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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

JULIO CESAR SANTANA ALVES

INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO EIXO

[ECA2/ANG(1-7)/Mas] ENCEFÁLICO PARA O

CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO EM

RATOS

ARACAJU

2013


INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO

EIXO [ECA2/ANG(1-7)/Mas] ENCEFÁLICO PARA O

CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO EM

RATOS

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-

Graduação em Medicina da Universidade

Federal de Sergipe como requisito parcial à

obtenção do grau de Mestre em Ciências da

Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior

ARACAJU

2013

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

A

474i

Alves, Julio Cesar Santana

Influência de hormônios gonadais no eixo [ECA2/ANG(1-7)/Mas] encefálico para o controle

da sede e apetite por sódio em ratos / Julio Cesar Santana Alves – Aracaju, 2013.

74 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior.

Dissertação (mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, 2013.

1. Fisiologia endócrina. 2. Hormônios gonadais. 3. Enzima conversora da angiotensina. 4.

Sede. I. Passos Junior, Daniel Badauê, orient. II. Título.

CDU 612.459:612.39


INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO

EIXO [ECA2/ANG(1-7)/Mas] ENCEFÁLICO PARA

O CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO

EM RATOS

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-

Graduação em Medicina da Universidade

Federal de Sergipe como requisito parcial à

obtenção do grau de Mestre em Ciências da

Saúde.

Aprovado em: ____/_____/____

__________________________________________________

1º Examinador: Prof. Dr. DANIEL BADAUÊ PASSOS JÚNIOR

__________________________________________________

2º Examinador: Prof. Dr. LUIS CARLOS REIS

__________________________________________________

3° Examinador: Profa.Dra. VIRGÍNIA MARA PEREIRA

PARECER

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a minha esposa e aos

meus filhos como forma de retribuição ao

amor e a paciência com que suportaram as

etapas desta dissertação até este momento.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço aos meus pais, José Augusto e Maria Helena que

sempre acreditaram que eu poderia chegar muito além dos meus limites. Obrigado pelo

incentivo e a afetividade com a qual pude contar durante toda a minha vida. Se hoje

galguei este degrau foi pela força e garra que vocês me ensinaram a ter.

Não poderia deixar de agradecer também a minhas irmãs, Cinthia e Laura por

brigar comigo sempre que falava em desistir, me fazendo acreditar em meu sonho acima

de qualquer dificuldade. Lau obrigado por plantar uma pequena semente de esperança

de que poderia seguir esta carreira tão bela que não é fácil, mas que possui seus

encantos. AMO VOCÊS.

A minha esposa, Franklane por suportar as minhas intempéries no decorrer desta

dissertação e principalmente a minha ausência em momentos importantes da nossa

família, sei que não foi nada fácil para você minha querida, TE AMO MUITO.

Aos meus filhos, Julia e Caio que no decorrer deste trabalho não permitiram que

a tristeza pudesse me envolver. PAPAI AMA MUITO VOCÊS!

À família LANBAC, Saulo, Laís, Marilia, Iura, Cibelle, Edênia, Demétrius,

Danielle e Cristiano Gaujac, Patrícia e Camilla pelo apoio científico e emocional

constante em que se dedicaram e se preocuparam para que o trabalho fosse cumprido da

melhor forma possível. Em especial, abro um parêntese para agradecer a Iura Gonzales

por compartilhar seus conhecimentos em estatística e ouvir pacientemente minhas

angústias, transmitindo serenidade. MUITO OBRIGADO!

À todos que fazem o Laboratório de Biologia Celular (LBCE), professor

Waldecy de Lucca Junior, aos alunos de mestrado e iniciação científica, em especial,

Rodrigo, Ramon, Elis, Renan e outros. MUITO OBRIGADO!

À equipe do LAFAC (Laboratório de Farmacologia Cardiovascular) pela

gentileza em atender a demanda por espaço para realização das cirurgias. OBRIGADO.

Agradeço também ao Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos, do

Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG, pelas drogas gentilmente cedidas

para a realização deste estudo.

Não poderia deixar de agradecer aos docentes, discentes e funcionários do

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da UFS, pela enorme contribuição

dada a minha formação de mestre.

Gostaria de agradecer ainda ao CNPq e a FAPITEC/SE pelo suporte financeiro

dado a este projeto, e a Universidade Federal de Sergipe pela infraestrutura oferecida

para a realização deste trabalho.

Devo aqui registrar o meu reconhecimento à importância do uso de animais para

experimentação, permitindo o avanço do conhecimento nas ciências biológicas e da

saúde, e assim, salvando muitas vidas, humanas e animais. Claro, reconheço, sobretudo,

a importância dos animais utilizados neste estudo, que, adicionalmente, contribuiram

para minha formação científica.

Por fim, não poderia deixar de agradecer ao meu orientador, professor Daniel

Badauê Passos Júnior por acreditar em minha capacidade para desenvolver este

fascinante projeto de pesquisa onde aprendi que não podemos desanimar na primeira

dificuldade. MUITO OBRIGADO pela oportunidade e a honra de ser orientado durante

esses anos. Professor, hoje termino essa etapa com a certeza de que posso vencer

qualquer desafio acreditando em minha capacidade, com comprometimento e

dedicação. Obrigado mais uma vez por tudo o que aprendi com o senhor, jamais poderei

esquecer das palavras de incentivo e críticas que sempre me ajudaram a querer fazer

sempre o melhor.

RESUMO

INFLUÊNCIA DE HORMÔNIOS GONADAIS NO EIXO [ECA2/ANG(1-7)/Mas]

ENCEFÁLICO PARA O CONTROLE DA SEDE E APETITE POR SÓDIO EM RATOS,

Julio Cesar Santana Alves, Universidade Federal de Sergipe, 2013.

Os comportamentos de ingestão de sódio e água constituem importantes componentes

regulatórios do equilíbrio hidroeletrolítico. Neste contexto, o organismo humano regula seu

déficit hidromineral através de uma resposta neuroimunoendócrina e comportamental

comandada majoritariamente pelo sistema nervoso central (SNC). Reconhecidamente, os

hormônios gonadais representam importantes fatores moduladores dos comportamentos

ingestivos. O presente estudo objetivou estudar a influência dos hormônios gonadais

masculinos e femininos no eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas sobre o controle da ingestão de água e

NaCl 0,3 M em ratos e ratas. Neste experimento, fêmeas ovariectomizadas foram tratadas

com benzoato de estradiol (20µg/animal/dia, s.c.; OVXE), ou com veículo (óleo de girassol;

OVXV). Machos foram submetidos à orquiectomia bilateral (ORQX) ou cirurgia fictícia

(SHAM). Por meio de cirurgia estereotáxica, cânulas-guia foram implantadas no ventrículo

lateral direito para administração intracerebroventricular (icv) das drogas utilizadas. Foram

utilizados o ativador da enzima conversora de angiotensina tipo 2 (ECA2), DIZE (Aceturato

de Diminazeno, 40 nmol / 2 µL, i.c.v.) ou o antagonista do receptor Mas de ANG (1-7), o D-

Ala7-ANG(1-7) (A779, 10 nmol / 2 µL, i.c.v.). O veículo para ambas as drogas foi líquido

cerebro-espinhal artificial (LCEa), administrado nos animais controle em igual volume. Para

indução da sede e apetite por sódio, os animais foram submetidos a depleção hidrossalina por

administração de um diurético de alça (furosemida, 20 mg / kg, s.c.) e acesso à água destilada

e dieta pobre em sódio (fubá de milho) por 24 horas. Após a microinjeção das drogas, água e

de NaCl 0,3 M foram reapresentados e registrados os volumes ingeridos nos tempos 15, 30,

60, 90, 120, 180, 240 min e 24 h. Foram realizadas análises de variância de duas vias seguidas

do pós-teste de Bonferroni, quando necessário. O nível de significância foi de p < 0,05. Os

dados demonstraram que, em fêmeas tratadas com DIZE ou veículo, a ingestão de água, NaCl

0,3 M e o índice de preferência ao sódio (IPS) não diferiram entre os grupos. Porém, fêmeas

OVXV ingeriram menos água quando comparadas às femeas OVXE, quando ambas foram

tratadas com A779 (p < 0,05). Vinte e quatro horas após a reapresentação de fluidos, a

ingestão de NaCl 0,3 M foi maior em ratas OVXV que nas OVXE, quando ambas receberam

A779 (p < 0,05). No mesmo sentido, ratas OVXV apresentaram maior preferência por sódio

que as OVXE, ambas tratadas com A779. Machos ORQX microinjetados com LCEa

ingeriram mais água quando comparados aos animais do grupo SHAM+LCEa. Todavia, aos

30 min, os machos SHAM+DIZE apresentaram maior ingestão de água quando comparado ao

seu respectivo controle. Até 15 min após a reapresentação de fluidos, a ingestão de NaCl 0,3

M em ratos ORQX foi menor em comparação aos ratos SHAM independente do tratamento

com DIZE (p<0,05), o IPS não diferiu entre os grupos. Os dados referentes a ingestão de água

e ao IPS em machos submetidos ao tratamento icv com A779, revelam não haver diferença

entre os grupos estudados, porém para ingestão de NaCl 0,3 M, os ratos ORQX+A779

demonstraram menor ingestão quando comparados aos animais ORQX+LCEa (p<0,05) nos

tempos 30, 60, 90, 120, 180 e 240 min. Assim, podemos concluir que o estrógeno parece

exercer influencia inibitória na ingestão de sódio independente da atividade do eixo

ECA2/ANG(1-7)/Mas. Por outro lado, os hormônios gonadais masculinos atuam elevando a

ingestão hidrossalina para a regulação do eixo no protocolo proposto.

Palavras-chave: sede, apetite por sódio, hormônios gonadais, ECA2, Mas.

ABSTRACT

INFLUENCE OF GONADAL HORMONES IN THE CEREBRAL ACE2/ANG(1-7)/Mas

AXIS FOR THE CONTROL OF THIRST AND SODIUM APPETITE IN RATS, Julio Cesar

Santana Alves, Federal University of Sergipe, 2013.

Sodium and water intake are important regulatory components of the hidromineral balance. In

this context, human body regulates hidromineral imbalance through the neuro-immune-

endocrine and behavioral response. Gonadal hormones are important players for the

modulation of ingestive behaviors. The present study aimed to investigate the influence of

male and female gonadal hormones in cerebral ECA2/ANG-(1-7)/Mas axis over the control of

water sodium intake in rats. In this experiment, ovariectomized female rats were treated with

estradiol benzoate (20μg/animal/day, sc; OVXE) or vehicle (sunflower oil; OVXV). Male rats

underwent bilateral orchiectomy (ORQX) or sham surgery (SHAM). Guide cannulae were

implanted into the right lateral ventricle for intracerebroventricular administration (icv) of

drugs. We used angiotensin-converting enzyme type 2 (ACE2) activator, DIZE (diminazene

of aceturate, 40 nmol / 2µl , icv ) or the antagonist of Ang-(1-7) Mas recetor, D-Ala7-ANG-

(1-7) (A779, 10 nmol / 2µl, icv). The vehicle for both drugs was artificial cerebrospinal fluid

(aCFS) administered in the same volume. For induction of thirst and sodium appetite, animals

were subjected to hydrossaline depletion by administration of furosemide (20 mg / kg, sc) and

access to distilled water and low sodium diet (corn ) for 24 hours. After microinjection of

drugs, water and 0.3 M NaCl were reoffered and the ingested volume were recorded at the

following 15, 30 , 60, 90 , 120, 180, 240 min and 24 h. Two-way analysis of variance was

performed, followed by Bonferroni posthoc test when appropriate. The level of significance

was p < 0.05. In females treated with vehicle or DIZE, sodium and water intake, as well as

sodium preference index (SPI) did not differ between groups. However, OVXV ingested less

water than OVXE when both were treated with A779 (p < 0.05). Twenty-four hours after

reintroduction of fluids intake sodium ingestions was higher in OVXV than in OVXE when

both received A779 (p<0.05). Similarly, OVXV rats showed greater preference for sodium

when compared to OVXE, if both received icv injection of A779. Males ORQX microinjected

with aCFS ingested more water than SHAM+aCSF. However, at 30 min, SHAM+DIZE male

rats presented higher water intake when compared to their respective control. Up to 15 min

after reintroduction of fluids, ORQX rats ingested less sodium than SHAM rats, regardless

DIZE administration (p < 0.05). Water intake as well as SPI did not differ between groups in

males undergoing A779 administrarion. However sodium intake was lower in ORQX+A779

than in ORQX+aCFS (p < 0.05) at 30, 60 , 90, 120 , 180 and 240 min after fluid presentation.

Thus, we conclude that estrogen seems to exert inhibitory influences on sodium intake

independent ECA2/ANG (1-7)/Mas activity. On the other hand, the male gonadal hormones

act by raising intake for the regulation of salt intake shaft in the proposed protocol.

Keywords: thirst, sodium appetite, gonadal hormones, ACE2, Mas.

LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Figura 1. Diagrama esquemático demonstrando cascata enzimática do Sistema Renina-

Angiotensina (SRA) e demais endopeptidases. ___________________________________ 24

Figura 2. Cirurgia de ovariectomia em ratas. ____________________________________ 32

Figura 3. Microscopia demonstrando fases do ciclo estral.__________________________ 33

Figura 4. Cirurgia de Orquiectomia em machos. _________________________________ 34

Figura 5. Cirurgia de estereotaxia. ____________________________________________ 36

Figura 6. Figura mostrando área de injeção ventricular no encéfalo de ratos (as). ________ 36

Figura 7. Efeito da ovariectomia no índice uterino de ratas castradas sem (OVXV) e com

(OVXE) reposição estrogênica. _______________________________________________ 40

Figura 8. Efeito da orquiectomia no Índice prostático e vesículas seminais (IPVS) em ratos 40

Figura 9. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem

(OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. ____________________________________ 42

Figura 10. Efeito do DIZE (40nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em fêmeas

sem (OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. ________________________________ 43

Figura 11. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em fêmeas

ovariectomizadas com (OVXE) e sem (OVXV) reposição hormonal após ingestão induzida.44

Figura 12. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem


Figura 13. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de sódio em fêmeas sem


Figura 14. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) no índice de preferência ao sódio (IPS) em

fêmeas sem (OVXV) e com (OVXE) reposição hormonal. __________________________ 49

Figura 15. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com

cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ____________________________ 51

Figura 16. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em machos

com cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ________________________ 52

Figura 17. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em machos

com cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). ________________________ 53

Figura 18. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com


Figura 19. Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de sódio em machos com


Figura 20. Índice de Preferência ao Sódio em machos com cirurgia fictícia (SHAM) e

orquiectomizados (ORQX) microinjetados com A779 ou LCEa. _____________________ 57

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A779 – D-Ala7 ANG(1-7)

ACTH – Hormônio Adrenocorticotrópico

AGT – Angiotensinogênio

ANG (1-7) – Angiotensina (1-7)

ANG I – Angiotensina I

ANG II – Angiotensina II

AP – Área Postrema

APO – Área Pré-óptica

AT1 – Receptor de ANG II tipo 1

AT2 - Receptor de ANG II tipo 2

AV3V – Parede Antero-ventral do terceiro ventrículo

BHE – Barreira Hematoencefálica

BVLR – Bulbo ventrolateral rostral

CEPA – Comitê de Ética e Pesquisa com Animais

DIZE – Aceturato de Diminazeno

E2 – Estrógeno

ECA – Enzima Conversora de Angiotensina

ECA2 – Enzima Conversora de Angiotensina tipo 2

EM – Eminência Mediana

FEC – Fluido Extracelular

FIC – Fluido Intracelular

HAD - Hormônio Antidiurético

IPS – Índice de Preferência ao Sódio

IPVS – Índice de Próstata e Vesiculas Seminais

LANBAC – Laboratório de Neuroendocrinologia Básica

LCEa – Líquido Cerebroespinhal Artificial

Mas – Receptor de ANG (1-7)

MnPO – Núcleo Mediano Pré-óptico

MS – Ministério da Saúde

NaCl – Cloreto de Sódio

NDR – Núcleo Dorsal da Rafe

NOS – Núcleo Supra-óptico

NEP – Endopeptidase neutra

NPB – Núcleo Parabraquial

NPV – Núcleo Paraventricular

NTS – Núcleo do Trato Solitário

OCV – Órgão Circumventricuar

OMS – Organização Mundial de Saúde

ON – Óxido Nítrico

ORQXA – Ratos orquiectomizados+A779

ORQXD – Ratos orquiectomizados+DIZE

ORQXV – Ratos orquiectomizados+veículo

OSF – Órgão subfornical

OT – Ocitocina

OVLT – Órgão Vasculoso da Lamina Terminal

OVXA – Ratas ovariectomizadas+A779

OVXD - Ratas ovariectomizadas + DIZE

OVXEA – Ratas ovariectomizadas com reposição estrogênica+A779

OVXED - Ratas ovariectomizadas com reposição estrogênica+DIZE

OVXEV – Ratas ovariectomizadas com reposição estrogênica+veículo

OVXV – Ratas ovariectomizadas+veículo

PEP – Prolil-endopeptidase

PNA – Peptídeo Natriurético Atrial

REN – Renina

REα – Receptor Estrogênico α

REβ – Receptor Estrogênico β

RNA – Ácido Ribonucleico

SHAMA – Ratos submetidos a orquiectomia fictícia+A779

SHAMD – Ratos submetidos a orquiectomia fictícia+DIZE

SHAMV – Ratos submetidos a orquectomia fictícia

SNC – Sistema Nervoso Central

SNS – Sistema Nervoso Simpático

SRA Sistema Renina-Angiotensina

UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais

UFS – Universidade Federal de Sergipe

VP – Vasopressina

SUMÁRIO

RESUMO _________________________________________________________________i

ABSTRACT_______________________________________________________________ii

LISTA DE TABELAS E FIGURAS___________________________________________iii

LISTA DE ABREVIATURAS________________________________________________iv

1. INTRODUÇÃO _________________________________________________________ 15

2. REVISÃO DE LITERATURA _____________________________________________ 17

2.1. Controle central da sede e apetite por sódio ...................................................................... 17

2.1.1. Sede ................................................................................................................................. 17

2.1.2. Apetite por sódio ............................................................................................................. 18

2.2.Regulação central do balanço hidroeletrolítico pelo Sistema Renina-Angiotensina (SRA) ..

........................................................................................................................ 19

2.2.1.O eixo ECA/ANGII/AT1 na regulação central da sede e apetite por sódio .................... 20

2.2.2.O eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas e suas funções regulatórias .............................................. 22

2.3.Os hormônios gonadais e a sua influência na sede e no apetite por sódio ......................... 25

3.OBJETIVOS ____________________________________________________________ 29

3.1.OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 29

3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 29

4.MATERIAL E METODOS _________________________________________________ 30

4.1.Animais utilizados .............................................................................................................. 30

4.2.Drogas Utilizadas ............................................................................................................... 30

4.3.Procedimentos Cirúrgicos................................................................................................... 31

4.3.1.Anestesia .................................................................................................................. 31

4.3.2.Gonadectomia .................................................................................................................. 32

4.3.3.Implantação de cânula intracerebroventricular (icv) ....................................................... 34

4.4.Reposição hormonal ........................................................................................................... 37

4.5.Indução da sede e do apetite por sódio e administração icv de drogas .............................. 37

4.6.Perfusão para fixação do tecido cerebral ............................................................................ 38

4.7.Delineamento experimental ................................................................................................ 38

4.8.Análise estatística ............................................................................................................... 39

5.RESULTADOS __________________________________________________________ 40

5.1.Efeito da gonadectomia em machos e fêmeas. ................................................................... 40

5.2.Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de NaCl 0,3M

em ratas. ........................................................................................................................ 41

5.3.Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e de NaCl

0,3M em ratas: ........................................................................................................................ 45

5.4.Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de NaCl 0,3M

em ratos. ........................................................................................................................ 50

5.5.Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e de NaCl

0,3M em ratos . ....................................................................................................................... 54

6.DISCUSSÃO ____________________________________________________________ 58

7.CONCLUSÃO ___________________________________________________________ 66

8.REFERÊNCIAS _________________________________________________________ 67

ANEXO A _______________________________________________________________ 74

15

1. INTRODUÇÃO

As desordens dos fluidos corporais estão entre os maiores desafios encontrados na

prática clínica, visto que diversas doenças podem potencialmente promover mudanças nos

mecanismos neuroendócrinos controladores da ingestão hidromineral. A manutenção da

volemia para que os órgãos e tecidos sejam adequadamente perfundidos, relaciona-se com a

concentração de sódio extracelular dos líquidos corporais. Assim, diversos estudos em

neurobiologia atribuem a gênese de doenças cardiovasculares, aos desequilíbrios entre o

consumo e a perda de sódio e água do organismo (FITZSIMONS, 1998; VERBALIS, 2003)

De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), o consumo

individual máximo de sódio deve ser inferior a 5 gramas diários. O uso excessivo de sal

(cloreto de sódio ou NaCl), constituinte da dieta diária em humanos, pode acarretar problemas

de saúde relacionados principalmente ao sistema cardiovascular, como a hipertensão,

considerada na atualidade, o principal fator de risco associado a mortalidade mundial. Dados

publicados pelo Ministério da Saúde (MS) apontam o crescimento da hipertensão arterial

entre os brasileiros, acarretado pelo consumo abusivo de NaCl chegando a 12 gramas diários

por pessoa (LESHEM, 2009; MECAWI et al., 2008).

Neste contexto, é sabido que sistemas fisiológicos, como o Sistema Renina

Angiotensina (SRA), atuam simultaneamente na regulação das funções cardiovasculares,

endócrinas e comportamentais de ingestão de água e sódio, envolvidos na manutenção da

homeostase hidroeletrolítica e hemodinâmica (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004;

FITZSIMONS, 1998).

Nas últimas décadas, tem sido demonstrado que a hiperatividade do SRA está

implicada na gênese de diversas doenças causadoras de patologias cerebrovasculares,

cardíacas e renais, com destaque para as doenças cardiovasculares, endócrinas e

comportamentais que resultam no desequilíbrio hidroeletrolítico e hemodinâmico, geradores

da hipertensão arterial (FERRARIO, 1990; GEERLING; LOEWY, 2008).

Ademais, evidências clínicas e experimentais têm reforçado a idéia de que mulheres

em idade reprodutiva são mais protegidas que os homens da mesma idade no que diz respeito

16

ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, e ao consumo excessivo de sódio. Este

percentual tende a se igualar após a menopausa, quando a atividade endócrina ovariana está

reduzida (HILLIARD et al., 2013; MECAWI et al., 2008).

Assim, tem sido imputado ao estrógeno, principal hormônio gonadal feminino, um

importante papel protetor do estabelecimento de doenças hemodinâmicas associadas a

distúrbios de comportamentos de ingestão de sódio e água (OPARIL; MILLER, 2005;

PECHÈRE-BERTSCHI; BURNIER, 2004). Paralelamente, estudos experimentais tem

demonstrado que o estrógeno é capaz de modular a atividade de componentes

contrarregulatórios do SRA, como a recém-descoberta Enzima Conversora de Angiotensina

tipo II (ECA2) (CLARKE; TURNER, 2012).

Neste trabalho, buscamos verificar a possível influência dos hormônios gonadais

masculinos e femininos, sobre mecanismos contrarregulatórios do SRA que atuam no controle

do comportamento de ingestão de água e sódio submetidas ao desafio experimental de

depleção hidrossalina.

17

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Controle central da sede e apetite por sódio

2.1.1. Sede

A sede é definida como uma percepção subjetiva da necessidade de ingerir água em

animais e humanos. A ingestão de líquidos é necessária para contrabalancear quaisquer perdas

que possam ocorrer durante processos fisiopatológicos do organismo. Essa ingestão é

regulada pelo mecanismo de sede experimentado por animais desidratados que buscam

avidamente por água. O hormônio antidiurético (HAD) mantém o controle preciso da

osmolalidade do líquido extracelular e da concentração de sódio. Constantemente os animais

terrestres perdem água e sódio, com isto são necessários reflexos e respostas comportamentais

com a finalidade de corrigir os desequilíbrios e manter a homeostase dos líquidos corporais

(ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; MCKINLEY; JOHNSON, 2004; SHAHID, 2011).

O aumento de 1 a 2% na osmolalidade plasmática é suficiente para gerar sede,

enquanto que para produzir este mesmo efeito torna-se necessária uma queda de 10 a 15% do

volume ou da pressão, que através da ativação de mecanismos reflexos autonômicos

associados a respostas endócrinas, causam liberação de aldosterona e vasopressina, com

objetivo de prevenir perdas renais de sódio e água evitando a desidratação (DE LUCCA et al.,

2007; STRICKER; WOODS, 2004).

A perda de água pode ocorrer tanto ao nível do compartimento intracelular quanto

extracelular, ou seja, apresentando dois tipos de sede: a intracelular ou hiperosmótica e

extracelular ou hipovolêmica. A redução do volume de liquido celular ou desidratação celular

pode ocorrer por perda de água para o meio extracelular resultante do aumento na

concentração de solutos osmoticamente ativos. A redução exclusiva do volume de líquido

extracelular em situações como vômitos, hemorragias, diarréias, depleção de sódio, etc,

causam o que chamamos de sede extracelular (ANTUNES-RODRIGUES, 2005;

THORNTON, 2010).

O cérebro pode influenciar o comportamento ingestivo de líquidos em vertebrados

através de pequenas estruturas neurais periventriculares específicas altamente vascularizadas e

desprovidas de barreira hematoencefálica, as quais respondem pela regulação da ingestão de

água e sódio. Estas estruturas são chamadas de órgãos circunventriculares (OCVs), os quais

18

são constituídos por duas estruturas sensíveis à ação dipsogênica, o Órgão Vasculoso da

Lâmina Terminal (OVLT) e o Órgão Subfornical (OSF), estas estruturas localizam-se ao

longo da parede ântero-ventral do terceiro ventrículo (AV3V) (FITZSIMONS, 1998;

MCKINLEY; JOHNSON, 2004).

