen ist.

Die Farbgebung und die Messwerte bei den 2,5 mM-Selenitansätzen (Abbildung 29)

ähnelten sich sehr mit dem ersten 1 mM-Selenitansatz.


Ein ähnlicher Farbton wie bei dem 5 mM-Ansatz (Abbildung 30) ist bei dem 2. Ansatz der

1 mM-Selenitkultur (Abbildung 28) zu sehen, welcher ebenfalls aufgrund der Vorversuche

zwar ein Bakterienwachstum und eine Zunahme des Proteingehaltes aufwies, jedoch laut

HG-AAS und ICP-MS der Selengehalt nicht signifikant abnahm und nur eine geringe

Anzahl an Nanopartikeln produziert wurde.

Abbildung 27: Suspension der isolierten

Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz (Ansatz 1))


Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz (Ansatz 2))


Nanopartikel (2,5 mM-Selenitansatz)


Nanopartikel (5 mM-Selenitansatz)

Zum Vergleich der mikrobiell erzeugten Nanopartikel wurde auch chemisch reduziertes

Se(0) hergestellt. Die dafür eingesetzte Selenitlösung zeigt sofort nach Zugabe des

Reduktionsmittels Hydroxylamin eine Rotfärbung und nimmt nach circa fünf Minuten eine

intensivere Rotfärbung an. Nach circa 20 Minuten fällt ein roter Niederschlag aus, es

bilden sich rote Flocken am Boden des Reaktionsgefäßes und der Überstand wird klar

(Abbildung 31). Diese instabile Lösung ist ein weiterer Unterschied zu den durch

Bakterien reduzierten Nanopartikeln, die eine stabile Suspension mit den enthaltenen

Nanopartikeln aufweisen. Bei der Selenatlösung sind auch nach über 100 Tagen keine

farblichen Änderungen zu erkennen. Somit fand keine Reduktion zu Selenit oder

elementaren Selen unter den gewählten Versuchsbedingungen statt (Abbildung 32).


Abbildung 31: Chemischen Reduktion von

Selenit (Bildung von rotem Niederschlag)

Abbildung 32: Chemische Reduktion von

Selenat (kein Niederschlag)

Nach einigen Monaten schlug der Niederschlag von rot zu grau um, welches mit der

Oxidation des Selens zu begründen ist. Des Weiteren waren kleinere Partikel zu erkennen,

als bei dem Niederschlag der frisch hergestellten chemischen Reduktion. Mittels UV/Vis

wurde zum Einen der Unterschied zwischen einer neuen chemischen Reduktion und einer

älteren dargestellt und zum Anderen wurde die mikrobielle mit der chemischen Reduktion

verglichen.

Die UV/Vis-Spektren sind in der Abbildung 33 dargestellt. Hierbei ist deutlich bei beiden

Proben ein Peak bei 567 nm zu erkennen, der jedoch bei der neuen chemischen Reduktion

stärker ausgeprägt ist.

500 550 600 650

0,00

0,05

Abso

rpti

on

Wellenlänge (nm)

neu

alt

Abbildung 33: UV/Vis Spektren des chemisch reduzierten Selenits


4.3.2 Elektronenmikroskopie in Kombination mit der energiedispersiven

Röntgenspektroskopie (EDX)

Die bei der Lichtmikroskopie wahrgenommenen Nanopartikel der Selenitkultur werden

mittels Elektronenmikroskopie erneut untersucht. Zum Einen wird dabei REM verwendet,

um die dreidimensionale Struktur der Bakterien und der Nanopartikel darzustellen. Mittels

TEM-Aufnahmen konnten ebenfalls Aussagen über Form, Größe und Lokalisation der

Nanopartikel getroffen werden. Mittels EDX konnte zusätzlich ermittelt werden, aus

welchen Elementen die Nanopartikel bestehen.

Die Bilder der Rasterelektronenmikroskopie zeigen Bakterien mit Nanopartikeln der

Selenitansätze, die schon bei der Lichtmikroskopie beobachtet wurden (Abbildung 34 und

Abbildung 35). Zur besseren Darstellung der Bakterien wurden teilweise einige Proben mit

Glutaraldehyd fixiert (Abbildung 36).

Abbildung 34: A. brasilense mit Nanopartikeln

aus dem Selenitansatz (Methode ohne

Fixierung)

Abbildung 35: Nanopartikel aus dem

Selenitansatz (Methode ohne Fixierung)

Bei der Untersuchung der Nanopartikel der Selenitkultur mittels energiedispersiver

Röntgenspektroskopie wurde bestätigt, dass die Partikel aus Selen bestehen. Der

Hauptpeak im EDX-Spektrum (Abbildung 37), bei einer Energie von 1,4 keV, ist dem

Selen zuzuordnen. Der Peak bei 0,5 keV zeigt das Vorhandensein von Sauerstoff und der

Peak bei 1,75 keV entspricht Silizium.


Diese beiden Stoffe wurden detektiert, da die Proben auf einem Plättchen aus Silizium-

dioxid fixiert wurden. Des Weiteren gibt es ein Schwefelsignal bei einer Energie von

2,3 keV.

Abbildung 36: A. brasilense mit Nanopartikeln

aus dem Selenitansatz (Fixierung mit

Glutaraldehyd)

Abbildung 37: EDX-Spektrum der

Nanopartikel

Vergleicht man die REM-Bilder der Selenitansätze mit denen der Selenatansätze, so wird

sichtbar, dass in den Selenatansätzen ausschließlich die Bakterien und keine Nanopartikel

(Abbildung 38) zu erkennen sind. Durch das EDX-Spektrum (Abbildung 39) wird

bestätigt, dass die Ablagerungen neben den Bakterienzellen im Selenatansatz kein

partikuläres Selen enthalten. Das Auftreten von Sauerstoff und Silizium ist durch den

Träger zu begründen.

Energie (keV)


Abbildung 38: Bakterien ohne Nanopartikel

aus dem Selenatansatz (Fixierung mit

Glutaraldehyd)

Abbildung 39: EDX-Spektrum aus dem

Selenatansatz

Vergleicht man die beiden angewendeten Methoden untereinander (Abbildung 34 und

Abbildung 36), ist zu erkennen, dass wenn die Bakterien mit Glutaraldehyd fixiert wurden,

es zu einer besseren Visualisierung führt. Wird der Fokus jedoch auf die Nanopartikel

gelegt, dann empfiehlt sich die Methode ohne Glutaraldehyd, da hierbei die Nanopartikel

besser dargestellt werden können.

