Univerzitet u Tuzli

Farmaceutski fakultet

Doktorski studij

Školska: 2014/2015

„Istraživanja stabilnosti proteina

(toplotnom denturacijom, pH

denaturacijom, denaturacijom

ureom) na rekombinantnim

proteinima“.

Dr.sc. Aida Smajlović, docent

• Biofarmaceutci savremeni način liječenja, naročito

malignih i tumorskih oboljenja.

• Biofarmaceutici su uglavnom proteinske strukture,

koja je jako nestabilna, čak i pri malim promjenama

uslova (pH, tamperatura, prisustvo nekih otapala,...),

kada može doći do promjene konformacijskog stanja.

• Biofarmaceutici su proteini (antitijela), nukleinske kiseline

(DNA, RNA, antisense lijekovi, oligonukleotidi) koji se koriste

za terapijske ili in vivo dijagnostičke svrhe.

• Modifikatori biološkog odgovora (engl. biological

modifiers)

• Prirodne supstance identične humanim koje mogu

modifikovati normalan imuni odgovor organizma.

• U biofarmaceutike spadaju: proteini, antitijela, enzimi,

interleukini, hormoni, vakcine...

•FDA (Food and Drug Administration) Biofarmaceutici

se definišu kao biotehnološki proizvodi odnosno bilo

koji virus, terapijski serum, toksin, antitoksin ili analogni

proizvod koji se može primijeniti u prevenciji, tretmanu

ili liječenju bolesti ili povreda kod ljudi .

• Većina biofarmaceutika proizvedena je genetskim

inženjeringom; prva takva supstanca koja je

administrirana u terapeutske svrhe je biosintetisani

humani inzulin, pripremljen metodama rekombinantne

tehnologije,1982. godine.

Razvoj biofarmaceutika

Proizvodnja

biofarmaceutika je

najvažniji

sektor u biotehnološkoj

industriji i jedna

je od najbrže razvijajućih

industrija

visoke tehnologije.

•Prvi primjeri

biotehnoloških

lijekova bili su

jednostavni

proteini –

„replacement

therapy“.

Kasnije je razvoj usmjeren

ka molekularnoj medicini i

otkrivanju većeg broja

gena koji su povezani sa

malignim oboljenjima.

Otkriveni su i klonirani neki

kancer-determinišući geni,

zbog čega se biotehnološki

lijekovi sve više koriste kao

zamjena za hemoterapiju.

Trenutno su u toku

istraživanja na više

od 100 potencijalno

terapijskih gena.

•Kasnih 90-tih

godina više od 350

biotehnoloških

lijekova bilo je u

različitim fazama

razvoja u više od

140 farmaceutskih i

biotehnoloških

kompanija.

•Tada se procijenilo da će

pacijenti oboljeli od

hemofilije, ozbiljne sepse,

ulcera kože,reumatoidnog

artritisa i brojnih kancera

imati koristi u narednim

godinama kada lijekovi

prođu kroz klinička

ispitivanja i dobiju dozvolu

za puštanje u promet.

• Neki od ovih lijekova već su na tržištu (Refacto za

hemofiliju, Fuzeon za terapiju HIV-a, Kineret za

hemoterapiju, Xigris za teške sepse).

• Genetski inženjering (tehnologija rekombinantne DNA)-

vještačko obrazovanje novih kombinacija nasljednog

materijala.

• Genetički kod je univerzalan i može se prenositi iz

jednog organizma u drugi čime se dobija organizam sa

drugačijom kombinacijom gena.

• Takva DNA je hibridna (rekombinantna) - u prirodi se

nikada ne nalazi.

• Genetski inženjering ima za cilj:

-stvaranje novih farmaceutika odnosno

biofarmaceutika (lijekova);

-stvaranje sigurnijih i/ili efikasnijih verzija već postojećih

farmaceutika odnosno biofarmaceutika;

-proizvodnju supstanci identičnih konvencionalno-

napravljenim farmaceuticima, u cilju uštede.

• Primjer biofarmaceutika koji je efikasan u tretmanu

kancera dojke je trastuzumab (Herceptin®),

monoklonsko antitijelo protiv Her2 receptora za tirozin

kinazu, koji je pre-eksprimiran u oko 1/3 tumora dojke.

Klasifikacija biofarmaceutika

•Biofarmaceutike možemo svrstati u dvije skupine:

biofarmaceutike prve generacije i biofarmaceutike

druge generacije.

•Biofarmaceutici prve generacije -

uglavnom kopije

endogenih proteina ili

antitijela, proizvedeni

rekombinantnom DNA tehnologijom.

•Biofarmaceutici druge

generacije - proteini ili

antitijela čije su fizičko-

hemijske karakteristike

dodatno poboljšane

inženjeringom.

Klasifikacioni sistem biofarmaceutika-BCS

(Biopharmaceutical Classification System) uzima u

obzir tri glavna faktora: rastvorljivost, topivost i

intestinalnu apsorpciju lijekova nakon oralne

primjene po trenutnom oslobađanju doze iz čvrste

oralne forme.

•Prema BCS, ljekovite supstance su klasifikovane u

različite grupe:

•1.klasa (visoka topivost i visoka permeabilnost)

•2.klasa (niska topivost, visoka permeabilnost)

•3.klasa (visoka topivost, niska permeabilnost)

•4.klasa (niska topivost i permeabilnost).

