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-
Amigo
AG1{ADECIMENTOS
Ao Professor Dr.Srgio Miguel Zucas - Pessoa que
nos iniciou na vida acadmico-cientifica, a quem devemos o
lugar que hoje ocupamos.
Ao Professor Dr. Rui Curi Pela amizade nos
momentos mais dificeis, ateno, disponibilidade de seu
laboratrio, e sobretudo, pela orientao deste trabalho Bem
a qual no seria possivel sua execuo.
Ao professor Dr. Eduardo Kokubun
inestimvel pela discusso dos ~esultados e sugestes ao
trabalho.
Ao Marcos Barbosa Recco o amigo com quem
dividimos a autoria deste trabalho.
A Ivette de Almeida Dirani Pela ajuda
fundamental na coleta de dados.
Aos amigos do Laboratrio de Fisiologia Celular -
Pela discusso do trabalho e pelas "risadas" necessrias
para o desenvolvimento de um estudo srio.
-
l-INTRODUAO:
1.1 Fontes Energticas
No organismo, varias so as fontes energticas
existentes para atender a demanda metablica. Analisando o
complexo orgnico pela sua menor estrutura, -a clula,
veremos que esta, possui diversas vias produtoras de energia
para atender suas necessidades. A eficincia do organismo
torna-se evidente quando requisio energtica feita de
1
maneira rpida. Existe na clula pequenos estoques
energticos na forma de tri-fosfato de Adenosina (ATP). Esta
substncia ento fracionada, pela ao de enzimas (ATPase)
espalhadas pelo citoplasma celular(vide figura-i). A quebra
das ligaQes fosfato com a adenosina, promove a libera~o de
energia e a formao de dois compostos: difosfato de
Adenosina(ADP) e fosfato inorgnico. Esta situa~o permite
ao organismo imediata liberao energtica, porm com
pequeno rendimento; 1 moI de ATP fracionado rende 20.000
calorias (Junqueira & Carneiro 1987). Por sua vez, o ADP
pode ser ressintetizado a ATP pela degradao do comPqsto\
Creatina Fosfato (CP) que libera a energia necessria para
que um fosfato inorgnico seja incorporado ao difosfato de
Adenosina.
A ingesta alimentar promove libera~o de
nutrientes ao organismo. Por sua vez, estes chegam at as
Clulas onde ficam armazenados, para posterior fornecimento
de energia, como os carboidratos (estocados como glicognio)
-
e os lipideos(sob a forma de triglicerideos). Estes estoques
2
representam acmulo de energia sob forma estvel e
concentrada e acessvel em condies de jejum e de demanda
energtica aumentada. O rendimento energtico liquido da
degradao de um moI de glicose(gliclise) a dois d~
piruvato fornece, igualmente, 40.000 calorias. Porm, este
processo, denominado de gliclise anaerbica, gera
substratos para a usina celular(mitocondria). Os dois
moles de piruvato formados so ento degradados
completamente a C02 e H20, ge~ando por moI de glicose
aproximadamente 690.000 cal que corresponde a 36 moles de
ATP (Lehninger 1988).
A utilizao do piruvato como fonte energtica
ocorre no interior mitocondrial atravs da fosforilao
oxidativa. Neste processo participam como precursores
energticos no apenas os carboidratos mas tambm os cidos
graxos e os aminocidos. Pode-se dividir a fosforilao
oxidativa em trs etapas: l)produo de Acetil Coenzima A
(Acetil CoA) pela piruvato desidrogenase ou beta-oxidao
2)ciclo de Krebs e 3)sistema transportador de eltron~. O
ciclo de Krebs apresenta um rendimento final lquido de 2
moles de ATP e a cadeia de transporte de eletrons de 32
moles de ATP(Stryer 1988)(vide- figura-l).
/
-
Figura 1 - Vias de Fornecimento de Energia
0llC088
\
[iiJATPaS8
CITOPLASMA
,,"./
.... 2ATP
A.G.L.
CJ.J
-
.1.2-Tipos de Exercicio Fsico e Demanda Energtica
Durante a atividade fsica, as fontes energticas
utilizadas variam de acordo com a intensidade e durao do
4
esforo. Nos momentos iniciais do exerccio, ocorre
metabolizao das fontes energticas primrias ATP e CP. Com
o prosseguimento da atividade, passa a responder com maior
suprimento energtico a degradao dos carbo.idratos;
glicognio celular e glicose circulante (Hultman 1967). A
converso de um moI de glic05e circulante em 2 de piruvato
forma 2 de ATP, conforme j mencionado. Contudo, a converso
de 1 moI de glicose do glicognio a piruvato forma 3 de ATP,
pois esta g1icose no precisa ser fosforilada, resultando em
~conomifl. de 1 moI de ATP. Ef-lte pi. rllvato 8.0 Bel' convert i.eio
em acetil CoA, pela aco da piruvato desidrogenase, no
interior da matriz mitocondrial, d inicio ao processo
oxidativo final da glicose.
Como descrito anteriormente, a degradao da
glicose ou glicognio a piruvato no constitui forma
eficiente de produo de energia(ATP). Na fosforilao
oxlduLlvu, em fun80 dos processos aerbicos ocorre ~~ior\
utilizao dos cidos graxos livres (A.G.L.) (Ahlborg et aI
1974, Pirnay et a1 1977; Ravussin et aI 1979) que passam a
responder pelo maior aporte energtico nas atividades
fsicas de longa durao. Desta forma, as atividades de
longa durao e baixa intensidade utilizam a via aerbica
como principal fonte energAticA. Esta via possui como fonte
de substratos piruvato, aminocidos e cidos graxos livres
-
(Felig & Wahren 1975). Durante as atividades mais longas e
menos intensas, a degradao dos cidos graxos livres pela
Beta-oxidao preferivel pela maior eficincia na formao
de ATP (a degradao completa de um moI de palmitoil CoA at
C02 fornece 131 moles de ATP no total). A Beta-oxidao
ocorre no interior da mitocndria e fornece acetilCoA que,
atravs do ciclo de Krebs, libera C02. Entre os fatores que
controlam a utilizao dos cidos graxos, o transporte
. atravs da membrana mitocondrial de extrema importncia. A
carnitina atua ligando-se ao abilCoA formando o complexo
acil-carnitina. Com a ao da carnitina palmitoil
transferase, este complexo atravessa a membrana
mltocondrial(Rebouche & Paulson 1986). Assim, o fornecimento
reduzido de carnitina pode diminuir a utilizao de cidos
graxos pelos tecidos.
As atividades de curta durao e alta intensidade
apresentam, por sua vez, alteraes metablicas bem
distintas que as de longa durao e baixa intensidade.Nessas
atividades, a fonte energtica predominante a degradao
do glicognio muscular. O proceso glicolitico anaerbico, a\
via preferencial pela rapidez com que conseguem fornecer
energia e atender as solicitaes energticas imediatas da
clula muscular.
1.3-Diferenciaco dos TecJ.,ctos Musculares
Esquelticos.
Como citado por Keul et al(1972) j em 1678,
Lorenzini diferenciou as fibras musculares de coelhos em
-
brancas e vermelhas. Mais tarde, cerca de dois sculos aps,
Ranvier em 1873 e Grutzner em 1884, demonstraram que os
vertebrados possuem dois tipos extremos de fibras musculares
6
que foram denominadas de fibras musculares escuras(tnicas)
e plidas(fsicas). Estas apresentariam adaptaes
metablicas de acordo com o "treinamento" a que fossem
submetidos. Mais recentemente, Saltin et al (1977)
demonstraram existir trs tipos distintos de fibras
musculares. Estas fibras foram ento classificadas como:
l)fibra do tipo I(contrao - lenta), 2)fibra do tipo
IIA(contrao rpida oxidativa) , 3)fibra do tipo
IIB(contrao rpida - glicoltica). Saltin descreve ainda
as caracteristicas metRblicas especificas de cada uma como
demonstrado na tabela 1.
Como pode-se observar (vide tabela 1), as fibras
musculares do tipo I possuem caractersticas fundamentais
para a manuteno de esfros de longa durao e baixa
intensidade, devido a sua alta capacidade oxidativa e sua
baixa velocidade de contrao. Nessas as principais vias de
gt~ ru(..~u de enel'g.lu sto as decorrentes dos proce~SOB\
oxidativos mitocondriais. Desta forma, estas fibras possuem
grande capacidude de utilizar os cidos graxos livres devido
a sua elevada capilaridade e alto estoque de triglicerdeos.
De modo oposto, aS fi1::).ras do tipo IIE, que possuem uma alta
capacidade glicoltica e tambm alta velocidade de
contrao, PBt~n envnlvir1Rfl pm FI i". i v 1dw)eA de fllt.fI
intensidade e curta durao. A gliclise favorecida pela
-
alta capacidade glico11tica e alto estoque de glicognio. J
as fibras do tipo lIA possuem alta resposta adaptativa ao
esforo ou seja podem responder, quando solicitadas, de
modo semelhante s fibras do tipoI ou tipoIIB.
