Microbiologia I

Tema 1.1. El món dels microorganismes

CONCEPTE DE MICROBIOLOGIA I MICROORGANISMELa Microbiologia és la ciència que estudia els organismes que són massa xicotets per poder-los veure a simple vista (<0,1-1mm). Virus, prions, arqueus, bacteris, protozous i moltes algues i fongs. Però d'aquests últims n'hi ha que són més grans i, per tant, visibles. És per això que s'ha suggerit incloure en la definició les tècniques que s'empren en el seu estudi (aïllament, esterilització, cultiu en medis artificials).

FORMES D'ORGANITZACIÓ DELS MICROORGANISMESLa Microbiologia pot estudiar dos grans grups, que es poden diferenciar entre cel·lulars i acel·lulars segons si formen cèl·lules o no:

− Acel·lulars:− Virus: són, bàsicament, un àcid nucleic i una coberta proteica, la càpsida.− Viroides: són una molècula d'RNA d'una sola cadena circular; es pot replicar, però

necessita d'una cèl·lula hoste.− Prions: són partícules proteiques infeccioses amb capacitat per a multiplicar-se i que

formen agregats.− Cel·lulars:

− Cèl·lula eucariota: protozous, algues i fongs.− Cèl·lula procariota: bacteris (eubacteris) i arqueus (arqueobacteris). De bacteris hi ha

Mycoplasma, Rickettsia i Chlamydia, que són paràsits obligats. Tenen una mida d'entre 1 i 10 micròmetres, tot i que poden ser de dècimes de micres.

En funció del microorganisme, caldrà un tipus de microscopi o un altre.

− Eucariotes: membrana nuclear, nuclèol, nombre de cromosomes superior a 1. Els seus gens presenten introns. Hi ha mitosi, així com reproducció sexual. Tenen mitocondris, cloroplasts, esterols a la membrana plasmàtica, reticle endoplasmàtic, aparell de golgi i ribosomes (80S). Poden tenir flagels. Tenen citoesquelet. La diferenciació cel·lular permet la distinció de teixits i òrgans.

− Procariotes: no tenen membrana nuclear ni nuclèol, i tenen 1 cromosoma. En general, no presenten introns. No hi ha mitosi i la reproducció és asexual (no hi ha meiosi). Només el Mycoplasma té esterols a la membrana cel·lular. Tenen ribosomes, però són diferents dels eucariotes (70S). Poden tenir flagels, tot i que són diferents quant a forma i mida respecte als dels eucariotes. Poden tenir citoesquelet. Tenen una diferenciació cel·lular rudimentària.

− Bacteris: la majoria tenen paret cel·lular, però el component principal que la forma és únic: el peptidoglicà o mureïna. El primer tRNA porta una formilmetionina. Cloroanfenicol, estreptomicina i canamicina són antibiòtics que afecten la traducció i, concretament, en els ribosomes (no afecten als arqueus). Poden desenvolupar moltes funcions metabòliques, algunes d'elles exclusives de bacteris, però no poden fer metanogènesi. També poden tenir vesícules de gas i grànuls de reserva de carboni.

− Arqueus: tenen paret cel·lular, però sense mureïna. El primer tRNA porta metionina. La unió entre els lípids de membrana són unions èter (en bacteris són èster). No els afecten els antibiòtics anteriorment esmentats.

− Eucariotes: el DNA no és circular (en procariotes, sí). L'mRNA es forma de manera diferent

-1-

Microbiologia I

respecte als procariotes. No tenen plasmidis. Tenen molt poca diversitat metabòlica.

ORIGEN I EVOLUCIÓ DE LA VIDAEn els seus inicis, l'ambient que hi havia a la Terra era d'elevades temperatures, anòxid i amb molta radiació. Només hi havia molècules inorgàniques. Per tant, una primera evolució havia de ser l'evolució de les molècules químiques, perquè sense àcids nucleics i aminoàcids no hi ha proteïnes, sense lípids no es poden formar cèl·lules, etc. Es creu que les molècules, en aquestes condicions, podien evolucionar i arribar-se a formar els primer aminoàcids i nucleòtids. Perquè es formi la primera cèl·lula es necessita material genètic; es creu que a l'inici va aparèixer primer l'RNA, ja que se'n van descobrir amb capacitat autoreplicativa, catalítica: els ribozims. També hi havia vesícules lipoproteiques que van acabar englobant aquest RNA. Posteriorment, entrarien en joc les proteïnes, que desplaçarien de la funció catalítica l'RNA actuant com a enzims. Així, l'RNA com a molècula codificant seria substituïda per DNA perquè és més estable i fiable en el moment de la replicació.

A part de l'evolució de les molècules químiques, també, en aparèixer la vida, es postula que hi va haver una evolució metabòlica. Això es creu que va anar des dels fenòmens metabòlics més senzills als més complicats. Hem de pensar que al començament, en un ambient anòxid (reductor), s'haurien d'obtenir compostos a partir d'hidrogen o sulfhídric, compostos reduïts. L'obtenció d'energia per oxidació de compostos reduïts es coneix com a quimiolitotròfia. A mesura que es van crear molècules noves, van aparèixer les primeres fermentacions, mancades d'oxigen. Se seguiria evolucionant i, en algun moment, apareixeria l'anell de porfirina, que es troba en citocroms i altres. Posteriorment, començarien altres processos metabòlics, tals com la respiració anaeròbia i la fotosíntesi anaeròbia o anoxigènica. Amb l'aparició de la fotosíntesi anoxigènica, després apareixeria l'oxigènica, que seria un moment important, atès que a partir d'aquell moment es va començar a formar oxigen que s'acumulava a l'atmosfera. Aquesta fotosíntesi féu possible la respiració aeròbia, però també la formació de la capa d'ozó, que filtra la llum ultraviolada (fins aquest moment, viure a la capa terrestre era impossible).

Els primers en diversificar-se van ser els bacteris. Seguidament, van aparèixer els arqueus i, posteriorment, els eucariotes. Els cianobacteris, apareguts més tard, realitzen la síntesi oxigènica. A partir d'aquí van anar apareixent formes de vida que empraven l'oxigen.

La teoria endosimbiòtica diu que en un principi hi hauria una cèl·lula procariota que aniria augmentant de complexitat amb l'evolució. Posteriorment, es donaria una simbiosi entre aquesta cèl·lula i bacteris, ja que està demostrat que els mitocondris són com un vestigi de bacteris; és a dir, inicialment, fou un bacteri que va fer simbiosi amb la cèl·lula procariota. Part d'aquests procariotes també adquiririen, per simbiosi, els cloroplasts, que actualment, el que més s'hi assembla, són els cianobacteris. Les plantes i les algues, per tant, eren simbionts entre bacteris i cèl·lula procariota.

L'ARBRE DE LA VIDAÉs l'arbre filogenètic dels ésser vius. Al principi, només es distigien plantes i animals. A finals del segle XIX comencen a distingir-se els protists. A mitjan segle XX comença a parlar-se de procariotes i eucariotes. L'any 1959, una altra classificació va establir els regnes de les plantes, protists, fongs, animals i moneres. Finalment, als anys 90, Woese, en base d'estudis filogenètics basats en les seqüències d'rRNA, va fer un arbre filogenètic a partir del qual s'estableix una diferenciació en els procariotes, apareixent arqueus, bacteris i eucariotes. Així, doncs, la classificació actual és de 3 dominis: arqueus, bacteris i eucariotes.

-2-

Microbiologia I

La taxonomia és un sistema jeràrquic. Les espècies són binomials: un que es correspon al gènere i l'altre, a l'espècie. El nom s'ha d'escriure en cursiva o subratllat (escrit a mà).

Una espècie es caracteritza per la semblança dels caràcters fenotípics i genotípics entre individus. Les soques són clons que formen una espècie en el cas de bacteris i virus.

EVOLUCIÓ HISTÒRIA DE LA MICROBIOLOGIANo va ser fins al 1673 que es té constància escrita del descobriment de microorganismes. La primera persona en descriure'n va ser Leeuwenhoek. Va descriure els animàlculs, que eren els microorganismes de la boca. Es va adonar que tenien formes diferents i, fins i tot, alguns es movien.

Posteriorment, hi va haver la discussió entre si els microorganismes es generaven per biogènesi o per generació espontània. Redi va ser el primer en començar a parlar sobre això a finals del segle XVII. Va demostrar precàriament la biogènesi. Needham, més tard, va posar aigua a bullir i la va traspassar en un pot, i va veure que seguien creixent microorganismes. Fet això, Spallanzani va provar el mateix, però sense canviar el flascó, i va veure que no creixien. No obstant això, hi seguia havent molta creença per la generació espontània. Al segle XIX, Louis Pasteur va tancar la polèmica convencent la comunitat científica que els microorganismes segueixen la biogènesi. Paral·lelament, Tyndall i Cohn van demostrar que hi havia formes de resistència en alguns bacteris, les endòspores, que resisteixen l'ebullició. Van idear un procés d'esterilització: la tindalització.

MALALTIES INFECCIOSES I MICROORGANISMESBassi va ser el primer en veure que un microorganisme podia causar una malaltia, i era un fong que infectava un cuc de seda. Més tard, Lister, que podríem dir que és el fundador de la cirurgia asèptica, per evitar que els pacients s'infectessin (infecció nosocomial: infecció en un hospital), escalfava les eines que utilitzava, així com també mullava les gases, les taules on era el malalt i altres amb fenol. Posteriorment, Robert Koch va demostrat que els bacteris que avui coneixem com a Bacillus anthracis són els causants del carboncle o àntrax. Concretament, aquest bacteri té endòspores, i es transmet a través del sòl via inhalació o a partir de ferides a la pell. També descobrí l'agent causant de la tuberculosi, el Mycobacterium tuberculosis, i va descobrir agars com a agents solidificants. També, en aquella època, es va idear la placa de Petri.

POSTULATS DE KOCHPer assegurar-se que un microorganisme causa una malaltia, cal complir els 4 postulats de Koch:

1. El patogen sospitós ha de ser present en tots els individus malalts i absent en els sans.2. El patogen sospitós s'ha de poder aïllar i fer-lo créixer en cultiu pur, on només hi creix un

microorganisme.3. Una volta aïllat el microorganisme sospitós de ser patogen, s'inocula a un altre individu,

però sa. Quan s'inocula en un animal sa, aquest ha de patir la mateixa malaltia que l'individu d'on l'hem aïllat.

4. Cal tornar a aïllar i fer créixer el microorganisme, i que aquest sigui el mateix que l'inicial.

En aquella època, Chamberland idea el filtre de porcellana, interessant per a filtrar una determinada grandària. Aquest fóu un mètode per esterilitzar, tot i que depèn del porus del filtre. Gram idea la tinció de Gram per a bacteris. Més tard, Ross demostra el cicle vital del Plasmodium, causant de la malària o paludisme. L'any 1898, Beijerinck va posar nom als virus, demostrant que un filtrat de fulles de tabac tenia poder infectiu. Leed i Carroll, més tard, van filtrar el primer virus humà (virus de la febre groga). Els últims descobriments daten de la segona meitat del segle XX. Prusiner va

-3-

Microbiologia I

descobrir els prions com a agents infecciosos; Montagnier descobreix el virus de la sida; el 2005, Marshall i Warren obtenen el Nobel en descobrir que un bacteri era el principal causant de gastritis i úlcera pèptica; Hausen, l'any 2008, va descobrir el virus del papil·loma humà.

TRACTAMENT I PREVENCIÓ DE LES MALALTIES INFECCIOSESEl 1796, Jenner va descobrir la primera vacuna per a la verola o pigota. A Pasteur i Roux, un segle després, els va funcionar, per casualitat, que els cultius de microorganismes, amb el temps, s'atenuaven (com també perden virulència en passar d'un individu a un altre). Metchnikof descobreix la immunitat cel·lular. Pasteur descobreix la segona vacuna per a la ràbia. Von Behring produeix antitoxines, anticossos per a la immunitat humoral. I Ehrlich, ja al segle XX, comença a practicar quimioteràpia amb salvarsan per al tractament de la sífilis. Més tard, Fleming descobreix la penicil·lina com a primer antibiòtic. L'any 1986 s'idea la primera vacuna per enginyeria genètica per a l'hepatitis B. Més tard ja van seqüenciar-se diferents organismes.

-4-

Microbiologia I

Tema 1.2. Tècniques microbiològiques bàsiques

MICROSCOPIS ÒPTICS (OM)Amplien la imatge o la mostra per a distingir coses més menudes. El llindar mínim a què treballem és cap als 200nm. Si baixem d'aquesta mida, necessitarem microscopis electrònics. Ens permeten de veure cèl·lules, però veure'n estructures cel·lulars, virus, prions, molècules, etc., ja requereixen de microscopis electrònics.

La refracció és la desviació de la llum. La llum es desvia quan passem d'una matèria a una altra. L'índex de refracció és una mesura de disminució de la velocitat de la llum; per això es desvia la llum. La distància focal és la distància mínima a la qual s'enfoca, en aquest cas fent referència a una lent; és la distància entre el centre de la lent i el punt focal, que és el punt on s'enfoca. La lent convexa escurça la distància a la qual s'enfoca.

Si parlem de microscopis òptics, estarem emprant la llum de longitud d'ona visible. La resolució d'un microscopi o d'una lent és la distància mínima a la qual podem diferenciar dos objectes molt pròxims. Com més curta sigui la longitud d'ona, major resolució. L'obertura numèrica és n (índex de refracció) per el sinus de l'angle zeta, que és la meitat de l'angle que es forma entre la mostra i l'objectiu. Podem utilitzar oli d'immersió per a permetre la visualització de mostres de mida més reduïda (n serà major, per tant de menor, és a dir, major resolució). La màxima resolució d'un microscopi òptic emprant oli és 0.2 micròmetres (aproximadament 1000 augments).

PREPARACIÓ DE MOSTRESA part de resolució, també necessitem un bon contrast. La majoria d'estructures cel·lulars es veuen en blanc i negre si no les treballem, dificultant-ne l'estudi. Per aconseguir el contrast, normalment emprem colorants, sobretots per al microscopi de camp clar. Abans d'afegir-hi colorants, cal fer un frotis amb la mostra, que és fixar-la en un porta. Posteriorment hi afegim colorants, que poden ser bàsics (carregats positivament) o àcids (carregats negativament). A part dels colorants, també hi ha el mordent, que és una substància que augmenta l'afinitat de la mostra per al colorant. Normalment, s'empra una solució de iode (lugol).

Es poden utilitzar diferents estratègies:− Tinció simple. S'empra un sol colorant. Augmenta el contrast. També es pot emprar el

mordent.− Tinció diferencial. S'empren dos o més colorants. Permet la diferenciació de

microorganismes. Es fa una fixació, s'hi afegeix colorant inicial, després el mordet, s'aplica una decoloració i s'aplica un segon colorant de contrast, que permetrà una distinció de tot el que no s'ha tenyit amb el colorant inicial. El més utilitzat és la tinció de gram, també l'àcid alcohol-resistent.− Tinció de gram. Hi ha dos grans grups de bacteris: els gramnegatius i els grampositius.

Són dos grans grups que podem diferenciar en base a la seua paret cel·lular. Aleshores, el colorant inicial (cristall violeta) fa que la paret cel·lular dels grampositius hi quedi enganxat el colorant; en cavi, en els gramsnegatius, no. Després s'hi afegeix el mordent (lugol), es decolora amb alcohol, perdent tot el que no han retingut les cèl·lules i, posteriorment, s'hi posa un altre colorant, la safranina, que és rosa.

− Tinció de Ziehl-Neelsen (àcid alcohol-resistent). S'utilitza una tinció diferencial per veure si els microorganismes tenen la paret cel·lular esperada o no. El colorant inicial és la fucsina fenicada. Després es pot utilitzar el lugol com a mordent, des decolora i s'hi

-5-

Microbiologia I

afegeix el blau de metilè, que és el colorant de contrast. Aquests bacteris s'anomenen micobacteris, i tenen una paret àcid-resistent; és a dir, resistiran la decoloració amb àcid-alcohol que no resisteixen la resta de parets.

− Tincions especials. S'utilitzen quan vols veure una estructura en concret. Per exemple, i hi ha microorganismes que secreten uns polisacàrids al voltant de la cèl·lula que s'anomenen càpsula, que és un factor de patogenicitat. Si es vol saber si els bacteris formen càpsula o no, s'utilitza la tinció negativa, que es fa amb tinta xinesa. També hi ha la tinció d'espores, que permet veure, finalment, un contrast on les espores queden de color verd (verd de malaquita, colorant inicial), i el que no és l'espora, cèl·lula vegetativa, queda de color rosat o vermellós degut a la safranina. En darrer lloc, també hi ha la tinció de Leifson que marca els flagels.

En el microscopi de camp fosc, s'obté el contrari/negatiu del camp clar. L'única diferència és que aquest utilitza un diafragma de camp fosc, que és un disc opac que, en col·locar-lo, farà que l'única llum que passa l'objectiu sigui la refractada per la mostra; la resta es veurà en negre. Per tant, no necessitem de colorants. Se sol utilitzar quan les mostres són de difícil tinció.

El microscopi de contrast de fases utilitza un diafragma anul·lar i un anell de fase. Tampoc calen colorants. S'aconsegueix desviar la meitat de la longitud d'ona, i per això s'obté major contrast.

El microscopi de contrast d'inferència diferencial (DIC o Nomarski) fa servir dos feixos de llum i s'obté una imatge tridimensional acolorida sense emprar colorants. S'obté major contrast perquè utilitza dos feixos de llum de diferent longitud d'ona.

El microscopi de fluorescència empra llum ultraviolada que fa augmentar la resolució, ja que té menor longitud d'ona. S'han d'utilitzar anticossos lligats a fluorocroms que s'incuben amb la mostra; si l'anticòs reconeix l'antigen, s'uniran. La llum ultraviolada, en incidir sobre el fluorocrom, s'excita i dóna llum fluorescent. Hi ha fluorocroms que s'exciten i donen llum verda o vermella per indicar si les cèl·lules estan vives o mortes.

El microscopi confocal de rastreig per làser utilitza llum làser i fluorocroms. La llum làser incideix sobre la mostra, fent excitar els fluorocroms. L'avantatge d'aquest és que el làser permet incidir a diferent profunditat de la mostra.

MICROSCOPIS ELECTRÒNICS (EM)El fonament és bàsicament el mateix, però en comptes de la llum, s'utilitza un feix d'electrons. La longitud d'ona és molt curta, de 0.005nm, fet que permet una elevada resolució. En comptes d'utilitzar lents de vidre s'empren lents magnètiques o electroimants. S'ha de fer el buit, no hi ha d'haver aire, perquè en enviar-hi els electrons no hi hagi interferències. La font d'emissió d'electrons és perillosa i es creen camps magnètics importants, de manera que calen mesures de seguretat.

MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE TRANSMISSIÓ (TEM)Permet variacions en la preparació de la mostra. Normalment, primer es fixa la mostra amb glutaraldehid, després es deshidrata amb acetona o etanol i s'hi inclou una matèria plàstica o parafina. Un cop a dins, s'hi fan talls nanomètrics mitjnaçant un ultramicròtom. Seguidament, es fa tinció amb acetat d'uranil (radioactiu) i es posa la mostra amb un metall pesat, que es fa per donar més densitat a la mostra per tal de veure'l en un blanc i negre més contrastat. També es pot fer tinció negativa o l'ombrejat amb metall pesant, que la deshidratació es fa en un angle d'evaporació

-6-

Microbiologia I

determinat, de manera que crea un efecte d'ona; finalment, també hi ha la criofractura, que es fa a -196º i després s'augmenta la temperatura sobtadament, i que permet substituir la mostra amb el metall pesant que s'utilitzi. La mostra es trenca en diferents parts.

MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE RASTREIG (SEM)Respecte al de transmissió, canvia que només detecta els electrons que reboten, que es refracten a la mostra. Utilitza metalls pesants.

MICROSCÒPIA DE RASTREIG D'EFECTE TÚNEL (STM)Permet un màxim de 100 milions d'augments. Per tant, permet veure, fins i tot, estructures moleculars. Funciona quan els àtoms de la mostra són conductors, com passa amb molècules biològiques com el DNA. Utilitza una sonda o una agulla molt prima que projecta electrons sobre la mostra. Aplicant un voltatge baix entre la punta de l'agulla i la mostra es crea un efecte de túnel, molt sensible a la distància.

MICROSCÒPIA DE FORÇA ATÒMICA (AFM)Distància constant entre la punta de la sonda i la superfície. Aplicacions: interaccions entre molècules i cèl·lules vives. L'agulla es mou mantenint la mesura de potencial constant. El que es mesura és el moviment de l'agulla.

-7-

Microbiologia I

Tema 1.2. Tècniques microbiològiques bàsiques

Si volem aïllar un únic organisme fem cultius purs o axènics, tot i que no sempre és possible. Si, en canvi, tenim microorganismes que necessiten d'una cèl·lula hoste, parlem de cultius bimembres. També podem fer cultius mixts per estudiar les interaccions entre diferents microorganismes. Posteriorment, cal saber quin medi de cultiu és l'adient per a fer créixer el microorganisme i quines tècniques calen per aïllar-lo.

MEDI DE CULTIUSol ser un medi artificial dissenyat per a fer créixer els microorganismes. Si volem que aquests creixin, cal que el medi tingui tot el necessari perquè es pugui multiplicar.

− Aigua destil·lada.− Nutrients (C, N, O, P, S), que són els elements químics de la matèria orgànica. Poden ser

nutrients per a microorganismes fotoautòtrofs o fotoheteròtrofs− Factors de creixement (vitamines, aminoàcids, purines, pirimidines). Són components

essencials que requereix la cèl·lula, però que no pot sintetitzar-los.− Pressió osmòtica (sals, sucres).− Control del pH.− Consistència (agar): líquid (0%), semisòlid (0,3%, sòlid (1,5%).− Definit o indefinit (peptones, extractes). Definit és quan coneixem tots els components del

medi de cultiu. Quan ens parla de peptones, extractes de carn, de llevats, etc., no sabem ben bé quina és la seva composició i per tant són medis indefinits o complexos.

Posteriorment, cal esterilitzar el medi perquè només hi creixi el microorganisme que vulguem, s'inocula l'organisme en el medi de cultiu i s'incuba. Quan s'utilitza agar en el medi, cal bullir-ho prèviament a l'esterilització. Una volta estèril,

Els cianobacteris, com que són fotosintètics, no necessiten de glucosa a diferència d'E. Coli.

Tipus de medis:− Un medi diferencial permet distingir microorganismes per alguna capacitat metabòlica.− Medi ric o nutritiu és quan el medi conté tant de nutrient com el microorganisme necessiti,

sense limitar-ne, per tant, el creixement. També pot ser medi mínim.− Un medi selectiu té substàncies inhibidores d'altres microorganismes que també poden

créixer, però que no ens interessen. Porta Agar Sabouraud amb un antibiòtic.− Un medi d'enriquiment fa créixer el microorganisme que volem, però afavorint el

creixement del que volem cultivar, no pas inhibint els altres que creixen.

− Microbiota: microorganismes que es troben en alguna part d'un altre organisme.

Al laboratori, en un medi de cultiu líquid, quan creix el microorganisme aquest es torna tèrbol. En un medi sòlid, si el tenim ben aïllat, hi veurem colònies ben separades.

MEDIS SELECTIUS I DIFERENCIALSQuan creixen microorganismes en Manitol hipersalí, el medi canvia de color i es veu groc (sobretot amb el gènere Staphylococcus). En Mac conckey es veu vermell, i està pensat per enterobacteris que fermenten la lactosa. En un principi és de color vermell pàl·lid. TCBS està pensat per al gènere

-8-

Microbiologia I

Vibrio; és diferencial per la sacarosa, marcant les colònies de color groc. En un principi és de color verd. L'ADA és un medi blavós que detecta la fermentació de dextrina.

Aquests medis també són selectius. Manitol hipersalí és selectiu per l'hipersalí, té una elevada concentració de sal. La majoria de medis de cultiu no duen sal o en duen en baixa concentració. Mac Conckey és selectiu perquè porta sals biliars i cristall violeta, fent que s'inhibeixin la majoria de bacteris que no són enterobacteris. TCBS també és selectiu per sals biliars. ADA és selectiu per ampicil·lina, que és un antibiòtic.