Vrste biofarmaceutika

•Biofarmaceutici se danas razvijaju kako bi se pomoću njih borilo sa

karcinomom, virusnim infekcijama, dijabetesom, hepatitisom, multiplom

sklerozom. Prema tome, oni su grupisani u slijedećih sedam glavnih

kategorija:

•Citokini

•Enzimi

•Hormoni

•Faktori zgrušavanja

•Vakcine

•Monoklonska antitijela

•Peptidni terapeutici .

•Trodimenzionalna struktura humanog hormona rasta koji se može svrstati u

biofarmaceutike prikazana je na slici.

Stabilnost biofarmaceutika

• Stabilnost lijekova se definiše kao stepen u kome

dozirni oblik zadržava sve svoje strukturne

karakteristike u navedenim granicama, kroz cijeli

period čuvanja i upotrebe koje je posjedovao i u

vrijeme izrade.

• Cilj ispitivanja stabilnosti ljekovitih preparata je da se

odredi vremenski period u kojem je lijek stabilan,

odnosno za koje vrijeme izgubi najviše 10% dejstva

aktivnog principa, skladišten pod normalnim uslovima.

• Stabilnost: hemijska, fizička, mikrobiološka.

• Na hemijsku stabilnost utiču: pH, temperatura,

svjetlost, priroda rastvarača, prisustvo kiseonika, joni

teških metala, prisustvo peroksida...

• Biotehnološki lijekovi su uglavnom proteini- imaju

nestabilnu strukturu i osjetljivi su na promjene in vivo i

in vitro okruženja.

• Relativno male promjene nekih faktora mogu

narušiti strukturu proteina. Ti faktori su:

- temperatura

- koncentracija soli

-denaturirajuća sredstva (urea, GdnHCl)

- pH

• Terapijska efikasnost biofarmaceutika određena je

njihovom proteinskom trodimenzionalnom strukturom

koja je ovisna o interakcijama između aminokiselina.

•Trodimenzionalna struktura se održava slabim,

nekovalentnim vezama i veoma je osjetljiva čak i na

male promjene u temperaturi ili pH.

•Može doći do denaturacije ili čak razgradnje u

organizmu i eliminacije.

• Proteini mogu umjesto nativnog stanja prilikom svijanja

zauzeti formu agregata ili amiloida,što je nepoželjno.

•Neophodne su mjere za određivanje i poboljšanje

stabilnosti- proteini se koriste u terapeutske svrhe!

•Najpoznatije metode koje se bave studijama stabilnosti

biofarmaceutika su:

Metoda cirkularnog dihroizma

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija

UHPLC ( Ultra-High Performance Liquid Chromatography)

Fluorescentna spektroskopija

•Primarna struktura proteina - podrazumijeva redoslijed vezivanja

aminokiselina u peptidnom lancu.

•Sekundarna struktura- podrazumijeva položaj koji u prostoru zauzimaju atomi

peptidnih veza u molekuli.

•Tercijarna struktura- prostorni raspored svih atoma u molekuli proteina

predstavlja

•Kvaternarna struktura- proteini čija se molekula sastoji iz više od jednog

polipeptidnog lanca.

Stabilnost biofarmaceutika tokom skladištenja

• Tokom skladištenja biofarmaceutika može doći do: racemizacije,

izomerizacije, oksidacije i agregacije.

Biofarmaceutici se skladište na temperaturi između 2 i 8 ºC

• Da bi se spriječilo stvaranje agregata - pažljivo se biraju rastvarači i

pomoćne supstance- ne smiju imati negativno dejstvo po biofarmaceutik.

• Sporije rastvaranje – smanjenje agregacije

• Protresanje oblika- uzrokuje pjenjenje- smanjuje se međuprostor između

vode i zraka.

• Mehanički stres - tokom procesiranja, rukovanja, transporta - uzrokuje

agregaciju biofarmaceutika.

• Jako je bitno: pažljivo rukovanje, transport,

skladištenje - mogu se spriječiti mehanički stresovi -

povećati i održati stabilnost biofarmaceutika.

Metode za određivanje stabilnosti

biofarmaceutika

• Stabilnost: - hemijska ( stabilnost kovalentnih veza )

- konformacijska ( stabilnost svijenog

proteina )

• Definicija: promjena slobodne energije u reakciji

promjene proteina iz nativnog u denaturisano stanje:

G° (T) = -RT ln K(T)

1. Cirkularni dihroizam (CD)

• CD- mjeri razlike u apsorpciji lijevo i desno kružno

polarizovane svjetlosti.

• Mjerenje optičke aktivnosti asimetričnih molekula.

• Mjeri se u dva područja:

- daleki UV CD spektar ( 170-250nm )

- bliski UV CD spektar ( 250- 320 nm )

• Mjerenje CD spektra radi se na temperaturi od 23°C, pomoću

spektropolarimetra.

• on se sastoji od: izvora monohromatskog linearno - polarizovanog

svjetla, optičkog sistema koji ga prevodi u desno i lijevo cirkularno

polarizovanu svjetlost (CPL), detektora i računarskog dijela uređaja

koji izračunava razliku između apsorbovane lijevo cirkularnopolarizovane svjetlosti (LCLP) i desno cirkularno polarizovane

svjetlosti (DCLP).

