บทท 3

อปกรณและวธการวจย

3.1 อปกรณและเครองมอ 1. Auto Pipette, 2,10,20,200,1000 µl (Biorad, USA) 2. Autoclave (Sanyo, Thailand) 3. Balances, AB204 (Mettler Toledo, Thailand) 4. Centrifuge tube, 15, 50 µl (Neptune, USA) 5. Centrifugation, UNIVERSAL 320R (Hettich Zentrifugen, Germany)

6. Electrophoresis for agarose gel, Sub-cell GT (Biorad, USA) 7. Electrophoresis power supply, ELITE 200 (WEALTEC Corp., Taiwan)

8. Gel documentation (Biorad, USA) 9. Incubator, UNB 100-500 (Memmert, Germany) 10. Laboratory Glass Bottle, 50, 250, 1,000 ml (Duran, USA) 11. Microwave (Sharp, Japan)

12. Microcentifuge tube, 1.5 ml (Molecular Bioproducts, USA) 13. Mini-centrifugation (GIBTHAI Co., LTD, Thailand) 14. Mortar and pestle 15. pH meter (Toledo, Switzerland) 16. PCR tube, (Molecular Bioproducts, USA) 17. Petri dish (Pyrex, USA) 18. Real-time Thermal Cycler, MyiQ5 (Biorad, USA) 19. Refrigerator, 4, 20 oC (Sanyo, Thailand) 20. Shaking incubator, NB 205 (N-Biotek, Korea) 21. Spectrophotometer, UVmini-1240 (Shimadzu, Japan)

22. Thermal Cycler, Mycycler (Biorad, USA) 23. Thermal Cycler, MJ Mini (Biorad, USA) 24. Tip, 50, 200, 1,000 µl (Molecular Bioproducts, USA) 25. Vortex mixer, VX 100 (GIBTHAI Co., LTD, Thailand)

22

3.2 สารเคม 3.2.1 สารเคมและสารละลาย 1. Agar (Criterion, USA)

2. Agarose (Vivantis, Malaysia) 3. Ampicillin (Vivantis, Malaysia) 4. Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 5. dNTPs (Fermentas, USA) 6. EDTA (Vivantis, Malaysia) 7. Ethanol (Merck, Germany) 8. Ethidium bromide (Invitrogen, USA) 9. Gene RulerTM 100 base pair DNA ladder plus (Fermentas, USA) 10. Glacial acetic acid (Lab Scan, Ireland) 11. IPTG (Vivantis, Malaysia) 12. Liquid nitrogen 13. Loading dye (Fermentas, USA)

14. β-Mercaptoethanol (Merck, Germany) 15. N,N’-dimethyl-formamide (Merck, Germany) 16. Oligonucleotide primer (Bio Basic Inc, Canada)

17. Peptone (Criterion, USA) 18. Sodium chloride (BDH and PROLABO, USA)

19. Sodium hydroxide (Merck, Germany) 20. 2X SYBR Green qPCR Master Mix (RBC Bioscience, Taiwan) 21. Tris (Vivantis, Malaysia)

22. X-gal (Vivantis, Malaysia) 23. Yeast extract (Criterion, USA) 3.2.2 เอนไซม 1. DnaseI (Fermentas, USA) 2. M-MuLV® Revertid reverse transcriptase (Fermentas, USA)

3. RiboLock™ RNase Inhibitor (Fermentas, USA)

23

4. Taq DNA polymerase (RBC Bioscience, Taiwan), (Vivantis, Malaysia) 3.2.3 ชดทดสอบ 1. GF-1 Gel DNA Recovery Kits (Vivantis, Malaysia) 2. HIT-DH5α competent cells (RBC Bioscience, Taiwan) 3. InviTrap® Spin Universal RNA Mini Kit (Invitek, Germany)

4. NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel, Germany) 5. T&A Cloning vector kit (RBC Bioscience, Taiwan)

3.3 วธการทดลอง การทดลองท 1 การหาล าดบเบสของ coding sequence ของยน biglycan 1. การเกบตวอยางชาง เกบตวอยางเนอเยอผวหนงทมบาดแผลของชาง 3 เชอก และเนอเยอซากชางจ านวน 6 เชอก ดงรายละเอยดตอไปน ตาราง 4 แสดงประวตชางทมบาดแผล ล าดบท

ชอชาง อาย เพศ สถานทเกบตวอยาง

1 พงสายทอง 50 เมย ปางชางแมแตง จ.เชยงใหม 2 พงโมมะเอ 18 เมย โรงพยาบาลชาง ศนยอนรกษชางไทย

จ.ล าปาง 3 พงโมเกรด 19 เมย โรงพยาบาลชาง มลนธ เพอนชาง จ.