TABELA 1 -CARACTERISTICAS DAS FIBRAS MUSCULARES HUMANAS
7
Propriedade Tipo I TipoIIA TipoIIB
Velocidade de Lenta Rpida RpidaContrao
Capacidade Baixa tvloderacla AltaGlicolitica
Capacidade Alta Moderada BaixaOxidativa
Estoque de Moderado Moderado ModeradoGlicognio Alto Alto Alto
Estoque de Alto Moderado BaixoTriglicerideos
Capilaridade Boa Moderada Pobre
Modificado de Saltin et al(1977)
1.4-Fatores t1etabl iCQ.fLJlll.e-fte.S-ul..anL_AJ...adiBa-aQ
Exerccio Fisico '~""~. \
A fadiga ao exercicio pode ter sua ocorrncia em
vrios pontos do organismo. Segundo Edwards (1983), a fadiga
pode acontecer durante a atividade fsica a partir do
sistema nervoso central pela reduo da motivao e
consequente alterao no recrutamento das unidades motoras.
Na coluna espinhal pode ocorrer alterao da conduo dos
reflexos. J nas inervaes perifricas, a alterao na
-
conduo neuro-muscular provocaria no sarcolema modificao
do potencial de ao tendo como consequncia, desbalano de
NaT , KT e H20 no sistema tubular transverso. Ainda, a
alterao na excitao e a consequente modificao na
8
actina-miosina, nas pontes transversas e ne
ocorreriam -leses na
ativao e
implicados.
interao
no fornecimento de
Como resultado disto,
energia podem estar
sarc6meros, provocadas pelo calor, com consequente reduo
da fora. O efeito de todas estas alteraes levaria
instalao do estado de fadiga. - Desta forma, a fadiga pode
ocorrer como consequncia de eventos centrais e/ou
perifricos.
06 mecaniemOB perifricoB que levam fadiga foram
descritos por Sahlin (1986). Este autor descreve que a
reduo do pH intracelular causa reduo da glic6lise e
consequente diminuio da regenerao do ATP. Isto
provocaria aumento nas concentraes de ADP, reduo da
atividade da Na-K-ATPase, aumento da concentrao de KT
extracelular e finalmente fadiga muscular.
Percebe-se nitidamente' que o entendimento"'\dos
mecanismos causadores de fadiga bastante complexo. Estudos
de Bergstrom et aI (1967) e Hermansen et aI (1967)
demonstraram que possvel, atravs de manipulao
nutricional associada atividade fisica, aumentar a
quantidade de glicognio acumulada no msculo eBqueltico e
que este aumento causa elevao proporcional no tempo de
resistncia ao esforo. Esta manipulao nutricional
./
-
9
refere-se utilizao de dieta hiperproteica por periodo de
dois dias associada atividade fsica intensa e posterior
oferta de dieta rica em carboidratos por dois dias. O
intuito da primeira etapa, promover a reduo dos estoques
de glicognio muscular. Este fato, eleva a atividade da
enzima glicognio sintetase, que com a oferta aumentada de
glicose passa a sintetizar glicognio rapidamente. Isto
ocorre na segunda etapa quando os indivduos recebem a dieta
hiperglic1dica, com treinamento moderado. A resposta a esta
manobra nutricional e de atividade f1sica, a elevao dos
estoques de glicognio em aproximadamente 100%, com
proporcional elevao do tempo de resistncia ao esforo,
como j descrito anteriormente. Entretanto, os mecaniemoe
precisos que envolvem este efeito no foram esclarecidos.
Por exemplo, como o aumento do contedo de glicognio
muscular pode elevar a resistncia ao esforo se este no
a principal fonte energtica nas atividades fsicas de longa
durao? O contedo de glicognio muscular suficiente para
a manuteno de esforo moderado por aproximadamente 71
minutos (Newsholme & Leech 1988). Quais seriam, ento'\ os
mecanismos de utilizao do glicognio que garantiriam o
fornecimento energtico por longo perodo de atividade?
Como pode-se explicar os resultados obtidos por Lancha,
Bergstromproposta
Jr.et al(1986)
nutricional
que, utilizando
por
a mesma
et
manipulao
al(1967),
demonstraram que os teores de A.G.L. plasmticos esto
elevados aps dieta hiperglicdica, pr e ps-exerccio,
/
-
COlllPUl'itivi1111eIlLe iO(; va.1oreu du dieL hiperproteica? I:!: qUt~
10
isto ocorre Bem 8.1 terr.:iio da g.1 icemia (Simes et aI 1986)?
Se o aumento do glicognio muscular promove maior
resistncia ao esforo pela sua converso a acetil CoA,
porque ocorreria elevao dos nveis de A.G.L. quando da
dieta hiperglicidica?
1.5-AQQ.ectQs-Envolvidos na Euncionalidade do Ciclo
de_.Krebs no t1.llaQulo Egu.eltico ....
o glicognio degradado piruvato e este
posteriormente a acetil CoA. O acetil CoA condensa-se ao
oxaloacetato e forma citrato; reao catalisada pela citrato
sintase. O citrato, se no for metabolizado atravs do ciclo
de Krebs, inibe alostricamente a citrato sintase (Smith &
Williamson, 1971; Johnson & Hansford, 1975) e
fosfofrutoquinase (Underwood & Newsholme 1965; Dunaway &
Weber 1974; Tornheim & Lowenstein 1976; Newsholme et aI
1977; Uyeda 1979). Dessa forma, a gerao de citrato poderia
bloquear a utilizao de glicose e cidos graxos (Rennie &
Holloszy, 1977).\
O msculo esqueltico libera par a
corrente sangunea entre outras a glutamina que produzida
a partir de oxoglutarato (Newsholme & Leech 1988). Este fato
provoca o "escape" de metablitos do ciclo de Krebs e
aumenta o CCH1GUlllO dt~ citr'nl.o (vlt~ figur1-
-
12
A
importante no
cidos graxos
atividade da piruvato carboxilase no
msculo somente para a metabolizao dos
livres. J foi mencionado anteriormente que,
em vrios pontos do ciclo dos cidos tricarboxlicos, ocorre
escape" de seus produtos. Alm daqueles descritos outros
precisam ser mencionados. O citrato que pode permear a
membrana mitocondrial reagindo com a CoA e ATP no citossol;
catalisada pela citrato liase, formando acetil CoA. Este,
por sua vez, pode-se constituir em precursor da biossntese
de lpides. (ocorrncia pouco provvel durante o esforo).
Outro ponto de "escape" a converso de oxaloacetato
fosfoenolpiruvato (catalisada pela fosfoenolpiruvato
carboxiquinase) que, sob a ao da piruvato guinase, ser
convertido a piruvato (Curi 1988); e este alanina ou
lactato. Existe tambm o escape do ciclo de Krebs na
biossntese de glutamina conforme j mencionado. Esta
formada a partir do 2-oxoglutarato e da transaminao com
valina que forma o glutamato. Reagindo com a amonia, oriunda
da desaminao de leucina, o glutamato convertido
glutamina (Newsholme & Leech 1988). Este mecanismo atl'(ado
durante a atividade fsica de baixa intensidade e longa
durao (Rennie et aI 1981;Millward et aI 1982)
O sistema de lanadeira Aspartato/Malato
representa ponto de "escape" do ciclo de Krebs (vide figura-
2). Este mecanismo promove a remoo de aspartato e 2-
oxoglutarato do interior m\tocondrinl EHteH.
regio citoplasmtica, pela ao da
reagem, na
aspartato
-
aminotransferase dando origem ao oxaloacetato e glutamato. O
glutamato, por sua vez, permeia a membrana mitocondrial e
II
reage com o oxaloacetato,
aminotransferase, gerando
reiniciam o ciclo. O
novamente pela ao da aspartato
aspartato e 2-oxoglutarato que
oxaloacetato, formado na regio
citosslica, convertido a malato, pela ao da malato
deoidrogenase com consumo de NADH. O malato formado,
atravessa a membrana mitocondrial e novamente pela ao da
malato desidrogenase, convertido a oxaloacetato gerando
NADH. Este mecanismo considerado de extrema importncia
para a oxidao do NADH citoplasmtico(Crabtree & Newsholme
1972 Williamson et aI. 1973). Acreditamos,
particularmente, que este mecanismo deva ocorrer
principalmente durante o estado de recuperao da atividade
fsica. Entretanto, alguns autores sugerem sua ocorrncia
durante a atividade fsica de baixa intensidade (Wasserman
et aI 1986; Palma et aI 1989).
