มาตรฐานสนคาเกษตร มกษ. 4003-2555

THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 4003-2012

ขาวกลองงอก

GERMINATED BROWN RICE

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กระทรวงเกษตรและสหกรณ

ICS 67.060 ISBN

มาตรฐานสนคาเกษตร มกษ. 4003-2555

THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 4003-2012

ขาวกลองงอก

GERMINATED BROWN RICE

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กระทรวงเกษตรและสหกรณ 50 ถนนพหลโยธน เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900

โทรศพท 0 2561 2277 โทรสาร 0 2561 3357

www.acfs.go.th

ประกาศในราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศและงานทวไป เลม 129 ตอนพเศษ 144 ง

วนท 19 กนยายน พทธศกราช 2555

(2)

คณะกรรมการวชาการพจารณามาตรฐานสนคาเกษตรเรอง ขาวกลองงอก

1 นางส าล บญญาววฒน

กรมการขาว

ประธานกรรมการ

2 นายอทธพงศ คณากรบดนทร

กรมการคาภายใน กระทรวงพาณชย

กรรมการ

3 นายเกรยงไกร ครฑไทย

กรมสงเสรมสหกรณ

กรรมการ

4 นางชนสข เมธากลวฒน

ส านกงานคณะกรรมการคมครองผบรโภค ส านกนายกรฐมนตร

กรรมการ

5 นางสาววารณ เสนสภา

ส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา กระทรวงสาธารณสข

กรรมการ

6 นายพศาล พงศาพชณ

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กรรมการ

7 นางวไลลกษณ สขปราการ

ส านกพฒนาผลตภณฑขาว กรมการขาว

กรรมการ

8 นางสาวสนนทา วงศปยชน

ส านกวจยและพฒนาขาว กรมการขาว

กรรมการ

9 ศาสตราจารยอรอนงค นยวกล

ศนยความเปนเลศแหงนวตกรรมขาว มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

กรรมการ

10 นายอารย นาชยด

บรษทดอยค าผลตภณฑอาหาร จ ากด

กรรมการ

11 นายสมคร ยงยง

วสาหกจชมชนพฒนาการปลกและแปรรปขาวเพอสขภาพ

กรรมการ

12 นายบญม สระโคตร

ศนยขาวชมชนต าบลด (เกษตรทพย)

กรรมการ

13 นางพชร ตงตระกล

ผทรงคณวฒ

กรรมการ

14 รองศาสตราจารยวรนช ตรเจษฎารกษ

ผทรงคณวฒ

กรรมการ

15 นางสาวองอร ปญญากจ

ส านกก าหนดมาตรฐาน

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กรรมการและเลขานการ

(3)

ขาวกลองงอก เปนอาหารทอดมไปดวยสารอาหาร โดยเฉพาะมกรดแกมมาแอมโนบวทรก (Gamma

aminobutyric acid) หรอกาบา (GABA) ซงมบทบาทส าคญในการเปนสารสอประสาท ในระบบประสาท

สวนกลาง ซงมประโยชนตอรางกาย ประกอบกบปจจบนมผผลตขาวกลองงอกเพมขนมาก คณะกรรมการ

มาตรฐานสนคาเกษตร จงเหนสมควรก าหนดมาตรฐานสนคาเกษตรเรอง ขาวกลองงอก เพอยกระดบและ

พฒนาคณภาพขาวกลองงอกใหเปนสนคาทมคณภาพและปลอดภยตอผบรโภค รวมทงมคณคาทาง

โภชนาการมากเพยงพอส าหรบการกลาวอาง

มาตรฐานสนคาเกษตรน ก าหนดขนโดยใชเอกสารตอไปนเปนแนวทาง

มกษ. 4001-2551. มาตรฐานสนคาเกษตร ขาวหอมไทย. ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหาร

แหงชาต. กระทรวงเกษตรและสหกรณ.

มกษ. 4003-2555

มาตรฐานสนคาเกษตร

ขาวกลองงอก

1 ขอบขาย

มาตรฐานสนคาเกษตรนครอบคลม ขาวกลองงอก (germinated brown rice) ซงผลตจากขาวทมชอทาง

วทยาศาสตรวา Oryza sativa L. วงศ Gramineae ทงขาวเจาและขาวเหนยว ทผานกระบวนการเพาะงอก

และจ าหนายในสภาพเมลดขาวบรรจในบรรจภณฑทปดสนท มาตรฐานนไมครอบคลมผลตภณฑขาวกลองงอก

รปแบบอน

2 นยาม

ความหมายของค าทใชในมาตรฐานสนคาเกษตรน ใหเปนไปตาม มกษ. 4001 และดงตอไปน

2.1 ขาวกลองงอก (germinated brown rice) หมายถง ผลผลตของขาวทผานกระบวนการท าใหงอก โดย