- ispitivanje sekundarne i tercijarne strukture proteina,

- poređenje strukture proteina iz različitih izvora ili strukture

mutiranih i nativnih proteina,

- ispitivanje uticaja temperature, pH i drugih uvjeta u okolini

ili interakcije sa drugim molekulama (protein-protein ili

protein-ligand) na konformaciju poteina,

- ispitivanje stabilnosti konformacije u stresnim uvjetima (pH,

T, denaturirajući agensi), pronalaženje uslova koji bi

obezbjedili više temperature topljenja i reverzibilnost

termalne denaturacije, dakle uslova koji općenito

povećavaju stabilnost,

- utvrđivanje optimalnih uslova za proizvodnju proteina

CD je metoda naročito pogodna za:

Određivanje sekundarne strukture proteina metodom

cirkularnog dihroizma

• Sekundarna struktura se može odrediti CD

spektroskopijom u "dalekom-UV" spektralnom području

(170-250 nm).

• Hromofora je peptidna veza, a signal nastaje kada se

ona nalazi u normalnom, svijenom stanju.

• Daleki-UV CD spektri zahtijevaju 20-200 μL otopine uzorka koja

sadrži 1 mg/mL do 50 g/mL proteina, u puferu.

Određivanje tercijarne strukture biofarmaceutika

metodom cirkularnog dihroizma

• CD spektar proteina u "bliskom -UV spektru" (250-350 nm)

može biti osjetljiv na određene aspekte tercijarne

strukture.

•Na tim talasnim dužinama hromofore su aromatične

aminokiseline i disulfidne veze, a snimljeni CD signali

odnosno spektri osjetljivi su na ukupnu tercijarnu strukturu

proteina.

• Signali u regiji 250-270 nm mogu se pripisati

fenilalaninskim aminokiselinskim ostacima, signali

270-290 nm mogu se pripisati tirozinskim, a oni u

regiji 280-300 nm mogu se pripisati triptofanskim

aminokiselinskim ostacima.

• Signal u bliskoj- UV CD regiji je dosta slabiji nego u

dalekoj -UV CD regiji.

• Bliski -UV CD spektri zahtijevaju veće količine

proteina za određivanje njihove tercijarne strukture.

Upoređivanje konformacijskih stanja

biofarmacutika pomoću CD

2. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC)

•Parametar koji karakteriše stabilnost sistema (npr.,

svijeno stanje proteina odnosno odvijeno stanje

proteina) je ravnotežna konstanta (K) ili slobodnaenergija (ΔG°) koja predstavlja zbir entalpije (ΔH°) i

entropije (ΔS°).

•Ovi parametri su ovisni o temperaturi kroz promjenu

toplotnog kapaciteta (ΔCp).

•ΔH° i ΔCp se računaju indirektno pomoću van’t Hoff-

ove metode,ili se mjere direktno kalorimetrijom.

•DSC- direktno mjerenje termodinamičkih

parametara koji karakterišu biomolekule.

• Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija

(DSC) je tehnika koja registruje energiju

(energetski fluks) potrebnu za održavanje

nulte temperaturne razlike između

ispitivanog uzorka i referentnog materijala,

pri unaprijed definisanoj brzini grijanja

(hlađenja), uz pretpostavku da se oba

materijala nalaze pod istim uslovima.

• DSC uređaj može raditi u dva režima: izotermskom i adijabatskom

(dinamičkom).

Izotermski metod: temperatura

ispitivanog uzorka i

temperatura referentnog

materijala održavaju jednakim

tokom zagrijavanja, variranjem

snage u oba segmenta peći,

preko koje se dobija promjena

entalpije ili toplotnog

kapaciteta u uzorku u odnosu

na referentni materijal.

Adijabatski režim rada podrazumjeva

da DSC kalorimetar obezbjeđuje

konstantnost toplotnog fluksa

između uzorka i referentnog

materijala. U ovom slučaju, promjena

entalpije ili toplotnog kapaciteta u

uzorku uzrokuje razliku temperature

u odnosu na referentni uzorak, a

mjeri se preko razlike napona između

uzorka i referentnog materijala.

Termodinamički parametri

• DSC-može pratiti termički inducirane prijelaze, a

posebno konformacijske prijelaze bioloških

makromolekula. (npr. između svijenog i odvijenog stanja

proteina ili između pojedinačne i dvostruke uzvojnice

DNA).

•DSC mjeri višak toplinskog kapaciteta molekule koju

ispitujemo (Cp) u funkciji temperature.

• Integracija Cp naspram T krive doprinosi promjenientalpije (ΔH°m).

• DSC je jedina metoda za direktno određivanjepromjene entalpije ΔH°m

DSC i svijanje proteina / stabilnost

• Protein u denaturisanom stanju ima veći toplotni

kapacitet nego onaj u nativnom- ΔCp odvijenog

proteina skoro uvijek pozitivan !

• Na svijanje biofarmaceutika utiču: hidrofobne

interakcije, vodikove veze, konformacijska

entropija, temperatura, pH...

• Temperatura taljenja (Tm)- indikator

termostabilnosti; veći Tm- protein je termostabilniji!

• Uticaj pH na stabilnost- maximalna termička

stabilnost je u blago kiselim uslovima! (studija na

osnovu pH 2-hidroksipropil-b-ciklodekstrin

(HPbCD) saharoze )

3. UHPLC ( Ultra-High Performance Liquid

Chromatography)

• HPLC odnosno tečna hromatografija visokih performansi ili

tečna hromatografija pod visokim pritiskom - oblik kolonske

hromatografije koji se koristi za radzvajanje komponenti iz

smjese na osnovu hemijskih interakcija između supstance

koja se analizira i stacionarne faze u koloni .

• Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane

supstance (ili smjese) kroz kolonu (cijev punjena

materijalom sitnih čestica) pumpanjem tečnosti (mobilna

faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu (stacionarna

faza).

•Vrijeme zadržavanja zavisi od: prirode supstance

koja se analizira, stacionarne faze i sastava mobilne

faze.

• Vrijeme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja

kolone)- retenciono vrijeme i karakteristično je za

određenu supstancu.

• Veći pritisak- veća brzina razdvajanja.

• Rastvarači: voda, metanol, organski rastvarači (u

vodu se može dodati i pufer).

Hromatografija na normalnim fazama

• Stacionarna faza- polarna ; mobilna faza- nepolarna

• Supstanca koja se analizira- polarna!

• Veća polarnost- veća jačina adsorpcije i duže vrijeme

zadržavanja.

Hromatografija na obrnutim fazama

• Stacionarna faza- nepolarna; mobilna faza- polarna

• Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa RMe2SiCl,

gdje je R alkilna grupa ravnog lanca kao C18H37 ili C8H17.

• Dodatkom polarnih rastvarača u mobilnu fazu- povećava se

vrijeme zadržavanja.

• Dodatkom hidrofobnih interakcija- smanjuje se vrijeme zadržavanja.

Uređaj za HPLC se sastoji od sljedećih komponenti:

•Rezervoar mobilne faze

•Pumpa

•Injektor

•Kolona

• Detektor

• Ultra HPLC koristi isti princip metode separacije kao i konvencionalna

HPLC, ali razlika je što UHPLC koristi kolone sa česticama manjeg promjera

od 2 μm.

• Manje čestice omogućavaju: veću efikasnost kolone, povećanje masene

osjetljivosti, analitičke rezolucije te brzine.

•Zahtijeva veći pritisak- samim tim i kvalitetnije pumpe.

• Otkriće RNA interferencije (RNAi) kao mehanizma za

selektivno utišavanje ekspresije messenger RNA (mRNA)

obezbjedilo je ogroman potencijal u okviru

biomedicinskih istraživanja i razvoja lijeka.

• Upotreba malih posredničkih RNA (siRNA) postala je

glavni fokus industrijskih i akademskih laboratorija.

• Jedan od glavnih izazova- učinkovita sistemska

dostava siRNA na ciljnim stanicama.

• Formulacije bazirane na liposomima u lipidnim

nanočesticama (LNP) najviše obećavaju i naširoko se

koriste kao strategija za in vivo isporuku siRNA.

•UHPLC- ključna uloga u karakterizaciji hemijskih

svojstava LNP formulacija!

•UHPLC- visoka propusnost i vrhunska učinkovitost

razdvajanja- brzo i pouzdano određivanje RNA, lipida i

srodnih formulacija u složenim frakcijama.

•Učinkovita i sigurna isporuka siRNA na ciljne

stanice- glavna prepreka u ostvarivanju velikih

mogućnosti siRNA kao terapeutika.

•Katjonski liposomi na bazi lipida u nanočesticama

(LNP)- najefikasniji u riješavanju tih problema.

•LNP- in vivo dostavljanje- poboljšavaju farmakokinetička svojstva sintetičkih

oligonukleotida,štiti od enzimske degradacije.

UHPLC u farmaceutskoj analizi

• UHPLC- uveden je 2004. godine i naširoko je

prihvaćena i popularna metoda u mnogim industrijama.

• UHPLC u odnosu na konvencionalnu HPLC ima

slijedeće prednosti:

Povećana hromatografska separacija

Znatno brža separacija

Povećana masena osjetljivost

Malo odlaganje volumena (brzo ponovno dovođenje u

ravnotežu kolone za gradijent analizu)

Brz odgovor detektora za efikasno eluiranje pikova na

hromatogramu

Korištenje submikroskopskih čestica

• UHPLC je najsavremenija metoda za farmaceutsku

analizu i jako je pogodna za brzo i ultra-brzo odvajanje!

4. Fluorescentna spektroskopija

• Fluorescencija-pojava koja nastane kada supstanca

koja je izložena elektromagnentom zračenju emitira

elektromagnetno zračenje veće talasne dužine od onog

kojim je izložena.

•Kod većine proteina nosioc fluorescencije je triptofan.

• Nukleinske kiseline ne fluoresciraju. Međutim, one se

mogu proučavati fluorescentnom spektroskopijom

ukoliko se vežu za neku pogodnu fluorescentnu

molekulu, tzv. sondu .

Horizontalnim linijama označeni su različiti vibracioni nivoi

(v=0,1,2,3...) osnovnog elektronskog stranja (S0), kao i vibracioni nivoi ekscitiranog elektronskog stanja (S1').

• Razlika u energiji odnosno talasnoj dužini (predstavljena kao hνEX - hνEM)

se naziva Stokes-ov pomak (promjena).

• Stokes-ova pomak (promjena) je fundamentalna za osjetljivost

fluorescentne metode.

• Iako postoje 3 aminokiseline koje posjeduju intrinzna fluorescentna

svojstva (Trp, Tyr, Phe) samo tirozin (Tyr) i triptofan (Trp) koriste se tokom

istraživanja svijanja proteina jer su njihovi kvantni prinosi (emitirani

fotoni/ekscitirani fotoni) dovoljno veliki da bi dali zadovoljavajući fluorescentni

signal.

• Ti aminokiselinski ostaci se mogu upotrijebiti za praćenje svijanja proteina,

jer njihova fluorescentna svojstva (kvantni prinosi) su osjetljiva na okolinu, a

ona se mijenja tokom svijanja ili odvijanja proteina.