\\
-
Figura 2 - Lanadeira Aspartato - Malato
ndria
se
~rlalO
ato NAD~~
Ma/atoDesidrogenase
/ "aloacetato NADH~
,
Glutamato Glutamato
~ ~ar tato Aspart.'ansferase Amlnotran
" ~2-oxoglutarato 2-oxoglutarato
sma Mitoco
/Aspartato
Citopla
Am
NAD Malato
~Ms/ato
Desidro(/enase
/,NADH Oxaloacetat
~
,,/
;-,L::.,
tv1odificado de Newsholme and Leech 1988
-
Como consequncia dos escapes citados, a
atividade do ciclo de Krebs regulada pela quantidade de
seus prprios substratos. Assim, a partir do momento em que
ocorre reduo de seus substratos/produtos, sua velocidade
cai, diminuindo, com isto, o aporte energtico muscular de
origem oxidativa. Como consequncia, o mscu~ paSSB B
utilizar as fontes citoplasmticas para atender a demanda
energtica da atividade fisica., A produo de energia pelo
compartimento citoplasmtico basicamente representada pela
gliclise anaerbica gerando cido ltico. O cido ltico
formado dissocia-se em lactato e H+. O acmulo de H+ no
citoplasma celular e portanto a reduo do pH, inibe a
atividado da foafofrutoquinaae reduzindo a atividade da via
glico11tica. Este fato diminui o fornecimento energtico
celular provocando a interrupo da atividade fsica e
fadiga (Sahlin 1986). Para se opor a isto, seria necessria
a manuteno de grande quantidade de precursores metablicos
dos componentes do ciclo de Krebs. Como j mencionado
anteriormente, possvel que o glicognio alimente o
ciclo via converso de piruvato oxaloacetato. ~\\
2.HIPOTESE DO PRESENTE ESTUDO
15
de oxaloacetato (Newsholme
Os
precursores
aminocidos asparagina e aspartato so
e Leech 1988).
Possivelmerlte, o aumento no aporte desses aminocidos eleve
68 concentraes de oXBloBcetBto no interior da mitocondria.
Assim, haveria substrato suficiente para metabolizar o
-
grande volume de acetil CoA oriundo da oxidao dos A.G.L.
facilitada pela ao da carnitina. Reforando esta idia,
sabe-se que, os nveis de asparagina, aspartato e carnitina
circulantes so inferiores em ratos sedentrios quando
comparados com animais exercitados (Miller et aI 1987), o
que sugere estimulo da sntese destes no figado.Reforando
16
este raciocnio, temo-se (j'Lle os animais treinados e em
repouso possuem valores de asparagina, aspartato e carnitina
circulantes superiores aos seus pares treinados sacrificados
aps a atividade fsica (Miller et aI 1987).
A atividade da enzima aspartato aminotransferase,
que promove a sntese de oxaloacetato a partir de Bspartato,
estA aumentada no tecjdo muscular, quando fatores como
anmia e atividade fsica de longa durao esto presentes
(Ohira et aI 1987). Evidentemente, o aumento da atividade
das enzimas do sistema oxidatlvo, bem como da enzima
aspartato amiotransferase quando do estado anmico, difere
em muito da elevao provocada pela atividade fsica. Esta
caracteriza-se pela maior produo de ATP, via ciclo de
Krebs, 1Jara supr 11' a reduzida capac idade do si tema>, de\
transporte de eletrons, prejudicado a nvel de citocromo
pela ausncia de ferro (Johnson et aI, 1990). J durante a
atividade fisica, o aumento -das atividades das enzimas
oxidativas da-se pelo aumento da biogenese de mitocondrias
provocado pelos processos de esquemia e reperfuso
resu 1tanteR ciA (~ont rfl'o mURr" 1 'ir (Oh i rFl et, Fll
Johnson et aI 1990)
1:-:lR7 t~
-
~m vista das evidncias apresentadas, o
17
fornecimento suplementar de asparagina e aspartato deve
provocar aumento da quantidade de oxaloacetato no interior
mitocondrial, garantindo a alta atividade do ciclo de Krebs.
Por sua vez, o fornecimento adicional de carnitina
promoveria eleva~o no contedo intramitocondrial de acetil
CoA pelo aumento de transporte de A.G.L .. Assim, a
Bssocia~o destes fatores poderia contribuir para aumentar a
eficincia do sist.ema fornecedor de energia e
consequentemente da resistncia 60 esforo.
Para verificar se esta hiptese verdadeira, o
presente trabalho foi desenvolvido. o objetivo foi
determinar se a admini8tra~o cr6nica de uma solu~o
contendo carnitina, asparagina e aspartato promove maior
resistncia ao esforo de longa durao e baixa intensidade.
Os A.G.L. representam a mais importante fonte de energia no
exerccio de longa durao e baixa intensidade (Newsholme &
Start 1973). Entretanto, que fator'es limitariam a sua
nti lizao pe lo msculo, caufwncio exausto?
Alguns estudos realizados anteriormente tent~ram\
avaliar esta questo. Soop et aI (1988), trabalhando com
suplementao nutricional de carnitina (beta-hidroxy-gama-
trimetilaminobutirato), demonstraram que no ocorre melhoria
na performance nem alterao da fonte energtica utilizada
quando esta substncia administrada isoladamente. Da mesma
forma, Negro(1985) demonstrou n~o ocorrer aumento da
mobilizao de A.G.L. atravs da suplementao nutricional,
/
-
'lpp.rHlf:;. d(~ c,\t'nitin"I.l\nnim, , \ c; fi r n -i 1-, i n fi n i1 () f ()1'11 t-, (I r'
lR
limitante para a oxidao dos cidos graxos nessas
condies. Sahlin (1990) demonstrou que, em exerccios de
alta intensidade, o contedo muscular de acetilcarnitina
aumenta proporcionalmente com o aumento dos teores de
lactato e piruvato. Este fato sugere que a acetilcarnitina
desempenha o papel de "sequestrador" de acetil CoA (Harris
et aI 1987). Desta forma, a razo acetilcarnitina/carnitina
atuaria como reguladora das concentraes de acetilCoa/CoA
(Bieber 1988)
aumento no
. Pelos fatos apresentados, acredita-se que o
contedo de oxaloacetato no interior
mitocondrial, provocado pelo fornecimento suplementar de
seus precursores, promoveria elevao na atividade do ciclo
de Krebs. Esta aumentaria o consumo de acetil CoA. Assim o
fornecimento suplementar de carnitina com aspartato e
asparagina garantiria que o aporte de acetil CoA fosse
compatvel com a atividade elevada do ciclo de Krebs. Esta
a proposio dest;e estudo. As informaes bioqumicas
descritas esto apresentadas na figura 3.
-
GLICOONIO
BIOSSINTESE
DE LlPOEOS
I :>Vias citadas no texto
i
---~Vias da Proposico
CoTRATO c:=:::=;:>
OLUTAMINA
A.O.L.
CARNlffTINA
ASPARAGffNAASPARrATO
)
1 (P~~O~CETIL CoA
LACTATO~ ~ \ALANINA OXALOACETATO~
-
3-MATERIAL e METODOS
.3... 1 Animj s
Foram utilizados ratos machos albinos pesando 250g
20
provenientes do Instituto de Cincias Biomdicas - USP. Os
animais torlIl1 mantidos em grupos de cinco por gaiola (com
exceo dos animais da atividade espontnea) mantidos a
temperatura de 23C e pf~rlod(j c.l.aro/cucuro de l~Vl~horas. OB
animais foram alimentados com rao comercial (Nuvilab CR
I,Nuvital Nutrientes LTDA. Estrada da Ribeira 3001, Km 3,
Curitiba) de composio aproximda de 52% de carboidratos,
21% de proteinas e 4% de gorduras.
Os reagentes para a preparao dos tampes foram
obtidos da Reagen, So Paulo. Lactato Desidrogenase, NAD,
DTNB (5,5-Dithio-bis-2-nitrobenzoic acid), Triton X-I00,
Piruvato e Acetil CoA foram obtidos da Sigma Chemical, USA.
~ Suple~
-
experimentais: a) antes da natao para avaliar o efeito do
treinamento, b) aps uma hora de natao e c) no momento da
exausto.
~~A-H~tQ_~~dBnt~Q
Foram utilizados vinte animais, divid1dos em dois
grupos (C) e (S).Os dez animais de cada grupo foram
divididos em duas gaiolas. Cada gaiola(17cm de altura, 33cm
de largura e 44cm de comprimento) contendo cinco animais.
Estes animais foram mantidos nas condies experimentais
durante cinco semanas sem serem submetidos a treinamento,
apenas manuseados de modo semelhante aos animais treinados.
3.5 Atividade Espontnea
21
Os animais
gaiolas rotatrias
foram mantidos individualmente em
(Vieira et aI 1987) durante cinco
semanas. Esta condio permitiu ao animal desenvolver
atividade de baixa intensidade e durao prolongada.
;.LlLTrei~ll1.!.L~
Para adaptao ao meio liquido e ao sistema de
natao (Vieira et aI 1987), os animais foram exercitados
por cinco dias com sobrecargas crescentes at 5% do peso
corporal. Aps a primeira semana de adaptao, os animais
dos dois grupos(C e S) foram treinados por cinco semanas,
cinco dias por BAnlnno, dllrantA \1lnf\ h( )rA por c1la com a
sobrecarga de 5% do peso corporal. Os ratos treinados em
-
na taao fO!'lrnen1,ao l3lcr J f icac!os em repouso,
de nataQo e aps exausto. A natao foi
temperatura de 32C entre 11:00 e 13:00 horas.