แชขาวเปลอกหรอขาวกลองในน า เพาะจนเกดราก มความยาวประมาณ 0.5 มลลเมตร (mm) ถง 1 mm

แลวน าไปผานความรอน (นง อบ หรอตม) และ/หรอลดความชนเพอท าใหแหง

กรณทผลตจากขาวเปลอก หลงจากท าใหแหงแลวตองเอาเปลอกออก

2.2 ขาวกลองงอกเตมเมลด (whole germinated kernel) หมายถง ขาวกลองงอกซงอยในสภาพเตมเมลด

ทไมมสวนใดหก

2.3 กรดแกมมาแอมโนบวทรกหรอกาบา (gamma amino butyric acid, GABA) หมายถงกรดแอมโนชนดหนง

ทไมใชโปรตน ซงเกดจากการงอกของขาวซงมปรมาณแตกตางกน ขนอยกบวตถดบทใชในการผลตและ

กระบวนการผลต

2.4 เมลดทมสผดปกต หมายถง ขาวกลองงอกทมสผดปกตไปจากพนธทใช

2.5 เมลดเสย (damaged kernel) หมายถง เมลดขาวกลองงอกทเสยอยางเหนไดชดเจนดวยตาเปลา

ซงเกดจากความชน ความรอน เชอรา แมลง หรออนๆ

มกษ. 4003-2555 2

2.6 เมลดแตกหก หมายถง เมลดขาวกลองงอกทหก ความยาวตงแต 5 สวนขนไป (เมอแบงขาวทงเมลด

ออกเปน 10 สวน)

2.7 สงแปลกปลอม (foreign matter) หมายถง สงอนทไมใชขาวกลองงอก ทอาจปนหรอตดมากบขาว

กลองงอก เชน แกลบ หรอฟาง

3 คณภาพ

3.1 คณภาพทวไป

3.1.1 มลกษณะปรากฏตรงตามพนธ ส ตามธรรมชาต

3.1.2 ไมมกลนผดปกต

3.1.3 ไมมมอด หรอแมลงอนๆ หรอชนสวนแมลง

3.1.4 ไมมวตถทเปนอนตรายตอผบรโภค เชน เศษหน เศษแกว

3.2 คณภาพเฉพาะ

3.2.1 มขาวกลองงอกเตมเมลด ไมต ากวา 90% โดยน าหนก

3.2.2 ความชน (moisture content) ไมเกน 14% โดยน าหนก

3.2.3 ปรมาณ GABA ไมนอยกวา 5 มลลกรม (mg) ตอ 100 กรม (g) โดยน าหนกแหง

3.3 ขอบกพรอง

ขอบกพรองของขาวกลองงอกทงหมด ยอมใหมรวมกนไดไมเกน 10% โดยน าหนก เกณฑการยอมรบ

ขอบกพรองตามตารางท 1

ตารางท 1 เกณฑการยอมรบขอบกพรอง

(ขอ 3.3)

ขอบกพรอง สดสวนโดยน าหนก

(%)

1. เมลดเสย 1.00

2. สงแปลกปลอม 0.05

3. เมลดเสย สงแปลกปลอม และเมลดทมสผดปกต

เมลดแตกหก

10

3 มกษ. 4003-2555

4 สารปนเปอน

ใหเปนไปตามขอก าหนดในกฎหมายทเกยวของ และขอก าหนดของมาตรฐานสนคาเกษตรทเกยวของกบ

เรองสารปนเปอน

5 สารพษตกคาง

ใหเปนไปตาม มกษ. 9002 มาตรฐานสนคาเกษตร เรอง สารพษตกคาง: ปรมาณสารพษตกคางสงสด

และ มกษ. 9003 มาตรฐานสนคาเกษตร เรอง สารพษตกคาง: ปรมาณสารพษตกคางสงสดทปนเปอน

จากสาเหตทไมอาจหลกเลยงได และขอก าหนดในกฎหมายทเกยวของ

6 สขลกษณะ

การผลตและการปฏบตตอขาวกลองงอกในขนตอนตางๆ รวมถงการเกบรกษาและการขนสง ตองปฏบต

อยางถกสขลกษณะ เพอปองกนการปนเปอนทจะกอใหเกดอนตรายตอผบรโภค โดยใหเปนไปตาม มกษ. 9023

มาตรฐานสนคาเกษตร เรอง หลกเกณฑทวไปเกยวกบสขลกษณะอาหาร และ มกษ. 4404 การปฏบตทด

ส าหรบการผลตขาวกลองงอก

7 การบรรจ

ตองบรรจในบรรจภณฑทสะอาด แหง ปดสนท หรอแบบสญญากาศ สามารถปองกนการปนเปอนทอาจกอใหเกดอนตรายตอผบรโภค และรกษาคณภาพขาวกลองงอกในระหวางการเกบรกษาและการขนสงได