• BSA koncentracije 0,1 M

pri ekscitacionoj talasnoj

doužini od 292 nm.

• Maksimum intenziteta

fluorescence na 340 nm

iznosi 135,161 a.u.

• BSA koncentracije 0,1 M

pri ekscitacionoj talasnoj

doužini od 295 nm.

• Maksimum intenziteta

fluorescence na 340 nm

iznosi 84,226 a.u.

• BSA koncentracije 0,2 M

pri ekscitacionoj talasnoj

doužini od 292 nm.

• Maksimum intenziteta

fluorescence na 340 nm iznosi

180,108 a.u.

• BSA koncentracije 0,2 M

pri ekscitacionoj talasnoj

doužini od 295 nm.

• Maksimum intenziteta

fluorescence na 340 nm

iznosi 120,087 a.u.

• Emisijski fluorescentni spektri nativnog goveđeg serum albumina

(C=0,2M), djelimično denturisanog u 1 – 5 M urei i potpuno

denaturisanog u 6M urei, snimljeni u području 300-450 nm pri

ekscitaciji od 292 nm nakon ravnotežne denaturacije od 40 min.

• Emisijski fluorescentni spektri nativnog goveđeg serum albumina

(C=0,2M), djelimično denturisanog u 1 – 5 M urei i potpuno

denaturisanog u 6M urei, snimljeni u području 300-450 nm pri

ekscitaciji od 295 nm nakon ravnotežne denaturacije od 40 min.

Procjena konformacijske stabilnosti pomoću

fluorescentne spektroskopije triptofana

• Fluorescencija svijenih proteina predstavlja

mješavinu fluorescencija iz pojedinih aromatskih

aminokiselinskih ostataka.

• Većina emisija fluorescencija dolazi od triptofanskih

ostataka, rijeđe od tirozinskih i fenilalaninskih.

• Značajne su i disulfidne veze.

• Triptofan ima talasnu dužinu sa maksimalnom

apsorpcijom od 280 nm i emisiju pika u rasponu od 300

do 350 nm, zavisno od polarnosti lokalnog okruženja.

• Na fluorescenciju triptofana utiče i blizina drugih a.k.

ostataka kao npr. asperginskih i glutaminskih,koji mogu

uzrokovati gašenje fluorescencije triptofana.

•Triptofan – relativno rijetka aminokiselina u proteinima (jedan do

nekoliko triptofanskih ostataka).

•Ako protein koji sadrži 1 triptofanski ostatak denaturira-pojava

crvenog pomaka spektra. (zbog izlaganja triptofana vodenomokruženju)

•Dodatak površinski-aktivne tvari (npr. tenzida) proteinu koji sadrži

triptofan-izaziva plavi pomak spektra. (zbog ugrađivanja triptofana

u vezikule ili micele tenzida)

Dužina života

Absorbancija Fluorescencija

Talasna dužina Apsorpcija Talasna dužina Kvant

Triptofan 2.6 280 5,600 348 0.20

Tirozin 3.6 274 1,400 303 0.14

Fenilalanin 6.4 257 200 282 . 0.04

•Fluorescentna spektroskopija triptofana predstavlja

dobar, brz i ekonomičan način za provjeru termičke

konformacijske stabilnosti različitih formulacija,

kakve su i biofarmaceutici.

Karakterizacija rastvora trastuzumaba (Herceptin®)

pomoću fluorescentne spektroskopije

• Terapeutski imunoglobulin trastuzumab (Herceptin®)

bi trebao biti topiv u 0.9% NaCl, a uočeno je i otapanje

u 5% dekstrozi.

• Nakon analize određenom metodom separacije, ne

može se uočiti razlika između trastuzumaba

otopljenog u NaCl-u i trastuzumaba otopljenog u

dekstrozi.

• U 5% dekstrozi se uočavaju agregati.

•Fluorescentna spektroskopija prati promjene u

strukturi (naročito tercijarnoj) proteina-

biofarmaceutika.

•Analiza pokazuje: dolazi do porasta intenziteta

fluorescencije i porasta anizotropija uzorka antitijela,

što uzrokuje njegovo vezivanje za trastuzumab

otopljen u dekstrozi- što uzorkuje stvaranje agregata.

Spektar anizotropije uzorka

antitijela u prisustvu

trastazumaba otopljenog u

0.9%NaCl-u (jasna linija) i

trastazumaba otopljenog u 5%

dekstrozi (isprekidana linija).

Fluorescentni emisioni spektar

uzorka antitijela u prisustvu

trastazumaba otopljenog u 0.9%

NaCl-u ( jasna linija) i 5%

dekstrozi (isprekidana linija).

Biofarmaceutici su proteini (antitijela), nukleinske kiseline (DNA,RNA)

koji se koriste kao lijekovi. Dobijaju se procesima biotehnologije

korištenjem živih organizama.

Posljednjih godina se zapaža veliki porast ovih lijekova na tržištu i

smatra se, da će se ta tendencija za inovacijom i nastaviti.

Koriste se u terapiji raznih teških oboljenja a naročitu primjenu su

našli u liječenju hroničnih inflamatornih oboljenja kao što je

reumatoidni artritis.

S obzirom na proteinsku strukturu- nestabilni su i skloni promjeni svog

osnovnog stanja.

Velika pažnja se posvećuje proučavanju stabilnosti

biofarmaceutika te načinu poboljšavanja iste.