22
aps uma hor.q
realizada na
;~ Determinaco do T~mpo de Ezausto
Foi considerado como exausto o animal que no
conseguia manter as narinas fora da gua. Neste momento, o
tempo de natao foi anotado e o animal sacrificado
imediatamente.
3...1LEr..Q.Q~l.i~t~.EZPJ~.r..1IDen.ta.l
Os animais foram sempre sacrificados entre 11:00 e
13:00 horaB (com exao dos animais do grupo exausto). O
sangue foi coletado para a determinao da glicose, cidos
graxos livres(A.G.L.) e lactato. O fgado, corao, e
msculos sleo e gastrocnmio(poro branca) foram removidos
para a determinao do glicognio e atividade mxima das
enzimas citrato sintase e piruvato carboxilase. Foi removido
o tecido adiposo epididimal para se estabelecer a relao da
massa adiposa com o peso corporal.
3.9 Tecido Adiposo Epididimal
O tecido adiposo" epididimal foi removido e
imediatamente pesado. Este tecido utilizado como indicador
do contedo total de lipides dos animais (Roclbell 1964). O
peso deste tecido foi dividido pelo peso corporal do animal,
-
obter o valor relativo em percentagem.
A glicose plasmtica foi determinada pelo mtodo
descrito por Dubowiski(1962), lactato pelo mtodo de Engle
e Jones(1978) e A.G.L. pelo mtodo de Falholt et .al(1973).
o glicognio muscular(sleo e gastrocnemio-poro
branca), heptico e cardaco foi extrado pela digesto dos
tecidos por 30 minutos em soluo de KOH 30% em banho
23
fervente. A extrao final foi obtida atravs da
precipitaQo com etano1 70% Am duas etapas. O glicognio foi
ento determinado com a mistura antrona e cido sulfrico
pelo mtodo descrito por Hassid e Abrahams(1957).
J.12 Atividades Mximas da Citrato Sntase e
Os tecidos (sleo, gastrocnemio, cardaco e
heptico) foram dissecados e congelados. Estes f~ram\
estocados em nitrognio lquido at as determinaes
enzimticas serem processadas. Os tecidos
-
foram entao homogeneizados utilizando equipamento
24
desenvolvido por Vieira et aI (1989). O meio de extrao
para a enzima citrato sintase(EC.4.1.3.7) consistiu de 50mM
de Tris-HCl e lmM de EDTA com pH final de 7.4. Para a enzima
piruvato carboxilase(E.C.6.4.1.1) o meio de extrao
consistiu de 50mM de Tris-HCl, 300mM de Sacarose e lmM de
EDTA com pH final de 7.4.
A mistura de ensaio para a citrato sintase
consistiu de: lOOmM de Tris-HCl, O,4mM de DTNB, Triton X-10a
1% e 15mM acetil CoA . A mistura de ensaio da piruvato
carboxilase consistia de: 400mM de Tris-HCl, lOOmM de
MgCI2, 4mM de DTNB, 50mM de ATP, 15mM de acetil CoA,200mM de
NaHC03, lOOmM de Creatino. fosfnLo e Triton X-100 1%.
A atividade mxima da citrato sintase foi
determinada baseada no fato de que a reao do acetil CoA
com o oxaloacetato forma citrato e CoA. O DTNB reage com a
CoA produzindo cor amarelada. A piruvato carboxilase foi
medida da seguinte maneira. A carboxilao do piruvato forma
oxaloacetato e este reage com acetil CoA, sob ao de
(~XCeABO de clLralo Binta8(~, tor'InB.ndo citrato e CoA. O~'l'NB
reage com a CoA dando cor amarelada. O complexo amarelo
formado pela reao do DTNB com a CoA absorvido em 412nm.
3.13 Anlise Estatstca
As diferenas estatsticas entre os grupos (C) e
(S) foram ca 1CII1 f:\OflA ut. i 1 i 7.l1nrln () 1,'1nt t rio St.lIdflnt p/H'H
p
-
4. Resultados
OB resultadoB que sero apresentados, esto ao
final deste captulo expressos sob a forma de grficos com
as mdias e devidas significncias o "Apndice" apresenta
os resultados em tabelas com as mdias, desvios padres e
significncias.
Os resultados
O"
4.1 Plasmticos
encontrados demonstram que a
glicemia dos animais submetidos as condies de: atividade
espontnea, treinados, natao~or uma hora e exausto, no
apresentaram diferenas significativas entre os grupos (C) e
(5). J os animais sedentrios do grupo (C) apresentaram
concentraes de glicose plasmticas maiores que o grupo
( 5) ( p
-
4.-. 2 GI i c
-
(p
-
28
treinauos, o gt'Upo (C) apresentou maior atividade desta
enzima em comparao ao c5) (p
-
aps natoo por umo hora e exaustos. J os animais
submetidos condio sedentria, o grupo (5) apresentou
L~9
maior peso relativo deste tecido
(p
-
Grfico 1 - Glicemia30
mo/lOOral180
100
140
120
100
80
00
40
20o
.........1. Allv.E ..-I_. Tlna"". " ...... 1 Ho.. E......_
'- - Control. ~ eupl....nt.o.o I
Grfico 2 - A.G.L...Eq/I
0.8
0.8
0.4
0.1
o ......... AUv .EopoIlta... Trw....... N.... 1H... 1__l-con11O.. !.\\\\l 8ujWmenme.o I
p
-
/
Grfico 4 - Glicognio Muscular.,..1IIDI~1OOm_..::.1I --,1.a
1.eUf.1
f
0..o.e0.40.1
o..... 1H...
I
1_ c-... L\\\1 -...... IrzJ c........ 111 .'-o _
."
31
........ ,.0.0.
Grfico 5 - GlicognioHeptico e Cardaco
1.:._=.=-....._:.:...... =_.:--"".--.:.:_:.....- ....1........ ,.0.0,
-
Grfico 6 - Citrato SintaseMuscular
ul1lOl/gl..ln.12-,----------------------,
10
8
8
..2
o........10 Allv.E......'-. T......... N...... 1 Ho.. E_1ao
32
_ Co.tr .
IE3 Co."''' &ui ...f'.\\'IJ 1.80..0lZ!lI 1........ I
Grfico 7 - atrato SintaseFgado e Corao
ul'IOI/gI..ln.80-,--=---=------------------,,--,
80
20
10
o
,_ Co Plgado
c:J Co Co_
p
-
Grfico 8 - Piruvato CarboxilaseMuscular
umollll/mkl.0.15 .....---==--------------------,
33
0..
0.3
0.2
0.1
o......... Alh.E.po....... r.......... N....... 1 Hor. E_tao
1
_ C_trola a..oO C_I..... eM"".
"'0.0-" ...0.01
lI\\\'l "Fila _.L _.
Grfico 9 - Piruvato CarboxilaseFgado e Corao
1-iU
.;.:mo:..:...II:...:":..-II_kl_,----------------,
o.a
o.e
0.4
0.2
o
1I\\\'l ..... LCor ...
-"'\
p
-
Grfico 10- Tecido AdiposoEpididimal
"1.6.----;=:=:::;;----------------~1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
o
34
SedentrIo TreInados Natao 1 Hora Exausto
p
-
35
.Q.--LJ:J.I:llQ.Q._...h.S-eden t r i o
5 ..l.l Detel'JJJina{')es Plasmticas
Como observado no captulo anterior, o grupo (5)
apresentou maior concentrao plasmtica de A.G.L. e lactato
e menor de glicose que o grupo CC). Este fato sugere
aumento da utiliza~o dos A.G.L. pelos animais que .receberam
a suplementao. E sabido, que B glicose circulante
aumentada, reduz a utilizao dos A.G.L.(Bagby et aI. 1978).
Este fato demonstra que os animais que receberam aspartato,
asparagina e carnitina apresentaram maior consumo de A.G.L.
que o grupo (C). A utilizao de piruvato pela via oxidativa
regulada pelo contedo de acetil CoA celular, pois este
inibe a enzima piruvato desidrogenase (Newsholme & Leech
1988). A elevao plasmtica dos A.G.L. indica grande
utilizao deste no fornecimento energtico. Estes
resultados sugerem que, devido ao grande aporte de acetil
CoA 01' lunda dOf:l A. G. L. nOtl anJnw.lf:l do grupo (S), a piruvato
desidrogenase foi inibida, favorecendo a formao de lactato
que se apresentou em concentraes elevadas no plasm~ do
grupo (5) (vide tabela 2).