8 ฉลาก

ใหแสดงฉลากตามขอก าหนดในกฎหมายทเกยวของ และอยางนอยตองมขอความระบในเอกสารก ากบสนคา หรอฉลาก หรอแสดงทภาชนะบรรจโดยขอความตองอานไดชดเจน ไมหลดลอก ไมเปนเทจ โดยม

รายละเอยด ดงตอไปน

8.1 ชอผลตภณฑ ใหแสดงวา “ขาวกลองงอก” หรอ “ขาวงอก” หรอ “ขาวงอกจากขาวกลอง” หรอ “ขาวงอก

จากขาวเปลอก” หรอ “ขาวฮางงอก”

8.2 น าหนกสทธ เปนกรม หรอกโลกรม

8.3 ชอและทตงของผผลต ผบรรจ และ/หรอ ผจ าหนาย และหมายเลขรหสสนคา (ถาม)

8.4 วน เดอน ปทผลต และ/หรอ ขอความวา “ควรบรโภคกอน (วน เดอน ป)”

8.5 รนของผลตภณฑ (ระบเปนรหสได)

มกษ. 4003-2555 4

8.6 ค าแนะน าการเกบรกษากอนและหลงเปดบรรจภณฑ รวมทงค าแนะน าในการบรโภค

8.7 ตองใชขอความเปนภาษาไทย กรณทผลตเพอสงออก สามารถแสดงขอความเปนภาษาอนทม

ความหมายตรงกบภาษาไทยทก าหนดไวขางตนได

9 วธชกตวอยาง

วธชกตวอยางขาวกลองงอก ส าหรบการตรวจวเคราะหตามรายการ ในขอ 3 ใหเปนไปตามภาคผนวก ก

วธชกตวอยางทจ าเปนนอกเหนอจากทระบในภาคผนวก ก ใหเปนไปตามขอก าหนดในกฎหมายทเกยวของ

10 วธวเคราะห

10.1 วธวเคราะห ใหใชวธทก าหนดในตารางท 2 (โดยอางองเอกสารฉบบลาสด) ดงน

ตารางท 2 วธวเคราะห

(ขอ 10.1)

ขอกาหนด วธวเคราะห หลกการ

1. คณภาพทวไป (ขอ 3.1)

ตรวจพนจดวยสายตาและประสาทสมผส

(ภาคผนวก ข ขอ 1.1)

-

2. ความชน (ขอ 3.2.2)

AOAC 925.10 หรอวธวเคราะหทม

ความถกตองเทยบเทา

(ภาคผนวก ข ขอ 2)

Gravimetry

3. ขอบกพรอง (ขอ 3.3)

ใชตะแกรงรอน คดแยกตวอยางขาว

กลองงอก และขอบกพรอง ชงน าหนก

(ภาคผนวก ข ขอ 1.2)

1. Subjective measurement

2. Gravimetry

4. ปรมาณ GABA (ขอ 3.2.3)

เตรยมตวอยาง สกดกรดแอมโน และ

วเคราะหดวย HPLC (ภาคผนวก ข ขอ 3)

หรอใชวธอนทมความถกตองเทยบเทา

1. High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)

2. Fractionating

5. น าหนกสทธ ชงน าหนกดวยเครองชงน าหนก Gravimetry

10.2 วธวเคราะหทจ าเปนนอกเหนอจากทระบ ใหเปนไปตามขอก าหนดในกฎหมายทเกยวของ และ

ขอก าหนดของมาตรฐานสนคาเกษตร เรองวธวเคราะห และชกตวอยาง

5 มกษ. 4003-2555

ภาคผนวก ก

วธชกตวอยาง

(ขอ 9)

ก.1 นยาม

ความหมายของค าทใชมดงตอไปน

ก.1.1 การชกตวอยาง (sampling) หมายถง ขนตอนการด าเนนงานเพอใหไดตวอยาง

ก.1.2 รน (lot) หมายถง สนคาทสงมาพรอมกนในแตละครง และเจาหนาทชกตวอยางทราบ หรอ

ตงสมมตฐานวามลกษณะทสม าเสมอกน เชน แหลงก าเนด ผผลต ชนด ผบรรจ ชนดของบรรจภณฑ

เครองหมาย ผขนสง

ก.1.3 แผนการชกตวอยาง (sampling plan) หมายถง การก าหนดวธการเกบและจ านวนหนวยตวอยาง

จากรนสนคา เพอตรวจสอบใหไดขอมลทน ามาใชในการตดสนใจยอมรบรนสนคา

ก.2 ขนตอนการชกตวอยาง (sampling procedure)