O OSF, OVLT e AP são os principais centros dipsogênicos estimulados pela

angiotensina II (ANG II) circulante, entretanto existem estruturas intracerebrais que não

podem ser diretamente influenciadas por este peptídeo, pois estas estruturas estão localizadas

em áreas protegidas pela barreira hematoencefálica (BHE), como o núcleo pré-óptico

mediano (MnPO) localizado na lamina terminal entre os OCVs integrando a região AV3V.

(JOHNSON; THUNHORST, 1997).

2.1.2. Apetite por sódio

O sódio é o soluto iônico essencial para as mudanças na osmolalidade. Sua

concentração no fluido extracelular é determinante para o equilíbrio da água entre os

compartimentos intra e extracelulares (JOHNSON; GROSS, 1993). O volume total de fluido

extracelular depende amplamente da adição de sódio neste espaço promovendo o controle da

pressão osmótica de entrada e saída de água. Esta adaptação regulatória constitui a razão pela

qual o sódio deve ser excretado para reduzir volume, e também deve ser ingerido e retido para

incrementar o volume plasmático (GEERLING; LOEWY, 2008; MCKINLEY et al., 2006;

STELLAR; EPSTEIN, 1991).

Quando o individuo encontra-se em status deficiente de sódio, o organismo

desencadeia um comportamento de ingestão em quantidade não usual de sódio ao nível

encefálico, iniciado por grupos de neurônios específicos promotores do incremento na

necessidade e na busca pelo mineral. Uma vez encontrado, o aparato gustatório transmite um

sinal de detecção e por fim estes sinais são integrados a uma ou mais áreas cerebrais

motivando o comportamento ingestivo (GEERLING; LOEWY, 2008; GIESTAS; PALMA;

RAMOS, 2010).

O apetite ao sódio, assim como a sede, representa um comportamento inato que se

manifesta ao longo da vida sendo desencadeado independente do aprendizado. O incremento

19

na preferência ao sódio em humanos ocorre por subsequente perda do mineral. Dentre os

fatores mais conhecidos por influenciar este apetite, os hormônios desempenham papel

essencial na deficiência do sódio, como por exemplo a ANG II e a aldosterona. Outro fator

bem conhecido está relacionado às mudanças na concentração de sódio sanguíneo de certos

fatores, como o fluido cerebroespinhal (FCE), fluido intracelular (FIC) e extracelular (FEC).

Em adição, os hormônios ligados ao estresse (glicocorticóides), sistema nervoso simpático

(SNS), hormônios da gestação e lactação como estrógeno, progesterona, OT, prolactina

devem estar envolvidos em complexas interações reguladoras do apetite ou da saciedade ao

sódio (KAUFMAN; MACKAY, 1983; STELLAR; EPSTEIN, 1991).

A parede anterior do terceiro ventrículo da lâmina terminal possui regiões envolvidas

direta ou indiretamente com a mediação central do apetite por sódio que incluem neurônios

especializados e células gliais sensíveis a elevações na osmolalidade extracelular e

concentração de sódio (WATANABE et al., 2006). Estes neurônios específicos estão

concentrados sobretudo em dois OCVs sensoriais: o OSF e OVLT, promovendo o

comportamento de ingestão de fluidos estimulados por ANG II (KAUFMAN; MACKAY,

1983; MORRIS et al., 2002).

Quanto aos mediadores implicados na gênese e na inibição do apetite ao sódio, a

aldosterona pode estimular este apetite com alta seletividade relativa a outros hormônios,

como a ANG II que incrementa a ingestão não-seletiva de sal e água atuando como agonista,

enquanto que a OT no PVN e a serotonina no núcleo dorsal da rafe (NDR) devem estar

envolvidos na saciedade ou inibição do apetite ao sódio. Adicionado a este fato, o ANP possui

ação antagonista inibindo a sede e o apetite ao sódio quando o indivíduo é submetido a

privação hídrica, depleção de sódio ou quando induzido por injeção central de ANG II (REIS,

2007; STELLAR; EPSTEIN, 1991)

2.2. Regulação central do balanço hidroeletrolítico pelo Sistema Renina-Angiotensina

(SRA)

Atualmente, estudos tem destacado a atuação do sistema renina-angiotensina como

fator de atuação cerebral para o controle dos fluidos corporais, podendo resultar na regulação

da pressão sanguínea, da sede, do apetite por sódio, da secreção de vasopressina (VP) e da

secreção do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Estudos mostram ainda, que o SRA

20

encefálico, é capaz de conduzir ações comportamentais de ingestão de água e resposta

pressórica sistêmica (FITZSIMONS, 1998; PARSONS; COFFMAN, 2007; PAUL; POYAN

MEHR; KREUTZ, 2006).

Além disso, o cérebro possui estruturas localizadas em torno do terceiro ventrículo,

que funcionam como verdadeiras janelas cerebrais, sendo responsáveis por detectar mudanças

de volume celular de origem central ou sistêmica, transmitindo informações que visam

modificar comportamentos, regular secreção hormonal e ativar o sistema nervoso simpático

objetivando restaurar o balanço dos fluidos corporais (BOURQUE; OLIET; RICHARD,

1994; OSBORN; COLLISTER; CARLSON, 2000).

2.2.1. O eixo ECA/ANGII/AT1 na regulação central da sede e apetite por sódio

O angiotensinogênio (AGT) constitui o principal substrato do SRA, é uma α-

glicoproteína produzida também no encéfalo, sobretudo nos astrócitos. Este componente pode

ser encontrado continuamente secretado no interstício cerebral constituindo uma das mais

abundantes proteínas encontradas no fluido cérebro-espinhal (MCKINLEY et al., 2003). No

cérebro, 95% do AGT relatado encontra-se no meio extracelular. A seqüência de eventos

envolvidos no sistema angiotensinérgico tem início com a clivagem do AGT por intermédio

de uma enzima intracelular cerebral chamada de renina (REN) em um decapeptídeo inativo

Angiotensina I (ANGI). A partir deste, a enzima conversora de angiotensina (ECA),

encontrada em altas concentrações nos OCVs, converte a ANG I cerebral em ANG II, a qual

exerce suas ações em receptores nestas regiões (SAAVEDRA, 1992; SHERROD et al., 2005)

A ANG II é considerada um peptídeo essencial do SRA, atuando em seus receptores

específicos subtipo 1 (AT1) e subtipo 2 (AT2) detectados em diversas áreas reguladoras da

homeostase cardiovascular e balanço de fluidos corporais (MCKINLEY et al., 2003). Dentre

os efeitos descritos na literatura para estes receptores, podemos destacar dentre outros, a sede

e o apetite por sódio como as respostas comportamentais mais significativas para injeções

centrais de ANGII. Os efeitos comportamentais acima citados são mediados pelos receptores

AT1, sendo descrito ainda que os receptores AT2 devem possivelmente exibir ações opostas

aos receptores anteriores no comportamento de sede (FITZSIMONS, 1998; MCKINLEY et

al., 2006; WRIGHT; HARDING, 1992).

21

A localização encefálica da ANG II foi descrita no corpo celular de neurônios em

várias regiões do sistema nervoso central (SNC) atuando como um neurotransmissor. As

regiões cerebrais contendo maior número de neurônios para angiotensina são: NPV (núcleo

paraventricular), NSO (núcleo supraóptico), OSF (órgão subfornical), NTS (núcleo do trato

solitário) e regiões periventriculares. Os receptores de ANG II central, AT1 e AT2, e seus

subtipos, estão localizados em regiões responsáveis por exercerem importante influência na

regulação de fluidos corporais e homeostase eletrolítica (SAAVEDRA, 1992). Estudos da

detecção de atividade neuronal por imunohistoquimica, utilizando antagonistas específicos

dos receptores citados, revelaram que ocorre alta predominância do subtipo AT1 em áreas

cerebrais importantes como NSO, NPV, NPB (núcleo parabraquial), NTS, dentre outras

(GILES et al., 1999; ROWE et al., 1990).

A localização central dos receptores de ANG II e a falta de acesso da ANG II

sistêmica através da barreira hematoencefálica (BHE) suportam a idéia de que ANG II seja

produzida em estruturas encefálicas dentro da BHE e não da circulação sistêmica. No entanto

os OCVs como o OSF, o OVLT, a EM (eminência mediana) e a AP (área postrema),

desprovidos de BHE, estão expostos a ANG II circulante, permitindo a mediação das ações da

ANG II em seus receptores (AT1), estes são expressos em altas concentrações nestes órgãos,

diferentemente de outras áreas encefálicas (BOURQUE; OLIET; RICHARD, 1994).

O padrão de distribuição dos receptores AT1 no cérebro sugere que a ANG II pode

atuar como um neuromodulador ou um neurotransmissor no SNC influenciando dentre outros

efeitos, a homeostase da água e eletrólitos, a liberação de hormônios pituitários e o controle

autonômico. De uma forma geral, a sede conta com requisitos importantes para ser

desencadeada, a diminuição do volume sistêmico resultante de perdas significativas como

hemorragia ou desidratação, estimula mecanismos que resultam no aumento da ANG II

circulante a qual deve interagir com os OCVs envolvendo mecanismos de regulação neural ou

humoral (GILES et al., 2001; JOHNSON; GROSS, 1993).

A conservação do sódio corporal está sob o controle permanente do SRA que atua na

deficiência do sódio, elevando os hormônios modulatórios deste sistema. Estes hormônios

atuam direta ou indiretamente no cérebro motivando o apetite por sódio. Ademais,

22

experimentos utilizando antagonistas dos receptores AT1 ou AT2, demonstraram a ocorrência

de inibição deste apetite especificamente em ratos e em babuínos (ROWE et al., 1990).

2.2.2. O eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas e suas funções regulatórias

O SRA tem sido abordado como um sistema endócrino capaz de regular as várias

funções orgânicas por intermédio do seu principal hormônio efetor funcional, a ANG II. Com

o advento de novas técnicas moleculares, houve um melhor entendimento de seu

funcionamento e identificação dos diversos componentes reguladores da cascata enzimática.

Dentre eles, o primeiro componente descoberto foi o heptapeptídeo ANG(1-7) por Schiavone

e colaboradores em 1988, demonstraram que este peptídeo possuía ações equipotentes a

ANGII para liberação de vasopressina pela neurohipófise. Além disso, um estudo utilizando a

microinjeção em doses muito baixas (fentomoles) de ANG (1-7) dentro do bulbo ventrolateral

rostral (BVLR) resultou em diminuição da pressão arterial com bloqueio dos receptores AT1

e AT2 (CAMPAGNOLE-SANTOS et al., 1989).

Em seguida, muitas pesquisas foram desencadeadas no intuito de encontrar uma via

enzimática específica para a formação da ANG(1-7). As pesquisas realizadas descreveram

uma enzima com propriedades catalíticas especifica para ANGII, a enzima conversora de

angiotensina tipo 2 (ECA2), uma isoforma da ECA (Enzima Conversora de angiotensina)

possuindo diferenças no que diz respeito a especificidade ao substrado e sua atividade

inalterada na presença de bloqueadores clássicos da ECA. (DOOBAY et al., 2007; ELASED

et al., 2006; SAKIMA et al., 2005).

A identificação da ECA2, proporcionou a descrição inicial de sua atividade na

hidrólise da ANGI gerando ANG (1-9), expressa predominantemente no endotélio vascular e

sendo altamente restrita ao rim, testículos e tecido cardíaco humano, exercendo sua influência

catalítica no SRA local do coração e do rim. Foi demonstrado ainda que a eficiência catalítica

da ECA2 para ANGII é 400 vezes maior que para ANGI (DONOGHUE et al., 2000;

VICKERS et al., 2002).

Ademais, muitas outras enzimas podem formar a ANG(1-7), tanto por ANGI quanto

por ANGII, incluindo a prolil-endopeptidase (PEP), endopeptidase neutra (NEP) e a prolil-

23

carboxipeptidase (PCP) (SANTOS; FERREIRA; SIMÕES E SILVA, 2008; VARAGIC et al.,

2008) (Fig. 1).

O interesse em estudar a ECA2 e receptores específicos para os fragmentos peptídicos

surgiu a medida que foram descritas propriedades contrarregulatórias do eixo clássico

(ECA/ANG II/AT1) sendo assim nomeado como um eixo depressor do SRA (HILLIARD et

al., 2013; KURDI; DE MELLO; BOOZ, 2005).

Neste cenário, diversos autores têm buscado o entendimento acerca das implicações

fisiológicas e mecanismos de ação deste eixo contrarregulatório do SRA. Este eixo pode ser

representado seqüencialmente pelos seus principais componente ECA2/ANG(1-7)/Mas.