ล าปาง

24

ตาราง 5 แสดงประวตชางตาย และเนอเยอตางๆทไดรบจากซากชาง

ล าดบท ชอชาง อาย เพศ เนอเยอ

1 พงบวเงน 50 ป เมย skin, pancrease, heart, cartilage, large intestine, kidney, lung, muscle, spleen, liver, cecum

2 พลายทองแท 4 ป ผ heart, lung, spleen, liver, lymph node, small intestine

3 ลกของพงแบน 1 วน ผ heart, kidney, spleen, liver, lymph node, thymus, placenta

4 พลายหลมสก 3 ป ผ heart, kidney, small intestine 5 พลายคด 50 ป ผ skin, heart, large intestine, kidney, lung,

spleen, liver, small intestine 6 พงสมใจ 60 ป เมย cartilage, kidney, spleen

2. การสกด RNA จากเนอเยอชาง เนอเยอชางทเกบจากแผลชางทมชวตและเนอเยอสวนตางๆจากซากชาง ตดเปนชนขนาด 1x1 cm3 จากนนน าเนอเยอมาชงประมาณ 20 mg แลวน าไปลางดวย phosphate buffer saline (PBS) และบดเนอเยอใหละเอยดดวยไนโตรเจนเหลวและโกรงทผานการฆาเชอ สกด RNA โดยใชชดสกดส าเรจรป InviTrap® Spin Universal RNA Mini Kit (Invitek, Germany) ซงสามารถอธบายวธการพอสงเขปได ดงน

1. เตม lysis buffer 600 µl ซงไดผสม β-Mercaptoethanol 6 µl แลว ลงในเนอเยอทบดละเอยดแลวในหลอดขนาด 1.5 ml จากนนน าไปปนเหวยง ท 10,500 รอบตอวนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 2 นาท

2. ดดสารละลายใสดานบน (supernatant) ออกมาใสหลอดใหม และเตมเอทานอลเขมขน 100% บมไวทอณหภมหอง เปนเวลา 1 นาท จงดดสารละลายไปผาน column เพอจบ RNA ไวบนแผน membrane ของ column

3. เตม buffer R1 600 µl น าไปปนเหวยงท 10,500 รอบตอวนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 30 วนาท เทของเหลวทตกลงมาในสวนลางของ column ทงไป

25

4. เตม buffer R2 700 µl น าไปปนเหวยงท 10,500 รอบตอวนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 30 วนาท เทของเหลวทตกลงมาในสวนลางของ column ทงไป

5. เตม Dnase I 10 µl บมทอณหภมหอง เปนเวลา 10 นาท หลงจากนนก าจด Dnase I ออกจาก RNA โดยการลางดวย buffer R2 700 µl น าไปปนเหวยงท 10,500 รอบตอวนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 30 วนาท เทของเหลวทตกลงมาในสวนลางของ column ทงไป

6. เตม buffer R2 700 µl อกครงจากนนเหวยงท 10,500 รอบตอวนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 5 นาท

7. น า column มาใสหลอดทดลองขนาด 1.5 ml เพอเกบ RNA ทงหมดโดยเตม elution buffer 30 µl บมทอณหภมหอง เปนเวลา 5 นาท น าไปปนเหวยงท 10,500 รอบตอวนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 1 นาท และเกบรกษาไวทอณหภม -80oC

3. การวดปรมาณและตรวจสอบคณภาพ RNA วเคราะหปรมาณและคณภาพของ RNA ทสกดได โดยการวดคาดดกลนแสง (absorbance: A) ดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 260 nm (A260) และ 280 nm (A280) ซงการวดคณภาพของสารละลาย RNA สามารถค านวณจากอตราสวนระหวางคา OD260 และ OD280 โดย RNA บรสทธจะมคาประมาณ 1.9-2.1 จากนนน าไป run gel electrophoresis ดวย 1% agarose gel ใน 1 เทา TAE buffer โดยใชก าลงไฟ 100 โวลต เปนเวลา 30 นาทและน าไปยอมดวย Ethidium Bromide (EtBr) เปนเวลา 10 นาท แชน ากลน 10 นาท กอนน าไปตรวจสอบตรวจสอบแถบ RNA และถายภาพดวยเครอง Gel documetator (Biorad, USA) 4. การสงเคราะห complementary DNA (cDNA) RNA ทสกดไดจากเนอเยอชางจะท าใหกลายเปน cDNA สายคโดยใชเอนไซม M-MuLV®