วธการชกตวอยางขาวกลองงอก ควรด าเนนการเพอใหไดตวอยางทเปนตวแทนของรนมากทสด โดยชก

ตวอยางจากต าแหนงตางๆ ในรนแบบสมใหกระจายทวทงรน น าตวอยางทไดทงหมดผสมใหเขากนด และ

น ามาลดปรมาณลงอยางเหมาะสม เพอใหไดตวอยางสงหองปฏบตการวเคราะหและตรวจสอบคณภาพ

อยางเพยงพอ จ านวนตวอยางทเกบจากต าแหนงตางๆ ในรน ใหเปนตามตารางท ก.1 ก.2 และ ก.3

อยางไรกตาม ควรเกบตวอยางทสงหองปฏบตการไวเพอประโยชนในการทวนสอบหากเกดปญหา

ก.3 การชกตวอยางและการยอมรบ ใหเปนไปตามแผนการชกตวอยางทก าหนดตอไปน หรออาจใช

แผนการชกตวอยางอนทเทยบเทากนทางวชาการกบแผนการชกตวอยางทก าหนด

ก.3.1 การชกตวอยางและการยอมรบ ส าหรบการตรวจสอบคณภาพ (ขอ 3)

(1) ใหชกตวอยางโดยวธสมจากรนเดยวกน ตามจ านวนทก าหนดในตาราง ก.1

(2) จ านวนตวอยางทไมเปนไปตามเกณฑคณภาพขอ 3 ตองไมเกนจ านวนตวเลข เกณฑยอมรบทก าหนด

ในตาราง ก.1 จงถอวาขาวกลองงอก รนนนเปนไปตามเกณฑทก าหนด

ก.3.2 การชกตวอยางและการยอมรบ ส าหรบการวเคราะหสารปนเปอน สารตกคาง และกรดแกมมา-

แอมโนบวทรก

มกษ. 4003-2555 6

(1) แบงตวอยางจากผลตภณฑแตละหนวย (บรรจภณฑ) ทชกตวอยางตามขอ ก.3.1 ในปรมาณเทาๆ

กน น ามาผสมรวมกนใหไดน าหนกรวม ไมนอยกวา 1 kg (กโลกรม)

(2) หลงจากวเคราะหตวอยาง ผลการวเคราะหตวอยางตองเปนไปตามเกณฑคณภาพขอ 3.2.3 ขอ 4

และ ขอ 5 จงถอวาขาวกลองงอกรนนน เปนไปตามเกณฑทก าหนด

ตารางท ก.1 จ านวนตวอยางและเกณฑการยอมรบ ส าหรบผลตภณฑในบรรจภณฑทมน าหนกสทธ

ไมเกน 1 kg

(ขอ ก.3.1)

ขนาดรน

(จ านวนหนวยของบรรจภณฑ)

ขนาดตวอยาง

(จ านวนหนวยของบรรจภณฑ)

เกณฑยอมรบ

(จ านวนหนวยของบรรจภณฑ

ทพบขอบกพรอง)

นอยกวาหรอเทากบ 4 800 6 1

4 801 ถง 24 000 13 2

24 001 ถง 48 000 21 3

48 001 ถง 84 000 29 4

84 001 ถง 144 000 38 5

144 001 ถง 240 000 48 6

มากกวา 240 000 60 7

ตารางท ก.2 จ านวนตวอยางและเกณฑการยอมรบ ส าหรบผลตภณฑ ในบรรจภณฑทมน าหนกสทธ

มากกวา 1 kg แตไมเกน 4.5 kg

(ขอ ก.3.1)

ขนาดรน (จ านวนหนวยของบรรจภณฑ)

ขนาดตวอยาง (จ านวนหนวยของบรรจภณฑ)

เกณฑยอมรบ

(จ านวนหนวยของบรรจภณฑ ทพบขอบกพรอง)

นอยกวาหรอเทากบ 2 400 6 1

2 401 ถง 15 000 13 2

15 001 ถง 24 000 21 3

24 001 ถง 42 000 29 4

42 001 ถง 72 000 38 5

72 001 ถง 120 000 48 6

มากกวา 120 000 60 7

7 มกษ. 4003-2555

ตารางท ก.3 จ านวนตวอยางและเกณฑการยอมรบ ส าหรบผลตภณฑ ในบรรจภณฑทมน าหนกสทธ

มากกวา 4.5 kg

(ขอ ก.3.1)