Dentre os efeitos já reconhecidamente comprovados, estão a vasodilatação, efeitos

natriuréticos, diuréticos e antiproliferativos em contraste aos efeitos da ANG II como

vasoconstricção, retenção sódio e de água, além de afetar a função cardiovascular elevando a

pressão arterial (vide figura esquemática, Fig. 01). Estudos pioneiros de Santos (2008),

Ferrario (2007) e Donoghue (2000) permitiram observar este eixo como alvo em potencial

para a busca de fármacos com potencial terapêutico de doenças hipertensivas. (SANTOS;

FERREIRA; SIMÕES E SILVA, 2008; TRASK; FERRARIO, 2007).

Recentemente, estudos têm demonstrado que a ANG (1-7) é um membro

biologicamente ativo do SRA produzindo efeitos por vezes similares, e na maioria das vezes

opostos aos da ANG II. O produto da hidrólise do metabolismo de ANG I em homogenatos

do cérebro de cães, constituiu a primeira evidência da geração de ANG(1-7) encefálica, sendo

esta molécula o principal produto do metabolismo da ANG I e ANG II.(TRASK et al., 2007;

VARAGIC et al., 2008)

A ANG(1-7) tem sido detectada no corpo de células neuronais e fibras do núcleo

magnocelular em áreas encefálicas como hipotálamo, medula oblongata e amígdala no

cérebro de ratos normais, todas envolvidas com o controle do equilíbrio hidrossalino e

cardiovascular. Da mesma forma, o seu receptor Mas é encontrado em neurônios, microglia e

células endoteliais destas mesmas estruturas, revelando assim a importância deste receptor na

regulação da pressão sanguínea, balanço de fluidos e osmorregulação. Interessantemente, a

liberação de vasopressina (VP) induzida por ANG(1-7) é semelhante a observada quando da

microinjeção central da ANG II (SHI et al., 2010; XU; SRIRAMULA; LAZARTIGUES,

24

2011). As ações destas angiotensinas no encéfalo têm sido alvo de estudos com o intuito de

entender o envolvimento dos diferentes receptores, circuitos neurais e a integração de

complexos mecanismos cerebrais (DOOBAY et al., 2007; VARAGIC et al., 2008).

As ações relatadas até o momento são mediadas principalmente pelo receptor Mas, o

qual foi descrito por Santos e col.(2003) através da identificação da ANG(1-7) como o seu

principal fator de ligação estabelecendo o eixo ECA2/ANG(1-7)/MAS como uma descoberta

relevante para o SRA cerebral. O receptor Mas acoplado a proteína G, é expresso em vários

tecidos corporais em mamíferos. Dentre os mais importantes é altamente predominante no

encéfalo e testículos, e com moderada expressão no coração e rins (SANTOS et al., 2003).

Quanto a expressão deste receptor, diversos estudos demonstram sua ocorrência no

coração, rins, pulmões, fígado, baço, língua e músculo-esquelético. Porém, sua alta expressão

foi primeiramente detectada em células do endotélio vascular cerebral, sendo restrito ao

hipocampo, córtex e bulbo olfatório (ALENINA et al., 2008; SANTOS et al., 2003; YOUNG

et al., 1988).

AGT

REN

ANG I

ECA

ANG II ANG (1-7)

ANG (1-9)

ANG

(1-5)ECA

Bradicinin

a

ECA2

NEP,

PEP ECA,NEP

ECA2, PEP

RECEPTOR AT1

Vasoconstricção

Proliferação celular

Hipertrofia

Sede

Apetite por sódio

RECEPTOR AT2 Mas

Vasodilatação

Anti-proliferação

Anti-hipertrofia

Figura 1. Diagrama esquemático demonstrando cascata enzimática do Sistema Renina-Angiotensina (SRA) e

demais endopeptidases. (AGT) Angiotensinogênio; (REN) Renina; (ECA) Enzima conversora de angiotensina;

(ANGI) Angiotensina I; (ANGII) Angiotensina II; (AT1) Receptor de angiotensina tipo 1; (AT2) Receptor de

angiotensina tipo 2; (ECA2) Enzima conversora de angiotensina tipo 2; (ANG(1-9)) Angiotensina 1-9; (PEP)

Prolil-endopeptidase; (NEP) Endopeptidase neutra; (ANG(1-7) Angiotensina (1-7)); (ANG(1-5)) Angiotensina

1-5 e (Mas) Receptor de ANG(1-7) (Adaptado de SANTOS et al. 2008).

25

Algumas áreas relacionadas ao controle cardiovascular foram descritas a partir da alta

densidade dos receptores Mas imunorreativos no NTS, BVLR (Bulbo ventrolateral rostral),

BVLC (bulbo ventrolateral caudal), porções parvo- e magnocelulares do NPV, NSO e área

pré-óptica lateral como sítios de ação para a ANG(1-7) cerebral (BECKER et al., 2007).

Estudos utilizando bloqueadores destes receptores como o A779 e D-Pro-Ang(1-7)

demonstraram que o receptor Mas exerce uma função global no endotélio vascular regulando

a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e na atividade da óxido nítrico sintaze (NOS).

Portanto, o receptor Mas constitui um componente altamente relevante para modulação da

vasodilatação induzida por agonistas dependentes ou não do SRA (PEIRÓ et al., 2013).

Recentemente, foram identificado dois novos componentes do SRA, o Alamandine

(Ala-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro) e o seu receptor MrgD. Este heptapeptídeo gerado da hidrólise

de Angiotensina A (Ala-AngII) pela ação da ECA2 humana, está presente na circulação

sanguínea humana produzindo vasodilatação, efeitos antihipertensivos em ratos

espontaneamente hipertensos e efeitos cardiovasculares central. Além disso, a semelhança

seqüencial entre o Alamandine e a ANG(1-7), levou a investigar se existia semelhança nas

ações biológicas deste peptídeos através do receptor Mas, não sendo observado efeito do

Alamandine para este receptor, mas a descoberta do receptor MrgD (LAUTNER et al., 2013).

2.3. Os hormônios gonadais e a sua influência na sede e no apetite por sódio

Em fêmeas, é sabido que os hormônios gonadais circulantes sofrem oscilações

constantes resultantes do ciclo estral e durante reposição hormonal. Com isso, evidencias

mostram que a ingestão de água e sódio nas diversas fases do ciclo, sofrem alterações

influenciadas pelo E2. A eliminação do E2 pela ovariectomia provoca mudanças

comportamentais não só na receptividade sexual, também na ingestão espontânea de fluidos

(KRAUSE et al., 2003; TARTTELIN; GORSKI, 1971).

O crescimento de pesquisas experimentais voltadas para o estudo dos efeitos não

reprodutivos do estrógeno (E2), ampliou o entendimento do mecanismo de ação deste

hormônio, a exemplo do equilíbrio de fluidos corporais, os comportamentos motivados pela

sede e pelo apetite por sódio são influenciados pelo E2. Evidências mostram a redução da

26

sede influenciada pela atuação do estrógeno em ratas estimuladas por isoproterenol (agonista

β-adrenérgico promotor de aumento de ANG II circulante) (CURTIS, 2009; KRAUSE et al.,

2003).

Os efeitos atribuídos ao estrógeno são classicamente genômicos e mediados por dois

subtipos de receptores, o REα, e o REβ. Assim, o E2 revela-se como um provável candidato a

desenvolver forte influência no controle central de fluidos corporais, isto devido a constatação

da presença de RE em áreas cerebrais envolvidas na regulação hidrossalina (GHAZI et al.,

1994; GRAVES et al., 2011; ROSAS-ARELLANO; SOLANO-FLORES; CIRIELLO, 1999).

A expressão de componentes e a resposta ao estimulo ou inibição do SRA sob

condições fisiológicas ou fisiopatológicas, representam diferenças significativas entre machos

e fêmeas. A ativação excessiva do SRA, implica na progressão de lesões a órgãos-alvo

provocando hipertrofia ventricular esquerda, insuficiência cardíaca congestiva, hipertrofia

vascular, doenças renais, dentre outras (HILLIARD et al., 2013). Segundo Oparil e Miller

(2005), o desenvolvimento e a progressão de doenças renais e cardiovasculares estão

relacionadas ao sexo, como por exemplo, mulheres em período de pré-menopausa apresentam

menor prevalência de hipertensão do que homens da mesma idade.

Os estrógenos possuem características altamente lipofílicas e podem acessar o SNC

facilmente. Desta forma, eles podem atuar nos receptores de estrógeno (RE) encefálicos,

sobretudo aqueles localizados em áreas envolvidas na regulação do balanço hidroeletrolítico.

Ademais, há evidências de que a administração de estradiol na área pré-optica medial, diminui

a sede induzida por ANG II em fêmeas, enquanto que em machos, tal efeito não foi observado

(GRAVES et al., 2011; KISLEY et al., 1999; KRAUSE et al., 2006).

É descrito ainda na literatura que o estrógeno regula todos os componentes do SRA,

seja incrementando a síntese de AGT ou diminuindo a síntese de REN e a ECA.

Adicionalmente, o estrógeno promove redução na expressão de receptores AT1 e elevação na

expressão de receptores AT2. Isto foi observado em rins de fêmeas ovariectomizadas que ao

receberem reposição estrogênica, expressaram maior quantidade de receptores AT2 quando

comparadas às fêmeas sem reposição (BAIARD et al., 2005; RECKELHOFF, 2008).

27

Quanto aos esteróides masculinos, a influência da testosterona no controle da pressão

arterial tem sido amplamente documentada por estudos utilizando a remoção e reposição

hormonal em machos. Dentre outros trabalhos, ao promoverem a orquiectomia (remoção da

testosterona endógena) em ratos espontaneamente hipertensos, foi observada uma redução

significativa da pressão arterial, sendo esta restaurada após a reposição hormonal com

testosterona (CHEN; MENG, 1991; IAMS; WEXLER, 1977). Em outro estudo, foi

demonstrado que a infusão crônica de baixa dose de ANG II diminuiu a pressão arterial

especificamente em fêmeas, enquanto que em machos infundidos com a mesma dose houve

um incremento significativo, sugerindo ação oposta entre os receptores AT1 e os receptores

AT2 (JONES et al., 2008)

Para EPSTEIN (1992), a regulação da ingestão de sal em ratos caracteriza-se pela

presença de esteróides como a testosterona e peptídeos de origem cerebral (ANGII), estes

podem interagir diretamente regulando a via clássica do SRA com características

vasoconstrictoras através da regulação da expressão de AGT, da atividade da renina e a

expressão de receptores AT1. Além disso, altos níveis de renina plasmático são observados

em ratos intactos após a orquiectomia, estes níveis são diminuídos ou até mesmo restaurados

após reposição com testosterona, indicando que existe uma correlação entre a atividade de

renina plasmática e atividade da testosterona (RECKELHOFF, 2008).

Estudos têm identificado diferenças na expressão de componentes do SRA em machos

e fêmeas. Significativamente, os componentes do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas podem estar

altamente regulados em fêmeas, particularmente na presença de níveis elevados de ANGII

(OJEDA et al., 2007; SAFARI et al., 2012). Esta evidência mostra ainda que as fêmeas

comparadas aos machos apresentam mecanismo estrógeno-dependente na regulação dos

componentes do eixo citado.

Diante das evidências apontadas por diversas pesquisas em neurobiologia, constata-se

que existem fortes indícios de que os hormônios sexuais contribuem para mudanças

comportamentais na ingestão hidrossalina. Além disso, faltam dados concretos na literatura

que expliquem o dimorfismo sexual dos mecanismos de controle encefálico para os

comportamentos de ingestão de sal e água. Por esta razão, torna-se necessário estudar os

componentes do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas sob uma nova pespectiva, no intuito de ampliar o

conhecimento acerca dos efeitos neuromodulatórios da ingestão hidromineral em ratos e ratas.

29

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Investigar a participação de hormônios gonadais na modulação das possíveis ações do

eixo ECA2/Ang(1-7)/Mas no controle das funções dipsogênica e natriorexigênica em ratos e

ratas.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Investigar se o aumento na atividade da ECA2 encefálica em ratas sofre interferência

estrogênica no comportamento de ingestão de água e sódio induzidos.

Estudar o efeito da testosterona na ingestão de água e sódio através do aumento na

atividade da ECA2 encefálica em ratos.

Avaliar a participação do receptor Mas no comportamento de ingestão de água e sódio

induzidos em ratas ovariectomizadas com ou sem reposição estrogênica.

Determinar a interferência dos esteróides masculinos nos receptores Mas encefálicos

para o comportamento de ingestão de água e sódio em ratos.

30

4. MATERIAL E METODOS

4.1. Animais utilizados

Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus) Wistar, machos e fêmeas adultos pesando

inicialmente 250 a 300 g (12 animais por grupo), obtidos do Biotério Central da Universidade

Federal de Sergipe (UFS). Os animais foram alojados em gaiolas individuais de aço

inoxidável em ambiente controlado com temperatura de 23 ± 2 ºC e luminosidade controlada

com ciclo claro-escuro de 12 horas (luz das 6 às 18h). As gaiolas metabólicas individuais

eram equipadas com bebedouros graduados a cada 1ml com capacidade para 100ml tampados

com rolhas de borracha providas de bico de aço inoxidável e comedouros onde tiveram livre

acesso à água, solução hipertônica de NaCl 0,3 M e ração para roedores durante um período

de habituação de 7 a 10 dias (BADAUÊ-PASSOS et al., 2007; MECAWI et al., 2008) . Estes

animais foram mantidos em sala de manutenção e experimentação localizada no Laboratório

de Neuroendocrinologia Básica e Comportamental (LANBAC, DFS).