Revertid reverse transcriptase (Fermentas, USA) ซงมขนตอนดงน 1. เตรยม PCR tube ใหมไว 2 หลอด โดยในหลอดแรกเตมสารดงตอไปน

oligo dT18 (10 µM) 1 µl 10 mM dNTP 2 µl DEPC water 6 µl RNA 8 µl

26

ผสมสารทงหมดในหลอดใหเขากนจากนนจงบมไวทอณหภม 65oC เปนเวลา 5 นาท แลวจงน าไปแชในน าแขงทนท เปนเวลา 1-2 นาท

2. เตรยม PCR tube ใหม หลอดทสอง โดยเตมสารดงตอไปน 5X buffer RT (Fermentas, USA) 4 µl RiboLock™ RNase Inhibitor (Fermentas, USA) 1 µl M-MuLV® Revertid reverse transcriptase (Fermentas, USA) 1 µl

3. ผสมสารละลายจาก PCR tube หลอดท 1 ลงใน PCR tube หลอดท 2 (ปรมาตรสดทายเทากบ 23 µl) จากนนจงน าไปบมทอณหภม 37oC เปนเวลา 5 นาทและ 42oC เปนเวลา 90 นาท แลวจงหยดปฏกรยาทอณหภม 70oC เปนเวลา 10 นาท

4. เกบตวอยาง cDNA ทสงเคราะหไดทอณหภม -20oC และน าบางสวนมาเจอจางลงโดยใชความเขมขนเปน 1:5 เพอใชเปนตนแบบ (template) ในการศกษาตอไป 5. การออกแบบ primer

การออกแบบ primer เรมจากการเพมปรมาณชนสวนของยน biglycan ในชางเอเชยจากบรเวณทเปน conserved sequence เนองจากยงไมมฐานขอมลยน biglycan ของชางเอเชย โดยการคนหาล าดบเบสของ cDNA ของยน biglycan จากสตวเลยงลกดวยน านมหลายชนดในฐานขอมล GenBank (วว (NM_178318), หม (XM_003135475), หน (mice) (NM_007542), หน (rat) (XM_001057996), ลงอรงอตง (NM_001132116), สนข (NM_001003229), กระตาย (NM_001195691) และ แกะ (NM_001009201)) แลวน าล าดบเบสมาท า alignment โดยใชโปรแกรม Clustal X (Larkin et al., 2007) ซงจะท าใหไดบรเวณทเปน conserved sequence 2 บรเวณ น าล าดบเบสบรเวณ conserve sequence นนมาออกแบบเปน primer โดยใชโปรแกรม Primer Premier 5.0 (Lalitha, 2000) ออกแบบ primer (BGNF-1, BGNR-1) (ภาพ 8) ตอมาเมอได primer ทงสองแลว จงน ามาเพมปรมาณชนสวนยน biglycan โดยเทคนค PCR ใหมขนาดประมาณ 204 bp จากนนเมอไดชนสวน biglycan แลวน ามาเปนขอมลในการออกแบบยน biglycan ถดไปอกใน 2 บรเวณโดยออกแบบ primer 2 ค (BGNF-2, BGNR-2 และ BGNF-3, BGNR-3) ทงนรวมกบอาศยขอมลล าดบเบสของยน biglycan ในชางแอฟรกาจากฐานขอมล GenBank (XM_003421701.1) มความยาว 1,110 bp โดยออกแบบใหครอบคลมสวนของ start codon และ stop codon และใหมล าดบเบสเหลอมซอนกน (ภาพ 9) ล าดบเบสของ primer แสดงในตาราง 6

27

ภาพ 8 แสดง conserved sequence ส าหรบการออกแบบ primer, ลกศรแสดงต าแหนง primer BGNF-1, ลกศร แสดงต าแหนง primer BGNR-1

ภาพ 9 ต าแหนง primer ทใชเพมปรมาณ cDNA ของยน biglycan (อางอง cDNA ของชางแอฟรกาจากฐานขอมล GenBank (accession number: XM_003421701.1)

