protease alcalina

Tropical fish alkaline proteases as a laundry detergent additive

ESPÓSITO, T. S., 2006Recife-Brasil

PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL

Apresentação:Gleiciane Pinheiro e Mauren Silveira

ENZIMAS

ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL

Produção de enzimas de origem animal

Enzima Origem Extração UsoPancreatina Pâncreas de porco Adição de

etanolAuxiliar digestivo

Renina Suco gástrico do quarto estômago

do bezerro

Adição de ácido

Elaboração de queijos italianos;

Preparação de pudins.

Pepsina Mucosa do estômago de

porco

Ácido clorídrico

Auxiliar digestivo;_ Produção de hidrolisados protéicos.

Catalase Fígado e sangue de (boi e porco).

Adição de acetona

Degradação do peróxido de hidrogênio

PROCESSO GERAL DE EXTRAÇÃO ENZIMÁTICA

• Extraídas em solução aquosa antes de serem processadas.

• Tecidos são secos e triturados em partículas pequenas e finas

• Tecidos ainda úmidos são desintegrados (moinhos ou homogeneizadores)

• Materiais são então, extraídos com água ou solução tampão adequada

• Resíduos insolúveis removidos por filtração ou centrifugação (terra diatomácea é adicionada como auxiliar de filtração

do extrato ou da solução de enzima bruta).

PRINCIPAIS INDÚSTRIAS CONSUMIDORAS DE

ENZIMAS

CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS

PROTEASES

SUBCLASSIFICAÇÃO DAS ENDOPEPTIDASES

MODO DE AÇÃO DAS PROTEASES

DETERGENTES EM PÓ

pH 9.0-12.0

Aplicação enzimática em detergentes no Brasil:-Organon (1968)- Biopresto (Unilever)- Henkel – Viva (1978-1984)- Gessy lever: Omo (1989) – líder de mercado

Proteases:- Mais utilizadas em detergentes- Removem manchas de ovo, sangue, suor, extratos vegetais,...- Detergentes sem enzimas: ineficiente para remover manchas de proteínas.- Proteases Alcalinas:Possuem pH ótimo alcalino e atuam em temperatura elevada

VANTAGEM DA PROTEASE ALCALINA ANIMAL

• MANTÉM ESTÁVEL MESMO COM ALTAS CONCENTRAÇÕES DE H2O2 (10%)

• A ESTABILIDADE DAS OUTRAS REQUER ENGENHARIA GENÉTICA QUE AUMENTA CUSTOS

• H2O2 É O BRANQUEADOR

PROCESSO DE EXTRAÇÃO DA PROTEASE ALCALINA DE TAMBAQUI

EXTRATO BRUTO

45°C-30 min

CENTRÍFUGA 10 MIN 4°C

SOBRENADANTE300 mL

+ ETANOL 4°C

ETANOL:FRAÇÃO 1: 0-30%

FRAÇÃO 2: 30-70%

CENTRÍFUGA 15 min 4°CFRAÇÃO 1: + 75 mL de

tris HCl 0,1 M

pH 8.0 25°CFRAÇÃO 2: IDEM

+ 0,05 M tris HCl pH 8.0 2hr

2X

20 mg/ mL de vísceras

+0,9% NaCl

Centrífuga10 min 10°C

PURIFICAÇÃO

• Purificações baseadas no tamanho da molécula (centrifugação)

• Purificações fundamentadas nas diferenças de solubilidade (sal e/ou solventes)

• Purificações baseadas na carga elétrica ponto isoeletrico-

não reage e precipita

• Purificações fundamentadas na separação por adsorção seletiva (cromatografia de afinidade)

1: SDS-PAGE de Proteínas padrões 2: SDS-PAGE de Proteínas do extrato bruto 3: SDS-PAGE de Proteínas precipitadas com 30-70% de etanol 4: Extrato bruto ( atividade proteolítica na azo-caseína)5: Precipitado com etanol 30-70% (atividade proteolítica na azo-caseína)

66 kDa –

46 kDa –

36 kDa –

29 kDa –24 kDa –

14 kDa –

1 2 3 4 5

ATIVIDADE PROTEOLÍTICA

AZOCASEÍNA 1% + PROTEASE

SULFOAMIDA ALARANJADA

ESPECTROFOTOMETRIA 280-260 nm

TESTESAtividade

TotalProteína

Total (mg)Atividade

Específica U/mgPurificação

Rendimento (%)

Extrato Bruto 46,875 834 56.2 1.0 100.0

Extrato Bruto aquecido

44,574 623 71.6 1.3 95.1

F1(0-30% etanol 6,971 448 15.6 0.3 14.9

F2 (30-70%)etanol 35,114 481 73.0 1.3 74.9

Sobrenadante final

1,921 97 19.8 0.4 4.1

MODO DE AÇÃO DAS PROTEASES

EFEITO DE INIBIDORES

SustratoAtividade Enzimática

mU/mLBenzamidina TLCK PMSF TPCK

BapNA 1.59 100% 98% 54%

Suc-Phe-p-Nam

0.04 96% 100%

EFEITO DA TEMPERATURA

Em pH 8.0Temperatura (a)

Estabilidade Térmica (b)incubado 30 min 25°C e depois testada sua atividade proteolítica de 25°C-80°C

EFEITO DE pH

Ativid

ad

e R

es

idu

al

Protease precipitada com Etanol

0.1 M Fosfato

Tris-HCl

NaOH/Glicina

EFEITO DE SURFACTANTES E OXIDANTES

Surfactantes (1%) Atividade Residual %

Depois 30 min Depois 60 min

Saponina 117.5 118.4

Colato de Sódio 94.2 107.3

Tween 20 117.3 108.2

Tween 40 112.0 107.8

SDS 15.1 7.3

COMPATIBILIDADE

Tempo/hrA

tivid

ad

e R

es

idu

al

Surf®

Ala®

Bem-te-vi®

Omo Multi-Ação®

Incubação 0,2 mg/mL de Protease 40°C+ 7 mg/mL de:

INATIVAÇÃO EM H2O2

Tempo (min)A

tivid

ad

e R

es

idu

al

Enzima incubada a 40°C com H2O2 em:

5%

10%

15%

Curva de Inativação em H2O2

CONCLUSÕES

Protocolos de extração de Proteases Alcalinas de Tambaqui com etanol são econômicos quando em escala industrial;

São estáveis em surfactantes, com exceção do SDS; São estáveis na presença de altas concentrações de H2O2 sem

gastos com manipulação genética ou preparações enzimáticas prévias;

São compatíveis com vários tipos de detergentes em pó; Suportam altas temperaturas como as encontradas em máquinas

de lavar com ciclo programado; São extraídos de resíduos da indústria alimentícia, não requerendo

cuidados com meios e crescimento de biomassa; Retira da natureza um problema da indústria alimentícia.

OBRIGADA!