AÏLLAMENTHi ha tres maneres d'aïllar-los:

− Captura directa. En procariotes, es descarta, ja que capturar un individu és complicat.− Aïllament en medi de cultiu líquid. No s'utilitza mai, però és possible fent dilucions

serials. Hi ha un tractament estadístic per saber la probabilitat que en un tub s'hi pugui trobar només una cèl·lula.

− Aïllament sobre medi de cultiu sòlid. És aïllament en medi sòlid. Es pot fer per diverses tècniques:− Sembra en estries o per esgotament. Es parteix d'una placa de Petri amb medi de cultiu

sòlid. S'utilitza una nansa de Kolle per sembrar la mostra on hi ha el medi de cultiu. Prèviament, cal estabilitzar la nansa per no contaminar el medi de cultiu. S'esterilitza amb un Bunsen. Després es fan estries en el medi amb la nansa; com més estries es facin en una superfície determinada, millor. Després es torna a esterilitzar la nansa, i ja no s'agafa més mostra, sinó que se sembra a partir de la primera estria. La finalitat és obtenir colònies aïllades.

− Sembra en profunditat. Es fan dilucions successives amb una dissolució salina isotònica (Ringer) a partir de la mostra original. Els últims tubs de la dilució se sembren en placa: s'agafa un mil·lilitre d'un dels tubs i es posa en una placa i després s'hi posa el medi de cultiu, o bé inocules el mil·lilitre on tens el medi de cultiu (preferible la segona). Quan creix el microorganisme, on està més diluït. Les colònies creixen en superfície i en profunditat, dins del medi de cultiu.

− Sembra en superfície o per extensió. S'inoculen 0'1 microliltres de dissolució, que se sembren per tota la superfície (1ml no ho permet perquè és massa líquid com per sembrar-lo a la superfície). S'utilitza una nansa de vidre que s'esterilitza indirectament mullant-la en metanol i flamejant-la; això s'ha de repetir 3 voltes. Després se sembra homogèniament la mostra a la placa. Serveix per fer recompte de les colònies crescudes, ja que sabem quin volum hi hem posat. Llavors es fa la mitjana del recompte de les diferents colònies en les plaques sembrades, sempre que provinguin de la mateixa mostra, i es fa un càlcul que permet saber-ne la concentració (ufc/ml: unitats formadores de colònies per mil·lilitre). Hi ha un límit a partir del qual no es pot fer recompte; només si hi ha entre 30 i 300 colònies es pot fer. Si n'hi ha menys de 30, no és fiable estadísticament. Després s'agafa la colònia que ens interessa amb la nansa i s'aïlla en una altra placa. És bo, un cop aïllada una colònia, anotar-ne les característiques (coloració, forma, elevació, marge, etc.).

CONSERVACIÓ DE MICROORGANISMESEs fa un cultiu en TSA en un tub, on el medi (TSA) es col·loca inclinat (el mateix medi en líquid es diu TSB). Hi ha un problema, i és que els bacteris en el laboratori poden ser diferents que en la naturalesa degut al medi. Per tant, quan anem a conservar el microorganisme, cal seguir uns

-9-

Microbiologia I

mètodes de manteniment:− Canvis a la població. La població ha de ser el més semblant possible a la població general.− Canvis genètics. No s'han de perdre característiques genotípiques i fenotípiques.− Puresa. S'ha de de minimitzar el risc de contaminació.− Valor dels cultius. És necessari avaluar el risc de la pèrdua del cultiu.− Freqüència d'ús. Amb relació al mètode de restauració del cultiu especialment.− Manteniment de la viabilitat. Minimitzar la mort cel·lular durant el procés de

manteniment.− Subcultius. Sembrar un medi fresc a partir del que ja teníem. Es fa una incubació en el medi

més adient, que acostuma a ser nutritiu; la conservació és a 4ºC-25ºC. És adient per a qualsevol tipus de microorganisme. Poden durar entre 2 setmanes i un mes. Si tens el microorganisme en una placa, tub, etc., conforme passa el temps va perdent viabilitat. Per evitar que es mori, cal anar fent subcultius.

− Dessecació. Es tracta d'impregnar un suport, que pot ser tan simple com tires de paper o gel de silici . Es fa una deshidratació sobre un suport. És molt útils per a fongs i llevats, i, a voltes, també s'empra per a fongs i bacteris.

− Congelació. Cal posar-hi un crioprotector (DMSO, glicerol) perquè les cèl·lules no es lisin. La tècnica es desenvolupa entre -20ºC i -80ºC: a menor temperatura, més temps dura un cultiu pur congelat. Aquest mètode de conservació pot durar uns quants anys.

− Ultracongelació. Pot durar desenes d'anys. S'empra nitrogen líquid per arribar als -196ºC. Evidentment, també ha de dur crioprotector.

− Liofilització. A part de la resuspensió bacteriana que es vol descongelar, s'ha de congelar el cultiu i, seguidament, sublimar l'aigua (evaporar-la fent el buit). S'obté el cultiu en forma de pols, totalment deshidratat. Això ha d'estar en un recipient hermèticament tancat, normalment vidre. És adient per a qualsevol tipus de microorganisme. S'hi posen uns cristall per detectar si hi ha entrat vapor d'aigua o no. S'empra un recinte amb forma de flama.

Depèn del que estiguem fent, emprarem un mètode o un altre.

COL·LECCIONS DE CULTIUSLes soques que podrem trobar en les col·leccions oficials són les soques tipus, que representen la seua espècie. Aquestes han de ser, almenys, en dues col·leccions oficials diferents. Açò es fa per assegurar la conservació de la biodiversitat. Aquestes col·leccions són públiques.

De col·leccions de cultius n'hi ha moltes arreu del món. A l'Estat espanyol, hi ha la CECT. Hi ha països amb més d'una col·lecció oficial al seu territori.

LIMITACIONSEn la majoria de casos, se sap que aïllant en cultiu pur només s'aconsegueix aïllar l'1% del que hi ha a la naturalesa. Això s'ha vist comparant extraccions de seqüències de DNA. Hi ha cèl·lules que, en un cultiu, es mostren actives (viables), però d'altres no (inviables). Dins de les viables n'hi ha de cultivables (les que creixen en el medi de cultiu que estem utilitzant) i no cultivables (estan vives, però no han crescut en el medi).

-10-

Microbiologia I

Tema 2.1. Morfologia de la cèl·lula bacteriana i estructures externes a la paret

LA IMPORTÀNCIA DE LA MIDA DELS PROCARIOTES− A menor mida cel·lular, hi ha major relació superfície/volum.− Una cèl·lula gran té major superfície relativa, que es correspon a una major exposició al

medi.− Aquest fet implica un major intercanvi de nutrients amb el medi i una major taxa de

creixement.− Una elevada taxa de creixement implica que les poblacions siguin elevades.− Conseqüentment, es produeixen efectes importants en l'ecosistema.− Cal destacar que les forces de gravetat són poc importants, al contrari que les forces de

fricció i viscositat.

Bacteris més xicotets:− Chlamydia: 0,2-1,5 micròmetres.− Mycoplasma: 0,3-0,8 micròmetres.− Rickettsia: 0,5-2 micròmetres.

Bacteris gegants: tenen una mida de 600-750 micròmetres.

FORMES CEL·LULARS MÉS FREQÜENTS EN ELS BACTERIS− Coc: forma esfèrica o arrodonida. N'hi ha que formen part de la microbiota, però d'altres que

són patògens.− Thiocapsa roseopersicina.− Neisseria.− Staphylococcus.− Streptococcus.

− Bacil: forma cilíndrica o allargada.− Desulfuromones acetoxidans.− Enterobacteris. Formen part de la microbiota intestinal (E. coli).− Pseudomones.− Bacilus.

− Espiril: forma d'espiral. Són rígids.− Rhodospinillum rubrum.− Spirillum.

− Espiroqueta: tenen forma helicoïdal, de tirabuixó.− Spirochaeta stenostrepta.− Treponema.− Leptospira.− Borrelia.

− Apèndix, peduncle o prosteica:− Rhodomicrobium vannielii.− Hyphocomicrobium.− Caulobacter.− Gallionella.

− Filamentoses:

-11-

Microbiologia I

− Chloroflexus aurantiacus.− Oscillatoria.

Les mides més freqüents són 0,2-1,5 micròmetres. Hi ha bacteris que poden adoptar més d'una forma alhora: pleomorfisme.

AGRUPACIÓEn ocasions, formen agrupacions.

− Cocs: si no s'agrupen, se separen i formen dos conjunts diferents. Si s'agrupen, formen un conjunt com Neissera formant diplococs. Si formen tota una filera de cocs, com és el cas d'Streptococcus (strepto-: cadena). Hi ha cocs amb dos plans de divisió que formen tètrades, com el Micrococcus. També n'hi ha que formen una estrctura com en raïm, com els estafilo-.

− Bacils: es formen diplobacils, estreptobacils i coccobacils (bacils molt curts, gairebé esfèrics, que poden confondre's amb els cocs). Hi ha un gènere molt important, Vibrio (com Vicholerae) que són com bacils, però corbats. L'espiroqueta és més flexible, i té un filament axial al voltant que li dóna la forma.

FORMES INUSUALS− Estrella: Stella, tenen uns apèndixs.− Quadrades: Haloarcula.

DIFERENCIACIÓ CEL·LULAREl mateix organisme pot tenir dues cèl·lules diferents.

− Cèl·lula prostecada: Caulobacter presenta una forma allargada, pedicel, i la punta, àncora. Això li serveix per fixar-se a superfícies. A mesura que va creixent, va dividint-se; la cèl·lula que es divideix té un flagel en comptes de prosteca. Les cèl·lules que van en grup s'anomenen cèl·lules en eixam. S'augmenta la relació superfície/volum, li permet flotabilitat i pot trobar-se en diferents medis. També poden formar rosetes.

− Mixobacteris: es poden moure lliscant. Són depredadors d'altres microorganismes. En algunes condicions, s'agrupen i formen els cossos fructífers. En els extrems del cos fructífer s'hi formen una mena de fruits (esporangíols) on es generaran espores (mixòspores, molt resistents). De la cèl·lula vegetativa a l'espora es pot induir el pas per elements químics sense passar pel cos fructífer.

− Streptomyces: s'assemblen molt als fongs, però són bacteris. Pertanyen a l'ordre dels actinomycetals (actinomicets). Són molt importants ja que, d'entre els bacteris, són els principals productors d'antibiòtics. Hi ha hifes que formen esporòfors per donar espores. Les espores sempre són a la part distal de la part aèria del bacteri. Els conidiòfors són un tipus d'esporòfor; les hifes formen les espores en cadena, i són els conidis o conidiòspores.

− Bdellovibrio: té forma de bacil corbat, amb un flagel amb beina. Són bacteris que lisen o s'alimenten d'altres bacteris. La diferenciació cel·lular d'aquest bacteri es deu al fet que es reprodueix intracel·lularment al bacteri que parasita. Després de reproduir-se en unes quantes cèl·lules a l'interior d'un bacteri, se separa en diferents bacils.

Els bacteris s'ahdereixen a la superfície i, seguidament, s'hi agreguen altres cèl·lules. El contacte o adherència es fa mitjançant flagels, els pili (estructura recta més curta que un flagel). També pot ser que els bacteris adherits es multipliquin a la superfície. Formen una mucositat anomenada EPS (substàncies polimèriques extracel·lulars o exopolisacàrids). Formen biopel·lícules o biofilms sobre pràcticament qualsevol superfície. Com que hi ha una agregació de moltes cèl·lules, això serveix

-12-

Microbiologia I

d'efecte de protecció, però també protegeixen el bacteri del medi extern (poden ser focus d'infecció, per exemple).

Estudiant biopel·lícules, s'ha vist que fins i tot es poden formar comunitats bacterianes conjuntes d'espècies diferents alhora: n'hi pot haver d'autòtrofs i heteròtrofs, hi ha senyalització intracel·lular i intercel·lular.

LLEVATSEls llevats es reprodueixen per gemmació. Els llevats són fongs heteròtrofs amb paret cel·lular pròpia, formada per quitina (NAGA). Les colònies que formen són mucoses, brillants i prudeixen algun pigment.

FLORIDURESCal veure les hifes que formen el miceli. Hifes cenocítiques o multicel·lular (no sempre estan segmentades). Les hifes poden estar dividies per septes o no. Les espores s'anomenen artroconidis o artòspores, que surten de la fragmentació de l'esporòfer. Si són dins d'un cist s'anomenen clamidòspores. També pot formar-se un esporangi o sac a partir de l'esporangiòfor que doni les espores: esporangiòspores. Conidiòfor amb conidiòspores. Finalment, també pot ser que les espores es formin per gemmació, que no s'ha de confondre amb els llevats atès que açò són espores que es formen per gemmació en una hifa.

Els conidiòfors tenen diferents formes, fet que permet de classificar-los. N'hi ha que es ramifiquen, típic de Penicillium.

MORFOGÈNESI: ENDÒSPORESLes endòspores són formes de resistència física, química i biològica davant d'un depredador o algú que vulga lisar el bacteri. Aquestes estan deshidratades i no mostren activitat. Són la forma cel·lular d'un organisme viu més resistent que es coneix. És molt útil com a indicador en processos d'esterilització.

Les endòspores són exclusives o pràcticament exclusives d'alguns bacteris grampositius: Bacillus i Clostridium, ambdós heteròtrofs, però el primer és aerobi, mentre que el segon, anaerobi.

Hi ha diferents estructures:− Exospori: naturalesa proteica.− Coberta: naturalesa proteica. Dóna resistència a les endòspores.− Membrana externa: deriva de la membrana cel·lular.− Còrtex: és una modificació de la paret cel·lular.− Membrana interna: envolta el protoplast. Prové de la membrana cel·lular.− Protoplast: derivat del citoplasma. És la part més interna. És un citoplasma modificat en el

sentit que està deshidratat: només té 30-40% d'aigua, quan el normal és 90%. Els components principals del protoplast són el DNA, RNA, SASP (proteïnes àcid solubles xicotetes), ribosomes, enzims (tot i que la majoria o bé estan inactius o bé tenen relació amb la reparació del DNA), i es forma una substància, DPA-Calci (àcid dipicolínic) fins a un 10%.

− Localització i deformació: ajuda a saber l'espècie que investiguem. Pot ser al centre (central), a l'extrem (terminal), entre terminal i central (subterminal) i pot estar deformada (deformant).

-13-

Microbiologia I

FORMACIÓ D'ENDÒSPORES: ESPOROGÈNESIQuan va a formar-se l'endòspora hi ha canvis en la multiplicació cel·lulars. El genoma bacterià es duplica, però està en una forma allargada anomenada filament axial. Després es forma el septe amb la membrana cel·lular, però sense que sigui simètrica. La part més petita és la pre-espora i la gran, cèl·lula mare, que engolirà la pre-espora. En aquest punt es forma el còrtex (derivat de la paret cel·lular). Després es forma la coberta i l'exòspora. L'endòspora és refràctil, brillant, degut a les capes proteiques.

RECUPERACIÓ DE L'ESTAT VEGETATIUUna endòspora pot activar-se o inactivar-se en funció de les condicions. Per exemple, pot activar-se per temperatura i germinar, formant, de nou, la cèl·lula vegetativa. Llavors, podrà tornar a multiplicar-se. No es tracta d'un mecanisme de reproducció en aquest cas, a diferència de l'anterior en floridures, que és un cas de reproducció. Aquí, les endòspores no tenen un sentit de reproducció, sinó de resistència. Entre d'altres coses, això es deu al fet que només es forma una única endòspora; aquesta duplicació és per poder formar una endòspora.

CÀPSULA BACTERIANAHi ha la membrana citoplasmàtica i la paret cel·lular, però per sobre hi pot haver la càpsula i la capa S.

Característiques de la càpsula:− Constituïdes per un o més polímers, que poden ser homopolímers o heteropolímers. La

majoria són polisacàrids, i hi pot haver càpsules també polipeptídiques.− Consistència amorfa, molt hidratades i carregades negativament.− La seua síntesi implica un elevat cost energètic.− No són essencials.

La càpsula es pot observar tant amb microscopi òptic (per tinció negativa i fluorescència) com microscopi electrònic. Hi ha cops en què es fan tractaments amb anticossos perquè la càpsula es mantingui i pugui observar-se millor.

− Exopolipèptid: Bacillus antracis. La seva subunitat és el glutàmic dextrògir, no pas L, que és la comuna a la naturalesa. Això és una protecció a nivell enzimàtic.

− Exopolisacàrids. Streptococcus pneumoniae. Els polisacàrids poden ser sintetitzats des de dins de la cèl·lula cap enfora, activant els polisacàrids mitjançant dinuclèotids (UDP, GDP). El dextran és un polisacàrid on s'acumula glucosa i hi ha una fructosa; en el levan, s'acumula fructosa i hi ha una glucosa. Aquests altre polisacàrids no cal que s'activin perquè ja són fora de la cèl·lula.

La càpsula és un factor de patogenicitat. S. pneumoniae és gram positiu.

Les funcions de la càpsula són les següents:− Adhesió:

− Entre cèl·lules de la mateixa o de diferents espècies: biofilms, mixobacteris.− A teixits animals: Streptococcus mutans en la dentina.− A les arrels formant nòduls: Rhizobium (fixador de nitrogen).

− Protecció o resistència:

-14-

Microbiologia I

− Contra substàncies tòxiques hidrofòbiques, ja que la càpsula és molt hidrofílica: detergents, antibiòtics.

− Per a metalls pesats tòxics.− Bacteriòfags (o fags).− Fagocitosi. Capacitat immunògena molt menor que la paret. Serovars (soques de bacteris

que presenten antígens diferents, per exemple mitjançant la càpsula), factor de patogenicitat i antigen K (un nom de la càpsula, emprat sobretot en enterobacteris)). Hi ha càpsules que, en funció dels polisacàrids o pèptids que tinguin, seran més resistents, també més o menys patògens).

− Reserva hídrica.− Reserva nutricional.

La càpsula només es formarà quan la cèl·lula hi tingui interès, ja que requereix d'una elevada aportació energètica.

Les seves aplicacions són:− Epidemiologia: serovar responsable de la malaltia. Se'n segueix el rastre.− Vacunes: depèn de la seua immunogenicitat i de si es formen anticossos protectors. Sol

conjugar-se a una proteïna (toxoide) per a augmentar la seua capacitat immunògena, tot i que aquesta proteïna s'atenua per tal que no sigui tòxica, però conservi la seva capacitat.− Streptococcus pneumoniae: més de 100 serovars descrits, tot i que hi ha uns 23 serovars

són patogènics. Hi ha vacunes heptavalents, que són per a 7 serovars concrets considerats predominants. El pneumococ produeix pneumònia, meningitis, septicèmia (sepsis)...

− Neisseria meningitidis C: es coneix com a meningococ. 9 serovars patogènics. Són gram negatius. Causa meningitis, septicèmia, etc.

− Haemophilus influenzae B.− Additius: en indústria alimentària, farmacèutica i tèxtil. Dextran, alginat, xantè, pul·lulà,

curdià...− Recuperació de metalls pesats. Segresten els metalls pesants.− Matriu cromatogràfica (dextran).

Hi ha dues vacunacions sistemàtiques que es posen de manera sistèmica: H. influenza B i meningococ.

CAPA SEs pot veure per microscòpia electrònica i es troba per damunt de la paret. La presenten tant arqueus com bacteris (la càpsula, només bacteris), i tant gram positius com gram negatius.

Característiques:− Monocapa cristal·lina bidimensional: 5-15nm, composta per subunitats proteiques o

glicoproteiques que es repeteixen fins a formar tota la capa unides per enllaços no covalents (hidrofòbics, ponts d'hidrogen, forces electrostàitiques).

− Fàcil desagregació: s'ha vist fent canvis de pH i força iònica. També és fàcil de reconstituir-la. Ocorre de manera espontània (morfogènesi in vitro o autoassemblatge).

− Observació per microscòpia electrònica.

-15-

Microbiologia I

Poden formar micel·les amb lípids, estabilitzant-los. Per exemple, liposomes.

Pot ser hexagonal, quadrada o obliqua. Entre les subunitats hi ha porus nanomètrics de 2 a 8 nm que poden servir a nivell nanotecnològic.

Les seves funcions són:− Protectora.− Barrera de permeabilitat.− Pot participar en l'adherència.− En els arqueus, ajuda al manteniment de la morfologia cel·lular.

Aplicacions:− Nanofiltració.− Estabilització de liposomes.− Matriu per a immobilitzar nanomolècules.− Utilització en vacunes conjugades (Aeromonas salmonicida).

-16-

Microbiologia I

Tema 2.2. Paret cel·lular

− Mureïna: és exclusiva dels bacteris. També s'anomena peptidoglicà o glicopèptid.− Estructura visible al microscopi electrònic envoltant la membrana citoplasmàtica.− Estructura semirígida.− Permet una osmolaritat diferent del medi, però sobretot major que el medi.− Determina la morfologia cel·lular.− Factors de patogenicitat.

Amb tinció de gram es pot veure la paret cel·lular. Els grampositius tenen la capa de mureïna molt més grossa que no pas els gramnegatius. A més, aquests darrers també tenen una altra capa dins la paret cel·lular, la membrana externa. La superfície és llisa en grampositius, i rugosa en gramnegatius. Això es deu a la membrana externa.

MUREÏNALa paret cel·lular dels eucariotes pot estar feta per cel·lulosa (plantes i alguns fongs; és un polímer de glucosa), quitina (fongs, exoesquelet de crustacis i insectes; és un polímer d'N-acetilglicosamina), i també glucan i manan (llevats).

La mureïna té tres components principals:− N-acetilglucosamina (verd)− N-acetilmuràmic, formant un enllaç glucosídic amb N-acetilglucosamina (blau). En la

posició 3 hi té un grup làctic amb una unió èter. Aquests disacàrids estan units i es van alternant.

− Hi ha un tetrapèptid. Sempre va unit a N-acetilmuràmic. La seva forma més freqüent és del grup làctic en surt un enllaç amb L-alanina, després D-glutàmic, seguidament meso-DAP i, finaoment, D-alanina. És la part peptídica de la mureïna. Aquest pèptid és resistent a enzims, ja que conté dos D-aa. Confereix resistència a l'estructura. Aquestes capes se situen una sobre l'altra formant diferents gruixos. Trobem unions entre tetrapèptids

Variacions:− El nombre de capes i cadenes de peptidoglicà pot variar.− El grau d'entrecreuament entre els tetrapèptids de les cadenes de peptidoglicà pot ser

diferent.− Pot haver-hi variacions en els sucres.− Variacions en els tetrapètids.

Les capes de mureïna es poden unir. Com més entrecreuament, més forta i resistent serà la mureïna. Entre el 3r aminoàcid d'una cadena i el 4t de l'altra es forma un enllaç peptídic. Hi ha cops en què els enllaços peptídics no són directes, sinó que hi ha pèptids que actuen de ponts entre cadenes.

Al llarg de la vida d'un bacteri, hi pot haver una renovació en els components de la mureïna.

Funcions:− Dóna forma i rigidesa a la cèl·lula.− Manté la pressió osmòtica per sobre de l'exterior, normalment. Hi ha un enzim, el lisozim,

que trenca la paret cel·lular (es troba a la boca). Com que la cèl·lula deixa d'estar protegida

-17-

Microbiologia I

per la paret, entra aigua dins de la cèl·lula i es produeix la lisi d'aquesta. També podem obtenir la cèl·lula sense paret, protoplast, grampositiu. O podem obtenir la cèl·lula com arrugada, plasmòlisi.

− Factors de virulència.