Auf dem TEM-Bild (Abbildung 40) sind sphärische Nanopartikel mit einem Durchmesser

von 400 nm zu erkennen. Der von den Nanopartikeln umgebene graue „Schatten“ und die

Nanopartikel wurden ebenfalls durch EDX analysiert.

Energie (keV)


Abbildung 40: TEM-Aufnahme der Nanopartikel

Dabei wurde bestätigt (Abbildung 41), dass die Nanopartikel größtenteils aus Selen (Peak

bei 1,4 keV, 11,5 keV und 12,5 keV) und Schwefel (Peak bei 2,3 keV) bestehen. Neben

Selen und Schwefel wurden mittels EDX auch Kohlenstoff, Sauerstoff, Silizium und

Kupfer detektiert, welche durch die Probenpräparation auf einem Kupfernetzchen mit

einem Kohle/Formvarfilm erklärbar sind. Die Selen-Peaks wurden mit Hilfe der Literatur

bestätigt (Oremland et al. 2004).

Abbildung 41: EDX-Spektrum der Nanopartikel

Bei der Untersuchung des grauen „Schleiers“ mittels TEM-EDX (Abbildung 42) wurden

Stoffe wie Silizium, Sauerstoff, Chlor, Natrium und Magnesium identifiziert. Diese Stoffe

sind Rückstände aus der Isolierung.

Se Se


Abbildung 42: EDX-Spektrum der von Nanopartikel umgebenden Substanz

4.3.3 Bestimmung der Oberflächenladung durch Zetapotentialmessungen

Durch Messen des Zetapotentials in Abhängigkeit von dem pH-Wert in dem Bereich

1 bis 7 konnten die Oberflächenladung und der isoelektrische Punkt der Selennano-

partikeln ermittelt werden.

In Abbildung 43 werden vier Messungen dargestellt, die von zwei unterschiedlichen

Ansätzen stammen. Zusätzlich wurde aus allen Messungen der Mittelwert gebildet. Diese

Kurve ist ebenfalls mit der jeweiligen Standardabweichung (Std.Abw.) im Diagramm

dargestellt.

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Zet

a-P

ote

nti

al

(mV

)

pH-Wert

Ansatz 2 vom 1. Exp. (1:30) Ansatz 1 vom 2. Exp (1:30)

Ansatz 2 vom 1. Exp. (1:100) Ansatz 2 vom 2. Exp (1:100)

MW Zeta-Potential

Abbildung 43: Zetapotentiale aller Nanopartikelsuspensionen der Selenitansätze mit Mittelwert aller

Zetapotentialmessungen mit Standardabweichung


Alle Kurven besitzen in dem untersuchten pH-Wertbereich ein negatives Zetapotential. Bei

pH 1 liegt das Zetapotential in dem Bereich von -0,6 bis -6,3 mV. Mit steigendem pH-Wert

verschiebt sich das Oberflächenpotential immer mehr ins Negative. So wurde bei einem

pH-Wert von 7 ein Zetapotential in dem Bereich von -15 bis -18 mV gemessen. Da bei

keinem pH-Wert ein positives Zetapotential auftrat, konnte kein isoelektrischer Punkt mit

einem Zetapotential von Null bestimmt werden.

4.3.4 Dynamische Lichtstreuung

Durch das Messen der dynamischen Lichtstreuung der Nanopartikelsuspension wurden der

Durchmesser der Selennanopartikel und die dazugehörige Partikelgrößenverteilung

ermittelt. Das Auftragen der Partikelgröße nach ihrem prozentualen Anteil ist in der

Abbildung 44 dargestellt.

Dabei wurden zwei 1 mM-Selenitkulturen verwendet, bei dem sich die Ansätze farblich

unterschieden, um zu untersuchen, inwiefern die Farbänderung in Beziehung zu der

Partikelgröße steht.

200 300 400 500 600 700 800

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Inte

nsi

tät

(%)

Log. Partikelgrößenverteilung (d.nm)

Ansatz 1

Ansatz 2

Abbildung 44: Partikelgrößenverteilung der 1 mM-Selenitansätze


Die orangefarbene Kultur besitzt Nanopartikel mit einem hydrodynamischen Durchmesser

in dem Bereich von 220 nm bis 825 nm. Der größte prozentuale Anteil ist bei einer

Partikelgröße von 396 nm mit 18,1 % zu finden. Bei der rot-orangenen Kultur ist das

Maximum der Partikelgröße ebenfalls bei 396 nm mit einer Intensität von 19,4 %. Die

Partikelgrößenverteilung dieses Ansatzes liegt im Bereich von 220 nm und 712 nm.

Die berechneten Durchschnittswerte der Partikelgrößen der beiden Ansätze sind in der

Tabelle 6 zusammengefasst.

Tabelle 6: Durchschnittliche Partikeldurchmesser der verschiedenen Ansätze

Selenitansatz Durchschnittlicher Durchmesser (nm)

1 443

2 407

Der orangene Ansatz besitzt im Durchschnitt größere Partikel mit einem Durchmesser von

443 nm. Der rot-orangene Ansatz hat mit 407 nm einen geringeren durchschnittlichen

Partikeldurchmesser.

Zwar befinden sich im 2. Ansatz mehr kleinere Partikel, jedoch sind die Unterschiede zu

gering um die Aussage zu bestätigen, dass die Partikelgrößenverteilung mit der Farb-

gebung der Kulturen zusammenhängt.

Neben der Partikelgrößenverteilung lässt sich aus den Messwerten der DLS zusätzlich eine

Autokorrelationsfunktion (Abbildung 45) aus den gemessenen Werten darstellen.


0,1 1 10 100 1000 10000 100000 1000000

0,0

0,5

1,0

Korr

elat

ionsk

oef

fizi

ent

Verzögerungszeit [µs]

Ansatz 1

Ansatz 2

Abbildung 45: Autokorrelationsfunktion

Mit Hilfe der Autokorrelationsfunktion können Probleme, beispielsweise zu kleine oder zu

große Partikel oder eine kontaminierte Probe identifiziert und interpretiert werden. Der

Verlauf der Funktion der beiden Ansätze zeigt eine typische Kurve, die repräsentativ für

große Partikel ist. Diese liegen mit einem Durchmesser von durchschnittlich 420 nm noch

im messbaren Bereich zwischen 3 nm und 3 µm. Somit stellt diese Größe kein Problem für

die Messung dar.