28

ตาราง 6 ล าดบเบสของ primer ทใชในปฏกรยา polymerase chain reaction (PCR) ส าหรบเพมปรมาณบรเวณ coding sequence ของยน biglycan ของชางเอเชย

Primer Sequence (5’--> 3’) Ta (°C) Product size (bp)

BGNF-1 Fw: CTACATCTCCAAGAACCACC BGNR-1 Rw: GATGGCCTGAAGCTCAA 60 204 BGNF-2 Fw: CCATGAGGCCCCTATGTCTT BGNR-2 Rw: CAGGTTCAAAGCCACTGTTCTCC 61 610 BGNF-3 Fw: GAACACGAACTGCATCGAGAT BGNR-3 Rw: CTACTTCTTGTAGTTGCCAAATTG 57 559

Ta = annealing temperature 6. ปฏกรยา polymerase chain reaction (PCR) cDNA ของชางเอเชย ถกใชเปน template ในปฏกรยา PCR เพอเพมปรมาณ cDNA ของยน biglycan โดยใชค primer ดงตาราง 6 และมสวนผสมของปฏกรยา ดงตาราง 7 โดยใชโปรแกรมควบคมอณหภมของปฏกรยา PCR ดงตาราง 8 ตาราง 7 สวนประกอบของสารเคมส าหรบการเพมปรมาณ cDNA ในบรเวณ coding sequence ของยน biglycan

สารทใช ความเขมขนสดทาย ปรมาตร (µl)

DEPC water - 13.3 10X PCR buffer 1X 2.0 10 mM dNTP 0.25 mM 0.5 10 µM Forward 0.25 µM 0.5 10 µM Reverse 0.25 µM 0.5 5U/µl Taq DNA polymerase 1U 0.2 cDNA Template - 3.0 Total 20

29

ตาราง 8 โปรแกรมการควบคมอณหภมส าหรบการเพมปรมาณ cDNA ในบรเวณ coding sequence ของยน biglycan ดวยเครอง thermocycle ขนตอนปฏกรยา อณหภม (°C) นาท จ านวนรอบ

Pre-denaturation 94 2.00 1 denaturation 94 0.30 annealing ตาราง 6 0.30 extension 72 2.00 38 final extension 72 10.00 1

ตรวจสอบผลผลต PCR บน agarose gel electrophoresis ทความเขมขน 1% ยอมดวย ethidium bromide และสองภายใตแสง ultraviolet 7. การสกดแยก PCR จาก agarose gel สกดแยกแถบชนสวนยนทตองการออกจาก agarose gel เพอน าไป clone gene โดยใชชดสกดส าเรจรป GF-1 Gel DNA Recovery Kits (Vivantis, Malaysia) มขนตอนดงน 1. น า PCR ไป run gel electrophoresis จากนนตดแถบทตรงกบขนาดยนทตองการ

2. เตม buffer GB อตราสวน 1 volumn : 1 volumn gel และน าไปบมทอณหภม 50oC จนกระทง gel หลอมละลายจนหมด

3. ดดของเหลวลงใน column จากนนน าไปปนเหวยงท 10,000 xg เปนเวลา 1 นาท เทของเหลวทตกลงมาในสวนลางของ column ทงไป

4. เตม wash buffer 750 µl จากนนน าไปปนเหวยงท 10,000 xg เปนเวลา 1 นาท เทของเหลวทตกลงมาในสวนลางของ column ทงไป และปนเหวยงท 10,000 xg เปนเวลา 1 นาท อกครงเพอท าให column แหง

5. น า column ไปตอกบหลอดทดลองใหมขนาด 1.5 ml แลวเตม elution buffer ประมาณ 30 µl จากนนบมไว 2 นาท น าไปปนเหวยงท 10,000 xg เปนเวลา 1 นาท จากนนเกบสารดานลางซงเปน PCR ขนาดทตองการในอณหภม -20oC

30

8. การโคลนชนสวนยน 1. การเชอมตอชนยน biglycan กบ TA cloning vector (ligation)

น าชนสวนยน biglycan ทไดจากผลผลต PCR ซงปลายของผลผลต PCR นเกดจากกจกรรมการท างานของเอนไซม Taq DNA polymerase มการเตม A-overhang ทบรเวณปลาย 3’ มาเชอมตอเวคเตอร TA cloning vector (RBC Bioscience, Taiwan) ทมปลายเปดเปน T-overhang ซงมสวนผสมของปฏกรยาดงน