Biosíntesi:Es comença amb la síntesi i activació de precursors. El fosfat passa a posició 1. Després es forma NAG, però unit a UDP. Així es pot activar per tal de poder formar part de la mureïna. Si no està activat, no pot formar-ne part. UDP és un precursor. El PEP (fosfoenol piruvat), quan s'incorpora, forma l'UDP-N-acetilmuràmic (UPD-NAM). En aquest pas, hi ha un antibiòtic, la fosfomicina, que és un anàleg del PEP; per tant, inhibeix la síntesi de la UDP-NAM. La fosfomicina és sintetitzada per un bacteri del gènere Streptomyces. El primer pèptid, la L-alanina, s'uneix a l'N-acetilmuràmic. Després es forma un enllaç peptídic amb el D-glutàmic i, seguidament, meso-DAP. Entren d'un en un. En el següent pas, en comptes d'entrar la D-alanina corresponent, primer s'hi uneixen dues D-alanines juntes (cada incorporació d'aminoàcid gasta un ATP). Per tant, en un principi, és un pentapèptid, no pas un tetrapèptid. En aquest punt, també hi trobem un altre antibiòtic, sintetitzat pel mateix gènere, la cicloserina (anàleg de l'alanina), que inhibeix la síntesi del pentapèptid. Es van afegint d'un en un els aminoàcids.

A continuació, ve una segona fase de la biosíntesi: la translocació i formació de l'enllaç beta-1, 4. Quan estan activats, entra en joc la membrana citoplasmàtica. Els precursors s'uneixen a la membrana citoplasmàtica; per aquesta translocació, hi ha una molècula de la membrana, el bactoprenol, que farà que s'incorporin els precursors en la membrana citoplasmàtica. Després s'incorpora el NAG-UDP (perdent l'UDP).

El pas següent és la polimerització i transpeptidació, s'incorporen els tres elements per allargar la cadena i es formen unions peptídiques entre cadenes. Els tres elements de la mureïna passen a la cara externa de la membrana citoplasmàtica. S'elimina l'UDP i queda el NAG. També cal alliberar el bactoprenol fosfat perquè només cal que n'hi hagi un d'unió amb la membrana, no se n'han d'acumular. Conforme va polimeritzant, s'allibera, juntament amb NAM, quedant-se amb 2 fosfats. Perquè el bactoprenol fosfat sigui actiu cal que només tingui un fosfat. La bacitracina inhibeix la desfosforilació del bactoprenol. Si no hi ha el bactoprenol-fosfat no hi pot haver paret. La bacitracina és un antibiòtic produït per soques del gènere Bacillus.

Les PBP són proteïnes d'unió a la penicil·lina. Fan la translocació i la polimerització entre les capes sense tenir despesa energètica. Es trenca un enllaç i es polimeritza un altre. Hi intervenen molts enzims diferents.

Quan es forma paret cel·lular, aquesta és sempre en el punt on es forma la separació entre les dues cèl·lules, com és el cas dels cocs. Comença sempre on va a formar-se el septe (separació entre les dues cèl·lules). En els bacils, comença a formar-se en diferents punts al llarg del bacil i també en el septe. Els antibiòtics beta-lactàmics són anàlegs de la doble alanina. Així, la transpeptidasa, en comptes d'unir-se a la doble alanina per trencar l'enllaç peptídic, s'unirà al beta-lactàmic i no podrà fer la transpeptidació. Les autolisines són uns enzims bacterians que renoven la paret cel·lular, la lisen; quan actuen els beta-lactàmics, el complex que es forma entre PBP i beta-lactàmic (bactericides) activa les autolisines.

Les penicil·lines tenen com a beta-lactàmic l'anell beta-lactam; també tenen un altre anell. El

-18-

Microbiologia I

conjunt dels dos anells és comú a les penicil·lines, és àcid 6-aminopenicil·lànic. L'enzim s'uneix a l'anell i l'inhibeix.

Hi ha moltes penicil·lines. La primera que es va descobrir era del gènere Penicillium. És un antibiòtic natural. De manera sintètica, se'n poden canviar els radicals i obtenir-ne d'altres (via semisintètica).

− Estabilitat en àcid (per quan es pren per via oral).− Absorció.− Espectre d'acció. No tots els antibiòtics tenen la mateixa funció. N'hi ha d'ampli espectre,

que actuen contra la majoria de grampositius i gramnegatius. L'Staphylococcus aureus (MRSA) és un grampositiu molt resistent que no entre en l'ampli espectre. També hi ha un gramnegatiu molt resistent, Pseudomonas aeruginosa. També són importants anaerobis (viuen en ambient reductor) i micobacteris (tenen paret cel·lular diferent). També pot ser espectre estret o reduït quan no hi entren la majoria de grampositius i gramnegatius. També hi ha bacteriostàtics, que no mata el bacteri, sinó que n'inhibeix el creixement.

− Resistència a beta-lactamases (enzims dels bacteris) que inhibeixen l'acció dels beta-lactàmics. La meticil·lina i la nafcil·lina són els més resistents a l'acció de beta-lactamases.

BETA-LACTÀMICS− Penicil·lines.− Cefalosporines. Són semisintètics. Tenen origen en Cephalosporium. Tenen estabilitat

contra beta-lactamases i capacitat per travessar la membrana externa. Conforme s'avança la recerca de cefalosporines semisintètiques es va parlant de 1a generació, 2a generació, etc., en funció de si són més actius contra gramnegatius i de la seva estabilitat a les beta-lactamaes. Tenen un anell comú (àcid 7-aminocefalosporànic), tambe un beta-lactàmic i un altre radical.

− Monobactàmics. Són sintètics a partir de l'anell beta-lactàmic. El més comú és Aztreonam, que actua sobretot contra gramnegatius. No és d'ampli espectre i la via d'entrada és intravenosa, de manera que no és gaire interessant.

− Carbapenems. Tenen l'anell beta-lactàmic. Tenen bona estabilitat contra beta-lactamases. Els més emprats són imipenem, meropenem i ertapenem. Són semisintètics a partir d'Streptomyces spp. Unió a PBP-1 i PBP-2. Són d'ampli espectre, però no MRSA. Són via intravenosa.

VANCOMICINAÉs un altre antibiòtic, un glicopèptid. És natural (prové d'Streptomyces). No té una acció d'ampli espectre, però actua sobretot contra grampositius i MRSA, fet que el fa interessant. Està indicat per a al·lèrgics a penicil·lines o cefalosporines. S'uneix a la doble alanina. Les PBP no poden fer la transpeptidació i formar la paret cel·lular.

MECANISMES DE RESISTÈNCIA− Els bacteris poden produir beta-lactamases (penicil·linases). S'obre l'anell beta-lactàmic

inhibint-ne l'activitat.− Poden patir modificacions de les PBP, fent que el beta-lactàmic no s'hi pugui unir.− Modificació de les porines, que són proteïnes dels bacteris gramnegatius que formen un

porus de transport a la membrana externa. Si la porina canvia la seva estructura, l'antibiòtic no podrà travessar la membrana externa.

-19-

Microbiologia I

− Si en comptes de dues alanines hi ha una alanina i un lactat, la vancomicina no s'hi pot unir.

Es poden emprar inhibidors de les beta-lactamases, tals com l'àcid clavulànic, sulbactam o tazobactam. També es poden subministrar penicil·lines amb inhibidors de les beta-lactamases que facin una funció sinèrgica.

Nucleòtid de Park: UDP-NAM-pentapèptid.

La mureïna és interessant en la recerca d'antibiòtics perquè en actuar contra un organisme viu cal que aquest agent nociu per l'organisme no ens danyi. En ser la mureïna una estructura única del bacteri, no serà tòxica per la resta dels tipus cel·lulars.

MODELS DE PARET CEL·LULAR BACTERIANAPer considerar-s'hi, cal que tinguin com a component la mureïna. Hi ha diferents models de parets:

− Grampositius.− Superfície llisa.− Mureïna ocupa gran part de la paret cel·lular (50-80%; 20-80nm). També està més

entrellaçada, té més enllaços transpeptídics. També solen ser mitjançant ponts peptídics. Així, la paret és més rígida i suporta major pressió osmòtica.

− Altres components exclusius dels grampositius: àcids teïcoics i lipoteïcoics (o teïcurònics).

− Proteïnes. N'hi ha que actuen com a factors de patogenicitat, com la proteïna A d'Straphylococcus aureus.

− Polisacàrids (com estreptococs). Amb molta variació en la proporció. La unió del teïcoic i la mureïna pot ser directa o bé mitjançant aquests polisacàrids.

− Gramnegatius.− Superfície ondulada.− La mureïna és una capa prima (5-10%). Això fa que no sigui tan rígida i que suporti

menys pressió osmòtica.− Membrana externa per sobre de la mureïna. És una bicapa de fosfolípids per la part

interna i LPS (lipopolisacàrid) per la part externa. És exclusiva dels gramnegatius.− Proteïnes. Es troben a la membrana externa. Participen en el transport de substàncies.− Periplasma. És l'espai entre la membrana citoplasmàtica i la membrana externa.

− Àcid-alcohol resistents. És propi dels micobacteris (Mycobacterium, on hi ha el causant de la tuberculosi: M. Tuberculosis; i el causant de la lepra: M. leprae). Aquesta paret no es pot veure amb tinció de gram, s'ha de fer amb tinció àcid-alcohol resistent o alguna altra.− Mureïna. És una capa primeta que té serina en comptes d'L-alanina en el peptidoglicà.− Àcids micòlics (60%). Són hidroxilípids (ceres) units a la mureïna mitjançant uns sucres

(arabinogalactà; propi dels micobacteris). Tenen 60-90 carbonis, fent que sigui hidrofòbica i donant-li una certa resistència a molècules tòxiques, detergents, etc.

− Glicolípids. Són un factor de patogenicitat o d'encordament.− Lipoarabinomanans. És una estructura unida a la membrana.− Proteïnes. També hi ha porines.

L'LPS té tres parts ben diferenciades:− Cadena lateral O o antigen O. És la part més externa i és la principal part antigènica d'un

gramnegatiu. Cadena de sucres amb unes determinades repeticions.

-20-

Microbiologia I

− Nucli del lipopolisacàrid. Hi ha sucres que hi són sempre, com l'heptosa i KDO (cetodesoxioctonat). Després vénen dos sucres més, dues glucosamines fosfat, i unides a elles hi ha àcids grassos. Els àcids grassos units als sucres s'anomenen lípid A. Aquest lípid A actua com a endotoxina (toxina a l'interior de la cèl·lula, a la membrana externa). Com més àcids grassos, llargs i ramificats tingui (per tant, com més hidròfob sigui), més tòxic serà.

− Hi ha gramnegatius on manca l'antigen O. Sobretot, es troba en mucoses. Per exemple, hi ha els gèneres Haemophilus i Neisseria.

El macròfag té receptors de membrana que s'uneixen al lípid A. Com a conseqüència, la cèl·lula activarà la producció de citocines. Se secreten citocines com TNF o IL-1. Quan la resposta és molt forta, perquè el lípid A és especialment tòxic o n'hi ha en molta quantitat, l'activació de les citocines és molt forta, produint l'anomenat xoc sèptic (implica febre, augment de pressió sanguínia i freqüència cardíaca, podent arribar a ser mortal).

PROTEÏNES− Estructurals. Unió a la mureïna, participen en l'estructura de la paret. Exemple:

lipoproteïna de Braun, OmpA.− Transport. Porines, que formen porus hidrofílic en la membrana per on poden passar

molècules d'un determinat diàmetre. També hi ha proteïnes de transport específiques de molècules.

− Enzims. Proteases, lipases.− Factors de patogenicitat.

ESPAI PERIPLASMÀTICÉs un espai on hi ha molta activitat.

− Mida aproximada d'1-71nm.− Hi ha proteïnes d'unió a sucres i aminoàcids, proteïnes de transport.− Enzims degradants (fosfatases, nucleases, proteases).− Enzims per a la síntesi del peptidoglicà.− Beta-lactamases i altres enzims de resistència a tòxics.

ANTIBIÒTICS BACTERIANSDegut a la paret dels micobacteris, cal que hi hagi antibiòtics específics per a combatre'ls. Per exemple, hi ha isoniazida i etionamida (anàlegs del NAD), que inhibeixen la síntesi d'àcids micòlics. L'etambutol inhibeix la síntesi dels arabinogalactans. Actuen contra la paret cel·lular dels micobacteris.

ARQUEUS− Pseudomureïna. L'enllaç és beta-1,3. L'enzim lisosim no pot actuar. També hi ha diferències

quant a la part peptídica de la mureïna bacteriana: en comptes de D-alanina, alguna és L-alanina. No és majoritària entre els arqueus.

− En comptes de la pseudomureïna, pot ser que hi hagi polisacàrids, glicoproteïnes o proteïnes, o bé res d'això.

− No tots els arqueus tenen capa S.

PARET CEL·LULAR

-21-

Microbiologia I

N'hi ha, tot i ser minoria, que no tenen paret cel·lular, no tenen mureïna. Dos exemples:− Mycoplasma. No tenen mureïna. Per sobre de la membrana tenen lipoglicans. La seva

membrana té esterols. Són fràgils (suporten poca pressió osmòtica, perquè no tenen mureïna), pleomòrfics, flexibles i resistents a antibiòtics que actuen contra la paret cel·lular.

− Chlamyidia. És semblant als lipopolisacàrid dels gramnegatius. Lipooligosacàrid (LOS) o bé proteïnes-S. La Chlamydia trachomatis ocasiona MTS i queratoconjuntivitis.

-22-

Microbiologia I

Tema 2.3. Membrana citoplasmàtica i citoplasma cel·lular

CARACTERÍSTIQUES− Sistema complex, altament organitzat, flexible i asimètric.− 5-10nm de gruix, 8-15% pes sec cel·lular, 70-90% dels lípids cel·lulars.− Model de mosaic fluid.− Bicapa lipídica i proteïnes. La diferència entre la membrana de procariotes i eucariotes és

que en els primers hi ha moltes més proteïnes proporcionalment.− Fosfolípids (amfòters).− Hopanoides. Estabilitzen. Són exclusius dels bacteris. Els eucariotes tenen esterols.− Proteïnes perifèriques, 20-30% (dèbilment connectades, solubles). Es troben a la cara

interna de la membrana, on hi ha el citoplasma.− Proteïnes integrals, 70-80% (estabilitzen, amfipàtiques, insolubles).

− Poden tenir hidrats de carboni a la cara externa.

Eucarya (no ramificats, poliinsaturats) i Bacteria (no ramificats, saturats). El fosfolípid té enllaç èster en bacteris i eucariotes. Els Archaea són ramificats i saturats, i no tenen àcids grassos, tenen enllaç èter. Tenen isoprenoide.

Els esterols tenen en comú 4 anells. Els hopanoides comparteixen 3 anells, però en tenen més de diferents. Els Mycoplasma tenen esterols en comptes d'hopanoides.

Els fosfolípids tenen glicerolfosfat en la part apolar, i etanolamina en la part hidrofílica. Hi ha moltes variants de fosfolípids, tant en l'àcid gras en concret com en la part polar.

Archea:

FUNCIONS DE LA MEMBRANA− Contenir el citoplasma (el separa del medi extern).− Barrera osmòtica.− Actua com a barrera selectivament permeable:

− Difusió: permet el pas d'ions i de determinades molècules, evita la pèrdua de molècules essencials.

− Transport actiu.− Activitats metabòliques energètiques:

− ATP sintasa.− Cadenes de transport d'electrons.

− Síntesi: paret cel·lular, EPS, LPS, etc.− Segregació cromosoma (replicació del DNA).− Excreció de metabòlits.− Secreció de proteïnes.− Quimiotaxi: receptors.− Ancoratge de flagels (del seu motor).

MEMBRANES BACTERIANES INTERNESAlguns bacteris, a més de la membrana citoplasmàtica, també tenen replecs.Concepte: replecs o invaginacions de la membrana plasmàtica que s'estenen pel citoplasma

-23-

Microbiologia I

cel·lular.Morfologia:

− Tilacoides (en paral·lel o concèntricament): cianobacteris (fotosíntesi oxigènica). Ex: Oscillatoria, Anabaena.

− Clorosomes (forma oblonga): Bacteris verds (fotosíntesi anoxigènica). Ex: Chlorobium, Chloroflexus.

− Sistemes mebranosos plans i en disposició paral·lela: bacteris vermells o porpra (fotosíntesi anoxigènica). Bacteris nitrificants (quimiolitòtrofs oxidants d'amoni o altres). Metanòtrofs (oxidació del metà).

Funcions:− Ancoratge del cromosoma, participant en la replicació cel·lular.− Increment de la relació superfície-volum.− Suport de pigments fotosintètics.− Suport de mecanismes de fosforilació i transport d'electrons.

ANTIBIÒTICS QUE ACTUEN SOBRE MEMBRANA CITOPLASMÀTICA BACTERIANA− Polipèptids cíclics:

− Competeixen pel Mg2+ i Ca2+, desestabilitzant els lípids .− Bactericides .− Neurotoxicitat i nefrotoxicitat .− Tirocidina. Ús tòpic, grampositius.− Gramicidina. Ús tòpic, gramnegatius.− Polimixina B. Bacillus polymyxa, ús tòpic, gramnegatius.− Colistina (polimixina E). Ús sistèmic (oral, intramuscular i intravenós).

− Lipopèptid cíclic:− Daptomicina (Streptomyces roseosporus).− Bactericida grampositius (MRSA).− Ús sistèmic.

ANTIMICROBIANS QUE ACTUEN SOBRE MEMBRANA PLASMÀTICA FÚNGICA− Poliens (Streptomyces):

− Afinitat per l’ergosterol, formació de porus, eixida del K+ intracel·lular .− Fungicida.− Nistatina. Ús tòpic.− Amfotericina B. Via oral, nefrotoxicitat.

− Azoles:− Sintètics.− Inhibeixen la biosíntesi d'ergosterol per desmetilació del lanosterol, interaccionant amb

el grup hemo del citocrom P-450.− Fungistàtics.− Tenen un anell en comú que pot tenir 2 o 3 nitrògens. És el que dóna num al grup.

− Al·lilamines:− Anàlegs de l'esqualè (precursor en la biosíntesi d'ergosterol). N'inhibeixen la síntesi.− Terbenafina. Via oral.− Naftifina. Ús tòpic.

-24-

Microbiologia I

MEMBRANA CITOPLASMÀTICA I CITOPLASMA CEL·LULAR− Nucleoide. És el nom donat al cromosoma bacterià.

− Cromosoma bacterià: DNA de doble cadena circular. Hi ha excepcions: DNA lineal i de dos cromosomes. Es pot aïllar i veure'l per microscòpia després.

− Disposició irregular amb contacte amb el mesosoma o la membrana plasmàtica.− Observació: microscòpia òptica (tinció HCI-Giemsa o altres) o electrònica.− Composició: 80% DNA, 10% mRNA i 10% proteïnes.− E. coli té 4700 kpb.− Mida: 1400 micròmetres (cèl·lula 5 micròmetres). Es dóna superenrotllament negatiu

en diferents dominis. Els dominis són plegaments sobresortints.

Quan el cromosoma està tot plegat o supernerotllat, els enzims no poden treballar, ja que el DNA ha d'estar relaxat perquè es pugui transcriure o replicar. Hi ha seqüències complementàries invertides que li permeten de plegar-se de manera automàtica. També hi ha una manera que introdueix superenrotllament negatiu. Hi ha uns enzims, les topoisomerases II (DNA girasa), que tallen la doble cadena superenrotllada i en passen una per sobre de l'altra, i després les torna a unir; així s'aconsegueix mantenir el superenrotllament. També hi ha uns enzims que fan el cas contrari, relaxen el DNA; són les topoisomerases de tipus I. També hi ha uns antibacterians, les quinolones, que inhibeixen la DNA girasa. Aquestes, en inhibir el supernerotllament negatiu, faran que el DNA estigui molt relaxat i la cèl·lula mori; per tant, són bactericides d'ampli espectre. Són sintètiques. Tenen anell nitrogenat en comú. Les més freqüents són àcid nalidíxic, norfloxacina i ciprofloxacina.

REPLICACIÓEn bacteris, el DNA té un únic origen de replicació. La replicació és semiconservativa, ja que les dues molècules resultants, cadascuna d'elles, conserva una de les cadenes velles. El sistema de replicació bidireccional fa que es formi l'estructura en Z, ja que es forma la forquilla de replicació.

La replicació es fa en direcció 5'-3'. Si es fa al revés, es formen els fragments d'Okazaki. Hi ha una cadena líder i una de retardada. Degut a la doble forquilla, es forma el replisoma, que és com un dímer que representa tot el que forma part del mecanisme de replicació (enzims, DNA, proteïnes...). Cal tenir en compte que es donen errades durant la replicació.

Les sulfonamides i trimethoprim inhibeixen la síntesi d'àcid tetrahidrofòlic (folat). Podem considerar que inhibixen la síntesi de nucleòtids i aminoàcids. Tenen toxicitat, sobretot per al·lèrgies, tot i que, a nivell teòric, no haurien d'afectar-nos, ja que nosaltres obtenim el folat a partir de la dieta (encara que podem sintetitzar-lo).

Les sulfonamides són anàlegs estructurals de l'àcid p-aminobenzoic; per això, inhibeixen. També s'empren, conjuntament, trimetoprim i sulfonamides, perquè tenen una acció simètrica.

TRANSCIPRICÓ I TRADUCCIÓEn la transcripció, l'enzim clau és RNA polimerasa, que desenrotlla el DNA, reconeix seqüències promotores i terminadores, i fa la transcripció 5'-3'. En els procariotes, només n'hi ha 1 tipus, igual que en arqueus (tot i que té més subunitats). En eucariotes, en canvi, n'hi ha 3 de diferents.

Un fragment de DNA no serà tot transcrit, sinó que tenim el promotor i el terminador (zones d'unió

-25-

Microbiologia I

amb RNA polimerasa). RNA missatger encara conté zones als extrems que no es codifiquen.

AUG codifica per N-formilmetionina.

La rifampicina és un antibiòtic semisintètic (al principi s'aïllava d'Streptomyces). Té un nucli de naftoquinona, una cadena alifàtica llarga i 5 CH3. S'uneix a la subunitat beta de la polimerasa, inhibint l'inici de la transcripció. És un bactericida d'ampli espectre. La polimerasa té diferents canals, ja que necessita la cadena motlle de DNA, també un canal d'entrada de ribonucleòtids i un canal per on polimeritza la cadena d'RNA.

En procariotes, la transcripció, la traducció i la replicació són processos acoblats. L'RNA policistrònic codifica per a més d'una proteïna (propi de procariotes); un operó és una seqüència genòmica que transcriu més d'un gen junt (en DNA). L'operó que dóna lloc rRNA codifica junt per a diferents RNA.

Mupirocina (àcid pseudomònic):− Bacteriostàtic.− D'ús tòpic.− Pseudomonas.− Inhibeix isoleucil-tRNA sintetasa.

Hi ha 3 fases a la traducció: iniciació, elongació i terminació. El lloc acceptor és on entren els nous aminoacil-tRNA; el lloc P és on es forma l'enllaç peptídic. El lloc E és per on surt.

Els aminoglucòsids s'uneixen a la subunitat 30S, la xicoteta. Inhibeixen la iniciació incorporant aminoàcids incorrectes.

− Streptomyces, Micromonospora, Bacillus.− Bactericides d'ampli espectre d'aerobis.− Poca absorció intestinal.− Amikacina, espectinomicina, neomicina...

N'hi ha uns altres que inhibeixen la iniciació de la traducció: oxazolidinones. La inhibeixen per unió a la subunitat gran 50S, inhibint la formació del ribosoma complet.

− Sintètics.− Bacterostàtics.− Grampositius (MRSA) i micobacteris.− Oral i parenteral.− Diarrea, nàusea, mal de cap.− Linezolid.

ELONGACIÓEn l'elongació, entrarà aminoacil-tRNA al lloc A. El següent pas és una transpeptidació. Després es dóna una translocació; el ribosoma avança un codó. El peptidil passa al lloc P perquè al lloc A s'hi pugui incorporar un nou aminoàcid. En aquest punt hi intervenen les tetraciclines, unint-se a la subunitat 30S, concretament al lloc A. Impedeixen l'entrada d'un nou aminoacil-tRNA.

− Streptomyces.− Bacteriostàtics d'ampli espectre.