Da verschiedene Ansätze mit unterschiedlichen Selenitkonzentrationen verwendet wurden

sind die Ergebnisse der 1 mM-Selenitkulturen in Abbildung 46 mit denen der

2,5 mM-Kulturen in Abbildung 47 zum Vergleich gegenübergestellt. Dafür wurde aus der

Partikelgrößenverteilung der Durchschnittswert der Partikelgröße der verschiedenen

Ansätze berechnet.


1 2 3 4 5

0

100

200

300

400

500

600

1 Exp. 1; 1 mM

2 Exp. 2; 1 mM (1)

3 Exp. 2; 1 mM (2)

4 Exp. 3; 1 mM (1)

5 Exp. 3; 1 mM (2)

Durc

hsc

hnit

tlic

he

Par

tikel

grö

ße

(d.n

m)

Proben

MW (443,2 d.nm)

Abbildung 46: Durchschnittliche Partikelgrößen der 1 mM-Selenitansätze

1 2 3 4

0

100

200

300

400

MW (341,7 d.nm)

1 Exp. 3; 2,5 mM

2 Exp. 4; 2,5 mM (1)

3 Exp. 4; 2,5 mM (2)

4 Exp. 4; 2,5 mM (3)

Proben

Durc

hsc

hnit

tlic

he

Par

tikel

grö

ße

(d.n

m)

Abbildung 47: Durchschnittliche Partikelgrößen der 2,5 mM-Selenitansätze

Beim Vergleich der beiden Diagramme wird ersichtlich, dass bei einer höheren

Selenitkonzentration eine geringere Partikelgröße mit einem Durchschnitt von 341 nm zu

erkennen ist. Im Gegensatz dazu besitzen die 1 mM-Selenitkulturen einen durch-

schnittlichen Durchmesser von 443 nm.

Inwiefern die Höhe der Selenitkonzentration (Mittelwert beider 1 mM-Ansätze, 2,5 mM-

und 5 mM-Ansatz) in der Kultur mit der Partikelgröße der gebildeten Nanopartikel

zusammenhängt, wurde in Abbildung 48 dargestellt.


Dabei wurde festgestellt, dass die 2,5 mM-Selenitkultur eine geringe Partikelgrößen-

verteilung besitzt als die anderen Konzentrationen. Die 2,5 mM-Selenitkultur weist die

meisten Nanopartikel mit der Größe 396 nm mit einem prozentualen Anteil von 30,5 %

auf. Die höchste Partikelgröße in einer Größenklasse von 459 nm mit einer Intensität von

22 % zeigt hingegen die 1 mM-Selenitkultur. Die Nanopartikel der 5 mM-Selenitkultur

besitzen den größten prozentualen Anteil mit 18 % bei einem Partikeldurchmesser von

396 nm.

200 400 600 800 1000

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

tät

(%)

Log. Partikelgrößenverteilung (d.nm)

1 mM

2,5 mM

5 mM

Abbildung 48: Partikelgrößenverteilung der Nanopartikel bei unterschiedlichen


Werden alle mit dynamischer Lichtstreuung gemessenen Partikelgrößen verglichen

(Abbildung 49), so kommt man zu dem Ergebnis, dass die Nanopartikel eine Größe von

durchschnittlich 443 nm aufweisen, welche in dem Bereich von 301 nm bis 603 nm

variieren.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

100

200

300

400

500

600

1 Exp. 1; 1 mM

2 Exp. 2; 1 mM (1)

3 Exp. 2; 1 mM (2)

4 Exp. 3; 1 mM (1)

5 Exp. 3; 1 mM (2)

6 Exp. 3; 2,5 mM

7 Exp. 3; 5 mM (2)

8 Exp. 4; 2,5 mM (1)

9 Exp. 4; 2,5 mM (2)

10 Exp. 4; 2,5 mM (3)MW (403,1 d.nm)

Durc

hsc

hnit

tlic

he

Par

tikel

grö

ße

(d.n

m)

Proben

Abbildung 49: Darstellung der durchschnittlichen Partikelgröße aller 1 mM-Selenitkulturen und

Ermittlung des durchschnittlichen Durchmessers

4.3.5 Raman-Spektroskopie

Zur weiteren Charakterisierung der mikrobiell gebildeten Selennanopartikel wurden

Ramanspektren im Wellenzahlenbereich von 150 bis 450 cm-1

aufgenommen. In

Abbildung 50 werden die gemessen Spektren zweier Nanopartikelsuspensionen aus den

2,5 mM-Selenitansätzen verglichen. Dabei zeigen beide Proben ein identisches Spektrum,

womit die Reproduzierbarkeit bewiesen wird. Bei einer Raman-Verschiebung von

257 cm-1

besitzen beide Proben den ersten Peak. Dieser Peak wird, laut Literatur, einer

Selenkette oder einem Se8-Ring zugeordnet (Poborchii et al. 1997). Ein zweiter Peak wird

bei beiden Ansätzen bei 355 cm-1

sichtbar und entspricht laut Schmidt und Wilhelm (1970)

einer S-Se-Valenzschwingung.


200 250 300 350 400 450

0

50

100

150

200

250

Ram

an-I

nte

nsi

tät

Raman-Verschiebung (cm-1

)

Probe 1

Probe 2

Abbildung 50: Raman-Spektrum der Nanopartikelsuspension

4.3.6 Thermostabilitätstest

Bei der Charakterisierung der Nanopartikel wurde die Stabilität gegenüber höheren

Temperaturen untersucht. Dabei wurden die isolierten Nanopartikel nach 24-stündiger

Erwärmung im Temperaturbereich von 35 °C bis 250 °C mittels UV/Vis und dynamischer

Lichtstreuung analysiert.

In der Abbildung 51 wird die farbliche Änderung der Nanopartikelsuspensionen nach der

Erwärmung bei den jeweiligen Temperaturen deutlich. Dabei wird sichtbar, dass die bei

35 °C-inkubierte Probe ein intensiveres rot besitzt als die Ausgangslösung. Nachdem die

Probe bei 50 °C erhitzt wurde, ist zu beobachten, dass die Partikel, nicht wie gewohnt

homogen verteilt vorliegen, sondern sich Aggregate gebildet haben, die aufgrund des

Gewichtes schneller sedimentieren. Die 100 °C-Probe hat eine blass-rote Färbung, jedoch

ist am Boden feines rötliches Sediment erkennbar. Bei dieser Probe konnte außerdem im

Teflonbecher des Stahlautoklaven ein rotes Sediment beobachtet werden. Dies war bei den

anderen Temperaturen nicht der Fall. Die 250 °C-Probe stellt eine klare farblose

Flüssigkeit dar, die optisch keine Nanopartikel mehr enthält.