5.1.2 Glicognio
5.1.2.1 Muscular Esqueltico
OR remI1tados fmcontrad0s de glicognio muscular
demonstram que os animais do grupo (S) apresentaram maior
tecidos (gastrocnmio e s61eo). A diferen~a em favor do
-
grupo (5) tu L da ordem de 160% para () msculo sleo e de 20A~
36
para o gastrocnmio. Esta diferena observada entre os
tecidos nos animais do grupo (5) e justifica-se por ser o
sleo composto de fibras do tipo revide tabela 1) e
consequentemente alvo mais efetivo para a ao dos
aminocidos e carnitina suplementados. Este -aumento no
contedo de gJicognio refora a hiptese levantada no item
anterior de maior consumo de A.G.L e reduo da gliclise.
Na condio sedentria, sabe-se que a principal via
energtica utilizada a oxidativa (Passmore & Eastwood
1986). Isto favorece a utilizao dos A.G.L. nesta condio.
o aumento no contedo de acetil CoA reduz a quebra de
glicognio. Este fato foi demonstrado por Stanko et aI
(1990) que suplementaram a alimentao de atletas com
precursores de acetil CoA e verificaram aumento do contedo
de glicognio muscular. Assim, acredita-se que o aumento na
utilizao de A.G.L tenha, nos animais do grupo (S), elevado
o contedo de acetil CoA inibindo a degradao do glicognio
muscular para este fim. (vide tabela 3).
5.1.2.2 Cardaco e Heptico \\
Nos tecidos cardiaco e heptico no foi observada
diferena no contedo de glicognio entre os grupos. O
tecido cardiaco utiliza predominantemente os A.G.L. para o
fornecimento enrgtico. Nos animais suplementados a
utilizao dos A.G.L. pelo corao foi provavelmente
elevada, reduzindo o consumo de lactato por esse tecido
causando tambm aumento na concentrao de lactato
-
37
plamnfttlco nf':U Lf:~ grupo. E sabido que o corao constitui um
dos principais orgos que utilizam lactato circulante para o
fornecimento de energia. Este orgo possui a enzima lactato
desidrogenase sob a forma de sua isoenzima H, que converte o
lactato piruvato para posterior oxidao (Kaplan & Everse
1972). Com o aumento da utilizao dos A.G.L. nas clulas
cardiacas nos animais do grupo (5), o consumo de lactato
como fonte de acetil CoA ficaria inibido. Dest~ forma, o
lactato circulante estaria ainda mais elevado e, no interior
oxaloacetato, pela
celular, restaria
fornecimento de
a sua possivel utilizao
ao da
para o
piruvato
carboxilase nos tecidos oxidativos.
5.1.3 Atividade Enzimtica
5.1.3.1 Muscular Esqueltico
No foi observada diferena significativa entre os
grupos na atividade mxima da citrato sintase nos tecidos
musculares dos animais sedentrios(vide tabela 5) .
Provavelmente, o estado sedentrio no tenha induzido
alteraes quantitativas do sistema oxidativo nas cl~las
musculares. Entretanto, a atividade da enzima piruvato
carboxilase apresentou-se elevada em 80% no msculo sleo
dos animais do grupo (5) em ~omparao ao grupo (C)(Tabela
7). Este fato refora a hiptese levantada no item 5.1.2.2
onde pressupe-se gue o lactato formado no interior das
clulas de capacidade oxidativa elevada, foi possivelmente
./
-
utlizado para a sintese de oxaloacetato, pois o fornecimento
de acetilCoA deve ter sido suprido pelo aporte de A.G.L ..
38
5.1.3.2 Heptico e Cardiaco A atividade da
enzima citrato sintase apresentou-se reduzida no tecido
heptico dos animais do grupo (6). Acredita-se que isto
ocorreu pela reduo, observada, da piruvato carboxilase
para o mesmo tecido destes animaiA(tabelas 6 e 8). Os
resultados das atividades enzimticas para o tecido cardiaco
confirmam a hiptese levantada nos itens anteriores. A
enzima citrato sintase ap-r-esentou-se elevada, em
aproximadamente 60% no corao dos animais do grupo (6), em
comparao com o grupo (C)(Tabela 6). Este fato, juntamente
com a atividade aumentada da piruvato carboxilaee em
52%(Tabela 8), tambm no grupo(S), sugerem que os animais
deste grupo passaram a metabolizar acentuadamente os A.G.L.
como fonte de acetil CoA, deslocando assim o piruvato para a
sintese de oxaloacetato. A enzima piruvato carboxilase
estimulada pelo aumento de piruvato e de acetil CoA
(Newsholme & Start 1976). Desta forma, pode-se acreditar que
o fornecimento suplementar de asparagina, asparta'tp e\
carnitina tenha sido eficiente no fornecimento de
oxaloacetato garantindo o aumento da atividade da citrato
sintase nestes animais. Por sua vez, o maior aporte de
acetil CoA, favorecido pelo consumo de A.G.L., bem como a
disponibilidade de piruvato celula cardiaca, favoreceriam
o aumento da atividade da enzima piruvato carboxilase
encontrada neste tecido. Estes fatos conflitam-se com os
-
39
relatos de Randle et aI (1963) e Randle (1981).Estes autores
sugeriram que, com o aumento do consumo de A.G.L., ocorre
reduo da utilizao dos carboidratos(glicose e glicognio)
pela clula cardaca. Se neste caso isto ocorresse, seria de
se esperar que o contedo de glicognio estivesse mais
elevado no corao dos animais do grupo (S), o~ue no foi
observado em nossos resultados(Tabela 4). Acredita-se que o
aumento no consumo de A.G.L. pela clula cardaca, faz com
que ocorra elevao no contedo de acetil CoA, provocando
inibio da atividade da enzma piruvato desidrogenase
(Newsholme & Leach 1988), causando acmulo de piruvato.
Estes dois fatores, como j mencionado, promovem o estmulo
da enzima piruvato carboxilase, garantindo a elevao da
atividade da citrato sintase pela formao de oxaloacetato.
Desta maneira, o ciclo glicose-cidos graxos teria a sua
funcionalidade alterada quando o suprimento de oxaloacetato
para a clula estivesse elevado como no grupo (S). O maior
aporte de oxaloacetato remove acetil CoA com mais eficincia
e reduz o efeito inibitrio sobre a piruvato desidrogenase
Assim, como conseqncia, ocorre degradao de A)O.L.\
juntamente com a glicidica, provocando fornecimento
suplementar de energia pelo ciclo dos cidos
tricarboxilicos. Isto faz com que aumente as concentraes
de precursores para os "escapes" deste ciclo. Na condio
sedentria isto poderia ocorrer, por exemplo, no sentido da
biossintesB de lipides.
/'
-
:5.1.4 Tecido Adiposo '/!'pididilllal
40
o peso relativo do tecido adiposo
epididimal(Tabela-9) encontrados nos animais sedentrios,
apresentou-se 20% superior nos animais do grupo (S) em
comparao com (C). Este fato refora a idia levantada no
item anterior de que, pelo aumento das atividadeSo/da citrato
sintase(Tabela 6) e piruvato carboxilase(Tabela 8) no
corao dos animais do grupo (S), estes animais estariam
metabolizando conjuntamente A.G.L. (elevado no plasma dos
animais dOI grupo (S e glicognio, gerando maior produo
energtica e de precursores para sntese de outros
metablitos como os triglicerdeos do tecido adiposo.
~~tiyidddU-EBpQntnea
5.2.1 Dete!~inaes Plasmticas
Os resultados obtidos das dosagens de lactato,
A.G.L. e glicose mostraram-se semelhantes nos grupos (C) e
(S)(Tabela 2). A atividade fsica de intensidade moderada a
elevada (50 a 70% V02max.)promove euglicemia, no ocorrendo
o mesmo com os A. G. L. (Weber e't al 1990) . Desta f'x;-ma,\
quando os animais foram submetidos a atividade fsica, a
glicemia alterada do estado sedentrio tornou-se semelhante
entre os grupos (C) e (S). Este fato deve ter contribuido
para os resultados de lactato e A.G.L. encontrados.
5.2.2 Gllcognio
5.2.2.1 Muscular O contedo de glicognio
muscular no apresentou diferena significativa entre os
-
animais dos grupo (C) e (S) no msculo sleo(Tabela 3). No
msculo gastrocnemio, entretanto, o glicognio apresentou-se
elevado em 170% aproximadamente nos animais do grupo (S), em
comparao aos do grupo (C)(Tabela 3). Esta elevao pode
ser entendida por ser a atividade espontnea mobilizadora
das vias oxidativas. Isto promoveria maior atividade do
ciclo de Krebs e conseguentemente maior produo d~ citrato
41
e ATP pelas clulas musculares. Como j discutido
anteriormente, o aumento de citrato e ATP, promoveria
inibio da enzima chave da glrclise; EEK. Esta inibio
provocaria diminuio da degradao glicdica e,
consequentemente, aumento dos estoques de glicognio.