-26-

Microbiologia I

− Via oral i intravenosa.− Irritacions gastointestinals.

Les estreptogramines s'uneixen a 50S. N'hi ha de dos tipus:− A: inhibeixen l'enllaç peptídic. Dalfopristina.− B: no inhibeix l'enllaç peptídic, ja que el que fa és alliberar el pèptid incomplet, el que s'hi

troba fins aquell moment. Qinupristina.

Administrades conjuntament, tenen acció sinèrgica.

− Streptomyces.− Bacteriostàtic.− Bactericida (sinèrgica).− Grampositius, patògens respiratoris i anaerobis.− Via intravenosa.

El cloramfenicol i les lincosamides també actuen en l'elongació. S'uneixen a la subunitat gran (50S) i inhibeixen la transpeptidació.

− Cloramfenicol:− Streptomyces (antibiòtic natural).− Bacteriostàtic.− Ampli espectre.− Via tòpica, oral i parenteral.

− Lincosamides:− Streptomyces (antibiòtic natural).− Bacteriostàtic.− Cocs grampositius i anaerobis (no ampli espectre).− Via oral i parenteral.− Diarrea.− Lincomicina i clindamicina com a importants. La clindamicina té un clor en comptes

d'un hidrogen en una posició determinada.

Els macròlids inhibeixen l'elongació en la translocació (subunitat 50S).− Streptomyces (antibiòtic natural).− Bacteriostàtic, però poden ser bactericides en altes concentracions.− Ampli espectre.− Via tòpica, oral i parenteral.− Irritacions gastrointestinals.− Tots comparteixen l'anell lactona, que els caracteritza.− Eritromicina, carlitromicina, oleandomicina, espiramicina, tilosina.

També hi ha l'àcid fusídic, que inhibeix la translocació (elongació) per unió a un factor d'elongació (EF-G).

− Fusidium (fong; també origen natural).− Bacteriostàtic, però bactericida en elevades concentracions.− Activitat, principalment, contra grampositius.

-27-

Microbiologia I

− Via tòpica i oral.− Irritacions gastrointestinals.

TERMINACIÓS'allibera proteïna formada, mRNA, etc., i el ribosoma es dissocia en les seves dues subunitats per poder començar de nou un cicle de traducció. L'mRNA es tradueix en sèrie, en cadena: una mateixa molècula es tradueix en diferents còpies de la proteïna simultàniament. Això es coneix com a polisoma.

PLASMIDISSón un element genètic dels procariotes diferent del cromosoma.

− Heretable (transmissió vertical).− No solen estar units a la membrana plasmàtica.− No són indispensables.− dsDNA circular autònom (es replica independentment de la resta de la cèl·lula).− Es pot realitzar una transferència gènica horitzontal (passar-se entre cèl·lules de la mateixa

generació).− Aporta avantatges selectius: resistència a antibiòtics, noves capacitats metabòliques, etc.

XAPERONESSón sinònim de proteïnes de xoc tèrmic. Es coneixien així perquè, quan hi havia un augment de la temperatura, les cèl·lules sintetitzaven moltes proteïnes d'aquestes per protegir-se. Amb el temps, s'han anat estudiant més i s'ha vist que aquestes proteïnes confereixen protecció cel·lular davant de qualsevol estrès, tant en procariotes com en eucariotes. Altres funcions:

− Participen en el plegament correcte de proteïnes.− Participen en la senyalització cel·lular.− Tenen capacitat immunològica, participant en la immunogenicitat i mmunoregulació.− Hi ha malalties inflamatòries i autoimmunes causades per xaperones, en aquest cas,

bacterianes.− S'empren les seves seqüències gèniques per fer filogènies d'éssers vius.

COSSOS D'INCLUSIÓSón com unes estructures definides que es troben al citoplasma. Es requereix, normalment, ME per a veure'ls. N'hi ha diversos i de diversa naturalesa.

− Orgànics:− Vacúols de gas. Són com uns cilindres buits d'estructura proteica. La seva funció és de

flotabilitat. Molts bacteris que viuen en aigües, tals com cianobacteris, en contenen.− Grànuls de cianoficina. S'acumulen en polipèptids d'arginina o asparagina com a

reserva de nitrogen. S'han descobert en els cianobacteris.− Carboxisomes. Són polièdrics. Contenen rubisco per a la fixació de CO2. Els bacteris

que en poden tenir són els autòtrofs, com cianobacteris o bacteris nitrificants i tiobacils.− Reserva de carboni. Midó (polímers de glucosa) i glucogen (ídem). També hi ha, en

bacteris, poli-beta-hidroxialcanoats (PHA) i poli-beta-hidroxibutirat (PHB). Aquests polímers serveixen com a reserva de font de carboni per als bacteris. Es poden observar al MO amb negre sudan o roig nil (difrerents tincions). PHA i PHB s'empren per fer plàstics biodegradables, però són molt cars.

− Inorgànics:

-28-

Microbiologia I

− Grànuls de polifosfat o volutina. Ortofosfat amb enllaços èster. Actuen de reserva de fosfat.

− Grànuls de sofre. Acumulen sofre elemental. Per exemple, hi ha bacteris porpra fotosintètics.

− Magnetosomes. Tenen ferro de diferent manera. Serveixen per orientar-se en el camp magnètic; per tant, fan una magnetotaxi. També es troben en el cap d'alguns animals que s'orienten pel camp magnètic, com dofins, tortugues, algunes aus, tonyines... En el cas dels bacteris, però, s'orienten no tant per nord/sud, sinó per amunt/avall, perquè s'ha descobert, sobretot, en bacteris microaeròfils (necessiten baixes pressions parcials d'oxigen).

-29-

Microbiologia I

Tema 2.4. Apèndixs cel·lulars

FLAGELSEs poden observar directament o indirecta. Directament és via MÒ, però cal fer una tinció específica (tinció de Leifson) perquè aquests flagels es vegin més ressaltats. També es pot augmentar el contrast mitjançant camp fosc o contrast de fases. També podem fer-ho indirectament veient com es mouen els bacteris (gota pendent).

Creixement en medi semisòlid (tècnica indirecta): consisteix en fer un medi semisòlid (0.3% d'agar). S'hi posa un tub de vidre buit petit. Un cop preparat el medi, s'inocula el cultiu dins del tub de Craige. En ser semisòlid, només creix on s'ha sembrat. Si són mòbils, el medi els permet el moviment i es pot observar que han crescut més enllà.

Disposició a la cèl·lula:− Monòrica (n'hi ha un que es troba polar, en un extrem, o bé lateral o subpolar).− Amfòtrica (té dos flagels, un a cada costat).− Lofòtrica (té un feix de flagels junts).− Perítrica (molts flagels al voltant de la cèl·lula).

Ultraestructura:− Filament helicoïdal: flagel·lina.− Ganxo.− Cos basal (anells): L, P, S-M en Gram- i S-M en Gram+.

Antigenicitat:− Determinen l'antigen H. Fa referència al flagel com a antigen.

− L'anell L s'uneix a la membrana externa.− L'anell P s'uneix al peptidoglicà.− A la base hi trobem 2 anells associats a la membrana citoplasmàtica (S i M). Les proteïnes

Mot actuen com un motor; les Fli, com a interruptor. L'energia ve de la força protomotriu.

GRAMPOSITIUSTenen una estructura cònica associada a la mureïna. Van formant-se els components. Primer afegeixen la base del flagel (anell M i S), després el cilindre i l'anell P i L. Seguidament es forma el ganxo i, finalment, el propi filament, constituïts per unitats de flagel·lina formant una hèlix. Conforme van produint-se aquestes subunitats, van pujant.

MOTILITAT FLAGEL·LARDepenent de cap on giri el flagel, s'anirà cap a una direcció o es faran tombs a l'atzar. Quan el flagel gira en sentit antihorari, avançarà en una direcció; en canvi, quan gira en sentit horari, donarà tombs. Si té més flagels i giren en sentit antihorari, tots s'han de coordinar per fer bé el moviment; quan és en sentit horari, no cal que es coordinin.

MOTILITAT EN EIXAM (SWARMING)Els bacteris es mouen de manera colonial. Això es pot observar en una placa de TSA. Quan creixen presentant aquest fenomen, ho fan concèntricament. Prenen l'aspecte de rai: les cèl·lules formen

-30-

Microbiologia I

filaments en paral·lel entrellaçant-se mitjançant els flagels. Per altra banda, secreten un sulfactant (tensioactiu): la surfactina. Aquesta permet desplaçar totes les cèl·lules.

MOTILITAT PER ENDOFLAGELEspiroquetes: Treponema, Leptospira, Borrelia. Tenen un endoflagel que va d'un pol a un altre de la cèl·lula, amb disposició helicoïdal envoltant la cèl·lula. Les cèl·lules, a més, són flexibles, fet que les ajuda a desplaçar-se per medis viscosos.

PILISón filaments proteics (pilina) rectes, prims i curts, distribuïts per tota la superfície cel·lular. Hi ha un pilus sexual, més llarg i recte, que connecta la cèl·lula amb una altra, fent transferència gènica horitzontal.

Es troben, sobretot, en gramnegatius.

Composat per pilina (proteïna). Té dues subunitats de pilina que formen, en conjunt, un filament.

Tipus de fímbries:− Morfologia. Com més curts són els pili, més flexibles esdevenen.− Ancoratge. Es poden diferenciar segons com s'ancoren a la cèl·lula. Els de tipus I estan

ancorats només a la membrana externa; en canvi, els de tipus IV tenen el seu ancoratge tant a la membrana citoplasmàtica com a la membrana externa.

− Antigenicitat.− Adhesines. Són altres proteïnes, a part de les pilines, minoritàries en els pili. Poden ser o bé

a l'extrem o bé en disposició lateral.− Funció:

− Adhesió. Els de tipus IV estan relacions amb la formació de biofilms. També poden adherir-se a teixits. L'hemoaglutinació fa que s'ajuntin uns hematies amb altres. Algunes adhesines tenen capacitat d'hemoaglutinació si no hi ha mannitol (ManS); les ManR són indiferents. També poden unir-se a receptors, com els receptors P, que es troben en la mucosa del tracte urinari; també poden unir-se a l'àcid siàlic.

− Conjugació. El pilus sexual s'encarrega de la transferència horitzontal del material genètic.

− Motilitat per contracció (twitching). Les cèl·lules polimeritzen el filament i quan l'extrem fa contacte amb la superfície, hi queden unides i el despolimeritzen. Els pili creixen de dins cap a fora.

ALTRES TIPUS DE MOVIMENT− Motilitat per lliscament (gliding). Per lliscar, hi ha 2 mecanismes diferents. Un és el que

tenen Cytophaga i Flavobacterium, que és com una cinta transportadora; aquest moviment es fa gràcies a proteïnes transmembrana de la membrana citoplasmàtica i la membrana externa. La força protomotriu desplaçarà les proteïnes des de la membrana citoplasmàtica, i aquestes, que es troben unides entre les cadenes, faran moure les proteïnes de la membrana externa. Així, la membrana externa funcionarà com una cinta transportadora. Després hi ha Oscillatoria i Myxococcus, que es mouen per propulsió a doll o raig mitjançant polisacàrids: extreuen els polisacàrids a propulsió, fet que permet el desplaçament cel·lular. La velocitat de desplaçament és de 20-90 micròmetres/s.

DETECCIÓ DE SENYALS AMBIENTALS (COMUNICACIÓ CÈL·LULA-AMBIENT)

-31-

Microbiologia I

− Quimiotaxi: moviment dirigit com a resposta a compostos químics (quimioefectors).− Tactisme al pH: moviment d'apropament o d'allunyament en condicions àcides o alcalines.− Aerotaxi: moviment dirigit com a resposta a l'oxigen.− Fototaxi: moviment dirigit cap a una font de llum.− Termotaxi: moviment dirigit a buscar la temperatura òptima.− Magnetotaxi: moviment dirigit al llarg de les línies de força geomagnètiques.

En absència d'estímul, parlem de moviment de vacil·lació, ja que és un moviment com a l'atzar. Això és degut al moviment dels flagels, que es troba descoordinat, fent que el bacteri giri cap a un costat i després cap a l'altre. En canvi, davant d'un estímul, la resposta de la cèl·lula és en cursa, és més llarga. Tot i això, la cèl·lula també es va aturant i, en funció de si hi ha estímul, girarà cap a una banda o cap a l'altra per orientar-se en direcció a l'estímul, fent una cursa més llarga o menys.

SISTEMES REGULADORS DE DOS COMPONENTSHi ha un senyal ambiental. Si la cèl·lula té un receptor en la membrana citoplasmàtica, un sensor, s'hi queda unida. Aquesta interacció del receptor passa al transmissor (cinasa sensora). De vegades, receptor és el mateix que transmissor; per exemple, en casos de fosforilació. Després hi haurà una cadena de fosforilacions fins que la cèl·lula acabi donant un senyal.

La fosforilació del transmissor farà de fosforilació del regulador de resposta, que en estar fosforilat estarà actiu i permetrà activar gens concrets. Al final de la cadena de fosforilació, la cèl·lula emet una resposta. Hi ha diversos fenòmens fisiològics que depenen de sistemes reguladors de dos components.

Les MCP són proteïnes de la quimiotaxi acceptores de grups metil. Detecten un senyal químic i transmeten informació a l'interior de la cèl·lula. Això causa un canvi conformacional en la cinasa sensora, que es fosforilarà; paral·lelament, es fosforila el regulador de la resposta, que activarà el gir del flagel en sentit antihorari. Per tant, la presència d'un estímul químic atraient és tota la cascada d'accions i reaccions que es donen fins que el flagel pot girar i avançar cap a l'estímul.

La cinasa sensora fosforila altres proteïnes donant grups metil als receptors. Conforme hi ha més metils en el receptor, menys sensible serà. Per tant, arriba un moment en què, per molt que hi hagi estímul, li serà insensible. Aquest procés d'insensibilització s'anomena acomodació.

DETECCIÓ DE SENYALS CEL·LULARS (COMUNICACIÓ CÈL·LULA-CÈL·LULA)En la percepció de quòrum, les cèl·lules bacterianes van emetent substàncies químiques que són reconegudes per la mateixa espècie (o similars). Aquest procés químic fa que una determinada població microbiana sàpiga quina és la seua concentració o població. Com més cèl·lules hi ha d'una població microbiana, major serà el senyal; s'arriba a un nivell de concentració de la substància química conegut com a llindar o crític a partir del qual es genera una resposta cel·lular. Si la resposta es donés a partir de poques cèl·lules no seria efectiva. El senyal químic es coneix com a autoinductor, ja que és una molècula que sintetitzen unes cèl·lules per després induir una resposta.

Es coneixen dos grans grups de sistemes sobre com funciona la percepció de quòrum:− Gramnegatius. L'autoinductor és una lactona N-acil homoserina. Si la concentració de

lactona no és suficient, la cèl·lula no la captarà. Quan n'hi hagi prou, es trobarà un receptor i a través de LuxR, una altra proteïna, s'activarà l'operó luxiCDABE (proteïna luxi fa que se sintetitzi l'autoinductor; la resta donarà la resposta cel·lular). Un exemple és la

-32-

Microbiologia I

bioluminiscencia de Vibrio fischeri. N'hi ha d'altres, com la formació de biofilms, activació de factors de virulència, motilitat en eixam i també conjugació.

− Grampositius. L'inductor és un oligopèptid (tant la lactona com l'oligopèptid són molècules petites). L'oligopèptid se sintetitza com a pèptid senyal, però després es processa perquè sigui actiu. Aquest oligopèptid funcionarà com a autoinductor.

Es dóna un sistema de dos components, amb cadena de fosforilació. La resposta, depenent de l'espècie en concret, pot ser diferent: virulència, transformació (competència; és transferència gènica horitzontal, però amb captació de DNA lliure del medi), biofilms...

-33-

Microbiologia I

Tema 3.1. Metabolisme i creixement cel·lular

Hi ha una cèl·lula que, en el cas dels procariotes, tendeix a créixer i multiplicar-se. Per fer-ho necessitarà elements químics, energia i poder reductor. Amb això, podrà fer treball químic, funcions de transport i treball mecànic.

Activitat cel·lular:− Relacionada amb el creixement. Divisió cel·lular, entrada de nutrients...− Independent del creixement. Motilitat, manteniment de la pressió de turgència, etc.

Els elements químics requerits poden ser diferents en funció de si el bacteri és heteròtrof (necessitarà compostos orgànics) o autòtrof (CO2, amb llum o font inorgànica com a font d'energia). De metabòlits precursors n'hi ha 12, a partir dels quals es formaran tots els components bàsics (blocs de construcció). Amb ells, la cèl·lula començarà l'anabolisme, obtenint-ne àcids grassos, sucres, aminoàcids i nucleòtids. Un següent pas és la polimerització. Finalment, les macromolècules donaran lloc a les estructures a partir del seu acoblament.

REQUERIMENTS NUTRICIONALSCal conèixer la composició de la cèl·lula. La gran majoria és aigua (96-98%), seguida de C, N, P i S; a dalt de la piràmide hi hauria potassi, magnesi, calci, etc., ions que necessitem en baixa concentració.

Els factors de creixement són els components bàsics que necessita la cèl·lula, però que és incapaç de sintetitzar.

La major part del pes sec total d'un bacteri el constitueixen les proteïnes.

ATPL'ATP s'obté per respiració aeròbica i anaeròbica, fermentació i fotosíntesi. Cal ATP per a les reaccions endotèrmiques. Hi ha dos mecanismes bàsics per a obtenir energia:

1. Fosforilació a nivell de substrat. Un substrat amb alta energia fosforila l'ATP. Es passa d'àcid 1,3-difosfoglicerat a àcid 3-fosfoglicèric. També es pot passar àcid fosfoenolpirúvic a àcid pirúvic i acetil-SCoA a àcid acètic.

2. Fosforilació a partir de la força protomotriu. Es genera un gradient de protons. En funció d'on vénen els protons poden haver-hi dos tipus:

a) Fosforilació oxidativa: molècules orgàniques (reduïdes) que transfereixen protons i electrons al NAD+ en oxidar-se (posteriorment entra a la cadena de transport electrònica).b) Fotofosforilació: l'energia lumínica fa pujar de nivell energètic dels electrons, produint-se una cadena redox a partir de la cadena de transport d'electrons.Hi ha alguns bacteris que empren gradient de sodi en comptes de gradient de protons. Això ocorre en dues ocasions: en ambients amb elevada salinitat i en ambients alcalins.

PODER REDUCTORHi ha un element químic reduït (donador d'electrons) i una molècula oxidada (acceptora d'electrons). Els elements electronegatius són bons donadors. Com major és la diferència de potencial, més energia se n'obté.

-34-

Microbiologia I

Tema 3.2. Diversitat metabòlica dels bacteris

Els bacteris es poden dividir, a nivell nutricional, en 4 grans grups tenint en compte 3 coses:− Font d'energia. Els organismes poden ser:

− Fotòtrofs.− Quimiòtrofs.

− Font de poder reductor. Hi ha:− Litòtrofs.− Organòtrofs.

− Font de carboni. Poden ser:− Matèria orgànica. Són organismes heteròtrofs.− CO2. Són organismes autòtrofs.

Els 4 grans grups nutricionals són:− Quimioorganoheteròtrofs. La font d'energia, matèria orgànica i poder reductor és la

matèria orgànica. Hi ha bacteris, protozous i fongs.− Quimiolitoautòtrofs. L'energia s'obté de matèria inorgànica, com el poder reductor; la font

de carboni és CO2. Hi ha bacteris de l'hidrogen i del sofre, bacteris nitrificants, bacteris del ferro i metanòtrofs.

− Fotolitoautòtrofs. L'energia l'obtenen de la llum, el poder reductor de la matèria inorgànica i el carboni, del CO2. Hi ha algues, cianobacteris, bacteris porpres del sofre i bacteris verds del sofre. És l'únic grup que inclou eucariotes.

− Fotoorganoheteròtrofs. L'energia l'obtenen de la llum, i el poder reductor i el carboni de matèria orgànica. Els individus que hi ha són bacteris porpres no del sofre i bacteris verds no del sofre.

Hi ha bacteris que pertanyen a diferents grups nutricionals alhora. Es coneixen com a mixòtrofs.

QUIMIOORGANOHETERÒTROFS− Glicòlisi (ruta Embden-Meyerhof-Parnas). A partir de l'oxidació de glucosa, al final s'obté

piruvat. De glucosa a fructosa 1,6-bisfosfat hi ha pèrdua d'energia, ja que les reaccions requereixen d'ATP. Seguidament, la molècula es trenca en dues i se n'obté gliceraldehid-3-fosfat i dihidroxiacetona-fosfat. A partir d'aquest moment ja s'obté energia i poder reductor. D'1,3-bisfosfoglicerat a 3-fosfoglicerat es dóna una oxidació a nivell de substrat. Finalment s'obtenen 2 ATP i 2 NADH.

Els metabòlits percursors de la glicòlisi són:− Glucosa 6-fosfat.− Fructosa 6-fosfat.− Gliceraldehid-3-fosfat.− 3-fosfoglicerat.− Fosfoenolpiruvat.− Piruvat.

− Ruta dels fosfats de pentosa. Un dels productes que se n'obté és el piruvat. Hi ha diversos metabòlits precursors, alguns iguals a la glicòlisi (no escrits):− Ribosa-5-fosfat.− Eritrosa-4-fosfat.− Sedoheptulosa-7-fosfat (hi ha autors que el consideren un metabòlit).

-35-

Microbiologia I

− Cicle de Krebs (cicle dels àcids tricarboxílics o cicle de l'àcid cítric). El primer pas és el pas de piruvat a acetil-CoA (metabòlit precursor), obtenint 2 NADH. Posteriorment, entra al cicle com a citrat. Finalment, s'obtenen 6 NADH, 2 FADH2 i 2GTP. La resta de metabòlits precursors són:− alfa-cetoglutarat.− Succinil-CoA.− Oxaloacetat.

VIES AUXILIARSA part de les vies comunes, hi ha unes altres vies:

− Ruta Entner-Doudoroff. Parteix de la glucosa. Funciona en comptes de la glucòlisi.− Cicle del glioxilat.− Fermentacions. Oxidacions parcials de la matèria orgànica. El poder reductor obtingut a la

glicòlisi es reutilitza per aconseguir el producte de la fermentació. Per tant, si hi ha fermentació, no hi ha producció neta de poder reductor.− Bacteris de l'àcid làctic. Són bacteris grampositius. Exemples: Streptococcus,

Lactobacillus i Bacillus. Dins de la làctica hi ha homolàctica i heterolàctica (formació de CO2 i etanol). El Bifidobacterium es troba a la microbiota intestinal dels nadons.

− Fermentació alcohòlica. Exemple: Saccharomyces cerevisiae. Permeten l'obtenció d'alcohol i pa.

− Fermentació propiònica. Exemple: Propionibacterium.− Fermentació butanodiòlica (acetoínica). Exemples: enterobacteris (Enterobacter i

Serratia), Bacillus.− Fermentació acidomixta. S'anomena així perquè el seu producte són diversos àcids:

àcid làctic, àcid acètic i àcid succínic (per ordre de presència); es forma CO2, hidrogen i etanol.

− Fermentació butírica. Exemple: Clostridium. Bacillus és com Clostridium, però aerobi.

BIOSÍNTESIEn el cas del cicle de Krebs, es fan reaccions metabòliques per obtenir (vies 1, 2 i 3) i obtenir finalment els metabòlits precursors. Així obtenim energia i poder reductor, aquest últim passarà a la cadena de transport electrònic.

RESPIRACIÓ AERÒBIAEl poder reductor, on el transportador és el NADH, passa a la cadena de transport electrònica formant electrons. Cadena de reaccions redox fins que arriba a citocrom A al sector, que és l'oxigen. Necessita oxigen per a funcionar. Aleshores, a part de la cadena de transport electrònic fa falta l'ATP sintasa. Els protons entren a favor de gradient a l'interior de la cèl·lula i fan funcionar l'ATPasa.

Amb respiració aeròbica, es poden arribar a aconseguir, al final del cicle, 38 ATP. Ara bé, els procariotes també poden fer respiració anaeròbia.