Metode koje se uspješno koriste za proučavanje

stabilnosti biofarmaceutika su: cirkularni dihroizam,

diferencijalna skenirajuća kalorimetrija, UHPLC,

fluorescentna spektroskopija i druge.

Jako je važno pažljivo rukovanje i skladištenje

biofarmaceutika radi očuvanja stabilnosti

biofarmaceutika, i spriječavanja pojave mehaničkih

stresova koje je narušavaju.

Tačkaste mutacije kod rekombinantnih proteina

P74S(E31) i H75W(Y31) ugrađene su na sredini

treće petlje.

-45

-25

-5

15

35

55

75

95

115

135

250 270 290 310

λ[nm]

deg

cm

2 d

mo

l-1

stB(E31)

P74S(E31)

H75W

▄ Spektri u bliskom UV području, koji pojašnjavaju asimetričnu okolinu

aromatskih aminokiselinskih ostataka, pokazali su da oba mutanta

P74S(E31) i H75W(Y31) imaju istu poziciju tirozinskog pika u bliskom

UV području kod 275 nm.

▄ Rekombinantni mutant H75W(Y31) izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg

stefina B (Y31) ima dodatni triptofanski pik kod 254 nm.

▄ CD spektar mutanta P74S(E31) u bliskom-UV području jasno pokazuje

da njegova mutacija ne mjenja tercijarnu strukturu u odnosu na incijalni

protein tj. divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B, tj. ne opažaju se promjene na

rigidnoj okolini aromata

-6000

-4000

-2000

0

2000

4000

6000

8000

195 205 215 225 235 245

λ[nm]

deg

cm

2 d

mo

l-1

stB(E31)

P74S(E31)

H75W

▄ Male razlike u dalekim-UV CD

spektrima posljedica su različite

distribucije oligomera u uzorcima

stefina B (E31) i njegovog mutanta

P74S(E31).

stB(E31)

-7000

-4000

-1000

2000

5000

195 205 215 225 235 245

λ[nm]

de

gc

m2 d

mo

l-1

stB(E31)

stB(E31)-M

stB(E31)-D

Protein %M %D %T %O

stB(E31) 32 33,49 23,54 11,05

P74S(E31) 2,17 73,23 15,92 8,68

Stabilnost proteina

Metode za određivanje

stabilnosti proteina

Denaturacija ureom Toplotna denaturacija

ΔG°N-U

cm

m

ΔH

Tm

termodinamički parametri termodinamički parametri

pH denaturacija

Denaturacija ureom

86420

0

-2000

-4000

-6000

Koncentracija uree [M]

Mo

larn

a e

lip

tiè

no

st

[de

g c

m2

/ d

mo

l]

P74S(E31)

86420

0

-2000

-4000

-6000

Koncentracija uree [M]

Mo

larn

a e

lip

tiè

no

st

[md

eg

cm

2 /

dm

ol]

H75W

86420

0

-2000

-4000

-6000

Koncentracija uree [M]

Mo

larn

a e

lip

tiè

no

st

[de

g c

m2

/ d

mo

l]

stB(E31)

Protein ΔGºN-U(kJ/mol) m (kJ/mol) cm (M)

wt stefin B (E31) -31,29 ± 3,9 6,5 ± 0,8 4,9 ± 0,1

P74S(E31) mutant -40,53 ± 4,7 7,7 ± 0,9 5,3 ± 0,1

H75W(Y31) mutant -20,79 ± 3,1 5,4 ± 0,8 4,3 ± 0,1

▄ Veća vrijednost kooperativnosti (m) tačkastog mutanta P74S(E31) u

odnosu na divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B (E31) i tačkasti mutant

H75W(Y31), najvjerovatnije je posljedica dimerizacije.

▄ Denaturacijske krive prikazuju zavisnost udjela odvijenog proteina od

koncentracije denaturirajućeg sredstva (uree), a izračunate su korištenjem dvo-

stepene aproksimacije (Santoro i Bolen, 1988):

Δε={[(ΔεN+mN x [D])+(ΔεU+mU x [D]) x exp-(ΔG˚N-U/RT+mG x [D]/RT)]/

[1+exp-(ΔG˚N-U/RT+mG x [D]/RT)]}

-Δε je vrijednost signala u mdeg pri izabranoj talasnoj dužini,

-ΔεN i ΔεU su vrijednosti signala pri određenoj talasnoj dužini za svijeni i odvijeni

protein,

-mN i mU predstavljaju nagib bazne crte u pred- i post-tranzicijskom dijelu krive,

-mG nagib pravca u tranzicijskom području,

-[D] je koncentracija denaturirajućeg sredstva,

-ΔG˚N-U slobodna energija odvijanja ekstrapolirana na koncentraciju

denaturirajućeg sredstva 0.

▄ Na osnovu gore navedene jednačine izračunati su udjeli odvijenog proteina u

funkciji koncentracije uree:

fU=(ΔεN- Δε)/(ΔεN- ΔεU)

▄ Ravnotežne denaturacije ureom, pokazuju da se divlji-tip (wt)

čovječijeg stefina B i tačkasti mutanati stefina B P74S(3E31) i

H75W(Y31) odvijaju kooperativno (sekundarna i tercijarna

struktura se odvijaju istovremeno) .

▄ Ovo je jedna od osobina proteina koji se svijaju dvostepeno.