ขนาดรน

(จ านวนหนวยของบรรจภณฑ)

ขนาดตวอยาง

(จ านวนหนวยของบรรจภณฑ)

เกณฑยอมรบ

(จ านวนหนวยของบรรจภณฑ

ทพบขอบกพรอง)

นอยกวา หรอเทากบ 600 6 1

601 ถง 2 000 13 2

2 001 ถง 7 200 21 3

7 201 ถง 15 000 29 4

15 001 ถง 24 000 38 5

24 001 ถง 42 000 48 6

มากกวา 42 000 60 7

ทมา: CODEX STAN 233-1969: CODEX SAMPLING PLAN FOR PREPACKAGED FOODS

(AQL 6.5)

มกษ. 4003-2555 8

ภาคผนวก ข วธวเคราะห

(ขอ 9)

ข.1 วธวเคราะหขอบกพรอง

ข.1.1 การวเคราะหเมลดทมสผดปกต เมลดเสย และเมลดแตกหก

(1) สมตวอยางขาวกลองงอก ชงน าหนกอยางนอย จ านวน 100 กรม (g)

(2) น าตวอยางขาวกลองงอกดงกลาว มาคดแยกเมลดทมสผดปกต เมลดเสย และเมลดแตกหกออก และชงน าหนก

ข.1.1.1 ค านวณหาเปอรเซนต (%) เมลดทมสผดปกต และเมลดแตกหก ดงน

% เมลดทมสผดปกต และเมลดแตกหก = (น าหนกเมลดสผดปกต + เมลดแตกหก) 100

น าหนกตวอยางขาวกลองงอกทสมมาทงหมด

ข.1.1.2 ค านวณหาเปอรเซนต (%) เมลดเสย ดงน

% เมลดเสย = น าหนกเมลดเสย 100

น าหนกตวอยางขาวกลองงอกทสมมาทงหมด

ข.1.2 การวเคราะหสงแปลกปลอม

ข.1.2.1 เครองมอ

(1) เครองเปาท าความสะอาด

(2) ตะแกรงรอน

ข.1.2.2 วธการ

(1) สมตวอยางขาวกลองงอก และชงน าหนกใหได อยางนอย 100 g

(2) รอนตวอยางทไดดวยตะแกรง และเปาท าความสะอาด เพอแยกสงแปลกปลอมทมน าหนก

เบาออก เชน แกลบ เศษฟาง ระแง และขาวลบ

9 มกษ. 4003-2555

(3) หากยงมสงแปลกปลอมเหลออยใหแยกออกดวยสายตาอกครง บนทกน าหนก และค านวณ

ปรมาณสงแปลกปลอม ดวยสตรการค านวณ ดงน

% สงแปลกปลอม = น าหนกสงแปลกปลอมทงหมด 100

น าหนกตวอยางขาวกลองงอกทสมมาทงหมด

ข.2 วธวเคราะหความช น

ข.2.1 เครองมอ

(1) ตอบลมรอน (hot air oven)

(2) เครองชงน าหนก ความละเอยด 4 ต าแหนง ทชงไดละเอยดถง 0.0001 g

(3) โถดดความชน (desiccators)

(4) เครองบดเมลดขาวทบดใหละเอยดใหถง 80 เมช (mesh) ถง 100 เมช

(5) กลองอะลมเนยม (aluminum dish) พรอมฝาปด

หมายเหต กรณทมการวเคราะหปรมาณความชนโดยใชวธอน เชน การใชเครองวดความชน เครองวดความชนตองไดมาตรฐาน โดยผานการสอบเทยบหรอไดรบการรบรองจากกระทรวงพาณชย หรอหนวยงานอนทม

อ านาจหนาท

ข.2.2 วธวเคราะห

ข.2.2.1 บดเมลดขาวกลองงอกดวยเครองบด ใหเปนแปง

ข.2.2.2 เปดฝากลองอะลมเนยม วางฝาซอนไวใตกลองอะลมเนยม และน าไปอบในตอบทอณหภม 130 3 องศาเซลเซยส (

๐C) เปนเวลา 1 h ปลอยไวใหเยนในโถดดความชน แลวชงน าหนกกลองอะลมเนยม

พรอมฝาปด

ข.2.2.3 ชงแปงทไดจากการบดเมลดขาวกลองงอก ประมาณ 1 กรม (g) ใสในกลองอะลมเนยม แลวชง

น าหนก

ข.2.2.4 น ากลองอะลมเนยมทใสแปง ไปอบทอณหภม 130 3 ๐C โดยเปดฝาไว เปนเวลา 1 h หรอจนกวา