RESPIRACIONS ANAERÒBIESLa respiració anaeròbica és exclusiva de procariotes. Hi ha processos on s'empra el nitrat com a acceptor final d'electrons, variant alguna quinona, o citocrom, etc. L'enzim serà específic en cada cas.Hi ha bacteris que poden produir nitrogen a partir de la respiració de nitrat. Aquest procés

-36-

Microbiologia I

s'anomena respiració d'NO3-, desnitrificació o reducció desassimilatòria.

E. coli pot fermentar, realitzar la respiració aeròbica i també l'anaeròbia. En funció de les condicions ambientals farà una respiració o una altra. Hi ha bacteris del gènere Pseudomonas que poden respirar aeròbicament nitrat i acabar formant, a més, nitrogen.

SINTRÒFIAEl major rendiment energètic en ordre és:

1. Respiració aeròbia. Es deu a la diferència de potencial de reducc8ió del NAD i de l'acceptor final d'electrons.

2. Respiració anaeròbia.3. Fermentació.

QUIMIOLITOAUTÒTROFSNomés són procariotes.

Grups fisiològics:− Bacteris de l'hidrogen. Obtenen energia i poder reductor a partir de l'hidrogen tenen

l'oxigen com a acceptor final d'electrons. Exemples: Ralstonia, Hydrogenophaga, Alcaligenes, Pseudomonas.

− Reductors del sulfat. Utilitzen sulfat com a acceptor final d'electrons en comptes d'oxigen. El donador és l'hidrogen del sulfat, donant sofre i aigua. Exemple: Desulfovibrio.

− Bacteris del sofre o bacteris incolors del sofre. Utilitzen compostes de sofre reduïts com a donadors d'electrons (sulfhídric, sofre elemental i tiosulfat). L'acceptor d'electrons sol ser l'oxigen, però també pot ser-ho el nitrat. Exemples: Beggiatoa, Thiothrix, Thiobacillus, Sulfobolus.

− Bacteris del ferro. El donador d'electrons és l'ió ferrós (2+), que s'oxida a fèrric (3+). L'acceptor d'electrons és l'oxigen.

− Bacteris nitrosificants. Utilitzen l'amoni i formen àcid nitrós. Exemple: Nitrosomonas.− Bacteris nitrificants. Quan es parteix de l'àcid nitrós formen àcid nítric. Exemple:

Nitrobacter.− Acetògens. Formen àcid acètic a partir de l'hidrogen com a donador d'electrons i CO2 com a

acceptor. Exemples: Clostridium, Acetobacterium.− Metanògens. El donador d'electrons és l'hidrogen i l'acceptor, CO2, però, en aquest cas,

donen metà. Exemples: Methanobacterium, Methanosarcina (ambdós gèneres són arqueus). Alguns animals, com les vaques, expulsen metà perquè tenen metanògens (també es dóna en pantans).

− Metanòtrofs. El metà és el donador d'electrons i l'oxigen l'acceptor; es forma CO2. Exemples: Methylomicrobium, Hyphomicrobium.

Font d'energia: fosforilació oxidativa a partir de molècules inorgàniques (respiració aeròbia o anaeròbia).

Font de poder reductor: pot ser reducció directa per substrat o bé transport invers d'electrons. Si són autòtrofs hauran de sintetitzar matèria orgànica. Necessitarem poder reductor i energia per a fabricar les molècules orgàniques.Font de carboni: Cicle de Calvin, acetogènesi o ruta de l'acetil CoA o bé Cicle de l'àcid cítric reductor (alguns bacteris de l'hidrogen).

-37-

Microbiologia I

CICLE DE CALVINL'enzim que hi participa és la rubisco. Molts bacteris en tenen, i tenen cossos d'inclusió anomenats carboxisomes, que és l'acumulació de l'enzim. El Cicle de Calvin permet fixar el CO2 i realitzar la biosíntesi. Hi ha una gran despesa energètica.

METANOGÈNESI I ACETOGÈNESIL'acetogènesi, a partir de l'hidrogen i la força protomotriu, fent reballar l'ATPasa, donarà ATP. També permet fixar el CO2.

El transportador del poder reductor és el NADH, que podrà crear la força protomotriu en els quimioheteròtrofs. Ara, en canvi, ho farà l'hidrogen directament per la cadena de transport electrònic.

Àcid nitrós a la cadena de transport electrònic. L'últim acceptor serà l'oxigen.

L'hidrogen pot reduir el NAD+ perquè és més ELN. Així, es dóna un transport invers d'electrons: la cadena de transport electrònica funciona a l'inrevés. Com que no es pot fer la reducció directament, part de l'ATP que s'ha obtingut es gastarà per formar poder reductor en forma de NADH. L'hidrogen és la millor manera d'obtenir energia i poder reductor. Al final s'obté NADH que, juntament amb l'ATP, podrà produir la biosíntesi.

FOTÒTROFSL'energia és la llum, però canvia el poder reductor i la font de carboni, que serà diferent.

Els de dalt són fotolitoautòtrofs, els de baix (on diu matèria orgànica) són fotoorganoheteròtrofs. Els bacteris porpra no del sofre utilitzen matèria orgànica, no pas sofre. Els bacteris verds del sofre, a part del color, es diferencien dels porpra perquè tenen una forma allargada amb uns replecs diferents i tenen bacterioclorofil·les diferents.

Rutes de fixació del CO2: Cicle de Calvin, Cicle de l'àcid cítric reductor (com Chlorobium) o Ruta de l'hidroxipropionat (com Chloroflexus). Un mateix bacteri pot tenir diferent procedència i

-38-

Microbiologia I

diferent font d'energia.

CIANOBACTERISLa fotosíntesi pot funcionar amb només el fotosistema I (tancada) o amb els dos fotosistemes (oberta). La que utilitza els dos diem que està en Z.

L'H20 és la molècula que redueix el fotosistema I. L'energia de la llum puja de nivell energètic en el fotosistema II i es produeix una reducció d'aquest. Hi haurà una sèrie de reaccions que expulsaran protons for ade la cèl·lula. Aquesta força protomotriu sintetitza ATP. La Fp (flavoproteïna) és l'encarregada de reduir el NAD+.

El flux d'electrons en els fotòtrofs oxigènics es desenvolupa a través de 2 reaccions fotoquímiques diferents, però interconnectades. Els fotòtrofs oxigènics fan servir la llum per generar ATP i NADPH. Els electrons per aquest últim provenen de la separació de l'H20 a O2 i electrons. Els dos sistemes de reaccions lluminoses es diuen fotosistema I (PSI) i fotosistema II (PSII), i cadascun té una forma espectral diferent de la clorofil·la a del centre de reacció. La clorofil·la del PSI, anomenada P700, absorbeix llum de longitud d'ona gran (IR), mentre que la clorofil·la del PSII, anomenada P680, absorbeix la longitud d'ona més curta (quasi roig).

Les reaccions fotoquímiques oxigèniques es produeixen en la membrana. En les cèl·lules eucariotes, aquestes membranes es troben al cloroplast, mentre que en els cianobacteris, les membranes fotosintètiques s'amunteguen en el citoplasma. En ambdós grups, les membranes estan disposades d'una manera molt similar i les dues formes de clorofil·la a s'uneixen a les proteïnes específiques en la membrana i interacciones com es mostra en la figura.

TRANSPORT D'ELECTRONSS'anomena esquema en Z. El potencial de reducció de la molècula de la clorofil·la a P680 en el PSII és molt electropositius, fins i tot més que el del parell O2/H2O. Això facilitat la primera etapa en el transport d'electrons oxigènic, la separació de l'H20 en O2 i els àtoms d'hidrogen, una reacció que és molt desfavorable termodinàmicament.

L'energia lumínica converteix P680 en un reductor moderadament fort, capaç de reduir una molècula amb un potencial d'uns -0'5V. Des d'aquí, l'electró excitat viatja a través de diversos transportadors de membrana, citocroms, quinones i una proteïna que conté coure anomenada plastocianina, que cedeix l'electró a PSI. L'electró és acceptat per la clorofil·la del centre de reacció del PSI, P700, que prèviament ha acceptat llum i ha començat les etapes que condueixen a la reducció del NADP+ a NADPH.

SÍNTESI D'ATP EN LA FOTOSÍNTESI OXIGÈNICAA més de la síntesi neta de poder reductor (és a dir, NADPH), es donen altres fets importants, Durant la transferència d'un electró de l'acceptor en el PSII a la molècula de la clorofil·la del centre de reacció del PSI, l'electró segueix una ruta termodinàmicament favorable (negativa a positiva). Això genera una força protomotriu a partir de la qual es pot produir ATP. Aquest mecanisme de la síntesi d'ATP s'anomena fosforilació no cíclica perquè els electrons aquí no tornen a reduir el P680 oxidat, però, en canvi, s'empren en la reducció del NADP+.

Quan existeix suficient poder reductor, també es pot produir ATP en els fotòtrofs oxigènics mitjançant la fosforilació cíclica. Això es produeix quan els electrons viatgen de la Fd (ferredoxina)

-39-

Microbiologia I

al complex del citocrom bf, des del qual el transport d'electrons torna l'electró a P700. Aquest flux crea una força protomotriu i la síntesi d'ATP addicional.

Ph = feofitinaQ = quinonaPC = plastocianinaFd = ferredoxinaFp = flavoproteïna

BACTERIS VERMELLS O PORPRA DEL SOFRETambé són no del sofre si en comptes de matèria inorgànica hi ha matèria orgànica.

El donador de protons són compostos de sofre reduïts, ió ferrós, etc., en comptes d'aigua. Aquests compostos, de manera espontània (sense requerir fotòlisis), absorbiran llum vermella, tirant cap a l'IR. Es dóna, gràcies a la llum, una reducció i augment d'energia. Per reduir el NAD+, en aquesta cadena no es pot fer de manera directa, així que es donarà un transport invers d'electrons. És un sistema cíclic.

BACTERIS VERDS DEL SOFRETenen un únic ecosistema. És un sistema cíclic. La diferència respecte als porpra és que aquests arriben a un nivell energètic superior i poden reduir el NAD+.

HELIOBACTERISMolt similars als anteriors.

CICLE DE KREBS INVERSExemples: bacteris verds del sofre com Chlorobium.

Incorpora el CO2 a la matèria orgànica.

RUTA DE L'HIDROXIPROPIONAT O GLIOXILATAquest sistema, que es troba en bacteris verds no del sofre (com Chloroflexus), parteixen de l'acetil-CoA. En aquest cas, els bacteris són fotolitoautòtrofs.

FIXACIÓ DE NITROGENNo hi ha cap eucariota que fixi nitrogen, només alguns bacteris. Ho fan gràcies a un complex enzimàtic, la nitrogenasa, que fixa el nitrogen atmosfèric. Hi ha una despesa energètica molt gran. Hi ha molibdè en el centre actiu de l'enzim.

El substrat és nitrogen atmosfèric, però també pot ser acetilè, que es redueix a etilè. També els protons, produint hidrogen. Es pot saber quant de nitrogen és capaç de fixar un bacteri mitjançant experiments amb suspensions bacterianes en les quals s'introdueix acetilè a l'atmosfera. Amb un cromatògraf de gasos es pot seguir el cultiu en el temps. Si fixa nitrogen, també serà capaç d'emprar acetilè.

La nitrogenasa és molt sensible a l'oxigen. Hi ha bacteris del gènere Clostridium que poden fixar nitrogen; com que viuen en ambient anòxid la nitrogenasa no tindrà cap problema. Ara bé, si són cianobacteris, que viuen en ambient amb oxigen i en produeixen, caldrà un sistema de protecció de

-40-

Microbiologia I

l'enzim perquè no s'inhibeixi per l'oxigen. Es forma l'heterocist, que serà una cèl·lula especialitzada a la fixació de nitrogen i resistent a l'oxigen. Aquest impedeix el pas d'oxigen. La cianoficina és un polipèptid ric en aspàrtic i arginina, que s'acumula.

Azotobacter i Rhizobium són els principals bacteris de fixació de nitrogen al sòl. Els primers augmenten l'activitat per tal de consumir oxigen; els segons formen nòduls amb les arrels de les lleguminoses, establint-se una simbiosi. Aquests darrers tenen una proteïna, leghemoglobina, que protegeix la nitrogenasa.

OBTENCIÓ DE FERROEl ferro és un element imprescindible, atès que moltes proteïnes i enzims en tenen. No es requereix en grans quantitats, és un oligoelement. S'utilitzen unes substàncies quelants de ferro anomenades sideròfors (amb molta afinitat per l'ió fèrric; per exemple, hidroxamat). El bacteri els secreta, s'uneixen al ferro i entren a dins de la cèl·lula. N'hi ha molts: en enterobacteris hi ha l'enterobactina, en aquàtics hi ha l'aquaquelina, etc.

-41-

Microbiologia I

Tema 3.3. Creixement de les poblacions bacterianes

ESCISSIÓ BINÀRIAEl punt mig, septe, per on es divideix la cèl·lula, caldrà que es recobreixi de membrana cel·lular i paret cel·lular. Pel punt mig és per on crec la cèl·lula en el cas dels cocs, que tenen forma esfèrica o arrodonida. En canvi, quan la cèl·lula és allargada com un bacil, creix en diferents punts. L'inici de la formació del septe és quan acaba de replicar-se el contingut genòmic.

En procariotes, s'ha vist que la formació del septe està dirigida per una sèrie de proteïnes, les proteïnes Fts, que tenen homologia amb la proteïna tubulina dels eucariotes. En concret, es forma un anell per la formació a partir d'un conjunt de proteïnes, que s'acumularan al centre de la cèl·lula. El complex proteic s'anomena divisoma o septasoma, que és per on es dividiran les cèl·lules. L'acumulació de les proteïnes va formant membrana cel·lular cap a dins.

FORMA CEL·LULARLa paret defineix molt la forma de la cèl·lula, però s'ha comprovat que hi ha unes proteïnes, les MreB, que són homòlogues a l'actina (proteïna que forma el citoesquelet en eucariotes); formen una estructura helicoïdal a la cara interna de la membrana citoplasmàtica, de manera que és una espècie de citoesquelet. S'ha vist que el gen de les MreB no existeix en cocs, de manera que la forma original podria ser la del coc. La polaritat cel·lular és saber on va a parar un orgànul o estructura quan la forma de la cèl·lula no és simètrica.

MESURA DEL CREIXEMENT− Recompte de cèl·lules totals: es fa en Neubauer. Es requereix un recompte de 100 cèl·lules

com a mínim perquè aquest sigui fidedigne. Es compten els requadres. La fórmula és la mitjana multiplicada per la inversa del volum i de la dissolució i multiplicat per 25, semblant a la del recompte de colònies.

− Recompte de colònies: la fórmula és la mitjana per la inversa del volum i de la dissolució. Les unitats són unitats formadores de colònies entre volum (ufc/ml). Són cèl·lules viables i cultivables, i es recompten quan n'hi ha més de 30 i menys de 300. Hi ha 2 mètodes per fer el recompte: sembra en superfície i sembra en profunditat, que és quan l'inòcul que s'ha de recomptar està barrejat amb el medi de cultiu. En aquest darrer, també poden créixer entremig del medi, per això el nom.

− Terbolesa: com més cèl·lules hi ha, més tèrbol és el medi de cultiu. Amb l'absorbància es pot conèixer el creixement. És una tècnica de recompte indirecta.

− Pes sec: centrifugaríem, obtenint un sediment, eliminaríem el sobrenedant i, per diferència de pes, eixugant la mostra al forn, obtindríem els mg/ml.

− Comptador coulter: es mesura la resistència elèctrica passant la mostra per un capil·lar. Com més cèl·lules hi ha, major és la resistència.

− Citometria de flux: s'utilitza l'amilasa.− Altres: es poden emprar tècniques que avaluïn qüestions del metabolisme de les cèl·lules.

CORBA DE CREIXEMENT− Fase d'adaptació. El cultiu s'adapta a les condicions del cultiu.− Fase exponencial.− Fase estacionària. La població deixa de créixer i es manté constant, assolint el màxim de

població. En aquesta fase es produeixen metabòlits secundaris, algun d'ells antibiòtics.

-42-

Microbiologia I

− Fase de mort. És exponencial negativa.

Si sabem que la població es duplica cada cert temps, podem establir una fórmula simple per a saber-ne el creixement. 2n, on n és el nombre de generacions. Si tenim una població inicial, fem N0x2n, on N0 és la població inicial.

N és la població en un determinat temps. N0 és la població inicial. n és el nombre de generacions. g és el temps de generació.

Com que la variació de la població respecte al temps és contínua, podem establir: dN / dt = k · N, on la k és una constant de velocitat específica de creixement. La N és el nombre de cèl·lules/ml (o biomassa, components cel·lulars).

Període finestra: és el període de temps en la qual hi ha una infecció, però no es detecta. Quan se sospita que una persona pot estar infectada, normalment la primera anàlisi s'ha de repetir al cap de mig any en alguns casos.

EQUACIÓ DE MONOD I RENDIMENTL'equació de Monod és una adaptació de l'equació de Michaelis-Menten, però adaptada al temps de creixement bacterià. Conforme s'augmenta la concentració de nutrient, hi ha major velocitat de creixement. Ara bé, arriba un moment en què la relació deixa de ser lineal: s'arriba a la velocitat màxima i, a partir d'aquesta, es fa constant. Això es deu al fet que els microorganismes arriben a un punt de saturació. Fins i tot, augmentant la concentració d'un determinat nutrient, es pot arribar a matar la cèl·lula degut a l'osmosi.

Rendiment molar:Ym = ([biomassa]f – [biomassa]0) / ([nutrient]0 – [nutrient]f) (g/mol)

CULTIU DIÀUXICÉs un creixement bifàsic. Això es dóna quan en el medi de cultiu no hi ha un nutrient limitant, sinó dos (nutrient limitant: nutrient bàsic per al creixement del microorganisme la concentració del qual és limitant, és a dir, abans s'esgota la concentració de nutrient que no pas el microorganisme se satura). En realitzar la corba de creixement, observem, per exemple, que quan s'acaba la glucosa s'arriba a una fase estacionària, però al cap d'un temps, es torna a veure una fase exponencial on també hi ha lactosa. Els microorganismes utilitzen la font més senzilla de carboni, la glucosa, i, posteriorment, la lactosa.

CULTIU SINCRÒNICÉs quan interessa tenir un cultiu en què totes les cèl·lules es trobin a la mateixa etapa del cicle cel·lular. Quan s'obté això, la corba de creixement és esglaonada. La fase exponencial no és contínua, sinó discontínua, ja que totes les cèl·lules es divideixen al mateix temps; en canvi, en cultius normals, el creixement és continu perquè les cèl·lules van dividint-se aleatòriament.

Màquina matrona (Helmstetter-Cummings): tenim una solució bacteriana i la filtrem. En el filtrat hi haurà les cèl·lules, el rentem suaument i, en aquest, només hi quedaran les cèl·lules que estiguin fixades, adherides al filtre. El filtre es gira i les cèl·lules queden cap avall; el medi de cultiu es va passant pel filtre. Conforme van tenint nutrients, les cèl·lules van replicant-se i van caient.

-43-

Microbiologia I

CULTIU CONTINUÉs un sistema que necessita tres components:

− Medi fresc.− Bioreactor (fermentador). No totes les reaccions passen per fermentacions. En ell, el

volum és constant.− Recipient. S'hi recull el medi sobrant.

Conforme anem afegint medi fresc, el medi anterior es va recollint per la part inferior cap al receptacle. El medi de cultiu fresc anirà difonent de dalt cap abaix; el producte s'anirà recollint al receptacle, on també hi haurà cèl·lules.

Sempre es té el cultiu en fase exponencial.

Hi ha d'haver una entrada d'aire, sigui oxigen o atmosfera, perquè estigui controlat.

En el quimiòstat i turbidòstat els tres components són els mateixos, però varia la taxa de flux o velocitat de flux, que es controla a través d'una vàlvula, i la velocitat de dilució, que és el temps en què es va renovant el medi de cultiu.

D = f / V

− Quimiòstat. Treballa sempre a una taxa de flux constant.− Turbidòstat. La taxa de flux va canviant, ja que és un sistema automatitzat en el qual hi ha

sensors, en el bioreactor, que mesuren la densitat òptica; és a dir, controlen la biomassa del bioreactor.

A major taxa de dilució, major velocitat de creixement, que és el mateix que reduir el temps de generació. La concentració de nutrient també augmenta amb la taxa de dilució. Si introduïm poc medi fresc, la velocitat de creixement serà més lenta.

Si fem entrar el medi fresc a una velocitat elevada, desplacem tota la columna i ens quedem sense microorganismes.

-44-

Microbiologia I

Tema 3.4. Creixement bacterià en ambients naturals

Temperatura òptima de creixement: quan la taxa de creixement és màxima i passa prop de la temperatura màxima. Conforme anem augmentant la temperatura, s'aconseguirà una major velocitat de creixement. Si la disminuïm molt, arriba un moment en què biològicament la cèl·lula no pot funcionar.

El bacteri que té el rècord de creixement a temperatura més baixa és -12ºC (Psychromonas ingrahamii). Aquest bacteri viu a Alaska.

Podem trobar microorganismes que viuen a temperatures molt elevades, per sobre de la temperatura d'ebullició. Per exemple, en fosses termals marines. Thermus aquaticus, per exemple, té aplicacions pràctiques: és la Taq polimerasa.

− Psicròfils. La seva temperatura òptima és entre 5-15ºC, però poden créixer a temperatures inferiors al punt de congelació. La temperatura màxima és per sota dels 20ºC.

− Psicròtrofs. Es troben entre els 15-30ºC. La temperatura màxima és per sota dels 37ºC.− Mesòfils. La temperatura òptima és entre els 30-40ºC, amb màxim als 45ºC.− Termòfils. La temperatura òptima és entre 45-75ºC, amb màxim als 80ºC.− Hipertermòfils. Es troben entre 60-65ºC, amb màxim a 110ºC.

El metabolisme ha d'estar adaptat a aquestes tempreatures. Els microorganismes extremòfils viuen en ambients extrems.

Els arqueus poden resistir les temperatures elevades gràcies a la monocapa que presenten.

ACTIVITAT D'AIGUA I OSMOLARITATEl millor medi de la cèl·lula és l'hipertònic.

L'activitat de l'aigua es mesura fent la relació entre la pressió de la solució i la de l'aigua pura, obtenint, com a màxim, un valor d'1. Una de les classificacions dels aliments és en base d'on no poden créixer els microorganismes. En ambients pròxims a 1 viuen la majoria de microorganismes. La major pressió osmòtica la tenen els bacteris grampositius, sobretot els cocs. Suporten menys pressió degut a que tenen una capa de mureïna amb el peptidoglicà molt més gros. Així, poden suportar major pressió osmòtica; per tant, menys activitat d'aigua. Als gramnegatius és al revés. També trobem arqueus en ambients extrems; solen ser extremòfils, tant pel que fa a la temperatura com a l'activitat d'aigua.

Els fongs poden créixer en una activitat d'aigua baixa. Les conserves, llacs salins, peix o aliments salats, aliments deshidratats, xocolata, llet en pols, etc., solen aparèixer-hi floridures degut a que resisteixen millor la baixa activitat de l'aigua.

Una altra manera de conservació d'aliments és la dessecació

CLASSIFICACIÓ DE MICROORGANISMES SEGONS LA PRESSIÓ OSMÒTICA− No halòfil: a concentracions discretes de sal no poden créixer.− Halòfil: si afegim més concentració de sal, deixen de créixer. E. coli.

− Discrets: la concentració de sal és entre 1-6%; no creixen sense sal afegida.

-45-

Microbiologia I

− Moderats: entre 6-15%.− Extrems: entre 15-30%.

− Halotolerants: toleren determinades concentracions de sal. Staphylococcus aureus.− Osmòfils: creixen a elevades concentracions de sucres.− Xeròfils: poden créixer en ambients molt secs.