PCR product 5.0 µl 10X ligation buffer A 1.0 µl 10X ligation buffer B 1.0 µl TA cloning vector 2.0 µl T4 DNA ligase 1.0 µl แลวน าสารไปบมทอณหภม 4oC เปนเวลา 24 ชวโมง และ 70oC 5 นาท เพอหยดการท างาน

ของเอนไซม T4 DNA ligase (RBC Bioscience, Taiwan) 2. การสงถาย recombinant vector เขาสแบคทเรย Escherichia coli สายพนธ DH5α (Transformation) น าสารละลายทไดจาก ligation 2 µl มาผสมกบเซลล competent E.coli DH5α (RBC Bioscience, Taiwan) ปรมาตร 20 µl และผสมใหเขากน แลวบมบนน าแขงนาน 8 นาท จากนนน าไป spread บน LB agar ทม 100 µg/ml ampicillin 20 µl 0.1 M IPTG และ 40 mg/ml X-gal จากนนน าไปบมทอณหภม 37 oC 16-18 ชวโมง 3. การตรวจสอบโคโลนแบคทเรยทตองการดวยวธ colony PCR จากการเพาะเลยงเชอแบคทเรยทถกสงถายเวคเตอร เฉพาะโคโลนทไดรบเวคเตอรเทานนทสามารถเจรญบนอาหารเลยงเชอไดเนองจาก TA cloning vector จะมยน ampicillin resistant อยจงสามารถเจรญบนอาหารทม ampicillin ได และโคโลนแบคทเรยทสามารถเจรญบนอาหารนไดมอย 2 แบบคอ โคโลนสขาว (white colony) และโคโลนสน าเงน (blue colony) โดยโคโลนทถกเลอกเปนโคโลนสขาว เนองจากมชนสวนยนแทรกอยในต าแหนง multiple cloning site ชวงยน ß-galactosidase ซงท าใหการท างานของเอนไซมผดปกต จงไมสามารถยอย X-gal ซงเปน substrate ได และไดท าการพสจนวามชนดเอนเอทเขาไปแทรกอยระหวาง TA cloning vector วาเปนขนาดชนทตองการโดยใช universal primer M13 (M13-forward: GTTTTCCCAGTCACGAC และ M13-reverse: TCACACAGGAAACAGCTATGAC) โดยมสวนผสมของปฏกรยาดงตาราง 9 โดยใชโปรแกรมควบคมปฏกรยา PCR ดงตาราง 10 และยายโคโลนดวยกนลงบน LB Agar ทม 100 µl/ml

31

ampicillin เพอใชเปน replica plate ส าหรบโคโลนทตรวจสอบ แลวบมไวทอณหภม 37 oC ใชเวลาประมาณ 16-18 ชวโมง จากนนตรวจสอบผลผลต PCR บน agarose gel electrophoresis ทความเขมขน 1% ยอมดวย ethidium bromide และสองภายใตแสง ultraviolet ตาราง 9 สวนประกอบสารเคมส าหรบการท า colony PCR เพอคดเลอกโคโลนแบคทเรยทไดรบเวคเตอรทตองการดวย M13 universal primer

สารทใช ความเขมขนสดทาย ปรมาตร (µl)

DEPC water - 20.8 10X PCR buffer 1X 2.5 10 mM dNTP 0.2 mM 0.5 10 µM Forward 0.2 µM 0.5 10 µM Reverse 0.2 µM 0.5 5U/µl Taq DNA polymerase 1U 0.2 Colony - - Total 25

ตาราง 10 โปรแกรมการควบคมอณหภมของการท า colony PCR ดวย M13 universal primer ขนตอนปฏกรยา อณหภม(°C) นาท จ านวนรอบ

Pre-denaturation 95 5.00 1 denaturation 94 0.20 annealing 60 0.30 extension 72 1.30 38 final extension 72 7.00 1