Todos os procedimentos, aos quais os animais utilizados neste estudo foram

submetidos estão de acordo com as normas e princípios éticos preconizados pela International

Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals e pelo Comitê de Ética em

Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade Federal de Sergipe, sendo aprovado por este

comitê conforme protocolo em anexo (Anexo A, protocolo # 029/2009).

4.2. Drogas Utilizadas

Para a indução da depleção de sódio, utilizamos o diurético inibidor do co-

transportador de Na+/K

+/Cl

- presente no ramo ascendente espesso da alça de Henle,

furosemida (Lasix™), na sua forma original. No experimento de manipulação central da

ECA2 utilizamos o Aceturato de Diminazeno em injeções intracerebroventriculares (i.c.v.)

como seu ativador; referida daqui em diante como DIZE. Para a manipulação central do

receptor de ANG (1-7), o receptor Mas, foi utilizada a droga D-Ala7 –ANG(1-7) referida

daqui em diante como A779 (AVENTIS pharma, EUA) gentilmente cedidas pelo Dr. Robson

Augusto Souza dos Santos, UFMG).

31

As drogas utilizadas para a manipulação farmacológica do SNC foram diluídas em

Líquido Cérebro-Espinhal-artificial (LCEa) (NaCl 140 mM, KCl 3,0 mM, CaCl 1,25 mM,

MgCl2 1,0 mM, Na2HPO4 1,2 mM, NaH2PO4 0,3 mM, glicose 3,0 mM). O volume de

administração foi de 2 μL através de seringa de Hamilton de 10μL (Microlab) acoplada a

bomba de infusão (BI-2008, AVS Projetos) através de tubo de silicone PE-10 durante três

minutos e oito segundos conforme configuração estabelecida pelo equipamento.

Para a reposição hormonal foi utilizado o Benzoato de Estradiol (Ric-BE,

TECNOPEC, São Paulo, Brasil) diluído em óleo de girassol e administrado continuamente até

o final do experimento em fêmeas castradas com reposição hormonal (OVXE). O óleo de

girassol foi utilizado como veículo.

Para os procedimentos cirúrgicos e a perfusão transcardíaca dos encéfalos, os animais

eram submetidos a anestesia sendo o tempo de procedimento cirúrgico menor que 20 min, por

esta razão utilizou-se a combinação anestésica entre quetamina (Cetamin, Syntecvet, Brasil) e

xylazina (Xilazin, Syntecvet, Brasil).

Para a profilaxia antibacteriana, utilizamos antibiótico de amplo espectro de ação

(Pentabiótico Veterinário, Fort Dodge Saúde Animal Ltda., Brasil). A analgesia pós-cirúrgica

foi produzida por meio da administração intramuscular de flunixim meglumine (Banamine

pet, MSD Saúde Animal, Brasil).

4.3. Procedimentos Cirúrgicos

4.3.1. Anestesia

Como procedimento anestésico para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os

animais foram anestesiados através de injeção intraperitoneal da combinação anestésica entre

quetamina (60 mg/kg, ip) e xylazina (7,5 mg/kg, ip). A profilaxia antibacteriana, foi iniciada

imediatamente após a aplicação do anestésico, com a injeção intramuscular de antibiótico de

amplo espectro de ação, na dose de 240.000 UI/Kg das penicilinas (pentabiótico pequeno

porte-). A analgesia pós-cirúrgica foi produzida, em todos os animais operados, por meio da

administração intramuscular de flunixim meglumine (1mg/animal, uma vez ao dia, durante 3

dias).

32

4.3.2. Gonadectomia

As cirurgias de orquiectomia e ovariectomia foram realizadas 21 dias antes do início

dos experimentos. As fêmeas devidamente anestesiadas, tratadas profilaticamente, foram

posicionadas em decúbito lateral para possibilitar o acesso lateral da cavidade abdominal.

Através de uma incisão de pele de aproximadamente 1.0 a 1,5 centímetro de comprimento na

parede lateral lombar, os ovários foram acessados através de abertura lateral (por divulsão) da

musculatura abdominal onde foram localizados envoltos por uma massa de tecido adiposo, em

seguida foram devidamente ligados e removidos. Após suturadas, as fêmeas foram mantidas

em caixas individuais e acompanhadas até a completa recuperação pós-operatória (vide Fig.

2).

Figura 2. Cirurgia de ovariectomia em ratas. Posicionamento do animal em decúbito lateral e local para incisão

indicado pela seta na parede lateral do abdome (A); Divulsionamento da musculatura abdominal para acesso a

cavidade abdominal após incisão (B); Identificação da gordura periovariana e ligadura do ovário (C e D) e

retirada do ovário (E). Fonte: (RIGALLI; LORETO, 2010).

A ausência de atividade ovariana foi avaliada diariamente através da colpocitologia

vaginal nas ratas antes de ambos os grupos com ou sem reposição hormonal. A presença de

diestro persistente, fase em que se observa ausência de células nucleadas com predomínio de

leucócitos e muco, confirmaram o decréscimo da atividade ovariana (Fig. 3-Diestro). Nas

fêmeas com reposição hormonal foi avaliada a presença da fase estrogênica com a presença

de células corneificadas em sua maioria e ausência de leucócitos e células nucleadas (Fig. 3-

Estro). Ademais, ao final do estudo, as fêmeas foram eutanaziadas e os úteros foram

removidos e pesados para a determinação do índice uterino (peso do útero/peso corporal)

medido em mg/100g de peso corporal.

33

Figura 3. Microscopia demonstrando fases do ciclo estral. Proestro (ausência de leucócitos e grande numero de

células nucleadas); Estro (ausência de leucócitos e células nucleadas); Metaestro (grande infiltração de

leucócitos, células nucleadas e corneificadas) e Diestro (grande quantidade de leucócitos e ausência de celulas

nucleadas e corneificadas) (GOLDMAN; MURR; COOPER, 2007).

A orquiectomia dos machos foi realizada com os animais anestesiados e posicionados

em decúbito dorsal para evidenciação da bolsa escrotal (Fig. 4A). Em seguida, foi feita uma

incisão sagital mediana da bolsa escrotal entre os testículos até atingirmos a túnica vaginal,

este procedimento permitiu o acesso ao funículo espermático para hemostasia e remoção de

ambos os testículos dos animais do grupo ORQX (Fig. 4B-E). Em animais com cirurgia

34

fictícia (SHAM), os testículos foram evidenciados e em seguida recolocados na bolsa escrotal.

A bolsa foi suturada e os animais acompanhados até a sua completa recuperação pós-cirúrgica

(Fig. 4F).

Figura 4. Cirurgia de Orquiectomia em machos. Posicionamento do animal em decúbito dorsal (A); Incisão

sagital-mediana da bolsa escrotal (B); Exposição do testículo através da incisão (C); Evidenciação do funículo

espermático (D); Ligadura do plexo arteriovenoso consequente incisão (E) e Sutura da bolsa escrotal (F). Fonte:

Adaptado de material de autor desconhecido (Fonte não encontrada).

Para confirmação do efeito da desandrogenização, ao final dos experimentos, todos os

machos foram eutanaziados para remoção e pesagem da próstata e vesículas seminais com o

objetivo de estabelecer o índice prostático e de vesículas seminais (IPVS).

4.3.3. Implantação de cânula intracerebroventricular (icv)

Doze a catorze dias após as gonadectomias procedeu-se às cirurgias para implante das

cânulas guia para administração de drogas no ventrículo lateral. Para isso, com o animal em

plano anestésico, realizamos a tricotomia da parte superior da cabeça. Em seguida, o animal

foi posicionado no aparelho estereotáxico (Grupo Insight Ltda, Brasil), e preso à barra

35

incisora no ponto zero (Fig. 5A). Depois de adequada assepsia do campo cirúrgico,

procedemos à aplicação de 0,1 ml de lidocaína com epinefrina a 2%, s.c., formando um botão

anestésico e em seguida era realizada incisão longitudinal da pele e tecido subcutâneo

isolando o periósteo por meio de retirada de camada muscular (Fig. 5B), em seguida a

abóbada craniana era trepanada com o auxílio de uma broca esférica no local adequado para a

introdução da cânula (Fig. 5C).

Após o alinhamento no plano horizontal dos pontos de bregma e lambda (Fig. 5D),

para a implantação da cânula guia (gauge 26 de 0,6 mm e medindo 10,0 mm de

comprimento), calculou-se o zero estereotaxico através da utilização das suturas craniais

como ponto de referencia. Foram considerados os seguintes parâmetros para o acesso

unilateral do ventrículo lateral: 1,08 mm posterior a bregma, deslocamento lateral de 2,0 mm

em relação ao plano sagital mediano, e 2,0 mm abaixo da superfície da calota craniana medida

em bregma de acordo com coordenadas do atlas estereotaxico (PAXINOS; WATSON, 2006)

conforme mostrado na figura 6. As cânulas injetoras utilizadas foram de espessuras de 30

gauge e 12,0 mm de comprimento.

Após a implantação, a cânula era estabilizada com acrílico autopolimerizável

sustentado por dois a três parafusos fixados à calota craniana. Em seguida, após a secagem do

acrílico, o animal era retirado do aparelho estereotáxico até a sua completa recuperação

anestésica. A localização adequada da cânula era confirmada ao final dos experimentos pela

análise histológica do tecido cerebral fixado com formol. Após a cirurgia estereotaxica, um

mandril era colocado na cânula guia e fixado permanecendo até o dia da microinjeção. Os

animais recebiam doses de anti-inflamatórios e antibióticos seguindo para recuperação em

caixas individuais por 7 dias.

36

Figura 5. Cirurgia de estereotaxia. Posicionamento do animal no Aparelho (A); Incisão e

retirada de camada muscular e fascias (B); Orifícios para colocação de parafusos e

cânula-guia (C) e Colocação da cânula-guia de acordo com coordenadas estereotaxicas

(D). Fonte: Adaptado de figura obtida em material de aulas práticas elaborado pelos Dr.

Celso Rodrigues Franci e Dra. Janete A. Anselmo Franci, docentes do curso de Pós-

Graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP.

Figura 6. Figura mostrando área de injeção ventricular no encéfalo de ratos (as). Fonte: Adaptado

de Paxinos & Watson, 2005.

D C

B A

37

4.4. Reposição hormonal

Nos experimentos utilizando-se fêmeas, as mesmas eram ovariectomizadas e

submetidas ao protocolo de reposição hormonal. A reposição estrogênica destas fêmeas era

realizada através da injeção diária de benzoato de estradiol (20 μg/animal, s.c.), iniciando a

reposição 24 horas após as cirurgias, até o dia do experimento (21 dias), administrado sempre

às 7h. O óleo de girassol foi utilizado como veículo e administrado no mesmo horário e

volume que o estrógeno (0,1ml por animal, sc) (FALK, 1965; MECAWI et al., 2008).

A presença característica de proliferação celular (células jovens e volumosas) em

esfregaços vaginais (Fig. 3-Estro) confirmaram a eficiência da reposição. Ademais, ao

término dos experimentos, os animais eram eutanaziados e seus úteros retirados e pesados

para a obtenção do índice uterino.

4.5. Indução da sede e do apetite por sódio e administração icv de drogas

Às 07 horas do dia anterior ao experimento, era iniciado o protocolo de depleção

hidrossalina conforme descrito por (JALOWIEC, 1974) e modificado por (BADAUÊ-

PASSOS et al., 2007). Neste, a administração de furosemida (20 mg/kg, sc) era associada a

dieta com restrição de sódio (água destilada e fubá de milho) por 24 horas.

Decorridas 24 horas do inicio da depleção, os bebedouros e comedouros foram

retirados e o mandril removido para posterior microinjeção da droga a ser utilizada. A

microinjeção foi realizada com uso de seringa de precisão (Hamilton, 10 µL), conectada a

tubo de polietileno (PE-10), e acoplada a bomba de infusão. Na extremidade do tubo PE 10

era conectada uma cânula injetora (12 mm) para injeção da droga diretamente no ventrículo

cerebral lateral direito. Trinta minutos após, os animais retornavam às gaiolas metabólicas

equipadas agora com água e NaCl 0,3 M. A partir de então era iniciada a coleta dos dados

relativos aos níveis de ingestão cumulativa de água e NaCl 0,3 M nos tempos zero, 15, 30, 60,

90, 120, 180, 240 min e 24 h após a reapresentação de fluidos. Ademais, foi avaliado o Índice

de Preferência ao Sódio (IPS), onde o volume ingerido NaCl 0,3 M, era dividido pelo volume

total de fluidos ingerido no mesmo tempo (i.e. volume ingerido de NaCl 0,3 M + volume

ingerido de água).