Aquests extrems de salinitat o de sucres els aconsegueixen a partir de l'acumulació de soluts compatibles, que són substàncies molt polars, de manera que igualen la pressió osmòtica entre l'ambient i la cèl·lula. N'hi ha que tenen derivats d'aminoàcids, d'altres acumulen carbohidrats, com la sacarosa o trehalosa, també hi ha soluts alcohòlics i altres, com algues marines o KCl d'alguns arqueus halòfils extrems.

OXIGEN I DIÒXID DE CARBONI− Anaerobis facultatius. E. coli. (c)− Anaerobis aerotolerants. Lactobacillus. (e)− Aerobis. Micrococcus luteus. (a)− Anaerobis estrictes. Clostridium. (b)− Microaeròfils. Campylobacter. (d)

Els microaeròfils poden créixer a baixa pressió o concentració d'oxigen.

Els microorganismes que creixen o toleren l'oxigen han de tenir algun mecanisme de defensa, atès que aquests ambients són molt oxidants. Uns exemples són el peròxid d'hidrogen i l'anió superòxid. Per vèncer-ne la toxicitat, les cèl·lules empren un seguit d'enzims que eliminen els productes: la catarasa converteix el peròxid d'hidrogen en aigua oxigenada; la peroxidasa ho converteix en aigua i NAD+; superòxid dismutasa genera oxigen, però també peròxid d'hidrogen; superòxid dismutasa/catalasa en combinació generen aigua i oxigen; i superòxid reductasa, que genera peròxid d'hidrogen i citocrom c.

Capnòfils: requereixen una pressió o concentració de CO2 superior a l'atmosfèrica. Si volem aïllar-los i cultivar-los, haurem de generar sistemes en què l'ambient sigui reductor. Mètode GasPak. Els medis de cultiu també porten substàncies reductores com el tioglicolat.

pHHi ha microorganismes que creixen en ambients molt àcids i n'hi ha que ho fan a pH bàsics.

− Acidòfils. Creixen en medis extremadament àcids.− Alcalòfils. Creixen en medis extremadament bàsics, alcalins.

RADIACIONSHi ha microorganismes que poden suportar radiacions ionitzants. El rècord és Deinococcus radiodurans. És un coc grampositiu que forma tètrades. És de color vermellós degut als carotenoides. Pot suportar fins a 12000Gy (cal tenir en compte que 10Gy són letals per als humans). Presenten proteïnes protectores i complexos antioxidants de magnesi i fosfat.

PRESSIÓ HIDROSTÀTICA− Baròfil. Poden créixer a pressions atmosfèriques, però creixen millor a pressions elevades.

També hi ha els baròfils extrems, que només poden créixer en condicions de pressió elevada.

-46-

Microbiologia I

Es troben, per exemple, a les profunditats marines.− Barotolerant. Creix millor a pressió atmosfèrica, però tolera pressions més elevades.

La pressió hidrostàtica és molt important en l'àmbit industrial quan es treballa amb bioreactors molt grans; d'aquesta manera el bacteri que s'escull ha de ser barotolerant.

-47-

Microbiologia I

Tema 3.5. Cinètica de la mort bacteriana

DEFINICIONS− Càrrega microbiana: nombre de microorganismes viables presents.− Antimicrobià: agent que mata o inhibeix el creixement dels microorganismes.− Infecció: invasió d'un hoste per un microorganisme que es multiplicarà. Pot produir

símptomes o no.− Contaminació: acció i efecte d'impurificar, de corrompre, d'infectar d'una malaltia

infecciosa.− Descontaminació: tractament aplicat a objectes o superfícies perquè es puguen manipular

sense risc biològic.− Antisèptic: agent antimicrobià que s'aplica a un teixit per a evitar una infecció en destruir o

inhibir els microorganismes patògens.− Desinfecció: eliminació dels microorganismes patògens presents en un medi determinat per

tal de minimitzar el risc de transmissió de malalties. Referit normalment al tractament d'objectes o superfícies amb productes químics, però també de ferides.

− Desinfectant: agent, normalment químic, que desinfecta.− Conservant: additiu alimentari que evita l'alteració microbiana dels aliments i n'elimina els

microorganismes o n'impedeix el creixement de tal manera que n'assegura la conservació.− Estèril: lliure de microorganismes, especialment per esterilització prèvia.− Esterilització: destrucció de la totalitat dels microorganismes vius i de les seves formes

resistents presents en un medi determinat (objecte, medi de cultiu...).

CINÈTICA DE LA MORT BACTERIANALa mort bacteriana és un decreixement de manera constant. dN/dt=-kN, on N és el nombre de microorganismes viables a temps t, i k és la constant d'inactivació tèrmica o velocitat específica de mort. Quan hi ha un descens d'un logaritme, voldrà dir que la població ha baixat el 90%.

Un altre factor important són els paràmetres que afecten als agents antimicrobians:− Temps o durada de l'exposició.− Càrrega microbiana.− Tipus de microorganisme.− Concentració o intensitat de l'agent antimicrobià.− Ambient (matèria orgànica, biopel·lícules, pH...).

CONTROL DE LES POBLACIONS MICROBIANES− Mètodes físics:

− Calor humida: autoclau, tindalització, ebullició, pasteurització.− Calor seca: forn, incineració.− Baixes temperatures: refrigeració, congelació.− Radiació: UV, ionitzant.− Filtració: profunditat, membrana, HEPA.

− Mètodes químics:− Desinfectants.− Antisèptics.− Conservants.

-48-

Microbiologia I

− Quimioterapèutics.− Antibiòtics.

ESTERILITZACIÓ PER CALORParàmetres per determinar el grau d'eficàcia:

− Temps de mort tèrmica (TDT) o valor F. Temps necessari per matar totes les cèl·lules o espores a una determinada temperatura.

− Temps de reducció decimal (DRT) o valor DT. Temps necessari per matar el 90% d'una població microbiana a una determinada temperatura.

− Nivell de seguretat d'esterilització (SAL).

Autoclau, tindalització i incineració són mètodes que esterilitzen; ebullició, no. Sempre que sigui possible, és preferible emprar autoclau.

− Autoclau.− Tindalització. Es realitzen tres cicles amb una temperatura pròxima a l'ebullició. Es fa un

primer cicle, es refreda i seguidament es torna a fer un altre cicle, així repetitivament. D'aquesta manera eliminem tot allò que pugui germinar; si encara queda alguna endòspora, es torna a disminuir la temperatura i es fa de nou un cicle.

− Ebullició.− Pasteurització. Si augmentem la temperatura, disminueix el temps necessari per realitzar el

procés. Després de l'ebullició s'ha de fer una refrigeració per poder donar una vida mes llarga a l'aliment. És el cas de l'LTH i HTST. La UHT és un dels processos que es fa a una temperatura més elevada: 141ºC.

− Forn. És calor seca. El poder de penetració sec és molt menor que el vapor. Es realitza a 160ºC.

− Incineració. És el que es fa amb la nansa de Kolle.

Radiacions:− UV. Té poc poder de penetració, de manera que no es considera esterilitzant. La seva acció

es deu al caràcter mutagènic (en àcids nucleics es formen dímers de timina). També transforma l'oxigen en ozó i l'aigua en peròxid d'hidrogen.

− Ionitzant. És esterilitzant. S'empren raigs gamma i X. S'utilitzen quan no es pot emprar la temperatura. Parlem de radioesterilització, i és un mètode d'esterilització en fred.

Filtració:La filtració no té un efecte microbicida.

− Filtres de profunditat. Actuen per adsorció. Les partícules s'adhereixen a uns materials; fibra de vidre, porcellana, terra de diatomees, etc.

− Filtres de membrana. Són de cel·lulosa, policarbonat (els més emprats). Actuen per exclusió.

− Dissolucions de substàncies termolàbils. Productes farmacèutics, medis de cultiu, olis, antibiòtics.

− Filtres HEPA. Esterilització de l'aire. Tenen una elevada eficiència.− Cabines de seguretat biològica de flux laminar.

-49-

Microbiologia I

INDICADORS D'ESTERILITZACIÓ− Físics. Temperatura, temps, radiació...− Químics. Un paper impregnat amb una substància química que canvia de color indicant que

s'ha assolit una determinada temperatura.− Biològics. Ens permeten una mesura directa de l'esterilització.

Les endòspores no són els microorganismes més resistents. Els més resistents són els prions: agregats de proteïnes infeccioses que s'autorepliquen. Aquests prions són molt difícils d'eliminar. La incineració està enfocada pels prions, així com el vapor saturat o amb agents químics com l'hipoclorit sòdic i l'àcid fòrmic al 96%.

Piràmide: els virus amb embolcall o lipofílics tenen una membrana (envolta lípidica) i aquesta la prenen de la membrana citoplasmàtica cel·lular; són els més sensibles dels microorganismes als agents antimicrobians. A continuació, hi trobem els bacteris, però en forma vegetativa; els micobacteris són més resistents. Per sobre hi ha els fongs, seguits de virus sense embolcall, criptosporidis (forma ovoquists, que és la seva forma de resistència), i per últim es troben les endòspores, que són les més resistents, i els prions per sobre de tot.

Aquesta piràmide també serveix per saber quan un agent esterilitzant és efectiu o no. Hi ha desinfectants que s'anomenen esterilitzants que tenen acció contra les endòspores. És el nivell màxim d'esterilització. Hi ha desinfectants que tenen molta acció antimicrobiana, anomenats desinfectants d'alt nivell, però que no arriben a esterilitzar; ho eliminen tot excepte les endòspores. Els desinfectants de nivell intermedi actuen contra la majoria de bacteris. Els desinfectants de baix nivell actuen contra la majoria de formes vegetatives bacterianes i alguns fongs i virus.

DESINFECTANTS I ANTISÈPTICS− Antisèpsia: és el procés que destrueix els microorganismes de la pell o de les membranes

mucoses mitjançant substàncies químiques, sense afectar sensiblement els teixits sobre els quals s'aplica.

− Desinfecció: és el procés que destrueix els microorganismes, excepte les espores bacterianes, dels objectes inanimats. Es pot realitzar per mètodes químics o físics (substàncies químiques, pasteurització, llum ultraviolada).

− Desinfecció de baix nivell: procediment químic amb el qual es pot destruir la major part de formes vegetatives bacterianes, alguns virus i fongs, però no el complex Mycobacterium tuberculosis ni les espores bacterianes.

− Desinfecció de nivell intermedi: procediment químic amb el qual s'aconsegueix inactivar les formes vegetatives bacterianes i la major part de virus i fongs.

− Desinfecció d'alt nivell: procediment químic que aconsegueix destruir tots els microorganismes llevat d'algunes espores bacterianes.

− Esterilització: consisteix en l'eliminació de qualsevol forma de vida microbiana, incloses les espores, ja sigui mitjançant mètodes físics o químics.

− Neteja: acció d'arrossegar la matèria aliena a l'objecte que es vol netejar, com la pols, matèria orgànica (sang, secrecions, microorganismes), mitjançant aigua, detergents i acció mecànica. Redueix o elimina el reservori de microorganismes patògens. Si netegem primer, eliminem matèria orgànica, després esterilitzem.

Classificació dels agents químics segons l'estructura química:

-50-

Microbiologia I

− Alcohols: l'etanol de 70º és més efectiu que el de 96º.− Aldehids.− Biguanides.− Colorants.− Derivats clorats.− Derivats iodats.− Detergents catiònics.− Fenol i derivats.− Metalls pesants: Chlamydia trachomatis és de transmissió sexual i els ulls del nadó es

poden veure infectats per aquest bacteri, produint el tracoma. Se li administra nitrat de plata al néixer per evitar-ho.

− Oxidants.− Altres.

ANTISÈPTICS I DESINFECTANTS SEGONS L'ESPECTRE D'ACTIVITATTaula on s'observen els diferents nivells antimicrobians segons l'espectre. No sabem si esterilitzen, ja que no hi ha la taula corresponent a les endòspores, però podem saber que són desinfectants d'alt nivell.

Taula d'ús dels desinfectants per a la desinfecció ambiental i de superfícies:− Hipoclorit sòdic: el de venda comercial correspon al 5% = 50g/l clor lliure = 50.000ppm1.

L'efecte de desinfecció i esterilització és d'entre 5000-20000ppm. Entre 100-1000ppm desinfecta, però no esterilitza. Entre 0,5-1ppm de clor lliure per la potabilitat de l'aigua.

COM INACTIVAR EL VIRUS DE LA SIDA?És un virus que té l'avantatge que presenta embolcall. Podem evitar la transmissió quan un element està contaminat degut a que presenta aquest embolcall i és fàcil de destruir. Es pot utilitzar lleixiu (dissolució de 5000ppm), aigua oxigenada, alcohol de 70º, etc. Exemple: una roba tacada amb sang la podem posar en una rentadora amb lleixiu i es desinfectaria. És més resistent que altres virus als raigs UV i ionitzants.

-51-

Microbiologia I

Tema 3.6. Agents antimicrobians

CONCEPTES− Antibiòtics: agents quimioterapèutics d'origen natural o derivat d'aquest origen natural (és a

dir, no és sintètic).− Espectre d'activitat: quan parlem de bacteris, l'espectre és ampli quan és actiu contra la

majoria de grampositius i gramnegatius.− Efecte sinèrgic: tenen més efecte dos compostos junts que per separat. Exemple: un beta-

lactàmic i un inhibidor de les beta-lactamases.− Toxicitat selectiva: hem de saber, per cada agent antimicrobià, quina és la dosi terapèutica i

quina és la dosi tòxica. És estrany, no obstant això, que no hi hagi efectes secundaris.

VALORACIÓ− MIC (Concentració Mínima Inhibitòria): a quina concentració es comença a inhibir el

creixement dels microorganismes.− MBC (Concentració Mínima Bactericida o Letal): a partir de quina concentració es

maten, s'eliminen, els microorganismes.− Proves de sensibilitat per dilució (en tub o en agar): assajar la sensibilitat a partir de la

dilució, conforme més diluït estigui l'agent antimicrobià menys propietats tindrà. S'utilitza un medi nutritiu líquid (l'estàndard s'anomena Mueller-Hinton). Es realitzen una sèrie de dilucions en què tots els tubs tinguin el mateix medi nutritiu i el mateix inòcul bacterià que volem assajar. A continuació, l'agent antimicrobià es va posant a cada tub de més diluït a més concentrat. Les dilucions solen ser entre 0,1-128 micrograms / ml. Seguidament, s'incuben els tubs a la temperatura i temps òptim del microorganisme i es fa la lectura dels tubs; a partir d'aquí, observem si hi ha creixement o no. Si hi ha creixement, el tub es trobarà tèrbol; si no està tèrbol i la densitat òptica és zero, aquest serà la MIC.

− Proves de sensibilitat per difusió en agar (antibiograma): conforme es va difonent l'agent antimicrobià va perdent propietats. Aquesta tècnica s'empra molt en microbiologia clínica. S'utilitza un medi de cultiu sòlid (Mueller-Hinton). Se sembra tota la placa de l'inòcul bacterià i sobre la placa es dipositen uns disquets que estan impregnats amb diferents agents quimioterapèutics. L'avantatge és que es pot assajar amb diversos agents quimioterapèutics i amb la dilució només un. A continuació, s'incuben les plaques i posteriorment s'observa si hi ha creixement o no; depenent de l'agent quimioterapèutic, s'observa un halo d'inhibició. El bacteri creix per tota la placa excepte en aquest halo; conforme ens allunyem d'aquest disquet, hi ha menys concentració de l'agent antibacterià i, per tant, més creixement. Així, doncs, a major diàmetre d'inhibició, més sensible serà el microorganisme. Si tinguéssim entre 32 micrograms/ml i 4 micrograms/ml, ens quedaríem amb l'última perquè com menor és la concentració inhibitòria, més sensible és l'agent. => - MIC + Sensible.

Gràfica MIC: hi ha relació directa entre el diàmetre d'inhibició i la MIC. L'altra cosa que volem saber és la concentració a la qual arriba l'agent quimioterapèutic al nostre organisme. A la gràfica, l'antibiòtic arriba entre 7-28micrograms/ml; a partir d'aquí, i amb la MIC, es pot saber quan la concentració és tòxica o terapèutica. És diferent per cada microorganisme.Taula 35.3 (Taula estandarditzada de diàmetres d'inhibició-agents quimioterapèutics): si la MIC és de 4micrograms/ml i la concentració d'agent quimioterapèutic que arriba al nostre cos és de 7-28micrograms/ml, el microorganisme serà sensible. Però si la MIC és de 32micrograms/ml i la concentració que arriba al nostre cos és la mateixa que hem dit, el microorganisme serà resistent. RESISTÈNCIA: MECANISMES

1. Manca la diana. Sense paret cel·lular o sense mureïna.

-52-

Microbiologia I

2. Per modificació de la diana. D-Ala-D-lactat per D-Ala-D-Ala (vancomicina); DNA girasa (quinolones); DHFR (trimetoprim); beta-RNApol (rifampicina); rRNA (eritromicina, cloramfenicol).

3. Producció d'alternatives a la molècula diana. Per exemple, proteïnes d'unió a la penicil·lina (són PBP).

4. Sobreproducció de la diana o adquisició de l'ambient. PABA (mitjançant sulfonamides s'inhibeix la ruta sintètica); àcid fòlic (sulfonamides i trimetoprim).

5. L'antibiòtic no pot arribar a la diana. Envoltes, com membrana externa o biofilms (penicil·lina G); disminució de la permeabilitat (penicil·lines); bombes de flux o translocases (tetraciclina i cloramfenicol).

6. Inactivació de l'agent quimioterapèutic. Beta-lactamases, fosforilació o acetilació d'aminoglucòsids o acetilació del cloramfenicol.

RESISTÈNCIA: ORIGEN I TRANSMISSIÓLes resistències poden ser o bé al cromosoma bacterià o bé en plasmidis R (resistència). En el primer cas, la transmissió és vertical (hereditària); en el segon, en canvi, tot i que pot deure's a transmissió vertical, també pot ser per transmissió horitzontal (conjugació). La transmissió mitjançant plasmidis és la més efectiva.

Hi ha microorganismes que tenen multiresistències. L'aparició d'aquestes es pot fer evitant el mal ús o abús d'antibiòtics: ús generalitzat dels antibiòtics en cas que no sigui necessari (àmbit clínic, veterinari, etc.,) i dosis incorrectes i interrupció del tractament (dosis subletals). En la indústria alimentària, hi ha casos en què es donen antibiòtics als animals perquè s'engreixin més (hipotèticament, perquè s'eliminarien infeccions lleus que causen un esforç al metabolisme que ens fan aprimar).

Es pot donar transmissió de resistències entre espècies diferents.

RESISTÈNCIA: NOUS ANTIMICROBIANSS'ha comprovat que durant molts anys ha estat de moda la síntesi química d'antimicrobians i, relativament, el nombre aparegut durant els darrers anys és molt baix. Ara es defensa retornar a les fonts naturals.

També s'ha vist interessant l'ús de bacteriòfags: virus que infecten bacteris.

El disseny per computació permet conèixer les relacions entre molècules, com pot ser conèixer quina molècula permetria inhibir un enzim en concret. Per exemple, s'ha fet saquinavir i indinavir, que són inhibidors de la proteasa del virus de la sida (la sida té uns enzims, les proteases, que permeten la maduració de les proteïnes que formaran part de l'estructura del virus).

-53-

Microbiologia I

Tema 4.1. Genòmica bacteriana

ELEMENTS GENÈTICS: CROMOSOMA BACTERIÀ− La gran majoria de bacteris tenen un únic cromosoma, tot i que hi ha excepcions com Vibrio

cholerae, que en té dos.− DNA de doble cadena circular (lineal en Borrelia burgdorferi).− Disposició irregular (no té membrana nuclear).− Ancorat al mesosoma (invaginació) o a la pròpia membrana plasmàtica.− 4,7Mpb (1400micròmetres). Això comporta que el DNA hagi d'estar superenrotllat, fet que

és permès gràcies a les topoisomerases II (DNA girasa). Ara bé, hi ha d'haver dominis o zones on es relaxi el superenrotllament via topoisomerases I per tal que hi pugui accedir la maquinària necessària per a la transcripció i replicació.

El genoma de l'espècie (pangenoma) és el conjunt de tots els gens que es poden trobar en una espècie, siguin comuns o no. Els gens conservats són comuns en totes les soques d'una espècie; els auxiliars, no. Els gens conservats es consideren essencials per a la vida de la cèl·lula; és a dir, eliminant els gens auxiliars, el bacteri podria viure perfectament.

ELEMENTS GENÈTICS: PLASMIDIS− DNA de doble cadena circular autònom.− Heretable.− Transferència horitzontal.− No solen estar units a la membrana plasmàtica.− No són indispensables.− Aporta avantatges selectius.− Mida: 1-1000Kpb.− Còpies: 1 a més de 100.− Grups d'incompatibilitat. Poden coexistir diferents plasmidis en una mateixa cèl·lula si no

pertanyen al mateix grup d'incompatibilitat. Si coincideixen en el mateix grup, una exclou l'altra perquè comparteixen sistemes de regulació.

− Curació. Eliminació dels plasmidis en una cèl·lula, ja bé sigui espontània (natural) o induïda per factors ambientals o artificials. Per electroporació es poden formar porus a la cèl·lula a través dels quals es perdran plasmidis (o se n'adquiriran).

Hi ha diferents tipus de plasmidis depenent del seu contingut:− Episomes. Plasmidi amb capacitat d'integrar-se en el cromosoma, la seua replicació

dependrà de la del cromosoma.− Plasmidis conjugatius. Codifiquen els mecanismes per interaccionar amb una cèl·lula

receptora i transferir-lli una còpia del plasmidi. Es transmeten per conjugació. Molt útils com a vectors en enginyeria genètica. Per exemple, plasmidi F. El gen tra implica que és un plasmidi de transferència; oriT és l'origen de la transferència; IS3 (seqüència d'inserció) fa que el plasmidi, a part de conjugatiu, també sigui un episoma. L'episoma s'integra per recombinació específica de lloc, que és una recombinació no homòloga.

− Plasmidis metabòlics. Poden codificar algun gen o, fins i tot, vies metabòliques senceres. Alguns exemples concrets són, per exemple, la nodulació i fixació simbiòtica de nitrogen (Rhizobium), la degradació de compostos orgànics (octà, càmfora alcanfor, naftalè ; Pseudomonas), degradació d'herbicides (Alcaligenes). La identificació fenotípica dels

-54-

Microbiologia I

bacteris pot ser complicada degut a la transmissió de plasmidis que poden canviar les propietats metabòliques dels bacteris.

− Plasmidis R (resistència). Confereixen resistència a agents quimioterapèutics i metalls pesants. Hi ha bacteris que poden tenir resistència a múltiples agents quimioterapèutics que poden estar codificats en plasmidis R. Quan aquests plasmidis són conjugatius, és fàcil la disseminació de resistències.

− Plasmidis de virulència. Codifiquen factors de patogenicitat o de virulència; és a dir, pot ser que una soca no sigui patoenica, però adopti un plasmidi i l'adquireixi, o una soca que sigui poc virulenta i adopti un plasmidi es torni més violenta. Poden codificar gens d'hemolosina, enterotozina, adhesió a l'epiteli intestinal, etc. Invasió de cèl·lules hostes.

− Plasmidis bacteriocinogènics. Prové de la paraula bacteriocina, que són pèptids produïts per bacteris que actuen encontra soques relacionades filogenèticament. És, per tant, com una espècie d'antibiòtic d'espectre molt reduït. Alguns són conjugatius. Nisina A s'empra com a conservant alimentari, que és un plasmidi de bacteris de l'àcid làctic.

ELEMENTS GENÈTICS MÒBILS: TRANSPOSONS− Transposons. Tenen un gen saltador, és a dir, poden saltar o transposar-se d'un element

genètic al mateix, però en un altre lloc, o a un altre element genètic (de cromosoma a plasmidi, per exemple). Es repliquen en formar part d'altres molècules de DNA (cromosomes, fags, plasmidis).

Tipus:− Seqüències d'inserció. Als extrems, hi tenen dues seqüències IR repetides invertides

d'aproximadament 15-45pb. Entre els dos extrems es troba el gen de la transposasa, que permet el salt d'un lloc a un altre. Pot tenir algun gen més, però sempre estarà relacionat amb la regulació de la transposició; per això, són gens molt curts.