น าหนกคงท (เรมนบเวลาเมออณหภมตอบสงถง 130 ๐C) จากนนปดฝาปลอยใหเยนในโถดดความชน

เมออณหภมลดลงจนเทากบอณหภมหองแลว ใหน าไปชงน าหนก

ข.2.3 ค านวณหาปรมาณความชนจากสตร

% ของความชน = (B – C) 100

มกษ. 4003-2555 10

B – A

เมอ A = น าหนกกลองอะลมเนยมพรอมฝา

B = น าหนกอะลมเนยมพรอมฝาและแปงกอนอบ

C = น าหนกกลองอะลมเนยมพรอมฝาและแปงหลงอบ

ข.3 วธวเคราะหปรมาณ GABA ดวยเทคนค HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

ข.3.1 สารเคมและวสดอปกรณ

(1) เมทานอล (Methanol)

(2) แอซโตไนทรล (Acetonitrile)

(3) คลอโรฟอรม (Chloroform AR grade)

(4) สารละลายกรดไทรฟลออโรแอซตก (Trifluoroacetic acid : TFA) ความเขมขน 0.05%

(5) สารละลายบฟเฟอรไดโซเดยมเททระบอเรต (Di-sodium tetraborate buffer) 0.1 (โมลาร) M

ปรบ pH ใหมคาเทากบ 10 ดวยสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (Sodium hydroxide) 8 M

(6) สารละลาย 9-ฟลออรนลเมทลคลอโรฟอรเมต (9-Fluorenylmethyl chloroformate: FOMC)

ความเขมขน 1 000 mg/l ในสารละลายแอซโตไนทรล (HPLC grade)

(7) กรดแอมโนมาตรฐาน (Standard amino acids) เชน ฮสทดน (histidine) อารจนน (arginine) กลตามน

(glutamine) ซรน (serine) กรดกลตามค (glutamic acid) กาบา (GABA) อะลานน (alanine) โพรลน

(proline) วาลน (valine) และ ลวซน (leucine)

(8) น าขจดไอออน

(9) หลอดปนเหวยง (centrifuge tube) ขนาด 50 มลลลตร (ml)

(10) เครองปนเหวยง (centrifuge)

(11) เครองเขยาผสม (vortex mixer)

(12) เครองอบแหงสญญากาศ (vacuum oven)

(13) ปเปต (pipette) ขนาด 10 และ 20 ml

(14) ไมโครปเปต (micropipette) ขนาด p 10 p 50 p 100 p 200 p 1 000

(15) Nylon membrane syring filter ขนาด 0.2 ไมครอน

(16) กระบอกฉดยา ขนาด 5 ml

(17) Column HPLC : waters Symmetry C18 5 mm ยาว 3.9 mm x 150 mm

(18) Fluorescence Detector Jasco FP-920

(19) Waters 485 Tunable Absorbance Detector

(20) Waters 600 controller pump

(21) Waters 717 plus Auto-sampler

11 มกษ. 4003-2555

(21) Waters SAT/IN Module

(23) เครองบดตวอยางละเอยดขนาด 80 เมช (mesh) ถง 100 mesh

ข.3.2 วธการเตรยมสกดโปรตนส าหรบวเคราะหกรดแอมโน

(1) น าขาวกลองงอก ไปบดใหละเอยดดวยเครองบดตวอยาง และชงตวอยางขาวกลองงอกทบดแลว

ประมาณ 2 g ใสลงในหลอดปนเหวยง

(2) เตมเมทานอล : คลอโรฟอรม : น า ในอตราสวน 12:5:3 ลงไป 8 ml

(3) เขยาดวยเครองเขยาผสมนาน 2 min แลวท าการปนเหวยงทความเรวรอบ 5,700 รอบตอนาท เปน

เวลา 15 นาท (min) ปน 3 รอบ

(4) เทสารละลายสวนใสลงในขวดรปชมพ ระเหย สวนกากตะกอนในหลอดปนเหวยงใหเตม

คลอโรฟอรม : น า ในอตราสวน 3:5 ลงไป 8 ml เขยาดวยเครองเขยาผสม นาน 2 min และท าการปนเหวยง

ทความเรวรอบ 5,700 รอบตอนาท เปนเวลา 15 min แลวใหเทสารละลายสวนใส ลงในขวดรปชมพ น าไป