Segundo Saltin (1977) os msculos compostos de fibras do
tipo IIE (como o gastrocnmio poro branca) possuem maior
capacidade para a sntese de glicognio e seriam menos
exigidos nesse tipo de esforo fsico. Assim, seria de se
esperar que neste tecido, o aumento da atividade oxidativa
produtora de citrato, causasse a resposta inibitria da
degradao glicdica. Esta proposio foi comprovada pelos
resu 1 tados encontrados ('l'abe lH ~3). '\
5.2.2.2 - Heptico e Cardaco - O contedo de
glicognio heptico foi semelhante nos dois grupos(Tabela
4). J, no msculo cardiaco, os animais do grupo (C)
tiveram o contedo de glicognio elevado em 116% comparado
ao grupo (S)(Tabe1a 4). Pode-se analiBr estes resultados da
seguinte maneira. Os animais do grupo (S) possuam maior
/'
-
42
fornecimentu de Rubstratos para a slnteee de oxaloacetftto.
Com o conte0do de oxaloacetato elevado, o ciclo de Krebs
garantida pelo aumento
mitocondrial, devido ao
possui condies
atividade(Rowan &
das concentraes
favorveis para
Newsholme 1979),
de acetil CoA
o aumento de sua
efeito da carnitina, que favoreceria a beta-oxidao dos
cidos graxos. O aumento do contedo de acetil CoA passaria
a atuar como ativador da via de sntese de oxaloacetato pela
enzima piruvato carboxilase(Newsholme & Leech 1988). Pode-se
ento concluir que a reduo dos estoques de glicognio no
msculo cardaco deve-se possivelmente ao intenso "escape"
de piruvato para formar oxaloacetato, exigido pelo tecido,
na manuteno de alta atividade do ciclo de Krebs. Este fato
confirma a hiptese levantada no tem 5.1.3.2 onde se
discute a operacionalidade do modelo proposto por Randle et
aI (1963) e Randle (1981) para o ciclo glicose-cidos
graxos, que causaria inibio da degradao de glicognio
quando o COnfH.lmO de cidos graxos estivesse elevado.
5.2 . .) Atividade Enzm":it;ictl
5.2.3.1 Muscular - A atividade da enzima citrato
sintase apresentou-se 36% superior nos animais do grupo (5)
em comparao com os animais do grupo (C) no msculu
sleo(Tabela 5). No msculo gastrocnmjo, este aumento foi
da ordem de 24% em favor dos animais do grupo (5)(Tabela 5).
Os dados demonstram estar correta a hiptese levantada no
tem 5.1.3.1 onde se afirma que a semelhana na atividade
./
-
43
enzimtica entre os grupos deve-se pela no existncia de
estimulos externos(atividade fsica) suficientes para
aumentar a atividade oxidativa. Nos animais da atividade
espontnea, o aumento verificado demonstra que, quando a
atividade motora torna-se efetiva, ocorre a mobilizao dos
aminocidos para a ativao do c1(:10 de KrebB~'A atividade
fsica de baixa intensidade e longa durao promove aumento
da atividade das enzimas oxidativas bem como da enzima
aspartato aminotransferase responsvel pela sntese de
oxaloacetato a partir de aspartato (Cadefau et aI 1990). No
msculo gastrocnmio, o aumento da atividade da citrato
sintase nos animais do grupo (S)(Tabela 5) confirma a
hiptese de que a produo de citrato e inibio da via
glicolitica, justificaria a elevao do glicognio neste
tecidos.
J a enzima piruvato carboxilase apresentou-se
semelhante em ambos os grupos(Tabela 6). Provavelmente, o
aporte energtico exigido, pela atividade imposta, no
exigiu, destes tecidos, maior quantidade de oxaloacetto
oriundo de gJicose.
5.2.3.2 Cardaco e Heptico - No tecido heptico,
a atividade da enzima piruvatb carboxilase foi semelhante em
ambos os grupos(Tabela 8). Provavelmente pelo fato de que a
atividade fisica imposta no foi. suficiente para estimular a
formao de oxaloacetato a parti 1:' eis pi ruvat,o neste tec ido.
Nos animais do grupo (S), provavelmente ocorreu elevao no
-
contedo de oxaloacetato, pela converso a partir de
44
piruvato alm da produo deste pela desaminao da
asparagina e aspartato suplementado. Assim, o contedo
aumentado deste intermedirio do ciclo de Krebs estimularia
a atividade oxidativa.
No msculo cardaco, a atividade da enzima
piruvato carboxilase apresentou-se reduzida em 560% nos
animais do grupo (C) em relao ao grupo (S)(Tabela 8). Este
fato refora a hiptese levantada anteriormente de que, o
fornecimento adicional de precu~sores de oxaloacetato iriam
estimular a degradao das fontes energticas(A.G.L. e
Glicognio), confirmada pela reduo do glicognio cardiaco
(Tabela 4), aumentando assim o contedo de acetil CoA
disponvel na mitocondria. O aumento da acetil CoA eleva a
relao acetil CoA/CoA que por sua vez inibiria a atividade
da piruvato desidrogenase (Newsholme e Leech 1988). O
aumento de acetil CoA, bem como a disponibilidade de
piruvato, estimulariam a atividade da piruvato
carboxilase(Tabela 8), que, reciprocamente, estimulariam a
reao catalisada pela citrato sintase que apresent'lt-se\
elevada em 34% no fgado e 63% no corao dos animais do
grupo (S), em comparao ao (C)(Tabela 6).
5.3 Treinados
Este grupo difere dos demais exercitados(atividade
espontnea, natao por uma hora e exausto) por ter sido
sacrificado durante o periodo de recuperao, ou seja,
-
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o\
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P+P
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8)
-
5. ,:J. 2 Glicognio
5.3.2.1 Muscular Esqueltico o contedo de
47
glicognio muscular no apresentou diferena entre (S) e (C)
em ambos os tecidos nos animais treinados(Tabela 3). O
estado de recuperao da atividade motora no causou a
mobilizao deste.
5.3.2.2 Cardiaco e Heptico o contedo deglicognio heptico no apresentou diferena entre os grupos
(5) e (C).(Tabela 4) Esta ocorrncia pode ser devida
atuao dos aminocidos suplementados no ciclo dos
nucleotldeos, tornando a disponibilidade destes, para o
sistema oxidativo, semelhante nos dois grupos. J o
glicognio cardiaco, apresentou-se reduzido em 142% nos
animais do grupo (5) em comparao ao grupo (C)(Tabela 4). E
sabido que, o tecido muscular cardiaco possui alta atividade
oxidativa. Desta forma pode-se acreditar que a ocorrncia do
deslocamento dos aminocidos suplementados para o ciclo dos
nucleotideos ou sistema de lanadeira aspartato/malato
provocaria, drstica reduo do contedo de oxaloacetato
para o grupo (S). Este sistema, promoveria ainda, aumen,o de
NAD reduzido no interior mitocondrial(vide figura 2). A
converso de piruvato a acetil CoA dependente de NAD
oxidado(Garland & Randle 1964 e Tsai et al 1973) . Assim
pode-se entender que os animais (S) passaram a utilizar
efetivamente as fontes citoplasmticas para o fornecimento
de energia palo, 8. formaeo dA ncetLL CoA oriundo de gli.cOEH':l
estava reduzida pela maior concentrao de NADH no interior
-
mitocondrial. Este sistema atuaria reduzindo a concentrao
de oxaloacetatomitocondrial e consequentemente a capacidade
de consumo de acetil CoA oriundo de A.G.L. resultando em
intensa degradao do glicognio cardaco.
5.3.3 Atividade Ilnzil11tica
5.3.3.1 Muscular Esqueltica - A enzima citrato
sintase apresentou atividade semelhante em ambos os grupos
no msculo gastrocnmio(Tabela 5), isto pode ser devido ao
48
envolvimento dos aminocidos - suplementados, como j
comentado, no ciclo dos nucleotideos, mais evidente nas
fibras do tipo IIE. A diferena de 30% na atividade da
citrato sintese nos animais do grupo (C) em comparao ao
grupo (S), no msculo sleo, pode ter ocorrido pela
quantidade aumentada de citrato formado e consequente
inibio desta enzima por acmulo de produto da reao de
condensao(Rowan & Newsholme 1979) (vide tabela 5).
Outra hiptese o desvio ocorrido em ambos os
msculos do grupo (S) dos aminocidos suplementados para o
hipteee tem-se que o
aietema lanudeira aSpal'tHtO/lmdl.:l to. Reforando'",eta
aumento substancial da atividade da
enzima piruvato carboxilase no msculo sleo(242%) e no
gastrocnmio(260%) nos animais do grupo (S) (Tabela 7). Isto
sugere a necessidade do msculo em sintetizar oxaloacetato a
partir de piruvato, provavelmente para compensar a reduo
do contedo de aspartato B aspRrRginR diponjvel para este
fim.