32

9. การสกด plasmid DNA น าเชอแบคทเรยทม vector ซงมยน biglycan แทรก มาเลยงในอาหารเหลว LB broth ทม 100 µg/ml ampicillin ปรมาตร 1 ml นาน 16 -18 ชวโมง เพอน ามาสกด plasmid ดวยชดสกดส าเรจรป NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel, Germany) ซงสามารถอธบายวธการพอสงเขปไดดงน 1. ดด LB medium ทมเซลลแบคทเรย 1 ml ลงใน 1.5 microcentrifuge tube จากนนน าไปปนเหวยงท 11,000 xg เปนเวลา 30 วนาท ก าจด supernatant ทง 2. เตม Buffer A1 250 µl ใชปเปตดดเปาเพอใหตะกอนแบคทเรยละลาย 3. เตม Buffer A2 250 µl พลกหลอดกลบขนลง 6-8 ครง บมไวทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท จะสงเกตสของสารละลายจางลง และเตม Buffer A3 300 µl พลกหลอดกลบขนลง น าไปปนเหวยงทความเรว 11,000 xg เปนเวลา 5 นาท 4. ดด supernatant (ประมาณ 750 µl) ใส column และปนเหวยงทความเรว 11,000 xg เปนเวลา 1 นาท เทของเหลวทตกลงมาในสวนลางของ column ทงไป 5. เตม Buffer A4 600 µl ลงใน column แลวปนเหวยงทความเรว 11,000 xg เปนเวลา 1 นาท เทของเหลวทตกลงมาในสวนลางของ column ทงไป และน าไปปนเหวยงทความเรว 11,000 xg เปนเวลา 2 นาท 6. น า column ไปตอกบ microcentrifuge tube ใหม ขนาด 1.5 ml และเตม Buffer AE 30 µl บมทอณหภมหอง 1 นาท และปนเหวยงทความเรว 11,000 xg เปนเวลา 1 นาท และเกบ plasmid ทอณหภม -20oC 7. ตรวจสอบ plasmid DNA ทสกดไดดวย 1% agarose gel electrophoresis และเครอง spectrophotometer 8. น า plasmid DNA ทไดไปหาล าดบเบสดวยเครอง Automate sequencer (1st BASE, Malaysia 10. การวเคราะหล าดบเบส สมเลอก clone ทมยน biglycan แทรก ไปวเคราะหล าดบเบสโดยบรษท 1st BASE Laboratories ประเทศมาเลเซย โดยสมเลอกไปชนสวนละ 3 โคโลน จากตวอยางชาง 3 เชอก คอ พงสายทอง โมมะเอ พงบวเงน จากนนน าผลล าดบเบสทไดไปเปรยบเทยบกบฐานขอมล GenBank

33

โดยใชโปรแกรม BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) เพอยนยนวาเปนยน biglycan และน ามาท า alignment โดยโปรแกรม clustal X (Larkin et al., 2007) เพอตดตอล าดบเบสของ coding sequence จากนนพจารณาความคลายคลงกนระหวางล าดบเบสของ coding sequence กบล าดบเบสของสงมชวตอนๆทปรากฏในฐานขอมล GenBank โดยพจารณาจากคา E-value ซงตองมคานอยกวา 1e-30 จงจะถอวามความคลายคลงกนอยางมนยส าคญ 11. การวเคราะหล าดบกรดอะมโน ท าการแปลรหสล าดบเบสของยน biglycan ใหอยในรปกรดอะมโนของโปรตน biglycan โดยอาศยโปรแกรม six frame translation (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html) จากนนน ามาท า multiple alignment เพอวเคราะหความคลายคลงกนของล าดบกรดอะมโนของโปรตน biglycan ในชางเอเชยกบสตวเลยงลกดวยน านมชนดอนโดยใชโปรแกรม clustal X (Larkin et al., 2007) สราง phylogenetic tree และหาคาระยะหางทางพนธกรรม (genetic distance)โดยโปรแกรม Mega 5 (Tamura et al., 2011) และท านาย secondary structure โดยโปรแกรม SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/) การทดลองท 2 การศกษาการแสดงออกของยนดวยวธ real-time PCR 1. การออกแบบ primer ส าหรบปฏกรยา real-time PCR

ออกแบบ primer ยน biglycan โดยใชขอมลล าดบเบสทไดจากการทดลองท 1 และออกแบบ primer ยน GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) ซงอาศยฐานขอมล partial cDNA ของยน GAPDH จากชางเอเชย (accession number: FJ423089.1) แสดงดงตาราง 11

34

ตาราง 11 ล าดบเบสของ primer ทใชในปฏกรยา PCR ส าหรบเพมปรมาณยน biglycan และยน GAPDH ในชางเอเชย

Primer Sequence (5’--> 3’) Ta (°C)

Product size (bp)

BGNF-1 Fw: CTACATCTCCAAGAACCACC BGNR-4 Rw: CAGGTTCAAAGCCACTGTTCTCC 62 179 GAPDHF-1 Fw: ATCACTGCCACCCAGAAGA GAPDHR-2 Rw: TTTCTCCAGGCGGCAGGTCAG 62 213