38

4.6. Perfusão para fixação do tecido cerebral

Ao final de cada procedimento experimental, todos os animais tiveram seus cérebros

perfundidos e fixados para posterior confirmação histológica do acerto das microinjeções.

Este procedimento iniciou-se com indução anestésica profunda dos animais que foram em

seguida perfundidos, por via transcardíaca, com aproximadamente 50 ml de salina isotônica

seguido da administração de 50 ml de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (tampão

fosfato, pH 7,2).

4.7. Delineamento experimental

O experimento realizado teve como objetivo determinar a existência ou não de

influencia dos hormônios gonadais no aumento da atividade da ECA2 central no controle da

ingestão de sódio e água. Em outro bloco de experimentos, procedeu-se a microinjeção do

bloqueador do receptor Mas de ANG(1-7), o A779 afim de avaliar seu efeito sobre a resposta

dipsogênica e natriorexigênica sob a interferência ou não de hormônios gonadais.

No presente estudo, dois Blocos de Experimentos foram realizados e os animais foram

divididos em grupos experimentais conforme descrito abaixo:

Bloco de Experimento com a ativação da ECA2. Neste bloco, machos e fêmeas,

previamente submetidos aos respectivos protocolos de manipulação dos hormônios esteróides

gonadais, foram depletados de sódio e água e receberam, 30 min antes da reapresentação de

fluidos, a microinjeção icv do ativador direto da ECA2, DIZE (40 nmol/2μL/animal)

(adaptado de MECCA et al 2011). Estes animais estavam distribuídos nos seguintes

grupos(com „n‟ de 10-12 animais por grupo):

1) fêmeas ovariectomizadas tratadas com óleo s.c. + veículo i.c.v. (OVXV);

2) fêmeas ovariectomizadas tratadas com óleo s.c. + DIZE i.c.v. (OVXD);

3) fêmeas ovariectomizadas tratadas com estrógeno s.c. + veículo i.c.v. (OVXEV);

4) fêmeas ovariectomizadas tratadas com estrógeno s.c.+ DIZE i.c.v. (OVXED);

5) machos orquiectomizados + veículo i.c.v. (ORQXV);

6) machos orquiectomizados + DIZE i.c.v. (ORQXD);

7) machos SHAM + veículo i.c.v. (SHAMV); e,

8) machos SHAM + DIZE i.c.v. (SHAMD).

39

Bloco de Experimento com o A779:

Neste bloco, machos e fêmeas, previamente submetidos aos respectivos protocolos de

manipulação dos hormônios esteróides gonadais, foram depletados de sódio e água e

receberam, 30 min antes da reapresentação de fluidos, a microinjeção icv do bloqueador de

receptor Mas da ANG(1-7), A779 (10 nmol/2μL/animal) (adaptado de CANGUSSU et al.

2009). Estes animais foram distribuídos nos seguintes grupos (com „n‟ de 10-12 animais por

grupo):

1) fêmeas ovariectomizadas sem reposição hormonal+veículo (OVXV);

2) fêmeas ovariectomizadas sem reposição+A779 (OVXVA);

3) fêmeas ovariectomizadas com reposição+veículo (OVXEV);

4) fêmeas ovariectomizadas com reposição hormonal+A779 (OVXEA);

5) machos orquiectomizados+ veículo (ORQXV);

6) machos orquiectomizados+A779 (ORQXA);

7) machos SHAM+veículo (SHAMV);

8) machos SHAM+A779 (SHAMA).

4.8. Análise estatística

Os dados referentes ao índice uterino e IPVS, foram analisados por meio do teste t de

Student. Para análise da ingestão cumulativa de água e sódio, bem como para o IPS, os dados

foram normalizados pelo peso corporal de cada animal no dia do experimento. A análise

estatística destas variáveis foram realizadas por meio da Análise de Variância de duas vias

(ANOVA), seguido do pós-teste de Bonferroni. Foram considerados sempre dois fatores de

variação (condição hormonal versus manipulação farmacológica central). A significância de

cada um destes fatores, bem como a existência de interação entre eles foram avaliadas. O

nível crítico fixado foi de 5% para se admitir uma diferença de médias como estatisticamente

significante. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média (EPM). Para

análise foi utilizado o Software GraphPad Prism, versão 5.01.

40

5. RESULTADOS

5.1. Efeito da gonadectomia em machos e fêmeas.

Nesse estudo foi observado que o índice uterino das ratas ovariectomizadas com

reposição de estrógeno (OVXE) foi significativamente maior que o de ratas ovariectomizadas

sem reposição de estrógeno (OVXV) (0,44 ± 0,04 versus 0,08 ± 0,01 mg/100g, p < 0,001)

(Fig. 7).

Além disso, o índice das glândulas reprodutivas (Índice da próstata e vesículas

seminais - IPVS) dos machos orquiectomizados (ORQX) foi menor em comparação aos

machos com cirurgia fictícia (SHAM) (0,65±0,03 versus 0,11 ± 0,01 mg/100g de peso

corporal, p< 0,001) (Fig. 8).

0.0

0.2

0.4

0.6

***

OVXE

OVXV

Ind

ice U

teri

no

(m

g/1

00g

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

***

SHAM

ORQX

IPV

S (

mg

/10

0g

de

PC

)

Figura 7. Efeito da ovariectomia no índice uterino de ratas castradas sem (OVXV) e com (OVXE) reposição

estrogênica. OVXV: (veículo, 0,1ml/rata/dia, durante 21 dias), n=30; OVXE (Benzoato de Estradiol,

20µg/0,1ml/rata/dia, durante 21 dias) n=23. Análise estatística: Teste t de Student. (***) p < 0,001.

Figura 8. Efeito da orquiectomia no Índice prostático e vesículas seminais (IPVS) em ratos 21 dias após a

cirurgia fictícia (SHAM), n=26 ou 21 dias após orquiectomia (ORQX), n=24. Análise estatística: Teste t de

Student. (***) p < 0,001.

41

5.2. Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de NaCl

0,3M em ratas.

Após análise dos dados obtidos, em ratas, nenhuma diferença foi observada na

ingestão de água em nenhum dos tempos e para nenhum dos fatores de variação estudados,

não havendo interação significativa deles (i.e. fator hormonal ou fator manipulação

farmacológica central; Fig. 9).

Quando da análise dos dados de ingestão de NaCl 0,3M, nenhuma diferença foi

observada em nenhum dos tempos e para nenhum dos fatores de variação estudados,

tampouco houve interação (Fig. 10).

Da mesma forma que as variáveis anteriores, o índice de preferência ao sódio não

diferiu em nenhum dos tempos e para nenhum dos fatores de variação estudados, não havendo

também interação (Fig. 11).

42

LCEa DIZE0

1

2

3

4

5

OVXE

OVXV

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

4

5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

4

5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

4

5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

4

5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

4

5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

4

5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

5

10

15

20

25

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

BA

C D

E F

G H

Figura 9. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem (OVXV) e com

(OVXE) reposição hormonal. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C),

90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a

reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC). OVXE + LCEa,

n = 11; OVXE + DIZE, n = 12; OVXV + LCEa, n = 14; OVXV + DIZE, n = 16. Análise estatística: ANOVA de

duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal

artificial.

43

LCEa DIZE0

2

4

6

8

OVXV

OVXE

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

5

10

15

20

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

BA

C D

E F

G H

Figura 10. Efeito do DIZE (40nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em fêmeas sem (OVXV) e com



reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) OVXE + LCEa, n

= 11; OVXE + DIZE, n = 12; OVXV + LCEa, n = 14; OVXV + DIZE, n = 16. Análise estatística: ANOVA de


artificial.

44

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

OVXV

OVXEIP

S

LCEa DIZE0.0

0.5

1.0

1.5

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

BA

C D

E F

G H

Figura 11. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em fêmeas ovariectomizadas

com (OVXE) e sem (OVXV) reposição hormonal após ingestão induzida. Volumes de ingestão cumulativa em

15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos

e 24 horas (Painel H) após a reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal

(mL/100g de PC) OVXE + LCEa, n = 11; OVXE + DIZE, n = 12; OVXV + LCEa, n = 14; OVXV + DIZE, n =

16. Análise estatística: ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato;

LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.

45

5.3. Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e

de NaCl 0,3M em ratas:

Na figura 12, os resultados mostraram que 30 min após a reapresentação de fluidos

(Painel B), ocorre uma forte tendência para a significância do fator hormonal sobre a ingestão

de água [F (1,33) = 3,74, p=0,062], com provável redução na ingestão de água nas ratas

OVXV em comparação com as ratas OVXE. No entanto, nos tempos 60 (Painel C), 90 (Painel

D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 min (Painel G), e 24 h (Painel H), já se observou

diferença significativa para o fator hormonal [F(1,33) = 6,43, p=0,016; F(1,33) = 5,64,

p<0,05; F(1,33) = 4,83, p<0,05; F(1,33) = 4,40, p<0,05 e F(1,33)= 26,50, p<0,001

respectivamente], com menor ingestão de água nos animais OVXV em comparação com os

animais OVXE. Nas ratas tratadas com A779, nestes mesmos tempos, o pós-teste de

Bonferroni, foi capaz de identificar menor ingestão de água em fêmeas OVXV + A779 que

nas OVXE + A779 (p < 0,05).

Para a ingestão cumulativa de água, 24h após a reapresentação de fluidos, o mesmo

pós-teste revelou uma menor média em ratas OVXV que em ratas OVXE, independente da

administração central das drogas (p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente tratadas com LCEa

ou A779, Fig. 15 H).

Na figura 13, painel H, após a análise de variância de duas vias, observou-se que a

ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em fêmeas, 24h após a reapresentação de fluidos, sofre

influência da interação dos fatores estudados (i.e. fator hormonal versus fator manipulação

farmacológica central) [F(1,33)= 6,57, p=0,015]. Após a aplicação do pós-teste de Bonferroni,

verificou-se que a ingestão de NaCl 0,3 M foi maior nos animais OVXV + A779 que nos

animais OVXE + A779 (p < 0,05), e também maior quando comparado aos animais OVXV +

LCEa (p < 0,05).

D

46

LCEa A7790

1

2

3

4

5

OVXV

OVXE

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

1

2

3

4

5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

1

2

3

4

5

*

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

1

2

3

4

5

*

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

1

2

3

4

5

*

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

1

2

3

4

5

*

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

1

2

3

4

5

*

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

5

10

15

20

25 *****

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

A B

C D

E F

G H

Figura 12. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de água em fêmeas sem (OVXV) e com



reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (ml/100g de PC) OVXE + LCEa, n

= 10; OVXE + A779, n = 11; OVXV + LCEa, n = 7; OVXV + A779, n = 9. Análise estatística: ANOVA de duas

vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. A779: D-Ala7-Ang (1-7); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial. (*)

p < 0,05; (**) p < 0,01; (***) p < 0,001.

47

LCEa A7790

2

4

6OVXE

OVXVIn

gestã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

5

10

15 **

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

A B

C D

E F

G H

Figura 13. Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) na ingestão cumulativa de sódio em fêmeas sem (OVXV) e com




= 10; OVXE + A779, n = 11; OVXV + LCEa, n = 7; OVXV + A779, n = 9. Análise estatítica: ANOVA de duas

vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. A779: D-Ala7-Ang (1-7); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial. (*)

p < 0,05.

48

Os dados referentes ao IPS em fêmeas (Fig. 14), revelam que há interferência

significativa do fator hormonal nos tempos 60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E) e 180

(Painel F) minutos, sendo F(1,33)= 4,37, p<0,05; F(1,33)= 7,26; p=0,011; F (1,33)= 5,63,

p<0,05 e F(1,33)= 7,76, p<0,01, respectivamente, com maior preferência por sódio nos

animais OVXV, em comparação com os animais OVXE. Nestes tempos, o pós-teste de

Bonferroni foi capaz de detectar diferença apenas nos animais OVXV + A779 em

comparação com os animais OVXE + A779. Após 24h da reapresentação de fluidos (Painel

H), foi observada significância para o efeito do fator condição hormonal (F(1,33) = 6,02, p<

0,05), bem como para a interação de ambos os fatores [F(1,33) = 8,81, p<0,01 (0,66 ± 0,12

versus 0,24 ± 0,03, p<0,001)]. Após a aplicação do pós-teste de Bonferroni, verificou-se que o

IPS foi maior nos animais OVXV + A779 que nos animais OVXE + A779 (p < 0,001), e

também maior quando comparado aos animais OVXV + LCEa (p < 0,01).

49

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0OVXV

OVXE

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 *

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 *

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*****

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 *

IPS

A B

C D

E F

G H

Figura 14. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL.) no índice de preferência ao sódio (IPS) em fêmeas sem (OVXV) e

com (OVXE) reposição hormonal. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel

C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H)após a


= 10; OVXE + A779, n = 11; OVXV + LCEa, n = 7; OVXV + A779, n = 9. Análise estatítica: ANOVA de duas

vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. A779: D-Ala7-Ang (1-7); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.

(**) p < 0,01; (***) p < 0,001.