− Transposons senzills. Com el cas anterior, però amb altres gens a més del de la transposasa.

− Transposons compostos. Als extrems, en comptes de la repetició invertida hi ha la seqüència d'inserció duplicada.

− Transposons conjugatius. El transposó forma part d'un plasmidi conjugatiu.

Transposició: tot transposó ha de tenir el gen de la transposasa. Pot ocórrer de dues maneres: o bé a l'atzar o bé en un lloc específic. Quan és d'un lloc específic, la transposasa reconeix una seqüència curta diana, que té entre 5 i 10 pb. A continuació, talla la doble cadena donant lloc a extrems cohesius, allà mateix s'insereix el transposó. Seguidament, sintetitza i completa la doble cadena en els extrems cohesius, de manera que al final es dóna una duplicació de la seqüència diana.

La transposició, a més, pot ser conservativa (on hi ha l'origen del transposó es perd i es guanya allà on salta) o replicativa (no només es transposa, sinó que es conserva en el lloc inicial, de manera que es duplica/replica). Perquè es doni aquest darrer cas, cal que es formi un cointegrat, que és una formació momentània a partir del transposó i la diana d'unió d'aquest.

La transposició pot tenir diverses conseqüències:− Mutació i canvi fenotípic.− Reordenació i deleció.− Inactivació per terminació.− Activació per promotors.

-55-

Microbiologia I

− Mutagènesi. Serveix per saber la funció dels gens.

-56-

Microbiologia I

Tema 4.2. Bases de la variabilitat genètica

Tipus de variabilitat genètica:− Duplicació.− Endosimbiosi.− Simbiogènesi.− Mutació.− Recombinació genètica.

Els més emprats són la mutació i la recombinació genètica.

MUTACIÓÉs l'alteració permanent i heretable en el material genètic d'una cèl·lula, que pot determinar o no un canvi fenotípic. La taxa de mutacions és baixa, però en poblacions elevades augmenta: 10-7-10-11 pb.

Quan parlem d'un gen, són tres lletres en cursiva i en minúscula, podent anar acompanyades d'una altra lletra o número: hisC. Si va sense cursiva i amb la primera lletra en majúscula, es tracta d'una proteïna. Si va acompanyada de positiu o negatiu, del fenotip.

− Mutacions condicionals. Mutació que només s'expressa si hi ha, per exemple, un augment de temperatura.

− Mutacions letals. Quan s'expressen, causen la mort cel·lular.− Mutants auxòtrofs. Un auxòtrof és quan hi ha una deficiència en la síntesi d'una molècula.− Mutants resistents. − Mutacions puntuals o microlesions. És quan afecten un o pocs parells de bases.− Reordenaments o macrolesions. Afecten molts parells de bases, gens sencers o, fins i tot,

diversos gens alhora.− Mutació inversa, retromutació o mutació retrògrada. És una mutació que torna a la soca

salvatge. Reverteix el genotip.− Mutació supressora extragènica o intragènica. Reverteix el fenotip, però no el genotip.

Pot ser intragènicament, sent una mutació d'aquell gen en un altre lloc, però que restableix el fenotip; o bé extragènica, sent una mutació fora del gen, ja sigui en la zona operadora o promotora.

− Mutacions en regions no codificadores (operadors, promotor, etc.). Les mutacions poden donar-se en zones de regulació.

Mutacions puntuals o microlesions:− Mutació per transició. Un nucleòtid canvia una base nitrogenada per una altra, però ha de

ser una purina per una altra purina (A i G) o bé una pirimidina per una pirimidina (C, T i U).− Mutació per transversió. Es canvia una purina per una pirimidina. És més freqüent.

L'efecte que causen les mutacions puntuals pot ser:− Mutació silenciosa. El codó canvia, però codifica per al mateix aminoàcid i, per tant, la

proteïna serà la mateixa. Hi ha un canvi en el genotip, però no en el fenotip.− Mutació neutra. És quan hi ha un canvi d'aminoàcid, però aquest canvi no comporta un

canvi en l'activitat o funció de la proteïna.− Mutació de canvi de sentit. El canvi de nucleòtid fa que el codó canviï i també la proteïna.

-57-

Microbiologia I

− Mutació sense sentit. S'origina un codó de terminació en canviar un nucleòtid. La proteïna no se sintetitzarà completament. La proteïna no serà funcional. Tindrem un canvi en el genotip i en el fenotip.

− Mutació per canvi en la pauta de lectura. Es dóna una inserció o deleció d'un o més parells de bases. Si s'insereix un nucleòtid o un parell de nucleòtids, o es delecionen, quan es tradueixi, havent-se corregut un nucleòtid o dos, tots els codons hauran canviat.

MUTACIÓ: TIPUSReordenaments o macrolesions:

− Duplicació. No origina una pèrdua de la funció de la proteïna. Afegeix una còpia més d'un gen.

− Deleció. Elimina un gen o fragments.− Translocació o inserció. Produeix un canvi de lloc d'un gen o una seqüència i s'afegeix

alguna seqüència.− Inversió. Canvia l'ordre d'un fragment.

Els reordenaments o macrolesions poden ser deguts a recombinacions i transposons.

MUTACIÓ: MECANISMES− Mutacions espontànies, casuals o naturals.

− Errades en la replicació. Un exemple pot ser la tautomerització de les bases nitrogenades. Això és quan s'utilitza l'isòmer d'una base nitrogenada. Pot causar un aparellament diferent entre les bases nitrogenades. No només es dóna una replicació, sinó que n'hi ha d'haver una segona. És una mutació per una transició o transversió.− Mutació de desfasament per canvi de la pauta de lectura. És una mutació per

inserció per deleció.− Inserció per transposons.− Errades en la recombinació.

− Mutacions induïdes o no espontànies. Hi ha mutàgens químics i físics. Els anàlegs de bases causen una tautomerització. Com a agents químics se solen emprar hidroxilamina, bromur d'etidi i acridines (aquests dos són colorants intercalants, s'insereixen entre dos parells de bases). Els mutàgens físics són radiacions UV i radiacions ionitzants.− Agents alquilants., Poden causar una transició o transversió. Per exemple,

nitrosoguanidina metila la guanina. La metilguanina s'aparellarà de manera diferent (s'aparella amb timina en comptes de citosina).

− Colorants intercalants. Si s'intercalen entre dos parells de bases, podran produir insercions o delecions.

− Radiacions UV i ionitzants. Poden causar danys directes, que són dímers de timidina (T-T). L'aflatoxina (micotoxina fúngica) també causa danys directes.

− Raigs X. Causen delecions.

MUTACIÓ: DETECCIÓ I AÏLLAMENTLa taxa de mutacions espontànies, tenint en compte que el genoma d'un bacteri pot tenir uns 5x10 6

pb, és baixa (10-7-10-11 per pb). Hi ha mutacions que són ben fàcils de detectar si afecten la pigmentació, la morfologia o, fins i tot, ocasionen la pèrdua de càpsula (es podrien detectar veient les colònies). Ara bé, si parlem de mutants auxòtrofs, que causen deficiències en la síntesi d'aminoàcids, no s'arribaran a percebre.

-58-

Microbiologia I

MUTACIÓ: DETECCIÓ I AÏLLAMENTUna manera prou simple per detectar mutacions per auxòtrofs és el sembrat per rèplica. Si tenim colònies aïllades en una placa, en fem una rèplica emprant un vellut o tela estèril. Aquesta placa amb les colònies la posem en contacte amb la tela. A continuació, podem fer dues plaques en medis de cultiu diferents: medi complet (normal) i medi mínim (medi complet, excepte per allò que volem buscar). Incubem les plaques i, després del temps d'incubació, comparem les colònies crescudes en ambdues plaques. Si tot creix en tot, no haurem aconseguit veure cap canvi; però si hi ha hagut creixement en un medi, però no pas en l'altre, podrem saber quina de les colònies del medi complet correspon a la soca mutada.

Les soques que creixen a prop són menys sensibles. A més, també podem emprar tècniques de mutagènesi dirigida per mutar allò que volem aconseguir. Podem provocar la mutació en el gen que vulguem a partir de tècniques de recombinació genètica.

El Test d'Ames serveix per detectar si una substància és tòxica o cancerígena. Assumim que la majoria d'agents cancerígens són també mutàgens. S'utilitza una soca bacteriana que sigui, per exemple, auxòtrofa per la histidina (histidina negativa); també té un dèficit en la reparació del DNA. Aquesta soca la cultivem amb histidina en el medi i incubem el cultiu de la soca mutant amb la substància química que volem assajar (mutagen sospitós) i amb un extracte de fetge de rata (s'utilitza perquè produeix enzims que permeten l'activació de les molècules tòxiques). Cal, a més, que hi hagi un control negatiu. Després d'aquesta incubació, fem una sembra, tant del control negatiu com de l'experiment, amb un medi sense histidina. Seguidament, observem les colònies aparegudes. Si les colònies obtingudes són majors igual al doble es consideraran un agent cancerigen. Si creixen en el control negatiu pot ser degut a mutacions espontànies. També es pot fer impregnant un disquet amb l'extracte de fetge i el mutagen.

Es fan diferents rèpliques i diferents concentracions de la substància a assajar. Això es fa per detectar substàncies letals.

RECOMBINACIÓ GENÈTICAIntercanvi de seqüències que provoca un canvi heretable. Pot significar que la cèl·lula adopti funcions noves o no. Les seqüències de DNA poden ser d'un mateix o de diferent element genètic.

Tipus:− Recombinació general, homòloga o legítima. Les seqüències han de ser, si no idèntiques,

semblants. Poden ser recíproques o no recíproques.− Recíproca. És quan hi ha un entrecreuament i, posteriorment, un intercanvi de

seqüències. Al final tindrem híbrids: una part vindrà d'una cadena i una altra, de l'altra cadena. És un intercanvi de fragments curts de DNA.

− No recíproca. Hi ha un entrecreuament, però realment no hi ha un intercanvi, entenent que un intercanvi es produeix quan totes dues reben i donen alhora. Una doble cadena en substitueix una altra. Al final, doncs, s'obté només un DNA recombinant, ja que l'altra no ha rebut cap seqüència.

− Recombinació específica de lloc, no homòloga o il·legítima. No és necessari que les seqüències siguin semblants. És el cas, per exemple, dels transposons, que poden saltar d'una seqüència a una altra, recombinant en un lloc específic. També bacteriòfags.

-59-

Microbiologia I

Tema 4.3. Sistemes de restricció i modificació

− Provenen de procariotes.− Protecció de dsDNA invasor.− Seqüències de reconeixement. Són de 4, 6 o 8 parells de bases. Aquestes seqüències són

molt freqüents en qualsevol genoma: com més llarga és una seqüència, menys probable és de trobar-se. El sistema propi de la cèl·lula la protegeix mitjançant metilacions dels nucleòtids, de manera que l'endonucleasa no actuarà si el nucleòtid està metilat.

− Enzims o endonucleases de restricció. Reconeixen seqüències curtes i tallen allà dins. Provenen de procariotes; també n'hi ha en bacteris.

− Tipus: I, II i III. I i III actuen com a enzims bifuncionals, fent metilacions i actuant com a nucleases. El II són dos enzims diferents que fan les funcions per separat. L'I actua a 1000 parells de bases del lloc de reconeixement, mentre que el III actua a 24-26 parells de bases. EcoR1 genera extrems cohesius quan talla les dues cadenes (si són extrems iguals són extrems roms).

És important conèixer el mapa de restricció d'un plasmidi per saber on talla cadascun dels enzims de restricció.

MECANISMES DE TRANSFERÈNCIA HORITZONTAL D'INFORMACIÓ GENÈTICALa informació es pot transferir per tres sistemes en procariotes:

− Transformació.− Conjugació.− Transducció.

TRANSFORMACIÓMecanisme de transferència de material genètic horitzontal mitjançant la captació a l'atzar d'un fragment de DNA lliure per part d'una cèl·lula receptora. No totes les cèl·lules procariotes poden fer transformació. Cal, doncs, que les cèl·lules siguin competents.

− Transformació natural. Si la cèl·lula és competent, captarà fragments de DNA lliures, que es convertiran en una monocadena, i aquesta podrà recombinar-se o no. Si es recombina, ha de fer-ho per recombinació homòloga no recíproca, ja que ha de substituir, en el cas que tingui suficient similitud, una de les cadenes del propi cromosoma. Aixó és una transformació estable. Ara bé, si no es recombina, potser perquè no té prou homologia, el DNA s'acabarà degradant. Per tant, es tractarà d'una transformació sense èxit. Exemples:− Streptococcus pneumoniae (pneumococ). Si la cèl·lula és competent és perquè és capaç

de sintetitzar proteïnes de competència. El mecanisme és: proteïnes de membrana capten DNA de doble cadena. Després, cal que s'obtinguin fragments més curts, que seguidament seran convertits en DNA d'una única cadena per efecte d'una exonucleasa. Després entra per efecte d'endonucleasa. Finalment, si té èxit la transformació, hi haurà una recombinació homòloga no recíproca.

− Haemophilus influenzae. Perquè el fragment es pugui captar, cal que sigui una seqüència específica d'11 parells de bases. És a dir, si la doble cadena de DNA lliure no té una determinada seqüència d'11 pb, no es podrà realitzar la transformació. El que ocorre és que en aquesta espècie bacteriana, la dita seqüència està molt repetida en el cromosoma bacterià. En aquesta transformació, difícilment es captarà DNA lliure d'una

-60-

Microbiologia I

espècie que no sigui de les influents. Les cèl·lules competents utilitzen una vesícula de membrana: transformasoma. Aquest transformasoma permet captar DNA de doble cadena lineal (només si és lineal podrà entrar a l'interior de la cèl·lula).

− Transformació artificial. Tenim un cultiu bacterià, el centrifuguem i descartem el sobrenedant. Després posem el sediment, que són les cèl·lules, en solució de clorur de calci i, immediatament, en un bany de gel. Així s'augmenta la permeabilitat. Si no hem de fer la transformació, les podem congelar. El que es posa és una solució on hi ha el plasmidi que volem fer entrar en la cèl·lula; normalment té un marcador, que sol ser una resistència a un antibiòtic que, a posteriori, permet detectar si el bacteri ha integrat la seqüència esperada. Quan ho tenim en gel, apliquem un xoc tèrmic passant de 4º a 42º en un bany. Això facilita la transformació; és a dir, que entrin els plasmidis a l'interior de la cèl·lula bacteriana. A continuació, es comprova si realment s'ha produït l'esperada transformació. Les colònies crescudes en l'antibiòtic seran les que tinguin el plasmidi.

Hi ha un altre sistema. En comptes de clorur de calci es posa aigua estèril. Després es posa en gel, es produeix una altra centrifugació i una altra resuspensió en aigua estèril. Llavors esdevenen competents. Es posa en gel i, seguidament, s'hi podrà posar la solució de plasmidi que interessa, i s'aplica un tractament per electroxoc: electroporació. Això fa que es creïn uns porus en els embolcalls bacterians que facilitin l'entrada dels plasmidis. Després es posa en solució salina isotònica i sembrem en plaques en un medi de cultiu que tingui ampicil·lina (o l'antibiòtic degut).

-61-

Microbiologia I

Tema 4.4. Conjugació

La conjugació és un tipus de transferència gènica horitzontal d'una cèl·lula a una altra per contacte directe entre cèl·lules mitjançant plasmidis conjugatius o sexuals. Hi ha cèl·lula donadora i receptora, i és necessari el plasmidi replicatiu perquè sense ell no es pot fer la transferència.

En grampositius, la conjugació és a través del pili, un tub proteic buit. El plasmidi conjugatiu codifica per als gens del pili. Es formen substàncies d'agregació, que entren en contacte entre la cèl·lula donadora i la receptora.

CONJUGACIÓ F+xF-

La positiva és la donadora; la negativa, la receptora. La cèl·lula donadora té el plasmidi conjugatiu; les cèl·lules positives són capaces de formar el pili entre les cèl·lules. El plasmidi es transformarà i es replicarà en la cèl·lula receptora. El mètode de replicació és l'anomenat cercle rodant.

Una de les cadenes es copia. Mentre es fa aquest procés, se'n transfereix una cadena a la cèl·lula receptora (el plasmidi és DNA circular de doble membrana). Ja a a la cèl·lula receptora, se'n sintetitza la cadena complementària. De manera que en aquest tipus de conjugació, la cèl·lula donadora segueix tenint el plasmidi, però li passa una còpia a la receptora. Les dues acaben sent F+.

Cercle rodant. L'origen de transferència (OriT) és per on es talla una de les cadenes. La cadena tallada s'obrirà i es transferirà per 5'. Conforme va transferint-se i girant, també s'anirà replicant i formant-se de nou la doble cadena. Aquest mètode també l'empren molts virus. Un plasmidi pot replicar-se i formar moltes còpies; un virus també. Això es coneix com a formació de còpies en tàndem.

CONJUGACIÓ HfrHfr vol dir elevada freqüència de recombinació. El plasmidi f no és només un plasmidi conjugatiu, sinó que també pot integrar-se al cromosoma (és, doncs, un episoma; s'integra per recombinació no homòloga). Així, el plasmidi s'integrarà en el cromosoma. A la cèl·lula, quan el plasmidi està com a episoma, també pot conjugar-se (segueix mantenint la capacitat conjugativa), de manera que a partir de l'origen de transferència començarà a transferir-se el plasmidi que es troba com a episoma. El sistema serà semblant al cercle rodant: conforme hi hagi monocadena al cromosoma, s'anirà completant i formant-se doble cadena.

L'origen de transferència es troba a la meitat del cromosoma, de manera que es transferirà part del gen plasmídic i part del cromosoma, ja que es transfereix més o menys l'equivalent a la longitud del plasmidi. Quan s'ha transferit a la cèl·lula receptora, continua transferint-se una cadena. Es forma la cadena complementària i, a continuació, hi haurà una recombinació. La recombinació de la cèl·lula receptora serà homòloga perquè part del que s'haurà transferit seran gens cromosòmics.

La donadora, Hfr, continuarà sent-ho, es queda igual. En canvi, la cèl·lula receptora continuarà sent F-, ja que no s'haurà transferit el plasmidi complet.

CONJUGACIÓ F'xF-

F' és la donadora; F-, la receptora. Hi ha una cèl·lula que en principi era Hfr, té un episoma (conjugativa), però igual que un plasmidi té capacitat d'integrar-se en el cromosoma, també pot ser que se n'escindeixi. Així, si estava com a episoma, s'escindeix i torna al citoplasma, pot ser que

-62-

Microbiologia I

s'escindeixi malament i cedeixi el plasmidi, però també part del cromosoma, dels gens que hi ha a continuació. S'escindeix el plasmidi sencer més una part de cromosoma.

F' seguirà sent conjugatiu. Es dóna conjugació entre F' i F-. Es forma el pilus sexuals i pel cercle rodant es transferirà una cadena que, en la cèl·lula receptora, es convertirà a doble cadena. Finalment, obtindrem dues cèl·lules F'. Aquesta cèl·lula de la mateixa espècie o relacionada, tindrà el seu propi cromosoma més el transferit pel plasmidi. La cèl·lula passarà a ser, doncs, parcialment diploide (merozigot, cèl·lula merodiploide).

-63-

Microbiologia I

Tema 4.5. Transducció

És la transferència de material genètic mitjançant virus que infecten bacteris, és a dir, bacteriòfags (fags).

CICLE LÍTICUn virus és un àcid nucleic recobert per una coberta proteica (càpsida). Penetra l'àcid nucleic del virus a dins del bacteri. Com que els virus són paràsits intracel·lulars i porten poca informació genètica, el que fan és segrestar la maquinària cel·lular en benefici propi. A partir d'aquí, la seva funció és replicar-se. Una de les maneres de fer-ho és per cercle rodant (a partir d'un punt de replicació del genoma del virus, van fent-se'n còpies conforme va girant i replicant-se una cadena). El virus, amb ajut d'enzims, el que fa és tallar a la longitud del genoma normal del virus. Així, d'un genoma víric se'n poden obtenir desenes de genomes nous. Quan ja s'ha replicat tot el genoma, el virus té la informació per a sintetitzar proteïnes que han de formar la càpsida (les polimerases les aprofita de les cèl·lules que infecta). S'autoacoblen totes les parts de la càpsida, quedant a l'interior un genoma víric. Quan ja ha estat format, lisen la cèl·lula i cadascun dels virus nous replicats podrà donar un altre cicle. Els virus són molt efectius multiplicant-se. Aquest cicle s'anomena cicle lític, i el duen a terme fags virulents.

CICLE LISOGENEn un cicle lisogen, el virus infecta la cèl·lula, introduint-li el seu genoma, però el virus pot integrar-se en el cromosoma de la cèl·lula. En aquest cas, s'anomena provirus, però en aquest cas concret parlarem de pròfags. El virus s'integra en la cèl·lula i es replica conjuntament. Els pròfags troben el seu inici en un fag temperat, que són aquells que fan el cicle lisogen per contraposició als fags virulents.

Alguns cops, el pròfag pot induir-se i fer un cicle lític (inducció del pròfag). Les induccions poden deure's a moltes causes diverses, com ara la irradiació per UV. Llavors, el pròfag s'escindeix del cromosoma i torna al citoplasma. En el citoplasma és on podrà donar un cicle lític. La millor manera per propagar-se és via cicle lític, però llavors es quedarien sense cèl·lules hoste; així, el propi virus pot combinar ambdós cicles.

TRANSDUCCIÓ GENERALITZADAQualsevol gen bacterià es pot transduir. És a dir, pot passar d'una cèl·lula a una altra mitjançant bacteriòfags.

Hi ha un virus que infecta un bacteri. En el citoplasma, si hi ha cicle lític, donarà transducció generalitzada i serà fag virulent. Havent infectat la cèl·lula, farà còpies del seu genoma. A voltes, en comptes de fer un cicle lític normal, el cromosoma del bacteri es fragmenta. També pot passar que a l'hora de formar-se el virus complet, dins de la càpsida no sempre hi hagi un genoma víric, sinó que hi hagi un fragment cromosòmic de longitud semblant al cromosoma víric. Els virus defectuosos són els que tenen genoma impropi. Per tant, tindrem “virus normals” i fags defectuosos o partícules transductores (aquells que contenen DNA víric).

El pas següent és centrar-se en les partícules transductores. El que pot passar és que infectin una altra cèl·lula, ja que la infecció no depèn el genoma, sinó de la càpsida; per tant, podrà fer contacte la càpsida amb una altra cèl·lula i fer entrar el fragment de DNA cromosòmic dins de la cèl·lula. Seguidament, perquè acabi de fer-se la transducció, es dóna una conjugació homòloga, i d'aquesta

-64-

Microbiologia I

manera s'haurà produït la transducció. Però no sempre hi haurà conjugació i pot ser que el fragment de DNA es degradi o que es quedi al citoplasma. Però perquè es quedi al citoplasma s'ha de circularitzar i aleshores parlem d'un merozigot (com tenir alguns gens duplicats); d'això s'anomena transducció abortiva.

TRANSDUCCIÓ ESPECIALITZADALa gran diferència de l'anterior és que no es transdueix qualsevol gen, sinó aquells que siguin al costat del lloc d'integració del pròfag. En ocasions, es pot induir l'escissió del pròfag. Ara bé, aquesta escissió és errònia, de manera que hi ha part del genoma del fag i part del genoma bacterià. Tot i això, es poden fer cicles replicatius, de manera que aquests virus defectius formaran les càpsida i seran altra vegada fags defectius que no podran fer un cicle lític normal. Se sap quina seqüència pertany al fag i quina al genoma bacterià, ja que no són exactament iguals. Les seqüències d'integració són part fag i part bacteriana.