"
-
5.3.3.2 Heptica e Cardiaca
49
A atividade da
enzima piruvato carboxilase no foi diferente entre os
grupos no tecido heptico(Tabela 8). J no tecido cardaco,
esta enzima apresentou sua atividade reduzida em 43% no
grupo (S), em compara~o ao grupo (C)(Tabela 8). Este fato,
juntamente com a atividade reduzida da citrato sintase neste
grupo, ft'.lvurec(~u a pu::wibi J idade dE~ que o msculo cardiaco
mobilizaria o glicognio como fonte energtica no estado de
repouso.
.5 .4 ..N.at~o._IJmf.LH.o.r..a
5.4.1 Medidas Plasmticas
Os animais treinados submetidos a natao por uma
hora e sacrificados aps o esforo tiveram os resultados de
A.G.L., glicose e lactato, semelhantes, no apresentando
diferenas significativas entre os grupos (5) e (C)(Tabela
2) . Nota-se com estes resultados que -os animais que
receberam a suplementao tiveram a concentrao de lactato
circulante semelhante ao dos animais do grupo controle~ No\
item 5.3.1 foi discutido o contedo de lactato elevado nos
animais treinados do grupo (S) comparado ao grupo (C)(Tabela
2) . A concentrao elevada tJe lactato no grupo (C), nos
animais treinados em repouso, desapareceu quando estes foram
submetidos natao por uma hora(Tabela 2). Por sua vez,
no ocorreu alterao da concentrao plasmtica de lactato
nos animais do grupo (S), do estado de repouso para o
-
5.4.3 Atividade l!.!lzi111tica
5.4.3.1 Muscular - A atividade da enzima citrato
sintase apresentou-se similar, para o msculo gastrocnmio,
51
em ambos os grupos de animais treinados e, sacrificados aps
uma hora de atividade tisica(Tabela 5). O mesmo fal
verificado para a atividade da piruvato carboxilase no
msculo sJeo onde, nao foi encontrada diferew;a
significativa para os dois grupos (S) e (C)(Tabela 7). J no
msculo gastrocnmio, a enzima piruvato carboxilase
apresentou'atividade 56% superiDr nos animais do grupo (S)
em comparao ao (C)(Tabela 7). Apesar dos valores
encontrados nos animais suplementados serem superiores,
nota-se elevao de 220% na atividade desta enzima no (C),
quando comparados aos animais treinados do mesmo grupo,
contra a elevao de apenas 38% para os animais (S),
comparados a seus pares treinados (Tabela 7). Este fate
demonstra que o tecido em questo, nos animais do grupo (S),
metabolizou acenduadamente os aminocidos suplementados para
a sintese de oxaloacetato, limitando a sua sintese a partir
de glicose e atravs da piruvato carboxilase. J a\
atividade da enzima citrato sntase no msculo sleo
apresentou-se 35% superior nos animais do grupo (C) em
comparao ao grupo (S)(Tabela 5). Este fato mantm a
diferena observada no msculo sleo para a citrato sintase
nos animais treinados, Como demonstrado na tabela 7, os
anima1E] do grupo (C), APf~ urnA hOT'F1 dA nAr,fH;o, I1UlTlP,ntArFtrIl
em 214% a atividade da enzima piruvato carboxilase. Este
-
fato no ocorreu nos animais do grupo (S) que apresentaram a
52
mesma atividade em ambos os casos(Tabela 7). Desta maneira,
acredita-se que a natao por uma hora no tenha solicitado,
do msculo sleo, aumento da atividade oxidativa em ambos os
grupos, quando comparados com os animais treinados.
Entretanto, nota-se, um aumento da atividade >da piruvato
carboxilas8, guarida compara-se os animais aps uma hora de
nata~o com seus pares treinados do grupo (C)(Tabela 7).
Isto nos leva a crer que os animais deste grupo recorreram
em maior iproporo a via de sintese de oxaloacetato oriunda
de g11cideos, fato no observado nos animais do grupo
(S)(T&bela 7) que, provavelmente, utilizaram a via de
slntese a partir dos aminocidos suplementados.
5.4.3.2 Cardlaco e Heptico - O msculo cardiaco
no apresentou diferena significativa na atividade das
enzimas citrato sintase e piruvato carboxilase entre os
grupos (C) e (S)(Tabela 6 e 8). Este fato pode ser devido a
no alterao da atividade oxidativa deste tecido, como
consequncia da atividade imposta(natao por uma hora). No
tecido heptico, a enzima piruvato carboxilase', no\
apresentou diferen~a entre os grupos(Tabela 8). No entanto,
nota-se uma elevao da atividade da enzima citrato sintase
no figado dos animais do grupo (6) em torno de 30%(Tabela
6). Para explicar este resultado, olltros estudos precisam
ser desenvolvidos.
-
.5.......Q Exausto
5.5 ..Z Detel'JJJina6es plasmticas
Os animais submetidos a exausto apresentaram
valores gl icmlcos e de lactato lemelhantes entre os grupos
(C) e (S)(Tabela 2). Por outro lado, os valores encontrados
53
parA os A.G.L. plAflmflt.irofl dos nn"imnifl do gruJlo un est.
-
5.5.2.2 Cardlaco e Heptico o contedo de
54
glicognio cardiaco no apresentou diferena entre os grupos
(C) e (S)(Tabela 4). Esta ocorrncia deu-se, provavelmente,
por ser o estado exausto semelhante nos dois grupos,
diferindo apenas pelo mecanismo de instalao e,
consequentemente, o tempo de resistncia a eete esforo
(Edwards 1983). J no tecido heptico, os animais/do grupo
(S) apresentaram o contedo de, glicognio, ao final_ da
exausto, elevado em aproximadamente 60 % comparado ao dos
animais do/grupo (C)(Tabel 4), demonstrando maior capacidade
de manuteno do Slicognio heptico nessa condio.
5.5.3 Atividade EnziJlJdtica
5.5.3.1 Muscular Esqueltico Os animais
submetidos a exausto no apresentaram diferenas
significativas na atividade das enzimas citrato sintase e
piruvato carboxilase no msculo gastrocnmio(Tabelas 5 e 7).
No msculo s61eo, no ocorreu diferena significativa na
atividade da enzima citrato sintase entre os grupos (C) e
(S)( Tabela 5) . Jli a atividade da enzima piruyato\
carboxilase, apresentou-se 76% superior nos animais do grupo
(S).(Tabela 7). Este fato, refora a hiptese levantada no
item 5.5.2.1 de que a redua do contedo de glicognio, no
msculo sleo(Tabela 3), dos animais do grupo (S) comparados
ao grupo (C) e que esta devida a maior utilizao dos
glicideos musculares para a sntese de oxaloacetato. Este
fato seria favorecido pelo aumento da atividade da piruvato
-
jJ r' () V ii V e I Im~ Il Le , o aumellto na atividade da
5f:i
piruvato carboxilas8 permitiu, aos animais do grupo (S),a
manuteno da capacidade oxidativa por maior tempo o que
possibilitaria ao grupo suplementado suportar, por tempo
prolongado, a atividade fsica.
5.5.3.2 Cardaca e Heptica A enzima piruvato
ctlrboxi lHfw Ilo apresentou diferena significativa nos
tecidos cardiBco e heptico entre amhos os grupos(Tabela ).
No figado, no foi observada diferena significativa na
atividade da enzima citrato sintase entre os animais do
grupo(C) e (S)(Tabela 6). J no corao, a atividade desta
enzima apresentou-se elevada em 38% no grupo (S)(Tabela 6).
Este fato demonstra que os animais (S) tiveram maior
capacidade de ativao da citrato sintase no processo de
exausto, provavelmente, pelo maior aporte de oxaloacetato
favorecido
precursores.
pelo fornecimento suplementar de seus
6 - Discusso Geral dos Resultados
6.1 Determinaces plasmticas
Como demonstrado
\
na Tabela 1, os animais do gr~po
(8) apresentaram aumento do lactato e dos A.G.L. plasmticos
e reduo da glicemia comparado com o (C) na condio
sedentria. Esta diferena foi abolida nos ratos em
atividade espontnea, treinadofl e n,"ltaf.io por Um1.:l hora.
Entretanto, durante a exausto, os niveis de A.G.L. no
plasma voltam a ser superiores no grupo (S).
/'
-
A capta~o dos A.G.L. pelos msculos e pelo figado
depende da sua concentra~o plasmtica (Newsholme & Start
1976). Desta forma, nossos resultados sugerem que a
suplementao favoreceu a utilizao de A.G.L ..
Na condio sedentria, o aumento no fornecimento
de acetil CoA, posAivelmente, inibiu a atividade ~a piruvato
desidrogenase, aumentando a converso de piruvato lactato.