2. ปฏกรยา real-time polymerase chain reaction (real-time PCR)

น า RNA มาสงเคราะหเปน cDNA ตามขอ 1.3 เพอน ามาเปน template ในการศกษาการแสดงออกของยน biglycan ในเนอเยอตางๆของชางจ านวน 6 เชอก (ตวอยางเนอเยอชางแสดงดงตาราง 12) และศกษาการแสดงออกของยน biglycan เปรยบเทยบระหวางเนอเยอผวหนงทมบาดแผลและผวหนงปกต (ตวอยางเนอเยอชางแสดงดงตาราง 13) ส าหรบปฏกรยา real-time PCR ใช primer ในตาราง 11 มาผสมสารเคมดงตาราง 14 เพอดปรมาณการแสดงออกของยน biglycan เทยบกบยน GAPDH โดยใชโปรแกรมควบคมอณหภมทใชดงตาราง 15 โดยใชเครอง real-time PCR รน MyiQ5 (BioRAD, USA)

ตาราง 12 แสดงขอมลชนดและจ านวนของเนอเยอตางๆจากชางเอเชยทน ามาศกษาการแสดงออกของยน biglycan

เนอเยอ จ านวน (เชอก) เนอเยอ จ านวน (เชอก)

Skin 2 spleen 5 pancrease 1 liver 4 Heart 5 cecum 1 cartilage 2 lymph node 2 large intestine 2 small intestine 3 kidney 5 thymus 1 Lung 3 placenta 1 muscle 1

35

ตาราง 13 แสดงขอมลของชางทมบาดแผลทผวหนงและผวหนงปกต ตาราง 14 สวนประกอบสารเคมส าหรบการท า real-time PCR

สารทใช ความเขมขนสดทาย ปรมาตร (µl)

DEPC water - 6.5 2X SYBR Green qPCR Master Mix 1X 12.5 10 µM Forward 0.2 µM 0.5 10 µM Reverse 0.2 µM 0.5 cDNA - 5.0 Total 25

ตาราง 15 โปรแกรมควบคมอณหภมทใชส าหรบ real-time PCR ขนตอนปฏกรยา อณหภม (°C) นาท จ านวนรอบ

Pre-denaturation 95 5.00 1 denaturation 95 0.15 annealing ตาราง 11 0.30 extension 72 0.30 45 final extension 72 7.00 1

ชอชาง ลกษณะผวหนง

โมมะเอ แผล

โมเกรด แผล

พงสายทอง แผล พงบวเงน ปกต

พลายคด ปกต

36

3. การวเคราะหระดบการแสดงออกของยน ท าการวเคราะหความสมพนธของระดบการแสดงออกของยน biglycan โดยอาศยการค านวณจากขอมลดบทไดจากกราฟของปฏกรยา real-time PCR และน ามาค านวณตามวธการ ของ Livak และ Schmittgen (2001) และ Schmittgen และ Zakrajsek (2000) โดยใชยน GAPDH เปนยนฐานในการเปรยบเทยบระดบการแสดงออก (relative expression) สตร Relative expression = เมอ ΔCT = (CT,biglycan gene - CT,GAPDH gene) CT คอ threshold cycle 4. การวเคราะหขอมลทางสถต ในการศกษาการแสดงออกของยน biglycan ดวยวธการ real-time PCR จากตวอยางเนอเยอของชางโดยไดน าแตละตวอยางมาท าปฏกรยา PCR ทงหมด 3 ครง จากนนจงน าคาทไดมาหาเปนคาเฉลย และสวนเบยงเบนมาตรฐาน ท าการวเคราะหเปรยบเทยบคาเฉลยของขอมลตางๆ ในแตละกลมการทดลอง โดยเปรยบเทยบระดบการแสดงออกของยนระหวางเนอเยอแตละชนด และเปรยบเทยบระดบการแสดงออกของยนในชางทมบาดแผลทผวหนงและผวหนงปกต จากนนน ามาวเคราะหระดบการแสดงออกของยนดวยวธ parametric คอ one-way ANOVA และ t-test และเปรยบเทยบความแตกตางระหวางกลมดวยสถต Tukey ทระดบความเชอมนรอยละ 95 หรอ P<0.05 โดยอาศยโปรแกรม SPSS version 14 (SPSS Inc., Chicago)