Tenim el fag defectiu, que s'ha replicat en una cèl·lula i pot infectar una cèl·lula de nou, ja que té la càpsida. Poden passar dues coses: 1. Pot ser que hi hagi recombinació homòloga entre la part cromosòmica del fag defectiu i el cromosoma bacterià de la cèl·lula receptora, i així tindrem una transducció estable. També pot ser que el bacteriòfag defectiu s'integri al cromosoma, i es recombini la part bacteriana amb la part cromosòmica. Normalment, la part del fag es desintegra i queda la part bacteriana, que es recombinarà homòlogament. Si es torna a integrar i en aquell cromosoma bacterià ja hi ha un pròfag d'aquell virus (que té el pròfag normal i el defectiu), s'anomena transducció inestable, ja que els virus poden estar com a pròfags i escindir-se. Si això passa, una part serà normal i una altra serà defectuosa. Si hi ha replicació del virus es generaran moltes partícules transductores. El pròfag defectiu només pot integrar-se en el cromosoma bacterià si anteriorment ja hi havia aquell pròfag en aquell cromosoma. Com que la integració del pròfag és lloc-específica, es pot integrar en llocs híbrids; per tant, en els que ja continguin un pròfag es podrà hibridar, però si no, no, ja que no trobarà aquests punts.

-65-

Microbiologia I

Tema 5. Virologia

Formes acel·lulars: prions, virus i viroides.

CONCEPTES− Virió. Partícula vírica completa que representa la fase extracel·lular i infecciosa d'un virus.− Virus. Agent infecciós submicroscòpic, paràsit intracel·lular obligat, constituït per DNA o

RNA i envoltat per una coberta proteica (càpsida).− Bacteriòfag (fag). Virus que infecta bacteris (procariotes).− Cicle lític. Cicle vital dels virus que implica replicació i alliberament de nous virions per lisi

cel·lular.− Provirus (pròfag). Genoma d'un virus integrat en el cromosoma de la cèl·lula hoste que

serà replicat en totes les cèl·lules filles.− Cicle lisogen. Cicle víric no lític que comporta la integració del virus en el cromosoma

cel·lular com a provirus i que serà transmès a les successives generacions cel·lulars.− Viroide. Xicoteta molècula d'RNA monocatenari (ssRNA) circular que es replica dins de les

cèl·lules i que no adquireix cap embolcall (nua). No codifica per cap proteïna i únicament s'ha demostrat que infecta plantes. L'únic agent infecciós humà semblant és l'HDV (virus de l'hepatitis delta), però codifica per una proteïna i adquireix l'embolcall de l'HBV. El virus de l'hepatitits d s'aprofita d'infeccions anteriors pel virus de l'hepatitis b per aprofitar-ne l'embolcall. Així, el virus de l'hepatitis d estaria entre viroide i virus.

− Prions. Partícules proteiques infeccioses molt resistents i noimmunògenes. Plegament anòrmal de la proteïna PrP, reclutament, conversió autocatalítica i agregació. Se n'ha trobat en fongs i vertebrats. Exemples: encefalopatia espongiforme bovina o malaltia de les vaques boges, kuru (tribus de Nova Guinea), malaltia de Creutzfeldt-Jakob, tremolor ovina (scrapie). Afecten el sistema nerviós. Es formen plegaments incorrectes per factors que no es coneixen molt bé, però fent-ho de manera espontània i formant làmines beta. Això ja es considera prió. Els prions indueixen el plegament incorrecte de noves proteïnes i la formació d'agregats. És un procés lent. També pot ser adquirir per alimentació, de caire infecciós. Una altra possibilitat seria que la proteïna tingués alguna mutació que li causés un plegament incorrecte, ja bé fos per mutació esporàdica (en cèl·lules somàtiques) o bé hereditària (en cèl·lules germinals, tals com espermatozoides o òvuls). Els prions són difícils d'eliminar.

CARACTERÍSTIQUES DELS VIRUSEls bacteris, normalment, solen ser d'unes quantes micres; en canvi, els virus es tracten en escala nanomètrica. Els virus més grans, però, són tan grans com els bacteris més xicotets, de manera que no podem arribar a distingir-los únicament per la mida. Una característica important dels virus és que són acel·lulars.

− Són submicroscòpics (no poden veure's amb microscopis òptics).− No són retinguts per filtres bacterians (0.22 micròmetres).− No creixen en medis artificials, entesos com un conjunt de substàncies que nosaltres posem

en el medi (sí en cultius cel·lulars). Els virus necessiten parasitar una cèl·lula i infectar-la per multiplicar-se.

− Són paràsits intracel·lulars obligats (tot i que també hi ha bacteris que ho són, com Rickettsia i Chlamydia).

− Infecten qualsevol organisme viu (bacteris, arqueus, protozous, fongs, plantes, animals).

-66-

Microbiologia I

− No tenen DNA i RNA alhora.− Els genomes vírics no codifiquen per a sistemes de generació d'energia ni per la síntesi

proteica.− No tenen ribosomes.− Els virions es formen per acoblament de components preformats i no com un increment i

divisió de tots els seus components integrats.− No es divideixen per escissió binària.

ESTRUCTURA I COMPOSICIÓHIV. Té pràcticament tots els components. SU és superficial, TM és transmembrana. Aquest virus porta l'enzim de la transcriptasa inversa, que transforma el DNA a RNA. El genoma víric està format per dos RNA de polaritat positiva que no són forçosament idèntiques; són d'una única cadena. Un altre enzim que té és la integrasa (integració del virus en el cromosoma), entre d'altres. També hi ha proteïnes que formen la nucleocàpsida (càpsida que envolta l'àcid nucleic). Al voltant, englobant-ho tot, hi ha la càpsida. Hi ha una altra estructura proteica: la matriu. I, finalment, envoltant-ho tot, hi ha la membrana cel·lular, sobre la qual hi ha les glicoproteïnes (TM i SU). El conjunt de glicoproteïnes i la membrana és l'embolcall.

− Genoma: DNA o RNA, ss o ds, circular o lineal, segmentat o no segmentat.− Càpsida: codificada per a l'àcid nucleic i formada per autoacoblament.− +/- Matriu o tegument: capa per sota de l'embolcall.− +/- Embolcall: adquirit per gemmació de la membrana plasmàtica, nuclear o de l'aparell de

Golgi.− +/- Enzims: participen en la replicació vírica (RNA polimerasa RNA-dependent,

transcriptasa inversa -DNA pol RNA-dependent-) i altres processos.

+/- Vol dir que poden tenir-ne o no.

− Càpsida. Coberta proteica que envolta i protegeix l'àcid nucleic d'un virus.− Capsòmer. Unitat morfologia d'una càpsida, formada per una o més subunitats proteiques.− Encapsidació o empaquetament. Introducció del DNA o l'RNA víric en la seua càpsida.− Matriu o tegument. Coberta proteica que envolta la nucleocàpsida en alguns virus i que pot

estar associada o no a l'embolcall.− Embolcall. Membrana que envolta la nucleocàpsida d'alguns virus i que està formada per la

bicapa lipídica cel·lular i gligoproteïnes víriques.− Espícula. Glicoproteïna vírica que forma una protuberància.

FORMES ESTRUCTURALS− Helicoïdal nua.− Helicoïdal amb embolcall.− Icosaèdrica nua.

SIMETRIA HELICOÏDAL− Virus filamentosos.− Simetria determinada per l'estructura de l'àcid nucleic.− Monòmers d'una mateixa proteïna (bàsica). S'uneixen diferents subunitats de proteïnes per

formar la càpsida helicoïdal.

-67-

Microbiologia I

− Diàmetre d'uns 15-19 nm.− Longitud total d'uns 300-500 nm (depèn de la mida del genoma).

SIMETRIA ICOSAÈDRICAL'icosàedre és l'estructura simètrica amb major volum intern i menor energia lliure. A partir de diferents components, s'autoacoblen i formen una càpsida. Si volem que la càpsida englobi l'àcid nucleic, l'espai serà el just i necessari. Presenta triple simetria: simetria 5:3:2. El més senzill està format per 20 cares o triangles equilàters, amb 3 subunitats proteiques per cara (poden ser subunitats idèntiques o no, depenent del virus) i 12 vèrtexs o pentàmers (20x3=60 subunitats proteiques).

Aquesta càpsida no pot empaquetar la majoria dels genomes vírics. Cal fer els icosaedres més grans, però mantenint simetria 5:3:2. Llavors entra en joc el que es coneix com a triangulació (T), que és el nombre de triangles en què es pot subdividir (4). Nombre d'unitats estructurals per cara o nombre de triangles en què se subdivideix cadascun dels 20 triangles equilàters: 20x3xT subunitats proteiques (iguals o diferents). No tots els valors de T són viables perquè s'ha de conservar la simetria 5:3:2.

També es pot calcular d'una altra manera. 12X5=60. Si hi afegim hexàmers, hauríem de multiplicar el nombre d'hexàmers x6.

Capsòmers són tant hexàmers com pentàmers.

SIMETRIA COMPLEXA− No es coneix exactament el mecanisme de formació d'aquestes estructures.− Exemples: Poxviridae: virus de la verola, Vaccinia virus, Molluscum contagiosum virus.

BACTERIÒFAGS− Mida: llargària d'uns 24-200 nm.− Cap o càpsida: icosaèdrica o helicoïdal.− +/- Cua: tub buit per on passarà l'àcid nucleic durant la infecció. Puja i baixa per injectar el

material genètic.− +/- Beina contràctil.− +/- Placa basal amb una o més fibres buides implicades en la unió del fag a la cèl·lula

bacteriana.− Aquesta forma (cap, cua, beina i placa) mai pot ser un virus animal; sempre serà un

bacteriòfag.

CORBA DE CREIXEMENT EN UN ÚNIC PASSi fem un assaig per veure com es multiplica un virus virulent, trobaríem la corba de creixement en un únic pas. Hores després d'haver inoculat el virus (infectat les cèl·lules) trobaríem una quantitat determinada de virus en PFU/ml (PFU = Unitats Formadores de Clapes). Per fer l'assaig, inocularíem virus sobre un cultiu cel·lular i aniríem traient mostra per valorar la quantitat de virus que tenim. Hi ha 3 fases:

1. Període eclipse. Si traiem mostra i fem un recompte de virus, ens trobarem prop del 0. S'hi troben les primeres fases de multiplicació del virus (el virus ha d'entrar en contacte amb la cèl·lula, s'ha d'adsorbir, i després ha d'entrar al seu interior; seguidament, ha de perdre la càpsida, quedant l'àcid nucleic nu dins la cèl·lula; finalment, el genoma víric s'ha de

-68-

Microbiologia I

transcriure i replicar). En aquest període, el virus no és infectiu. S'ha de fer en una proporció entre 5/10 virus/cèl·lula per assegurar que totes s'infectin. Si en traiem una mostra i l'inoculem en un altre cultiu cel·lular, el virus no podrà infectar, ja que estarà entrant a la cèl·lula o començant amb la transcripció i traducció; no pot infectar fins que no s'ha format com a virió.

2. Període resta latent (virus infectiu). És un període intracel·lular en el qual el virus ja és infectiu; és a dir, s'ha format el virió, però no s'ha alliberat de la cèl·lula. Conforme passen les hores, a partir del període latent, el creixement és exponencial.

Cada pas pot variar entre un virus i un altre:1. Unió a la cèl·lula (adsorció).2. Entrada del virus (penetració).3. Pèrdua de l'embolcall (despullament o decapsidació).4. Transcripció i síntesi de les proteïnes víriques i replicació del genoma. Diferents models:

• S'adsorbeix la càpsida a la cèl·lula i entra l'àcid nucleic directament.• El primer que entra en contacte amb la cèl·lula són microproteïnes (protuberàncies de

l'embolcall). Hi hauria adsorció, després una fusió de l'embolcall amb la membrana cel·lular, de manera que la càpsida penetra perdent l'embolcall. Finalment, perd la càpsida.

• En comptes de fusionar-se, es forma un doble membrana entre l'embolcall i la membrana cel·lular, de manera que es forma una vesícula i acaba infectant el virus en forma de vesícula. Aquesta entrada s'anomena endocitosi. Un lisosoma contacta amb un endosoma i la baixada del pH produeix la decapsidació. També es pot produir sense embolcall.

5. Maduració i acoblament dels components. La maduració són les modificacions post-transcripcionals i post-traduccionals. L'acoblament és quan les diferents proteïnes que formen la càpsida s'ajunten i el genoma víric entra a l'interior de cada càpsida.

6. Alliberament dels virions. Entren a la fase extracel·lular.

La conseqüència d'una infecció vírica pot ser diferent (les primeres fases són semblants). Esquema:− Cicle lític (2): hi ha multiplicació de virus i s'alliberen els virions per lisi cel·lular.− Infecció latent: si el virus pot integrar-se com a pròfag o com a provirus de manera que la

infecció és latent o lisògena. No totes les infeccions latents (infecció latent: no hi ha producció de virus; el virus es queda a l'interior de la cèl·lula i hi ha un determinat moment en què es multiplica). S'integra en el cromosoma (provirus) o es queda en el citoplasma de la cèl·lula.

− Infecció persistent (3): producció contínua o intermitent de virus, però que en general no causa la mort cel·lular.

− Transformació. La infecció del virus causa la transformació, que és quan un virus causa canvis a una cèl·lula. Un dels canvis pot ser transformar una cèl·lula normal en tumoral.

Quan es produeix la multiplicació del virus:− Infecció persistent (línia blava): infecció persistent.− Infecció aguda: normalment no és una infecció lítica. És una infecció aguda, però que es

resol.− El virus simple de l'herpes és un virus latent, però que de tant en tant es reactiva.− Virus d'infecció lenta: primer hi ha una infecció aguda, a la qual respon el sistema

immunològic. Per exemple, el VIH, que també es pot integrar en els cromosomes de la cèl·lula. Aleshores, queda com una infecció latent que al cap d'uns anys es reactiva.

-69-

Microbiologia I

BACTERIÒFAGSTenen una forma pròpia. Poden fer cicle lític o lisogen. El lisogen pot ser induït i fer un cicle lític.

CLASSIFICACIÓ DE BALTIMOREÉs una classificació en base a la formació de l'mRNA. Parteix del genoma del virus.

1. Grup I. Virus de doble cadena de DNA, a partir de DNA es fa transcripció d'mRNA.2. Grup II. Monocadena de DNA de polaritat positiva. Primer cal completar la doble cadena i

després, a partir de la cadena de polaritat negativa sintetitzar l'mRNA.3. Grup III. Virus d'RNA. Si és de doble cadena, només cal copiar d'RNA a DNA. La

polimerasa és diferent (RNA polimerasa depenent d'RNA).4. Grup IV. Cadena d'RNA de polaritat positiva que sintetitzarà la cadena complementària

(negativa), que podrà actuar de motlle per a l'mRNA, que és de polaritat positiva.5. Grup V. RNA negatiu que pot actuar com a motlle.6. Grup VI. Són els retrovirus, amb transcriptasa inversa. Tenen RNA de polaritat positiva,

com el VIH, però per sintetitzar l'mRNA han de passar per DNA de doble cadena, que ha de ser sintetitzat pel virus.

7. Grup VII. Té doble cadena de DNA i actua de motlle per l'mRNA, com el grup I. Aquest cas, però, és el del virus de l'hepatitis B, que no es replica a partir de la doble cadena, sinó que ho fa a partir de l'RNA de polaritat positiva. Per tant, també té transcriptasa inversa.

TAXONOMIALa taxonomia actual funciona de manera semblant a la classificació dels éssers vius.

− Ordre (-virales).− Família (-viridae).

− Subfamília (-virinae).− Gènere (-virus).

− Espècies.− Soques.

En primer lloc separem segons àcid nucleic, després per la càpsida, seguidament segons l'embolcall i, en darrer lloc, pel genoma (propietats característiques: si és segmentat o no, doble cadena, lineal o circular...).

Els virus d'RNA muten més que els de DNA perquè la correcció de dades en la replicació fa que augmenti la probabilitat.

Es coneixen molts tipus diferents de bacteriòfags. Se n'han trobat amb una sola cadena de DNA, doble o, fins i tot, d'RNA, tant simples com dobles.

AÏLLAMENT I CULTIUHi ha diferents mecanismes:

− Inoculació d'animals d'experimentació.− Ous embrionats.− Cultius cel·lulars. És un sistema que té les seues pegues en el sentit que no tots els virus

s'han aconseguit cultivar i aïllar per aquest sistema. Exemples: virus de l'hepatitis B i C (HBV i HCV).

Una cèl·lula quan es diferencia ja no pot créixer més; per tant, si tenim un cultiu cel·lular d'aquesta

-70-

Microbiologia I

mena no ens serveix, sinó que hauria de ser un cultiu com el dels bacteris en què sempre en algun moment es poguessin multiplicar. Hi ha una excepció, que són les línies de cèl·lules tumorals. El que es fa és aïllar les cèl·lules tumorals humanes o animals i cultivar-les, ja que teòricament sempre estan creixent. Aleshores, el que s'ha de saber és quant de temps triga un cultiu en créixer un determinat nombre de cèl·lules, etc.Els cultius cel·lulars ens serveixen per a l'aïllament de virus, per al diagnòstic, per a la preparació de vacunes i per a la sensibilitat a antivirus.Per evitar una contaminació quan estem realitzant un cultiu, a part d'emprar tècniques asèptiques, també utilitzem antibiòtics, antisèptics i antifúngics per tal que l'asèpsia sigui completa.El microscopi òptic invertit serà l'utilitzat per a observar aquests cultius, ja que és com un microscopi normal, però amb l'objectiu a baix.

La línia cel·lular MDCK (epitelial, ronyó de gos) permet aïllar el virus de la grip i produir-ne vacunes. Cal conèixer molt bé quin virus volem trobar i amb base a quin cultiu cel·lular treballem en cada cas.

DETECCIÓ− Microscòpia electrònica.− Efectes citopàtics (CPE) en cultius cel·lulars. Veiem els efectes del virus sobre el cultiu.− Antígens vírics per a anticossos (ELISA, EIA, IC, IF).− Àcids nucleics vírics (hibridació, PCR, PCR-RT).− Serologia. Es detecten anticossos contra el virus a la sang.

EFECTES CITOPÀTICS (CPE) EN CULTIUS CEL·LULARS− Mort cel·lular: cèl·lules arrodonides i refringents (la llum del microscopi s'hi reflecteix),

pèrdua d'adherència (hi ha línies cel·lular que no tenen adherència i, per tant, cal fer-les en suspensió) agregació entre si, lisi...

− Formació de sincicis: són cèl·lules multinuclears. S'uneixen les membranes d'unes cèl·lules amb les altres, fusionant-se les cèl·lules.

− Canvis histològics: aparició de cossos d'inclusió.− Canvis a la superfície cel·lular: antígens vírics, hemoadsorció (unió a hematies).

ASSAIG EN PLACATenim plaques de TSA preparades i fem una suspensió del bacteri i una suspensió del bacteriòfag. L'agar tou és un agar de baixa concentració (0.3%). El mantenim a 50ºC i després i es barreja. Llavors ho passem tot en un medi nutritiu i ho escampem per tota la placa. Això permet que el bacteriòfag quedi retingut a l'agar i no pugui disseminar-se. S'incuba a la temperatura normal del bacteri i al cap de 24h-48h observem la placa.

No només podem cultivar i aïllar el bacteriòfag, sinó també fer un recompte del virus. Si hi ha molts virus, pot ser que estigui tota la placa lisada i no es vegi correctament el creixement bacterià.

DETECCIÓ D'ÀCIDS NUCLEICS PER PCREs pot fer una mescla de PCR amb els encebadors específics per a cada virus i buscar-los tots paral·lelament.

SEROLOGIAÉs la detecció d'anticossos contra el virus.

-71-

Microbiologia I

− Útil per a detectar virus que no creixen o ho fan malament en cultiu.− Per a detectar virus de curs lent.− Determinar si una infecció és recent.

ANTIVÍRICS− Paràsits intracel·lulars obligats. La majoria d'antivírics hauran d'entrar dins la cèl·lula

infectada. Són força tòxics en general.− Important que l'índex terapèutic sigui el més baix possible.− Els virus tenen diferents estratègies per replicar-se. No hi ha antivírics d'ampli espectre

per a cobrir-los.− S'han de buscar dianes pròpies del virus, però no sempre es coneixen.− Com que no hi ha antivírics d'ampli espectre, serà necessari un diagnòstic precís.− Hi ha pocs models cel·lulars i animals per a fer assaigs.− Es generen resistències força ràpid, sobretot en virus amb RNA.− Hi ha molt pocs antivírics quimioterapèutics.

DIANESPodem buscar les dianes terapèutiques del virus i, així, saber les etapes del seu cicle:

− Absorció.− Penetració.− Síntesi de macromolècules (proteïnes i àcids nucleics).− Acoblament.− Alliberament dels virus.

Exemples:− Inhibició de l'adsorció. Els pleconarils són inhibidors dels rinovirus. Els rinovirus

pertanyen a la família dels Picornauridae, que no tenen embolcall i amb càpsida icosaèdrica (60 units, 12 pentàmers). Aquests pentàmers estan formats per diverses proteïnes, com ara la VP-1. El pleconaril s'uneix a la cavitat de la VP-1, de manera que impedeix que s'hi uneixin receptors cel·lulars.

Un altre exemple és maraviroc, inhibidor de l'HIV. Aquest virus sí que té embolcall amb dues glicoproteïnes, una d'elles, la gp-120; aquesta està implicada en l'adsorció. La gp-120 s'ha d'unir a receptors CD4 dels limfòcits T i a un altre receptor. El maraviroc el que fa és unir-se al coreceptor, de manera que la gp-120 no pot acabar d'unir-se a la cèl·lula. Té efectes tòxics directes.

− Inhibició de la fusió. Quan la gp-120 s'ha unit al coreceptor, apareix la gp41, que apropa el virus a la cèl·lula i d'aquesta manera s'acaba fusionant amb la membrana. L'enfuvirtida s'uneix a la gp41 i inhibeix la fusió de l'HIV a la membrana cel·lular.

Un altre exemple és el palivizumab, anticòs anti-HRSV (virus sincític respiratori humà). Pertany a la mateixa família del xarampió. Aquest virus té embolcall. Un cop s'ha donat la recepció, en la fusió participa una altra proteïna.

− Inhibició de la pèrdua de l'embolcall. Amantadina és inhibidor del FLUAV (virus de la grip A), facilita la pèrdua de l'embolcall. Quan tenim l'endosoma format han d'entrar protons, el pH baixa i això provoca que s'alliberi la ribonucleoproteïna (RNP). La proteïna M2 és l'encarregada de generar un canal iònic que permeti l'entrada dels protons. L'amantadina el que fa és bloquejar el canal iònic que forma la proteïna M2. Per tant, si inhibim la pèrdua d'embolcall, el virus no podrà continuar fent el seu cicle, no podrà

-72-

Microbiologia I

replicar-se.− Inhibició de la síntesi dels àcids nucleics. Ànalegs de nucleòsids que inhibeixen la

replicació. Aciclovir és inhibidor de l'HSV (virus herpes simple).Hi ha altres exemples pel VIH. Un cas és la zidovudina (AZT; Azidotimidina), que inhibeix la transcriptasa inversa. És un anàleg de la timidina; quan la transcriptasa inversa estigui replicant d'RNA a DNA, podrà anar retrotranscrivint, però quan s'hi afegeixi l'anàleg s'aturarà la retrotranscripció.Un altre exemple són els no anàlegs de nucleòsids NNRTI. Inhibeixen directament la transcriptasa inversa (menys toxicitat que l'anterior, que afecta la transcriptasa inversa, enzim víric, etc.).També hi ha els inhibidors de proteases. Aquests s'uneixen al centre actiu de les proteases i, per tant, l'inactiven, no poden dur a terme la seva funció. En el cas de l'HIV talla les proteïnes a trossos per tal que no puguin madurar.

− Inhibició de l'alliberament dels virions. El virus de la grip està acabant el seu cicle, però necessita adquirir l'embolcall per tal de finalitzar el cicle infectiu, sinó adquireixen l'embolcall no són actius. Zanamivir i oseltamivir trenquen les unions formades per un receptor cel·lular, l'àcid ciàlic. En tallar l'àcid ciàlic, trenca la unió de la membrana i l'embolcall, a més d'evitar l'agregació dels virions.

-73-