Abbildung 51: Aufnahme der Ausgangslösung und der bei unterschiedlich hohen Temperaturen

inkubierten Nanopartikelsuspension

4.3.6.1 UV/Vis-Spektroskopie

Zur weiteren Charakterisierung der Nanopartikelsuspensionen nach der Inkubation bei den

unterschiedlichen Temperaturen (35 °C, 50 °C, 100 °C, 250 °C) wurden Absorptions-

spektren im Wellenlängenbereich von 200 bis 1200 nm aufgenommen. Durch Auftragen

der Absorption über die Wellenlänge entsteht das Absorptionsspektrum (Abbildung 52) der

Nanopartikelsuspension der Ausgangslösung vor und nach der Inkubation bei unter-

schiedlichen Temperaturen (35 °C, 50 °C, 100 °C, 250 °C).

Ausgangs-

lösung 35 °C 50 °C 100 °C 250 °C


200 400 600 800 1000 1200

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abso

rpti

on

Wellenlänge (nm)

Ausgangslösung

35 °C

50 °C

100 °C

250 °C

Abbildung 52: UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei unterschiedlichen

Inkubationstemperaturen

Die Absorptionsspektren der Partikelsuspensionen der Ausgangslösung und der bei 35 °C

inkubierten Probe zeigen keine signifikanten Unterschiede. Beide Spektren besitzen einen

Peak bei 600 nm und eine Schulter bei 780 nm. Diese Peaks können dem Element Selen

zugeordnet werden (Oremland et al. 2004). Bei der 50 °C-inkubierten Probe kommt es zu

einer Veränderung der Verhältnisse, wobei der Hauptpeak und die Schulter nun eine

Wellenlänge zwischen 600 nm und 800 nm aufweisen.

Die Lösung bei 100 °C und 250 °C weisen kaum eine Absorption auf. Ein vergrößerter

Ausschnitt der zweier UV/Vis-Spektren ist in Abbildung 53 dargestellt.


600 800

-0,03

0,00

0,03

Abso

rpti

on

Wellenlänge (nm)

100 °C

250 °C

Abbildung 53: UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei einer Inkubation von 100 °C und

250 °C

Hierbei ist zu sehen, dass bei der 100 °C Probe eine geringe Absorption von 0,02 bei

620 nm zu erkennen ist. Dies bestätigt die Beobachtung, dass bei dieser Probe nach der

Inkubation rotes Sediment im Teflonbecher aufzufinden und nach dem Resuspendieren

eine schwach rote Lösung zu erkennen war. Bei der 250 °C Probe wurde hingegen eine

klare Lösung wahrgenommen.

4.3.6.2 Dynamische Lichtstreuung

Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung wurde nach der Inkubation der Nano-

partikelsuspension der Einfluss von unterschiedlichen Temperaturen auf die Partikel-

größenverteilung (Abbildung 54) untersucht.


1000

0

5

10

15

20

25

30

35In

tensi

tät

(%)

Log. Partikelgrößenverteilung (nm)

Ausgangslösung

35 °C

50 °C

100 °C

Abbildung 54: Partikelgrößenverteilung der Ausgangslösung und der Proben, die bei 35 °C, 50 °C und

100 °C inkubiert wurden

Mittels dieser Ergebnisse wurde aus der Partikelgrößenverteilung der jeweiligen Probe ein

Partikelgrößendurchschnitt bestimmt (Tabelle 7).

Tabelle 7: Inkubationstemperaturen mit dazugehörigem durchschnittlich gemessenem Durchmesser

Inkubationstemperatur Durchmesser (nm)

Ausgangslösung (RT) 301,2

35 °C 370,1

50 °C 2329,5

100 °C 380,7

250 °C -


Dabei ist gut zu erkennen, dass die Ausgangslösung und die Proben, die bei 35 °C und bei

100 °C inkubiert wurden, einen ähnlichen Partikeldurchmesser besitzen. Bei der

250 °C-Probe konnte keine Partikelgrößenverteilung bestimmt werden. Dies war zu

vermuten, da die Nanopartikelsuspension nach der Inkubation keine rötliche Färbung mehr

besaßen, sondern eine farblose Flüssigkeit im Teflonbecher des Stahlautoklaven zurück-

blieb. Nach einer Wärmebehandlung bei 50 °C wiesen die Partikel mit 2329 nm einen fast

8-mal größeren Durchmesser als die Partikel in der Ausgangslösung auf.

4.3.6.3 Bestimmung des TOC-Gehaltes

Die Bestimmung des Kohlenstoffgehalts soll Aufschluss über das Vorhandensein

organischer Substanzen liefern. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 55 grafisch

dargestellt.

0 50 100 150 200 250

0

5

10

15

20

25

3028,4

3,12,5

10,2

Ausg

angsl

ösu

ng

TO

C [

mg/l

]

Temperatur (°C)

TOC-Gehalt

1,9

Abbildung 55: Grafische Darstellung des TOC-Gehaltes der Nanopartikelsuspension vor und nach der

Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen

Zunächst ist ein eindeutiger Trend, angefangen bei der Ausgangslösung (RT) bis zu den

höher temperierten Nanopartikelsuspensionen, zu erkennen. Die Ausgangslösung besitzt

einen Kohlenstoffgehalt von 1,9 mg/l. Danach ist eine Steigerung der Konzentration zu


beobachten. Bei der Probe, die 24 h bei 35 °C erhitzt wurde, ist ein Wert von 2,5 mg/l

Kohlenstoff gemessen worden. Eine weitere Erhöhung der Konzentration ist auch bei der

50 °C-Probe zu erkennen. Eine Ausnahme mit 3,1 mg/l bildet die Probe, die bei 100 °C

erwärmt wurde, denn diese besitzt einen geringeren Kohlenstoffgehalt als die 50 °C-Probe.

Den höchsten Gehalt an TOC mit 28,4 mg/l besitzt die bei 250 °-inkubierte Probe. Je mehr

Nanopartikel durch die Inkubation zerstört wurden, desto höher ist auch der gemessene

TOC-Gehalt.