ระเหยรวมกนกบครงแรก

(5) น าขวดรปชมพ (flask) ระเหยทเกบสารละลายสวนใสมาท าการระเหยดวยเครองอบแหงสญญากาศ

(vacuum oven) ทอณหภม 60 0C (องศาเซลเซยส) จนแหง

(6) ชะลางสารทตองการออกจากขวดรปชมพ ระเหยดวยน ากลนขจดไอออน ปรมาณ 5 ml

(7) ดดสารละลายสกดกรดแอมโนจากตวอยางขาวกลองงอกจากขอ 6 ปรมาตร 1 ml และสารละลาย

FOMC ปรมาตร 1 ml ลงในขวดปรบปรมาตรขนาด 5 ml แลวปรบปรมาตรใหครบ 5 ml ดวยสารละลาย

บฟเฟอรโซเดยมบอเรต (sodium borate buffer) เขยาขวด ตงทงไวเปนเวลา 15 min จากนนกรองผาน

syringe nylon membrane filter ขนาด 0.2 μm (ไมโครเมตร) ลงในหลอดตวอยาง (vial) ของเครอง

HPLC แลวท าการฉดสารทผานการกรอง จ านวน 10 ml เขาเครอง HPLC เพอวเคราะหหาชนดและ

ปรมาณกรดแอมโน โดยเปรยบเทยบกบกราฟสารละลายมาตรฐานกรดแอมโนแตละชนด

ข.3.3 การวเคราะหหาปรมาณกรดแอมโนอสระ โดยวธ HPLC

ข.3.3.1 สารเคมและวสดอปกรณ

(1) สารละลายเมทลแอลกอฮอล

(2) สารละลายแอซโตไนทรล

(3) สารละลายกรดไทรฟลออโรแอซตก ความเขมขน 0.05%

(4) สารละลายบฟเฟอรไดโซเดยมเททระบอเรต 0.1 M ปรบ pH 10 ดวยสารละลาย 8 M sodium hydroxide

(5) สารละลาย 9-ฟลออรนลเมทลคลอโรฟอรเมต ความเขมขน 1,000 mg/l ในสารละลายแอซโตไนทรล

มกษ. 4003-2555 12

(6) กรดแอมโนมาตรฐาน เชน ฮสทดน อารจนน กลตามน ซรน กรดกลตามค กาบา อะลานน โพรลน

วาลน และลวซน

(7) ไมโครปเปต ขนาด 50 ml 100 ml 200 ml และ 1,000 ml

(8) ขวดปรบปรมาตร ขนาด 5 ml 50 ml 100 ml 1,000 ml และ 2,000 ml

(9) หลอดตวอยาง และฝาปด ส าหรบเครอง HPLC

(10) Syringe Nylon Membrane Filter ขนาดรผาน 0.2 μm ขนาดเสนผานศนยกลาง 13 mm

(11) Nylon Membrane Filter ขนาดรผาน 0.2 μm ขนาดเสนผานศนยกลาง 47 mm

(12) กระบอกฉดยาพลาสตก (Syringe) ขนาด 5 mm

(13) ขวดปรบปรมาตร 5 ml 50 ml 100 ml 500 ml 1,000 ml และ 2,000 ml

(14) ชดกรองสารละลาย Mobile phase เครอง HPLC

(15) เครองชงส าหรบการวเคราะห

(16) เครอง HPLC

(17) เครองฟลออเรเซนตดเทคเตอร (Fluorescence detector)

ข.3.3.2 สภาวะการตงเครอง HPLC

(1) คอลมม symmetry Reverse-phase C18 (5 m ; 3.9 x 150 mm)

(2) ควบคมอณหภมของคอลมม 40 oC

(3) ใชฟลออเรเซนตดเทคเตอร ความยาวคลนกระตน ( excited) 270 nm และความยาวคลน

กระจาย ( emission) 315 นาโนเมตร (nm)

(4) ฉดสารละลายในการวเคราะห (inject sample) ปรมาณ 10 μl

(5) สภาวะในการวเคราะหมการปรบเปลยนปรมาณของสารตวพาตลอดเวลา (Gradient elution) โดย

ใชสารตวพา 3 ชนด อตราการไหลของสารตวพา 1 ml/min ดงตาราง ข.1

ตารางท ข.1 สภาวะในการวเคราะหสารมาตรฐาน GABA ในขาวกลองงอก

Time (min) Flow rate 0.05% TFA (%) Acetonitril (%) Methanol (%)

0 1.0 65 35 0

1.5 1.0 65 35 0

3.0 1.0 80 15 5

10 1.0 55 20 25

15 1.0 55 20 25

13 มกษ. 4003-2555

21 1.0 35 30 35

23 1.0 40 30 30

27 1.0 0 75 25

33 1.0 65 35 0

ข.3.4 การเตรยมสารละลายผสมกรดแอมโนและสรางกราฟมาตรฐาน

ข.3.4.1 เตรยมสารละลายมาตรฐานกรดแอมโนผสม 10 ชนด คอ กรดแอมโน ฮสทดน อารจนน กลตามน ซรน กรดกลตามค กาบา อะลานน โพรลน วาลน และลวซน ความเขมขน 2 mg/l 5 mg/l 10 mg/l