86420

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

koncentracija uree [M]

ud

io o

dvije

no

g p

rote

ina

(fu

) stB(E31)

86420

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

koncentracija uree [M]

ud

io o

dvije

no

g p

rote

ina

(fu

) P74S(E31)

86420

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

koncentracija uree [M]

ud

io o

dvije

no

g p

rote

ina

(fu

) H75W

Toplotna denaturacija

▄ CD spektri snimljeni u dalekom UV području, za divlji-tip (wt) čovječijeg

stefina B u temperaturnom području od 313 K do 363 K, a za mutantne

proteine P74S(E31) i H75W(Y31) u temperaturnom području od 298 K do 368

K, na talasnim dužinama 222 nm i 210 nm, radi određivanja temperature

neophodne za potpuno odvijanje proteina.

▄ CD signali na talasnoj dužini od 222 nm i 210 nm korišteni su za analizu

krivih odvijanja proteina dobivenih toplotnom denaturacijom proteina.

▄ Krive toplotne denaturacije su prilagođene i date kao modifikovana forma

Van´t Hoff-ove jednačine, koja istovremeno prilagođava nativnu i

denaturisanu baznu liniju, kao i tranzicijski region.

▄ Na osnovu modifikovane forme Van´t Hoff-ove jednačine određene su

vrijednosti temperature taljenja Tm i promjene entalpije ∆H za divlji-tip (wt)

rekombinantnog čovječijeg stefina B, tačkasti mutant P74S(E31) i tačkasti

mutant H75W koji su podvrgnuti toplotnoj denaturaciji (Karantzeni i sar.,

2003):

∆ε = (mnT + bn) + (mdT + bd) [K / (1+K)]

gdje je

K = exp[-∆H(1 – T/Tm) / RT]

B

380360340320300

-24000

-28000

-32000

-36000

-40000

Temperatura [K]

md

eg

(2

10

nm

) 210 nm

H75W

C

380360340320

-40000

-44000

-48000

-52000

-56000

Temperatura [K]

md

eg

(2

10

nm

)

210 nm

stB(E31)

A

380360340320300

-30000

-35000

-40000

-45000

-50000

Temperatura [K]

md

eg

(2

10

nm

)

210 nm

P74S(E31)

380360340320

-50000

-52000

-54000

-56000

Temperatura [K]

md

eg

(2

22

nm

) 222 nm

stB(E31)

380360340320300

-48000

-50000

-52000

Temperatura [K]

md

eg

(2

22

nm

)

222 nm

P74S(E31)

380360340320300

-35000

-40000

-45000

-50000

-55000

Temperatura [K]

md

eg

(2

22

nm

) 222 nm

H75W

A

B

C

210 nm 222 nm

Protein ΔGºN-U(kJ/mol) m (kJ/mol) cm (M)

wt stefin B (E31) -31,29 ± 3,9 6,5 ± 0,8 4,9 ± 0,1

P74S(E31) mutant -40,53 ± 4,7 7,7 ± 0,9 5,3 ± 0,1

H75W(Y31) mutant -20,79 ± 3,1 5,4 ± 0,8 4,3 ± 0,1

Protein pH c [μM] Tm210 [K] Δ H210 [kJ/mol]

stB(E31) 7 47 349,91±0,44 756,41±167,95

P74S(E31) 7 47 352,61±0,44 587,40±133,0

H75W 7 47 341,90±0,95 1287,09±218,20

Red stabilnosti proteina

P74S(E31) > stB(E31) > H75W(Y31)

Strukturna karakterizacija intermedijata svijanja

stB(Y31)

-30

0

30

60

90

120

150

250 270 290 310

λ[nm]

de

gc

m2 d

mo

l-1

stB(Y31); pH=6,04

stB(Y31); pH=4,8

Ravnotežni spektri izo-oblika divljeg-

tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) pri

pH 6,04 (nativan protein) i pH 4,8

(nepotpunog ponovnog svijanja u

0,015 M acetatnom puferu 0,15 M

NaCl, pH 4,8).

▄ CD spektar intermedijata svijanja sličan spektru nativnog

proteina, ali je nešto nižeg intenziteta

▄ Pokazuje vrijednost amplitude približno 66% od amplitude

tercijarne strukture nativnog proteina .

▄ Dakle, radi se o intermedijatu „nativnom stanju sličnom“, koji

nastaje u uslovima nepotpunog refoldinga kod pH 4,8 (0,015 M

acetatnom puferu 0,15 M NaCl), tj. uslovima pH u kojima se

opaža nastajanje fibrila izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg

stefina B.

stB(Y31)

-5000

-3000

-1000

1000

195 205 215 225 235 245

λ [nm]

deg

cm

2 d

mo

l-1

stB(Y31)

Daleki UV CD spektar od 250 do 195

nm izo-oblika divljeg-tipa (wt)

čovječijeg stefina B (Y31) snimljen

nakon denaturacije u 0,02 M TEA

puferu i nepotpunog ponovnog

svijanja u 0,015 M acetatnom

puferu 0,15 M NaCl, pH 4,8.

▄ „Nativnom stanju sličan“ intermedijat, nastao u

blago kiseloj sredini kod pH 4,8 (0,015 M acetatnom

puferu 0,15 M NaCl, pH 4,8) imao je u potpunosti

uspostavljenu sekundarnu strukturu.

Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt)

čovječijeg stefina B (Y31) i njegovog mutanta

H75W(Y31)

Metode za određivanje kinetičkih faza

svijanja i konstanti brzine svijanja proteina

metoda ANS (1-anilino-

naftalen 8–sulfonat)

fluorescence

metoda ANS (1-anilino-

naftalen 8–sulfonat)

fluorescence

metoda Trp fluorescence

metoda ThT fluorescence

H75W(Y31) stB(Y31)

Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt)

čovječijeg stefina B (Y31) praćena ANS

fluorescencom kod pH 4,8

6040200

9,2e+005

8,8e+005

8,4e+005

8e+005

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=4,8; 36°C; k2

stB(Y31)

A2

80006000400020000

1,4e+006

1,2e+006

1e+006

8e+005

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM; pH=4,8; 36°C; k3

stB(Y31)

A3

8642

9,2e+005

8,8e+005

8,4e+005

8e+005

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=4,8; 36°C; k1

stB(Y31)

A1

▄ U trećoj kinetičkoj fazi svijanja,

koja se odvijala u intervalu od 60 do

7000 s, sa konstantom brzine k3,

došlo je do porasta ANS

fluorescence i stvaranja „nativnom

stanju sličnih“ intermedijata.

1512963

92000

88000

84000

80000

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=5,8; 36°C; k1

stB(Y31)

80604020

90000

87000

84000

81000

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=5,8; 36°C; k2

stB(Y31)

9006003000

96000

92000

88000

84000

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=5,8; 36°C; k3

stB(Y31)

80006000400020000

96000

93000

90000

87000

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=5,8; k4

stB(Y31)

▄ Kod pH 5,8 čovječiji stefin B (Y31) se svijao preko dva intermedijata, prvog

kratkoživućeg (15 s) i intermedijata 2 (900 s) nakon čega se u 7000 s

uspostavila nativna konformacija.

Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) praćena

ANS fluorescencom kod pH 5,8

6040200

1,8e+005

1,6e+005

1,4e+005

1,2e+005

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k3

stB(Y31)

80006000400020000

1,6e+005

1,4e+005

1,2e+005

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k4

stB(Y31)

A1

A2

▄ Slična kinetika svijanja opažena je

i kod pH 7,0 s tim da su se

konformacije intermedijata

uspostavljale brže, a nativna

konformacija se počela

uspostavljati već nakon 60 s.

▄ Sa povećanjem pH od 4,8 na 5,8

odnosno 7,0 povećale su se

konstante brzina nastajanja

intermedijata svijanja, a smanjilo

se vrijeme njihovog života.

Kinetika svijanja izo-oblika divljeg-tipa (wt) čovječijeg

stefina B (Y31) praćena ANS fluorescencom kod pH

7,0

▄ ANS fluorescencom, Trp fluorescencom i ThT fluorescencom praćena

kinetika svijanja mutanta H75W(Y31) je pokazala da se protein kod pH 4,8 svijao u

jednoj kinetičkoj fazi do intermedijata, na osnovu čega se može zaključiti da se

njegov mehanizam svijanja razlikuje od mehanizma svijanja izo-oblika divljeg-

tipa (wt) čovječijeg stefina B (Y31) kod ovog pH.

80006000400020000

2e+005

1,6e+005

1,2e+005

80000

40000

Vrijeme [s]

Inte

nzit

et A

NS

flu

ore

scen

ce (

"a.u

.")

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=4,8; 36°C; k1

H75W

80006000400020000

1000

800

600

Vrijeme [s]

Inte

nzit

et T

rp f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

Trp fluorescenca; pH=4,8; 36°C; k1

H75W

80006000400020000

52000

48000

44000

40000

36000

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

ThT

flu

ore

scen

ce (

"a.u

.")

ThT fluorescenca; 6 M urea; pH=4,8; 36°C; k1

H75WT

rp f

luo

rescen

ca

Kinetika svijanja mutanta

H75W(Y31) kod pH 4,8

80006000400020000

6000

4000

2000

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=5,8; 36°C; k1

H75W

80006000400020000

1000

800

600

400

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

Trp

flu

ore

scen

ce (

"a.u

.")

Trp fluorescenca; pH=5,8; 36°C; k1

H75W

A

B

▄ ANS fluorescencom i Trp

fluorescencom praćena

kinetika svijanja mutanta

H75W(Y31) je pokazala da

se protein kod pH 5,8 svijao u

jednoj kinetičkoj fazi do

intermedijata što je slično

kinetici svijanja ovog proteina

kod pH 4,8.

20161284

1640

1600

1560

1520

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k1

H75W

8642

1920

1900

1880

1860

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

Trp

flu

ore

scen

ce (

"a.u

.")

Trp fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k1

H75W

25002000150010005000

1650

1600

1550

1500

1450

1400

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k2

H75W

12010080604020

1850

1800

1750

1700

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

Trp

flu

ore

scen

ce (

"a.u

.")

Trp fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k2

H75W

6800640060005600

1480

1440

1400

1360

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

AN

S f

luo

resc

ence

("a

.u."

)

ANS fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k3

H75W

80006000400020000

2000

1800

1600

Vrijeme [s]

Inte

nzi

tet

Trp

flu

ore

scen

ce (

"a.u

.")

Trp fluorescenca; 3 mM ANS; pH=7,0; 36°C; k3

H75W

▄ Kod pH 7,0 mutant H75W se svijao u tri kinetičke faze do

uspostavljanja strukture intermedijata 2, analogno svijanju čovječijeg

stefina B (Y31) na pH 4,8.

Puno zdravlja, ljubavi, sreće i uspjeha na predstojećim

ispitnim rokovima u novoj 2015. godini