D i s k u s s i o n S e i t e | 62

5 DISKUSSION

5.1 REDUKTION VON SELENIT/SELENAT

In dieser Arbeit wurden signifikante Unterschiede zwischen den Wachstumskurven der

Selenit- und Selenatkulturen ersichtlich. Da die Wachstumskurven der Kontroll- und

Selenatkultur einen fast identischen Verlauf aufweisen, kann davon ausgegangen werden,

dass das Bakterium A. brasilense das im Medium enthaltene Selenat nicht in seinem

Stoffwechsel aufnimmt und Selenat somit nicht toxisch bei der eingesetzten

Selenatkonzentration von 1 mM auf seinen Metabolismus wirkt. Im Gegensatz dazu wirkt

sich Selenit bereits ab einer Konzentration von 1 mM negativ auf den Wachstumsverlauf

der A. brasilense-Kulturen aus. Sowohl der Verlauf der optischen Dichte, des Gesamt-

proteingehalts und auch des pH-Wertes spiegelten während der Kultivierung eine starke

Verlängerung der lag-phase im Zellwachstum wieder. Dies spricht für die hohe Toxizität

des löslichen Oxyanions Selenit. Nach der lag-Phase folgt ebenfalls bei den Selenitkulturen

eine Steigerung der Zelldichte, welches auf eine Anpassung der Bakterien an die

Kultivierungsbedingungen zurückzuführen ist. Diese Wachstumsverzögerung der

Bakterien in Gegenwart von Selenit wurde bereits in der Literatur beschrieben (Sarret et al.

2005).

Es konnte durch die Ergebnisse der HG-AAS und der ICP-MS (Kapitel 4.2.2) gezeigt

werden, dass Selenit mikrobiell zu elementarem Selen reduziert wurde. Innerhalb von

sieben Tagen konnte das Bakterium A. brasilense 1 mM Selenit vollständig zu Selen-

nanopartikel umwandeln. Dagegen konnte Selenat durch A. brasilense nicht reduziert

werden. Die Selenatkonzentration blieb während der gesamten Kultivierung konstant. Dies

bestätigt die Aussage, dass Selenat nicht in den Metabolismus des A. brasilense

aufgenommen wird.

Studien belegen, dass unterschiedliche Arten von Bakterien nach der Reduktion von

Selenit rote, amorphe Allotrope von Se(0) bilden (Kessi et al. 1999, Oremland et al. 2004).

Dabei konnte ein Zusammenhang zwischen der Farbintensität der suspendierten

Nanopartikel (Kapitel 4.3.1) und dem Selengehalt im Medium (Kapitel 4.2.5) hergestellt

werden. Die blass-rötlich gefärbten Suspensionen, zeigten bei der HG-AAS und bei der

ICP-MS eine geringere Abnahme des Selenits aus dem Medium und dementsprechend

auch eine geringere Bildung der Selennanopartikel.


Dieser Zusammenhang kann auch mit dem Wachstumsverhalten und der Ermittlung der

Gesamtzellproteinkonzentration hergestellt werden.

Je schneller die lag-Phase überwunden wird, desto eher beginnen die Bakterien mit der

Reduktion des elementaren Selens. Da nur ein Ansatz bei den 5 mM-Kulturen

Bakterienwachstum aufwies, konnte hier schon vermutet werden, dass nur geringe Mengen

an Nanopartikel gebildet wurde. Dies spiegelt sich auch bei der blass-rosa Farbe der

isolierten suspendierten Nanopartikel wieder.

In Kapitel 4.2 wurde beschrieben, dass Auffälligkeiten in Bezug auf die Farbentwicklung

der Kulturen mit Selenit zu beobachten sind. Während der Kultivierung wurde eine

schwach rote Farbe der Selenitkulturen wahrgenommen, die bis zum Ende der

Kultivierung intensiver wurde. In anderen Publikationen wurde während des

Kultivierungszeitraumes der Selenitansätze eine Bandbreite von verschiedenen Rottönen

angegeben. Dabei wurde ebenfalls bei A. brasilense, in Gegenwart von Selenit, eine

Veränderung der Kulturen, beobachtet. Dies äußerte sich in durch eine schwache

Rotfärbung, die sich bis zum Ende der Kultivierung ebenfalls intensivierte. Dieser Effekt

wurde bei Tugarova et al. (2012) bis zu einer Selenitkonzentration von 1 mM beschrieben.

Im Kapitel 4.2.3 wurde beschrieben, wie tolerant das Bakterium A. brasilense gegenüber

unterschiedlich hohen Selenitkonzentrationen ist. Dabei war eine Tendenz zu erkennen,

dass mit steigender Selenitkonzentration im Kulturmedium mehr Zeit benötigt wird, um

das Maximum der Zelldichte zu erreichen. Die maximale wachstumsinhibierende

Selenitkonzentration konnte nicht eindeutig bestimmt werden, da sich die 5 mM-Ansätze

untereinander sehr unterschieden. Tugarova et al. (2013) untersuchte die Wirkung von

höheren Selenitkonzentration auf A. brasilense. Bei der Kultivierung auf festem Medium

wurde eine Wachstumshemmung bei einer Selenitkonzentration von 10 mM festgestellt.

Bei der Charakterisierung der Wachstumsverläufe der Kulturen bei unterschiedlichen

Selenitkonzentrationen besitzen alle ein lag-Phase, die bis zum 3. Tag andauerte. Die

Ergebnisse der HG-AAS und der ICP-MS hingegen verdeutlichen, dass mit steigender

Selenitkonzentration im Kultivierungsmedium die Selenitabnahme und die damit

verbundene Nanopartikelbildung später einsetzt. Bei einer Konzentration von 1 mM

beginnt die Abnahme der Selenitkonzentration zwischen dem 3. und dem 6. Tag, hingegen

die Abnahme bei den 2,5 mM erst am 7. Tag beginnt.


Die 5 mM-Selenitkultur, bei der ein Wachstum sichtbar wurde, zeigte innerhalb von 10

Tagen keine Reduzierung der Selenitkonzentration. Dabei war die Selenkonzentration zum

Schluss höher als am Anfang. Diese Erhöhung könnte dadurch zu begründen sein, dass

aufgrund der Kultivierung im Wärmeraum ein geringer Teil des Mediums verdampft und

das Selenit somit höher konzentriert ist.

Um eine eindeutige Aussage über die Höhe der Selenitkonzentration, die zum Hemmung

des Wachstums führt, machen zu können, sind weitere Versuche notwendig.

Damit kann eindeutig ein Zusammenhang zwischen Wachstumsverhalten von A. brasilense

und Abnahme des Selenits im Medium und der damit verbundenen Bildung der

elementaren Selennanopartikel bewiesen werden. Je schneller sich die Bakterien in

Gegenwart von Selenit erholen, desto eher beginnt die Reduktion des Selenits zu

elementarem Selen.