D G H

50

5.4. Estudo da participação da ECA2 encefálica na ingestão induzida de água e de

NaCl 0,3M em ratos.

Em machos tratados intracerebroventricularmente com DIZE ou seu veículo (Fig. 15),

observa-se que após 15 (Painel A) e 30 (Painel B) min, a ingestão induzida de água sofreu

interferência da interação dos fatores estudados (fator hormonal e fator manipulação

farmacológica central) [F(1,29)=6,62, p=0,015 e F(1,28)=5,91, p<0,05 respectivamente]. Aos

15 min (Fig. 12 A) os animais ORQX + LCEa ingeriram mais água que os SHAM + LCEa (p

< 0,05), o que não se observou nos animais tratados com DIZE. Ademais, até o tempo 30 min

(Fig. 15 B), os animais SHAM + DIZE ingeriram mais água que os animais SHAM + LCEa

(p < 0,01).

Também observou-se significância estatística para o fator hormonal no tempo 240 min

(Fig. 15 G) [F(1,28)=4,19, p<0,05], com menor ingestão de água nos animais ORQX, em

comparação com os animais SHAM, independentemente da manipulação farmacológica

central.

É digno de nota que, na análise da ingestão cumulativa de água em 24 h (Painel H), foi

observada tendência para significância do fator hormonal [F(1, 1,28) =3,15, p=0,087], com

possibilidade de reduzida ingestão nos animais ORQX em comparação com os SHAM.

Para a ingestão de NaCl 0,3M em machos (Fig. 16), a análise estatística revelou haver

significância somente na ingestão cumulativa até o tempo de 15 min (Painel A), onde foi

observada diferença para o fator hormonal [F(1,33)=4,29, p<0,05], com menor ingestão

cumulativa de NaCl 0,3 M nos animais ORQX em comparação com os animais SHAM. Nos

demais tempos estudados não foi observada diferença estatística para nenhum dos fatores.

O índice de preferência ao sódio (IPS) em machos submetidos a ingestão induzida de

sódio e água pelo protocolo utilizado neste trabalho não diferiu entre os grupos em nenhum

dos tempos propostos no estudo, e tampouco sofreu influência da interação ou, isoladamente,

dos fatores de variação aqui investigados (Fig. 17).

51

LCEa DIZE0

1

2

3

SHAM

ORQX

*

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

**

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

1

2

3

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

5

10

15

20

25

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

BA

C D

E F

G H

Figura 15. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com cirurgia fictícia

(SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60

(Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a

reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC) SHAM + LCEa, n

= 10; SHAM + DIZE, n = 10; ORQX + LCEa, n = 9; ORQX + DIZE, n = 10. Análise estatística: ANOVA de


artificial. (*) p < 0,05; (**) p < 0,01.

52

LCEa DIZE0

2

4

6

8SHAM

ORQX

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa DIZE0

5

10

15

20

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

A B

C D

E F

G H

Figura 16. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de NaCl 0,3M em machos com cirurgia

fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B),

60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H)após a

reapresentação de fluidos. Os valores estão normalizados pelo peso corporal (mL/100g de PC). SHAM + LCEa,

n = 10; SHAM + DIZE, n = 10; ORQX + LCEa, n = 9; ORQX + DIZE, n = 10. Análise estatística: ANOVA de

duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: líquido cérebro-espinhal

artificial

53

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SHAM

ORQX

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa DIZE0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

A B

C D

E F

G H

Figura 17. Efeito do DIZE (40 nmol/2μL) no índice de preferência ao sódio (IPS) em machos com cirurgia

fictícia (SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B),

60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a


= 10; SHAM + DIZE, n = 10; ORQX + LCEa, n = 9; ORQX + DIZE, n = 10. Análise estatística: ANOVA de


artificial.

54

5.5. Estudo da participação do receptor Mas encefálico na ingestão induzida de água e

de NaCl 0,3M em ratos.

No estudo seguinte, os resultados demonstram não haver diferença estatística para

nenhum dos fatores e em nenhum dos tempos estudados para ingestão de água em machos

(Fig. 18).

Para ingestão de sódio em machos (Fig. 19), evidenciou-se que nos tempos 30 (Painel

B), 60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F) e 240 minutos (Painel G) há

interação dos fatores estudados (fator manipulação farmacológica central versus fator

hormonal), sendo, F (1,16)= 7,31, p<0,05 para 30 minutos; F (1,16)= 6,15, p<0,05 para 60

minutos; F (1,16)= 6,14, p<0,05 para 90 minutos; F (1,16)= 5,64, p<0,05 para 120 minutos; F

(1,16)= 5,33, p<0,05 para 180 minutos; e F (1,16)= 6,22, p<0,05 para 240 minutos. Após a

aplicação do pós-teste de Bonferroni, verificou-se que a ingestão de NaCl 0,3 M foi menor

nos animais ORQX + A779 que nos animais ORQX + LCEa (p < 0,05) (Painéis C, D, E, F e

G). Nos demais tempos estudados não foi observada nenhuma diferença estatística (Fig. 19).

O índice de preferência ao sódio (IPS) em machos (Fig. 20) não sofreu influência da

interação dos fatores de variação utilizados neste estudo. Isoladamente, estes fatores também

não afetaram estatisticamente o IPS em nenhum dos tempos estudados.

D

E F

G H

A B

55

LCEa A7790.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 SHAM

ORQXIn

gestã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

LCEa A7790

5

10

15

20

25

Ing

estã

o d

e á

gu

a (

ml/100g

)

A B

C D

E F

G H

Figura 18. . Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de água em machos com cirurgia fictícia

(SHAM) e orquiectomizados. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60 (Painel C),



= 5; SHAM + A779, n = 5; ORQX + LCEa, n = 5; ORQX + A779, n = 5. Análise estatítica: ANOVA de duas

vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.

56

LCEa A7790

2

4

6

8SHAM

ORQXIn

gestã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

8

*

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

8

*

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

8

*

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

8

*

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

8

*

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

LCEa A7790

2

4

6

8

Ing

estã

o d

e N

aC

l 0,3

M (

ml/100g

)

A B

C D

E F

G H

Figura 19. Efeito do A779 (10 nmol/2μL) na ingestão cumulativa de sódio em machos com cirurgia fictícia

(SHAM) e orquiectomizados (ORQX). Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B), 60

(Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a



vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. DIZE: dimanizine aceturato; LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.

(*) p < 0,05.

57

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SHAM

ORQXIP

S

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

LCEa A7790.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IPS

A B

C D

E F

G H

Figura 20. Índice de Preferência ao Sódio em machos com cirurgia fictícia (SHAM) e orquiectomizados

(ORQX) microinjetados com A779 ou LCEa. Volumes de ingestão cumulativa em 15 (Painel A), 30 (Painel B),

60 (Painel C), 90 (Painel D), 120 (Painel E), 180 (Painel F), 240 (Painel G) minutos e 24 horas (Painel H) após a



vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. D-Ala7-Ang (1-7)(A779); LCEa: liquido cérebro-espinhal artificial.

58

6. DISCUSSÃO

Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, a atuação dos

hormônios gonadais masculinos e femininos no eixo ECA2/ANG-(1-7)/Mas cerebral,

regulando os comportamentos ingestivos de sódio e água em ratos e ratas, bem como a ação

deste eixo, per si, sobre o apetite por sódio.

A participação de hormônios gonadais masculinos e femininos nestes comportamentos

já tem sido amplamente demonstrada (CURTIS, 2009; EPSTEIN, 1992). No entanto, os

mecanismos neuroendócrinos reguladores das mudanças no comportamento ingestivo de água

e sódio em ambos os sexos permanecem ainda obscuros e contraditórios.

Um dos possíveis mecanismos que constituiu o foco deste estudo foi a provável

influência dos hormônios gonadais em paralelo ao eixo ECA2/ANG-(1-7)/Mas, supostamente

contrarregulatório ao eixo ECA/ANGII/AT1 que reconhecidamente promovem dentre outros

efeitos, a sede e apetite ao sódio.

A distribuição de ECA2 no encéfalo de ratos foi identificada em áreas envolvidas na

regulação central da função cardiovascular e do controle do balanço hidroeletrolítico, tais

como o OVLT, o OSF, o NPV, o NTS, núcleo ambíguo, BVLR e AP (DOOBAY et al.,

2007). Assim, sugerimos que a ECA2 deve, potencialmente, participar não apenas da

regulação da função cardiovascular, bem como da homeostase dos líquidos corporais. Como

por exemplo, sobre aqueles que modulam ou determinam os comportamentos de ingestão de

sódio e água. Paralelamente, estes mecanismos poderiam sofrer interferência dos hormônios

gonadais.

Inicialmente, verificamos que os modelos utilizados de manipulação hormonal foram

eficazes em abolir ou reestabelecer as ações mais conhecidas dos hormônios de interesse. Isto

foi observado pela significativa redução nos índices prostático e da vesícula seminal de ratos

orquiectomizados, quando comparados aos animais submetidos a cirurgia fictícia. Em ratas

ovariectomizadas, a administração diária de estrógeno por 21 dias, elevou o índice uterino a

valores encontrados por Mecawi e colaboradores (2008) em ratas adultas submetidas a um

protocolo de reposição semelhante ao utilizado neste experimento. Já é bem conhecido que

59

ratas submetidas à ovariectomia bilateral apresentam diminuição nas concentrações

plasmáticas de 17β-estradiol, sendo detectados valores muito baixos deste hormônio já ao

final do 7º dia após o procedimento cirúrgico (HERNÁNDEZ et al., 2000). Além disso, o

protocolo utilizado é amplamente adotado por diversos grupos de pesquisa que investigam a

função dos mesmos hormônios gonadais (JONES; CURTIS, 2009; KRAUSE et al., 2003;

MECAWI et al., 2007).

Utilizando os modelos experimentais anteriormente citados, buscamos avaliar a

resposta comportamental de ingestão de sódio e água após a ativação da ECA2, com DIZE

administrado icv, em machos e fêmeas submetidos a protocolos distintos de manipulação de

seus hormônios gonadais.

O efeito ativador da ECA2 pelo DIZE administrado centralmente foi descrito por

MECCA e colaboradores (2011) em protocolo distinto do nosso, já que os autores

administraram cronicamente, enquanto que em nosso estudo o tratamento foi agudo e em dose

única. Segundo os autores, os efeitos obtidos de diminuição do tamanho do infarto cerebral e

do déficit neurológico mensurado 72 horas após o infarto, foram mediados pela ativação dos

receptores Mas por meio da conversão elevada da ANGII em ANG(1-7) através da ação da

ECA2. Isto se opõe aos efeitos da ANGII ligadas ao seu receptor AT1.

Nas fêmeas ovariectomizadas com ou sem a reposição de estrógeno e que receberam

DIZE ou seu veículo, os comportamentos de ingestão hídrica, de NaCl 0,3 M, bem como o

índice de preferência por sódio, induzidos pelo protocolo de depleção de sódio, não sofreram

qualquer interferência de nenhum dos fatores estudados [i.e.: efeito da administração do DIZE

(fator manipulação farmacológica central), ou do estrógeno (fator hormonal)] em nenhum dos

tempos estudados. Num estudo prévio, no qual os autores utilizaram um vetor viral para a

transfecção do gene da ECA2 humana, foi demonstrado que a expressão elevada desta enzima

influencia a regulação central da função cardiovascular e da homeostase dos fluidos corporais

(FENG et al., 2008). Segundo os autores, a elevação da expressão desta enzima resulta em

redução da expressão de receptores AT1 responsáveis pelos efeitos mediados por ANGII.

Portanto, assumindo o possível efeito contrarregulatório da ECA2, nossa hipótese era a de que

a ativação desta enzima com o DIZE fosse capaz de inibir a ingestão de água, mas sobretudo

de NaCl 0,3M e a preferência por sódio, o que não foi observado. Deve-se ressaltar aqui que o

60

protocolo de depleção de sódio utilizado evoca uma ingestão mais expressiva de sódio do que

propriamente de água.

Da mesma forma, o tratamento hormonal crônico com estrógeno nas ratas tratadas

com DIZE ou seu veículo não afetou nenhuma das variáveis estudadas, induzidas pelo

protocolo de depleção de sódio associado a oferta de dieta pobre em sódio. Assim, podemos

especular que o eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas dos substratos neurobiológicos da gênese da sede

e do apetite por sódio induzidos por este protocolo, parecem permanecer estáveis e em

equilíbrio com o eixo ECA/ANGII/AT1. Além disso, diante do achado de que a ativação da

ECA2 com o DIZE não afetou o comportamento de ingestão de água, aventamos a

possibilidade da não participação do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas na ingestão induzida de água

e sódio pelo protocolo de depleção de sódio utilizado neste estudo.