15 mg/l 20 mg/l 25 mg/l และ 30 mg/l

ข.3.4.2 ดดสารละลายมาตรฐานกรดแอมโนผสมจากขอ 1 จ านวน 1 ml และสารละลาย FOMC จ านวน

1 ml ลงในขวดปรบปรมาตรขนาด 5 ml แลวปรบปรมาตรใหครบ 5 ml ดวยสารละลายบฟเฟอรโซเดยม

บอเรต เขยาขวด ตงทงไวเปนเวลา 15 min จากนนท าการกรองผาน syringe nylon membrane filter

ขนาด 0.2 μm ลงในหลอดตวอยางของเครอง HPLC แลวฉดเขาเครอง HPLC เพอสรางกราฟสารละลาย

มาตรฐานกรดแอมโนแตละชนดระหวางความเขมขนของกรดแอมโน แตละชนดกบพนทใตกราฟของกรด

แอมโนชนดนนๆ ดงรปภาพท ข.1

รปภาพท ข.1 ระยะเวลาทสารคงอย ( Retention Time, RT) ของ GABA มาตรฐาน และกรดแอมโน อสระ

ชนดอนๆ

จากรปภาพท ข.1 เมอฉดสารละลายมาตรฐานของกรดแอมโนชนดอนๆ รวมกบการวเคราะห GABA

พบวาม RT แตกตางกน โดยเรยงตามล าดบดงน

ฮสทดน 2.219 min

มกษ. 4003-2555 14

อารจนน 2.644 min

กลตามน 5.978 min

เซอรลน 9.520 min

กลตาเมต 10.622 min

FMOC 17.023 min

GABA 22.022 min

อะลานน 22.474 min

โพรลน 24.061 min

วาลน 26.754 min

ลวซน 29.779 min

ข.3.4.3 กรดแอมโนทวเคราะหไดจาก HPLC น ามาเปรยบคา RT (retention time) และพนทใตกราฟท

ระดบความ เขมขนตางๆ กบสารมาตรฐาน เพอค านวณปรมาณกรดแอมโนในตวอยางทวเคราะห ซง

ปรมาณพนทใตกราฟของสารมาตรฐาน GABA ทระดบความเขมขนตางๆ แสดงในตารางท ข.2 และ

น ามาแสดงเปนกราฟมาตรฐาน (standard curve) ดงรปภาพท ข. 2

ตารางท ข.2 พนทใตกราฟของ GABA มาตรฐานทระดบความเขมขนตางๆ

(ขอ ข.3.4.3)

ความเขมขน

(mg/l)

พ นทใตกราฟ (peak area)

5 1,817,094.00

10 4,759,386.20

15 8,532,576.70

20 140,417,115.58

30 200,970,697.00

40 800,338,636.00

50 1,200,017,351.00

60 1,400,300,548.00

70 1,700,592,202.00

15 มกษ. 4003-2555

รปภาพท ข. 3 กราฟมาตรฐานของ GABA ทระดบความเขมขน 2 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 15 mg/l 20 mg/l

25 mg/l และ 30 mg/l ทวเคราะหดวย HPLC คาความสมพนธของขอมล (R2 = 0.9993)

รปภาพท ข. 2 กราฟมาตรฐานของ GABA ทระดบความเขมขนตางๆ ทวเคราะหดวย HPLC คา

ความสมพนธของขอมล (R2 = 0.953)

มกษ. 4003-2555 16

ภาคผนวก ค

หนวย

หนวยและสญลกษณทใชในมาตรฐานน และหนวยท SI (International System of Units หรอ

Le Systéme International d’ Unités) ยอมใหใชได มดงน

รายการ ชอหนวย สญลกษณหนวย

ความยาว

นาโนเมตร (nanometer) nm

ไมโครเมตร (micrometer) μm

มลลเมตร (millimeter) mm

เซนตเมตร (centimeter) cm

ปรมาตร มลลลตร (milliliter) ml

ไมโครลตร (microliter) μl

ความเขมขน มลลลตรตอลตร

(milliliter per liter) ml/l

มวล

มลลกรม (milligram) mg

กรม (gram) g

กโลกรม (kilogram) kg

อณหภม องศาเซลเซยส (degree celius) ๐C

เวลา นาท (minute) min

ชงโมง (hour) h