Neben den mikrobiell erzeugten Nanopartikel wurden zum Vergleich Untersuchungen mit

chemisch reduziertem Selen durchgeführt. Bei dem Vergleich der UV/Vis-Spektren, wurde

beobachtet, dass die chemisch reduzierte Selenitlösung einen Peak bei 667 nm aufwies und

demnach einen Peak bei einer ähnlichen Wellenlänge besitzte wie die mikrobiell erzeugten

Nanopartikel. Somit kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei beiden um

elementares Selen handelt. Die geringe Verschiebung des Peaks könnte mit dem Schwefel

in Verbindung stehen, welches in mikrobiell erzeugten Partikeln nachzuweisen ist.

Durch das in der Arbeit verwendete Reduktionsmittel Hydroxylamin konnte ausschließlich

Selenit chemisch reduziert werden, welches durch Bildung eines roten Niederschlags zu

beobachten war (Kapitel 4.3.1). Dies deutet auf eine Reduktion von Selenit zu

elementarem Selen hin. Es entstand im Gegensatz zum mikrobiell erzeugten Nanopartikeln

keine stabile Suspension. Beim Selenat hingegen wurde optisch keine Veränderung

sichtbar. Diese Beobachtungen wurden in der Literatur ebenfalls mit anderen

reduzierenden Reagenzien beschrieben. Viele Publikationen beschreiben bei der

Verwendung verschiedenster Bakterien, dass bei der chemischen Reduktion mit

unterschiedlichen Reduktionsmitteln keine Selennanopartikel, sondern ein roter flockiger

Niederschlag entsteht (Bruggeman et al. 2005, Bruggeman et al. 2007, Scheinost & Charlet

2008).


Selenit- und Selenat reduzierende Reagenzien, die in der Literatur beschrieben werden,

sind beispielsweise Hydrazin (Buckley 1976), Ascorbinsäure (Shaker 1996) und

Natriumascorbat (Mees et al. 1995).

5.2 CHARAKTERISIERUNG DER NANOPARTIKEL

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Bakterium A. brasilense die

Fähigkeit besitzt unter aeroben Bedingungen das giftige Selenit in das weniger gefährliche

elementare Selen in Form von Nanopartikeln umzusetzen.

Nachdem die Nanopartikel isoliert (Kapitel 3.5.10) und mit VE-Wasser resuspendiert

wurden, blieb eine kaminrote Lösung zurück, welche auf die Farbe der Nanopartikel

zurückzuführen ist. Die Nanopartikel wurden über mehrere Monate in VE-Wasser gelagert.

Dabei war zu beobachten, dass im Gegensatz zu den chemisch reduzierten Partikeln, eine

stabile Suspension entstand. In dieser Zeit lösten sich die Nanopartikel nicht in Wasser und

agglomerierten auch nicht. Diese Beobachtung wird durch Oremland et al. (2004) bestätigt.

Durch Lagerung der Nanopartikel in destilliertem Wasser über einen Zeitraum von

mehreren Monaten behielten diese die Struktur bei und können somit als stabil angesehen

werden.

Die unter dem Lichtmikroskop beobachteten Nanopartikel konnten, ebenfalls mittels REM

und TEM visualisiert und über EDX als ein Selen-Schwefel-Gemisch identifiziert werden.

Dabei lagen die Nanopartikel außerhalb der Zelle vor. Nur durch TEM-Dünnschnitte der

Bakterien kann eindeutig bestimmt werden, ob die Nanopartikel innerhalb und/oder

außerhalb der Bakterienzelle vorkommen. In der Veröffentlichung von

Tugarova et al. (2013) wird ein Versuch mit ähnlichen Bedingungenbeschrieben. Die

Kultivierung des A. brasilense erfolgte sieben Tage bei aeroben Bedingungen und wurde

während des Versuches nicht geschüttelt. Die dabei entstandenen Partikel lagen

intrazellulär vor (Tugarova et al. 2013). Andere in der Literatur erwähnten Bakterien

besaßen ebenfalls die Fähigkeit Nanopartikel in Gegenwart von Selenit zu bilden waren

sowohl intrazellulär als auch extrazellular lokalisiert (Oremland et al. 2004)

Mittels EDX konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der von Nanopartikel umgebene

„Schatten“, weitestgehend aus Spurenelementen besteht und dies auf Rückstände aus der

Isolierung der Nanopartikel zurückzuführen ist.


Durch Bestimmen der Oberflächenladung (Kapitel 4.3.3) wurde bei einem pH-Wert von 7

ein Oberflächenpotential in dem Bereich -15 bis -18 mV gemessen. Während der

Bestimmung des Zetapotentials konnte in dem untersuchten pH-Bereich von 1 bis 7 kein

isoelektrischer Punkt ermittelt werden.

Diese starke Ladung der Partikel ist für die Stabilität und Ausbildung der

Nanopartikelsuspension notwendig, da sich gleichgeladene Partikel voneinander abstoßen

und nicht agglomerieren. Für Nanopartikel, die durch Bakterium Bacillus cereus gebildet

wurden, konnte eine Ladung von -46,86 mV bestimmt werden (Dhanjal & Cameotra

2010).

Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (Kapitel 4.3.4) wurde die Partikel-

größenverteilung ermittelt. Für die durch A. brasilense gebildeten Selennanopartikel

konnte daraus ein durchschnittlicher Partikeldurchmesser von 400 nm berechnet werden.

Dieser Wert stimmt mit der Ausmessung der isolierten Nanopartikel der TEM-Aufnahme

(Kapitel 4.3.2) überein. Bei den 1 mM-Selenitkulturen wurde häufig die Auffälligkeit

beobachtet, dass sich die Ansätze schon kurz nach Zugabe des Selenits sich farblich

unterscheiden. So färbten sich einige Ansätze orange und andere hingegen rot. Durch die

Analyse mittels DLS sollte untersucht werden, inwiefern ein Zusammenhang zwischen

Farbe und Partikelgröße bzw. deren Verteilung besteht. Die orangefarbene Kultur besaß

Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 443 nm, die rötliche hingegen

407 nm. Da die Unterschiede so gering sind, kann nicht eindeutig gesagt werden, ob eine

Abhängigkeit zwischen Partikelgröße und Färbung der Kultur besteht. Bei der Messung

der Optischen Dichte und der Bestimmung der Gesamtzellproteinkonzentration konnten

hingegen große Unterschiede festgestellt werden. Ansätze, die sich während der

Kultivierung orange färbten, wiesen ein starkes Wachstum auf (ODmax bei 4 bis 5) und eine

hohe Proteinkonzentration (cmax = 1780 µg/ml bis 2350 µg/ml) auf. Die rötlichen Kulturen

hingegen besaßen durchschnittlich eine OD von 3 und eine Gesamtzellproteinkonzen-

tration von 800 µg/ml. Nach circa zwei Wochen im Wärmeraum konnte beobachtet werde,

dass sich die orangene Färbung der Kultur sich zu Rot änderte. Dieser Farbwechsel wird

auch von Lin und Wang (2005) beschrieben, wobei diese die Änderung von gelb zu rot als

einen Beweis für die Vergrößerung der Partikelgröße der Selennanopartikel angeben.