Como consequncia houve reduo da glicose sangunea e
aumento do lactato. Com a imposio da atividade fsica,
entretanto,; a capacidade do msculo em utilizar acetil CoA
foi aumentada, como demonstrado pelo aumento da atividade da
citrato sintase,que converte acetil CoA + oxaloacetato
citrato, e a diferena observada desapareceu. Os animais do
grupo (S), entretanto, aumentaram o tempo de resistncia ao
56
esforo, atravs da maior mobilizao de A.G.L .. A
importncia deste fato na manuteno da atividade fsica por
perodos mais prolongados precisa ser investigada.
fi.....2-.Cillc..QRfuQ
A suplementao de asparagina, aspartato\ e
carnitina marcadamente aumentara o contedo de glicognio
muscular na condio sedentria. A atividade espontnea
anulou o efeito da dieta no msculo sleo, reduziu no
corao e manteve no gastrocnmio. O contedo de glicognio
muscular no apresentou diferena entre os grupos nos
animais treinados, aps natac;:fio por urna hora e exausto.
Desta forma, apesar da suplementao aumentar o contedo de
./
-
gl icogim\ (J TlUU IllScuJO:"1, h d(~gr"idal~o deste durante o
exerciclo foi semeHwntE: emtre (C) e (S). No corao, o
glicognio no apresentou diferena entre os grupos nas
condies de sedentarismo e de exausto. Durante a atividade
espontnea e nos animais treinados, o glicognio cardaco
esteve elevado para o grupo (C). Estes dados 'permite-nos
acredi tal' que a suplement;ac,.:o alimentar provavelmente tenha
alterado o compo~tamento do ciclo glicose-A.G.L descrito por
Randle et aI (1963). Os dados sugerem que o fornecimento
57
extra de oxaloacetato ao -tecido cardiaco mobilize
acentuadamente o glicognio nos animais da atividade
espontnea e treinados. Quando estes animais foram
submetidos a esforo mais intenso (natao uma hora), a
resposta do glicognio cardaco foi alterada, passando este
a ser armazenado no miocrdio e desta forma voltando a
responder de acordo com o modelo proposto por Randle (1963).
Esta hiptese requer um estudo mais detalhado e suas estapas
esclarecidas. J o contedo de glicognio no fgado
apresentou-se de maneira semelhante em todas as condies
para ambos os grupos. "''', \\
o aumento do glicognio no msculo esqueltico do
grupo (8) na condio sedentaria deve ter ocorrido devido ao
ciclo glicose-A.G.L .. O aumento da utilizao dos A.G.L.
pelo msculo, provavelmente, elevou a produo de ATP e
citrato pelo ciclo de Krebs. Estes produtos da oxidao dos
cidos graxos livres podem ter inibido a atividade da PFK,
./
-
aumentando o disponibilidade de glicose-6 fosfato para a
sintese de glicognio.
6.3 Citrato Sintase
A atividade espontnea elevou a atividade da
enzima citrato sintase no msculo sleo dos animais do grupo
(S). Entretanto, nos animais treinados e aps uma hora de
natao, esta enzima teve sua atividade reduzida comparada
ao controle. A atividade mxima da citrato sintase no fgado
foi reduzida nos animais sedentrios e treinados e aumentada
nos animais mantidos na atividade espontnea e nos ratos da
natao por uma hora. Estes resultados da citrato sintase
atividade mxima no fgado no podem ser esclarecidos no
presente trabalho.
58
A suplementao de asparagina aspartato e
carnitina aumentou a capacidade de sntese de citrato no
msculo sleo sob condies aerbicas (atividade espontnea)
mas no foi efetiva em atividades mais intensas (natao com
5% do peso corporal de sobrecarga).
No corao a atividade da citrato sintase
apresentou-se mais elevada no grupo (5) nos r~tos,
sedentrios, em atividade espontnea e exausto. Estes dados
refletem a eficincia do aporte elevado dos precursores de
oxaloacetato para o miocrdio na ativao do sistema
oxidativo. Os animais em natao por uma hora no
apresentaram diferena na atividade mxima da citrato
sintas~ entre os grupos (5) e (C). J nos animais treinados
ocorreu reduo da atividade da citrato sintase no grupo
-
60
glicOliuc. 1\ t-tLivldude db piruvato carl:Joxilase foi maior no
cora~o do (5) para os animais sedentrios e atividade
espontnea. DestR forma, o fornecimento adicional de
precursores de oxaloacetato aumentou a capacidade do msculo
de produo de oxaloacetato como indicado pela atividade
da piruvato carboxilase. E possivel que a gera~o aumentada
de oxaloacetato estimule a atividade do ciclo de .krebs e a
produo de ATP; e isto, sabido, aumenta a atividade da
piruvato carboxilase (Rowan & Newsholme 1979). Estas
afirma~es requerem ainda mais investigaes para serem
comprovadas.
6.5 Tempo de Exausto
Os animais (5) nadaram por um periodo superior que
o grupo (C) at a exausto. Os valores obtidos em minutos
foram: 423.8 27.7 e 297.8 42.2 (mdia e erro padro)
para (5) e (C), respectivamente. Isto representou um aumento
de 42% em favor do grupo (5) com diferena significativa de
p
-
7. Concluses
A suplementao de asparagina, aspartato e
61
carnitina eleva a capacidade do msculo em utilizar os
A.G.L. e poupar o glicognio; como indicam os resultados de
glicemia, A.G.L., lactato e glicognio muscular. O contedo
de glicognio muscular apresenta-se estritamente relacionado
COIJI l. res lsLIlcia ao (~Sf(H'4'O de longl durao (Bergstrom et
aI 1967 e Hermansen et aI 1967). Assim, este resultado do
glicognio muscular, por si s demonstra que os animais (5)
possuem maior capacidade de - resistncia ao esforo
comparados ao controle.
A importncia do oxa~oacetato para os resultados
da exausto descritos, foi enfatizada pelo fato de, apesar
da suplementao de seus precursores(asparagina e
aspartato), ocorreu tambm aumento da atividade da enzima
produtora de oxaloactato a partir de piruvato; piruvato
carboxilase. Acredita-se que a resistncia ao esforo
aumentada pela elevao do glicognio muscular d-se pelo
maior fornecimento de oxaloacetato oriundo do glicognio
para a oxidao dos A.G.L .. Desta forma, a redu\ do\
glicognio torna o msculo inapto para metabolizar o
acetilCoA oriundo dos A.G.L. levando exausto.
Outros experimentos precisam ser realizados para
detalhar alguns pontos levantados neste ~studo. Certamente,
entretanto, os resultados aqui reportados contribuem para o
entendimento do controle do metabolismo perifrico para o
estabelecimento da exausto no exerccio fisico.
/'
-
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the glucoseexercising
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Tabe~as
"
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APNDICE
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Tabela 2 - Determinaes plasmticas dos grupos controle(C)e Buplement{H.~fo (S) submetidos as seguintes condioes:sedentrio, atividade espontnea, treinados, natao 1 horae exausto. Os valores so apresentados por media desviopadro de 10 animais por grupo *(p
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Tabela 3 - Contedo de glicognio muscular - gastrocnmio eeleo cio fI erllpOS controle (C) e suplementa(;:o (~;) Bubmetic!o('3as seguintes condies: sedentrio, atividade espontnea,treinados, natao 1 hora e exausto. Os valores soapresentados por media desvio padro de 10 animais porgrupo *(p
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Trd)cd.ll '1 CUlILedo de gU cugnio heptico e cnrdlaco dOBgrupos controle(C) e suplementao(S) submetidos asseguintes condies: sedentrio, atividade espontnea,treinados, natao 1 hora e exausto. Os valores soapresentados por media desvio padro de 10 animais porgrupo *(p
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Tabela 5 - Atividade mAxima da enzima citrato sintase notecido muscular gastrocnmio e sleo dos gruposcontro le (C) e suplemen tao (S) fiubmet.idos as seguinteE.\condies: sedentrio, atividade espontnea, treinados,natao 1 hora e exausto. Os valores so apresentados pormedia desvio padro de 10 animais por grupo *(p
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Tabela 6 - Atividade maXlma da enzima citrato sintase nostecidos heptico e cardiaco dos grupos controle(C) esuplementao(S) submetidos as seguintes condies:sedentrio, atividade espontnea, treinados, natao 1 horae exausto. Os valores so apresentados por media desviopadro de 10 animais por grupo *(p
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Tabela '7 Atividade mxima da enzima piruvato carboxilasenos tec ido(3 Oll.wculf.ll'el3 - gastrocnmio e sleo dos gruposcontrole(C) e suplementao(S) submetidos as seguintescondies: sedentrio, atividade espontnea, treinados,natao 1 hora e exausto. Os valores so apresentados pormedia + desvio padro de 10 animais por grupo *(p
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, ,
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Tabela 8 -Atividade mxima da enzima piruvato carboxilasenos tecidos heptico e cardaco dos grupos controle(C) esuplementao(S) submetidos as seguintes condies:sedentrio, atividade espontnea, treinados, natao 1 horae exausto. Os valores so apresentados por media desviopadro de 10 animais por grupo *(p
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Tabela 9 - Peso relativo do tecido adiposo epididimal dosgrupos controle(C) e suplementao(S) submetidos asseguintes condies: sedentrio, atividade espontnea,treinados, natao 1 hora e exausto. Os valores soapresentados por media desvio padro de 10 animais porgrupo *(p
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