Deve-se destacar aqui que a busca por fármacos com eficiência na ativação da ECA2

está em fase inicial e muito sigilo e restrição de acesso gira em torno da disponibilização

destas promissoras drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. Neste sentido, o

DIZE, droga gentilmente cedida pelo Prof. Robson Santos (UFMG), tem eficiência e DE50

ainda pouco definidas, sobretudo para administração intracerebroventricular

Em relação aos efeitos inibitórios do E2 no comportamento ingestivo de água e sódio,

recentemente Dalmasso e colaboradores (2011), utilizaram o modelo experimental de ratas

ovariectomizadas e ratas ciclando normalmente. Os autores promoveram indução do apetite

por sódio pelo uso de furosemida e dieta pobre em sódio, as fêmeas com reposição hormonal

e fêmeas no estro exibiram um significante decréscimo na ingestão de sódio induzida,

comparável a ratas em diestro ou somente ovariectomizadas. Entretanto, estes achados não

foram reproduzidos em nossos animais.

Ademais, deve-se apontar aqui estudo prévio que mostra que a reposição estrogênica

em ratas ovariectomizadas induz a redução de 20 a 30% nos níveis de RNAm (RNA

mensageiro) que decodifica o receptor AT1 na glândula pituitária (KISLEY; SAKAI;

FLUHARTY, 1999). Adicionalmente, foi relatado por outros autores que a presença de

receptores estrogênicos em neurônios do OSF, atuam reduzindo a ligação da ANGII ao

receptor AT1, bem como diminuindo o número de neurônios que expressam este receptor,

resultando na regulação da resposta dipsogênica em ratas (MECAWI et al., 2007; TANAKA

61

et al., 2003). Neste contexto, outras estruturas encefálicas foram descritas como sendo

influenciadas pela ação do E2, desenvolvendo respostas neuroendócrinas de controle da

ingestão hídrica, tais como o i) MnPO, o qual recebe projeções do OSF; ii) o NPV envolvido

na gênese da sede; iii) o NTS; iv) BVL e; v) o NPB são exemplos de que o E2 deve modular a

ativação de vias encefálicas para respostas a estímulos osmóticos(CURTIS, 2009; ROSAS-

ARELLANO; SOLANO-FLORES; CIRIELLO, 1999; TANAKA; NOMURA, 1993).

Ji et al (2008) implicaram as mudanças nos níveis de estradiol como principal fator

responsável pela regulação da atividade da ECA2. Em seu estudo, os autores observaram que

a ovariectomia resultou em uma redução substancial na atividade da ECA2 renal, sendo esta

revertida pela reposição hormonal no modelo de hipertensão renal. Outro estudo concluiu que

fêmeas cronicamente tratadas com E2 respondem às mudanças na osmolalidade plasmática e

a concentração de ANGII estimulando a ingestão de água e/ou liberação de VP, ao contrario

de fêmeas ovariectomizadas que apresentam resposta reduzida para este fator. (AKAISHI;

HOMMA, 1996). No entanto, apesar destas evidências, em nosso estudo nenhum efeito foi

observados nos comportamentos de ingestão estudados nas ratas com ou sem reposição

hormonal, tampouco com ou sem a ativação da ECA2.

Em ratas, a análise de variância revelou que a ausência do estrógeno reduz a ingestão

cumulativa induzida de água em todos os tempos estudados, exceto nos tempos mais precoces

de 15 e 30 min. Ademais, a administração do antagonista de receptores Mas não afetou este

comportamento, em nenhum dos tempos estudados.

Distintamente, a ingestão cumulativa de sódio não sofreu influência do fator hormonal

e tampouco da administração de A779 em nenhum dos tempos estudados, exceto na ingestão

cumulativa em 24h após a administração de fluidos. Apenas neste tempo, observou-se que o

bloqueio do receptor Mas foi capaz de elevar a ingestão de sódio em ratas OVXV, quando

comparadas a ratas OVXV tratadas com LCEa ou comparadas a ratas OVXE que também

receberam A779. Este achado sugere que a longo prazo, provavelmente por meio de ação

genômica, os receptores Mas são determinantes da redução da ingestão induzida de sódio em

ratas castradas. Porém, na presença do estrógeno, este receptor não parece exercer papel

relevante no controle deste mesmo comportamento, ao menos quando induzido pelo protocolo

utilizado neste estudo.

62

Quando a preferência ao sódio foi investigada pelo IPS, uma significativa elevação da

preferência foi observada em ratas OVXV em comparação com as OVXE, independente da

administração icv do A779 ou do seu veículo. Este achado, tomado em conjunto com os

discutidos anteriormente, sugere que, apesar da não observância da influência do fator

hormonal no comportamento de ingestão de sódio, a constatação da redução da sede em ratas

OVXV foi responsável pela elevação do IPS nas ratas deste grupo.

Quando o IPS foi analisado 24h após a reapresentação de fluidos, observou-se que, na

mesma linha dos achados de ingestão de sódio nestes mesmos animais, o bloqueio do receptor

Mas foi capaz de elevar a preferência ao sódio em ratas OVXV, quando comparadas a ratas

OVXV tratadas com LCEa ou comparadas a ratas OVXE que também receberam A779. Este

achado reforça que, a longo prazo, os receptores Mas são determinantes da redução da

ingestão induzida de sódio em ratas castradas. Contudo, na presença do estrógeno, este

receptor não deve, de fato, exercer papel relevante no controle deste mesmo comportamento,

ao menos quando induzido pelo protocolo aqui utilizado.

Nos machos, observamos que os ratos submetidos à orquiectomia fictícia (SHAM),

apresentaram maior ingestão cumulativa de água aos 240 min após a reapresentação de fluido,

quando comparados aos animais orquiectomizados (ORQX) nos tempos iniciais aos 15 e 30

min. Porém, neste tempo, a administração icv de DIZE não alterou o padrão de ingestão de

água de ratos ORQX ou SHAM. Este achado sugere que os hormônios testiculares exercem

um papel potencializador da sede induzida pelo protocolo de depleção de sódio utilizado neste

estudo.

De modo interessante, a ingestão precoce de água nestes mesmos animais teve um

comportamento paradoxal. Enquanto a castração reduziu a ingestão cumulativa tardia de água

aos 240 min, a ingestão cumulativa em 15 min mostrou a ocorrência de uma maior e mais

precoce avidez por água em animais ORQX, quando comparados aos animais SHAM. Porém,

quando tratados com DIZE, este efeito foi revertido. Este achado sugere que a ativação da

ECA2, apenas em ratos ORQX, é capaz de reverter o efeito dipsogênico precoce da castração.

Considerando que a análise de variância revelou a presença de interação dos fatores de

variação estudados, aos 15 min, pode-se sugerir ainda que apenas em ratos ORQX o eixo

ECA2/ANG-(1-7)/Mas encefálico parece participar da regulação da sede precoce induzida por

este protocolo.

63

De modo ainda mais intrigante, a ingestão cumulativa de água, aos 30 min, agora

adota outro comportamento. Os achados deste tempo mostram que apenas animais não

castrados, quando tratados com DIZE, apresentam sede mais intensa, enquanto nenhum efeito

é observado quando DIZE é administrado em animais ORQX. Nos tempos seguintes este

efeito desaparece. Tomados em conjunto, pode-se especular que o efeito dipsogênico mais

tardio (i.e. observado aos 30 min) do DIZE pode ser dependente de provável ação genômica

da ativação da ECA2, dependente da presença dos hormônios testiculares, que logo

desaparece, como por exemplo a redução da expressão de receptores AT1, como observado

por FENG e colaboradores (2008). Por outro lado, o efeito precoce e inverso observado aos

15 min pode ser decorrente de ação não genômica. Escassos são os dados da literatura que

ostentem outras possibilidades.

Nossos achados, mostraram que a ingestão induzida de NaCl 0,3M em machos

orquiectomizados foi menor em comparação aos ratos SHAM, independente da ativação da

ECA2 encefálica com DIZE. Portanto, nestes animais, a ECA2 parece não influenciar a

ingestão cumulativa de sódio, induzida pelo protocolo utilizado neste estudo. É bem descrito

na literatura que os andrógenos, como a testosterona, exercem um importante papel no

dimorfismo sexual da regulação da pressão arterial. Dentre os estudos descritos, Reckelhoff e

colaboradores (1999) encontraram menor desenvolvimento de hipertensão em ratos SHR com

3 a 5 semanas de idade após a orquiectomia. Ademais, os autores descrevem o bloqueio

crônico do receptor de andrógenos reduz a pressão arterial em machos a valores comparáveis

aos encontrados em fêmeas SHR (RECKELHOFF, 2001).

Os efeitos produzidos pela testosterona foram descritos por Chow e colaboradores

(1992), neste estudo os autores observaram que a castração neonatal de ratos machos resultou

em um comportamento ingestivo ao NaCl a 3% semelhante às fêmeas continuando até a fase

adulta. A androgenização de ratas submetidas a castração neonatal com Propionato de

Testosterona, revelou que a necessidade ao sódio era semelhante aos machos. O tratamento

com Dehidrotestosterona em fêmeas no mesmo modelo anterior, sugere que o dimorfismo

sexual da ingestão de sódio é resultante da aromatização da testosterona para o estrógeno.

No que diz respeito ao índice de preferência ao sódio em machos ORQX ou SHAM,

tratados com DIZE ou seu veículo, foi observado que nenhum dos fatores de variação

64

afetaram esta variável. Contudo, dados da literatura indicam a testosterona como uma das

prováveis causas do dimorfismo sexual da ingestão de sódio em ratos. Neste estudo os autores

encontraram que machos castrados logo após o nascimento, manifestam menor apetite por

sódio, semelhante a fêmeas adultas. No mesmo estudo os autores demonstraram também que

fêmeas tratadas com testosterona no período de amamentação ingerem NaCl na mesma

proporção que machos adultos (EPSTEIN, 1992).

Quando investigamos a participação do receptor Mas encefálico nos comportamentos

ingestivos de água e NaCl 0,3 M, através da sua manipulação farmacológica com o A779, um

antagonista específico, observamos a manutenção do paradoxo que norteia a participação do

eixo ECA2/ANG-(1-7)/Mas no controle destes comportamentos em ratos e ratas submetidos

aos protocolos de manipulação hormonal deste estudo.

O estudo da participação do receptor Mas no comportamento ingestivo de água em

machos castrados ou submetidos a castração fictícia, revelou a ausência da influência dos

fatores estudados, em todos os tempos em que esta análise foi realizada.

Porém, quando a ingestão cumulativa de sódio foi analisada nestes mesmos animais,

observou-se uma significativa interação dos fatores investigados neste estudo. Para esta

variável, o pós-teste revelou que a administração de A779 a ratos ORQX reduziu a ingestão

de sódio destes animais, o que não ocorreu com os animais contendo hormônios gonadais

circulantes. Assim, estes achados sugerem que o receptor Mas exerce papel excitatório sobre a

ingestão de sódio em machos sem hormônios testiculares. Porém, na presença destes

hormônios, os receptores Mas parecem não ter papel relevante no controle da ingestão

induzida de sódio, ao menos no protocolo de indução utilizado neste estudo. Por sua vez, o

IPS não diferiu entre os grupos.

Até o presente momento, não há dados na literatura que descrevam a atuação dos

hormônios gonadais masculinos e femininos na ingestão de água e sódio resultantes da

ativação da ECA2 ou do bloqueio do receptor Mas encefálicos. Esta constatação torna este

estudo inédito e demonstra pela primeira vez os aspectos paradoxais que envolvem a

participação da ECA2 e do receptor Mas de ANG-(1-7) em machos e fêmeas submetidos a

manipulação de seus hormônios gonadais no controle destes importantes comportamentos de

regulação do balanço dos fluidos corporais.

66

7. CONCLUSÃO

Face ao exposto neste estudo e considerando as evidências relatadas por outros

autores, podemos concluir que:

1. A administração icv de DIZE não afeta a sede e o apetite por sódio induzidos por

depleção de sódio em ratas ovariectomizadas ou ovariectomizadas com reposição

de estrógeno;

2. A ovariectomia com ou sem reposição de estrógeno não interfere na ingestão

induzida de sódio e água;

3. A ausência do estrógeno é capaz de reduzir a ingestão induzida de água

independente do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas;

4. O receptor Mas participa a longo prazo, inibindo a ingestão de sódio e o índice de

preferência ao sódio, apenas na ausência de estrógeno;

5. Os hormônios gonadais masculinos atuam independentemente da atividade da

ECA2 promovendo elevação da ingestão de água e NaCl;

6. Os níveis fisiológicos de testosterona parecem suprimir os efeitos do receptor Mas

no protocolo de indução hidrossalina;

7. Os receptores Mas apresentam efeitos natriorexigênicos na ausência de hormônios

gonadais masculinos;

Desta forma concluímos que o estrógeno atua inibindo a ingestão de NaCl

independentemente do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas. Já os hormônios gonadais masculinos

interferem elevando a ingestão hidrossalina sem a interferência do eixo citado. Assim, este

eixo evidencia a necessidade de ampliar as pesquisas a respeito dos distúrbios

comportamentais de ingestão hidrossalina que repercutem diretamente na fisiopatologia das

doenças cardiovasculares.

67

8. REFERÊNCIAS

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ANEXO A

universidade federal de sergipe prÓ … · sodium and water intake are important regulatory...

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