Andere, in der Literatur angegebene, Bakterien produzieren in Gegenwart von Selenit

ebenfalls sphärische Partikel, bei denen von dem Pseudomonas sp. gebildeten Nano-

partikeln ein Durchmesser von 400 nm und bei Bacillus sp. die Partikel mittels

REM-Aufnahme auf 200 bis 300 nm geschätzt wurden (Kashiwa et al. 2000, Hunter &

Manter 2009).

Bei dem Vergleich der durchschnittlichen Partikelgröße der unterschiedlich hohen

Selenitkonzentrationen ist eine Tendenz erkennbar. Je höher die Selenitkonzentration im

Medium, desto kleiner ist die durchschnittliche Partikelgröße. Jedoch sind die

Unterschiede so gering, dass nicht eindeutig bestimmt werden kann, dass die Partikelgröße

von der Höhe der Selenitkonzentration abhängig ist. Betrachtet man die Verteilung der

Partikel, so ist zu erkennen, dass sich die Partikel des 5 mM-Ansatzes in dem Bereich

190 bis 712 nm aufteilen, wo hingegen die Partikel des 1 mM-Ansatzes sich zwischen

295 und 1106 nm befinden. Dies kann mit Länge der lag-Phase zu begründen sein. Die

1 mM-Kulturen besitzen eine kürzere lag-Phase und beginnen dementsprechend eher mit

Wachstum als die anderen Kulturen. Somit haben die Bakterien bei einer geringeren

Selenitkonzentration mehr Zeit, um das Selenit aus dem Medium zu Nanopartikel zu

reduzieren, welches wiederrum Einfluss auf die Nanopartikelgröße hat.

Der in dieser Arbeit detektierten Peaks bei 257 cm-1

und 355 cm-1

werden auch in der

Literatur als Strukturen von Selen beschrieben. Die Raman-Verschiebung bei 257 cm-1

wird in Publikationen einer Selenkette und einem Se8-Ring zugeordnet (Poborchii et al.

1997). Der kleine Peak bei 355 cm-1

könnte vor dem Hintergrund der

TEM-EDX-Ergebnisse als Selen-Schwefelverbindung interpretiert werden. In Schmidt und

Wilhelm (1970) wird beschrieben, dass Banden, die um 360 cm-1

liegen, der S-Se-Valenz-

schwingung zugeordnet werden. Dies würde mit den Aussagen der EDX-Analyse

übereinstimmen, bei der die Nanopartikel als ein Selen-Schwefel-Gemisch identifiziert

wurden. In Oremland et al. (2004) wurden ebenfalls die Nanopartikel dreier Bakterien-

stämme beschrieben, die mittels Raman-Spektren charakterisiert wurden. Ein ähnliches

Spektrum, wie das in dieser Arbeit gemessene, besitzt einen Peak mit einer Raman-

Verschiebung von 240 cm-1

zeigen die Nanopartikel des Bakteriums. Die Nanopartikel des

Bakterienstamm S. shriftii wiesen Se8 strukturelle Einheiten auf. In Kohara et al. (1998)

wird die typische strukturelle Anordnung der Selen-Atome beschrieben. Diese liegt in

verschiedenen Oxidationsstufen als Ringe oder Ketten vor. Dabei variiert die molekulare

Zusammensetzung oder die Kettenlänge, beginnend von Se3 bis S12.


Durch Inkubation der Nanopartikelsuspension bei unterschiedlich hohen Temperaturen

(Kapitel 4.3.6) wurde die Thermostabilität der Nanopartikel untersucht und anschließend

mittels dynamischer Lichtstreuung und UV/Vis charakterisiert.

Des Weiteren wurde der TOC-Gehalt der Lösungen gemessen. Schon nach dem Erhitzen

wurden bereits rein optische Unterschiede sichtbar (Abbildung 51), die sich auch in den

UV/Vis-Spektren zeigten.

Da die Spektren der Ausgangslösung identisch (Peak bei 600 nm) mit der bei 35 °C

inkubierten Probe sind, kann davon ausgegangen werden, dass hier keine Änderung in der

Atomanordnung zu verzeichnen ist. Bei einer Temperatur von 50 °C beginnen die Partikel

ihre Größe zu ändern oder zu agglomerieren, sodass die roten Nanopartikel nach einer

gewissen Zeit sedimentieren. Dies spiegelt sich auch bei der Messung der DLS wieder. Die

durchschnittliche Partikelgröße nimmt mit zunehmender Inkubationstemperatur zu. Eine

„Ausnahme“ bildet sich 50 °C-inkubierte Probe, bei dem ein hydrodynamischer

Durchmesser von 2330 nm gemessen. Dies ist ein 7-fach größerer Durchmesser als die

Partikel bei den anderen unterschiedlichen Inkubationstemperaturen.

Die UV/Vis Spektren der 100 °C- und 250 °C-Probe wiesen kaum eine Absorption auf.

Jedoch wurde bei der 100 °C-inkubierten Probe ein kleiner Peak bei 620 nm detektiert

werden. In Lin und Wang (2005) werden die Absorptionsspektren für eine Folge

verschiedener Größen der Selennanopartikel dargestellt. Die Partikel, die ebenfalls bei

einer Wellenlänge von 600 nm einen Peak aufwiesen, besitzen einen Partikeldurchmesser

von 182,8 ± 33,2 nm. Je größer die Partikel werden, desto mehr verschiebt sich der Peak in

höhere Wellenlängen. Das Absorptionsspektrum der isolierten Selennanopartikel des

Bakteriums Bacillus cereus unterstützt ebenfalls die Aussage, dass Selen bei einer

Wellenlänge von 600 nm aufzuweisen ist (Dhanjal & Cameotra 2010). Dieser Unterschied,

zwischen den in dieser Arbeit bestimmten Partikelgröße und deren Partikeldurchmesser,

könnte mit der von Dhanjal und Cameotra (2010) durchgeführten chemischen Reduktion

zu begründen sein.

Die TOC-Messungen der unterschiedlich temperierten Proben sollte Aufschluss über das

Vorhandensein organischer Substanzen liefern, welche an der Nanopartikelbildung

beteiligt sind. Dazu wurde der Gehalt an organisch gebundenen Kohlenstoff bestimmt.

Es kann gesagt werden, dass mit steigender Temperatur mehr organisch gebundener

Kohlenstoff vorhanden ist. Grund dafür könnte sein, dass mit steigender Temperatur


zunehmend Nanopartikel zerstört werden und dementsprechend auch der TOC-Ghealt

erhöht wird. Die Ausnahme stellt die 100 °C-Probe dar, die einen geringeren TOC-Gehalt

aufwies. Ein Grund könnte das bei der Erhitzung gebildete rote Sediment sein, da dieses

mittels Pipette nicht resuspendieren und somit nicht aufgenommen werden konnte. Daher

fehlt ein gewisser Teil an Nanopartikel, der mittels TOC-Messung nicht mit erfasst werden

konnte.

A u s b l i c k S e i t e | 70

6 AUSBLICK

Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Aspekte gaben Aufschlüsse über die

Verträglichkeit von Selenat und Selenit gegenüber des Bakteriums A. brasilense. Die

Untersuchungen zeigten, dass nur das Oxyanion Selenit toxisch auf das Bakterium wirkt.

Durch Variation der Selenitkonzentration konnte unter gewählten Bedingungen und

Konzentrationen gezeigt werden, inwieweit das Bakterium A. brasilense in der Lage ist,

eine bestimmte Selenitkonzentration zu tolerieren, sodass es lebensfähig bleibt. Aufgrund

der Reduktion von Selenit zu elementaren Selen bildeten sich extrazellulär Nanopartikel,

die mit Hilfe verschiedener Methoden charakterisiert wurden. Die Erkenntnis, dass die

Nanopartikel bei einer 24-stündigen Inkubation bei 50 °C einen größeren Partikel-

durchmesser annehmen kann für die Isolierung der Nanopartikel in großem Maßstab von

Nutzen sein. Diese könnten leichter mittels Sieb abgetrennt werden als kleinere Partikel.

Für die Betrachtung des Bakteriums in natürlicher Umgebung wären weitere

Untersuchungen von großem Interesse. Dabei könnte ermittelt werden, ob das Bakterium

in der Natur ebenfalls das Verhalten äußert Selenit zu reduzieren und Nanopartikel zu

bilden. Demnach könnte Wasserproben aus regionalen Flüssen oder Seen entnommen

werden und beispielsweise durch Zugabe von Selenit das Verhalten beobachtet werden.

Des Weiteren kann sowohl die Sorption von Selennanopartikel an Mineralen untersucht

werden als auch die Sorption von nuklearen Stoffen, beispielsweise Europium und Uran,

an Selennanopartikel und wäre somit für die Endlagerforschung von großem Interesse.

Auch die Sorption an Metallen, beispielsweise Kalzium, Magnesium und Eisen, könnte in

nachfolgenden Experimenten analysiert werden. Bei der Kultivierung des A. brasilense

wurden einige Auffälligkeiten bezüglich des aeroben Wachstums festgestellt, welche durch

weitere Experimente untersucht werden können. Die Bakterienkulturen, die bei der

Kultivierung, aufgrund der unterschiedlichen Größen der Erlenmeyerkolben, eine größere

Oberfläche und damit verbundenen größeren Kontakt mit Sauerstoff, besaßen, begannen

schneller mit der Produktion der Selennanopartikel. Diese Aerotaxis wird in einigen

Publikationen in Gegenwart einer geringen Sauerstoffkonzentration beschrieben (Barak et

al. 1982) und die Bakterien wandern zur optimalen Sauerstoffkonzentration (Zhulin et al.

1996).

A u s b l i c k S e i t e | 71

In einigen Publikationen wird davon berichtet, dass das Bakterium A. brasilense in der

Lage ist, das Phytohormon Indolessigsäure zu produzieren.

Inwieweit ein Zusammenhang zwischen der Produktion dieser Indolessigsäure und

Bildung der Nanopartikel besteht, könnte in weiterführenden Experimenten untersucht

werden.

L i t e r a t u r v e r z e i c h n i s S e i t e | 72

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E i d e s s t a t t l i c h e E r k l ä r u n g S e i t e | 76

8 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich eidesstattlich, dass die vorliegende Masterarbeit ohne unzulässige Hilfe

Dritter und ohne Benutzung anderer als der von mir angegeben Hilfsmittel angefertigt

habe. Die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als

solche kenntlich gemacht.

Dresden, den 30.September 2013

Anika Maffert

D a n k s a g u n g S e i t e | 77

9 DANKSAGUNG

Als erstes möchte ich Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas Wiegert für die Betreuung

meiner Masterarbeit sowie sein Interesse am Fortgang der Arbeit danken.

Die vorliegende Masterarbeit wurde in der Abteilung Biogeochemie am Institut für

Ressourcenökologie des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf e.V. angefertigt. An

dieser Stelle möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die durch ihre tatkräftige

Unterstützung zum Entstehen dieser Arbeit beigetragen haben.

Dabei gilt mein ganz besonderer Dank meinen Betreuern Frau Dr. Manja Vogel,

Herr Dr. Robin Steudtner und Frau Dr. Carola Franzen, bei denen jederzeit die Tür für

mich offen stand, um Fragen zu beantworten und Probleme zu lösen. Außerdem danke ich

ihnen für die lehrreichen Gespräche, die anregenden Diskussionen, die fachliche

Kompetenz und die mitreißende „wissenschaftliche Neugier“ am zu bearbeitenden Thema.

Weiterhin möchte ich mich bei meinen Bürokolleginnen Julia Berger, Maria Berger,

Sandra Köppchen und Dorina Köpke für die vielen wissenschaftlichen und privaten

Diskussionen, die entspannte Arbeitsatmosphäre und die stete Hilfsbereitschaft aller

bedanken.

Des Weiteren möchte ich mich herzlich für die tatkräftige Hilfe beim Korrigieren der

grammatischen Fehler bei meinen Freundinnen Julia Berger und Maria Berger bedanken,

die sich bereit erklärt haben, meine Arbeit gegenzulesen.

Nicht zuletzt gilt mein besonderer und tiefer Dank meinen Eltern, meiner Oma und

meinem Freund, die mir immer bei Seite standen, mich unterstützten und immer ein

offenes Ohr für mich hatten.

bakterium azospirillum brasilense - … charakterisierung der wechselwirkung von selen mit dem...

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