universidade do sul de santa catarina bianca …
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
BIANCA BOTELHO ROUSSENQ
DESENVOLVIMENTO IN LOCO DE UM INDICADOR BIOLÓGICO
CONTROLE DE ESTERILIZAÇÃO DE AUTOCLAVES
Tubarão
2017
UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
BIANCA BOTELHO ROUSSENQ
DESENVOLVIMENTO IN LOCO DE UM INDICADOR BIOLÓGICO
CONTROLE DE ESTERILIZAÇÃO DE AUTOCLAVES
Relatório Técnico/Científico apresentado ao Curso de
Engenharia Química da Universidade do Sul de Santa
Catarina como requisito parcial à obtenção do título de
Bacharel em Engenharia Química.
Prof. Dr. Jonathan Alexsander Bork (Orientador)
Tubarão
2017
3
Com amor e admiração, dedico este relatório a
minha avó Elisabete.
4
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a energia divina que nos impulsiona diariamente na
jornada da vida.
A todos os meus professores, que possuem o dom de transmitir conhecimento
aqueles que pouco sabem, em especial ao meu orientador Prof. Dr. Jonathan Alexsander Bork.
Ao Rodrigo Batista Souza Farmacêutico-Bioquímico do Laboratório Didático da
Saúde da UNISUL, meu sincero agradecimento, por todas as horas prestadas em prol de me
auxiliar com a metodologia deste trabalho.
A Farmacêutica-Bioquímica Talita Rampinelli Monteiro, minha orientadora na
empresa de análises clínicas, por me transmitir sua paixão pela microbiologia.
A toda minha família, em especial meus avós Adair e Elisabete, e meus pais
Martinho e Josiane, pela dedicação em me ajudar a alcançar meus sonhos.
Ao Cirilo A. Nunes, pelo carinho e paciência.
A todos os meus amigos, que de alguma forma me deram força para eu chegar até
aqui, em especial a minha amiga Bárbara Furlan Hübbe por emprestar um pouco da sua
afinidade com o inglês.
Ao curso de Engenharia Química e a Universidade do Sul de Santa Catarina por
proporcionar o meu desenvolvimento profissional e pessoal ao longo desses anos.
5
“Viver no mundo sem tomar consciência do significado do mundo é como vagar
por uma imensa biblioteca sem tocar nos livros” (Manly P. Hall).
6
RESUMO
No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária exige o uso dos indicadores biológicos
para controle do processo de esterilização em empresas que prestam serviços a saúde. Estes
indicadores biológicos tem um alto valor de mercado e seu uso é abundante no país. Ele é
composto por um disco impregnado com uma população de esporos de Geobacillus
stearothermophilus e uma solução contendo um meio de cultura e um indicador de pH. Este
relatório objetivou produzir indicadores biológicos em laboratório de microbiologia a afim de
encontrar o método de fabricação dos mesmos. Realizou-se a inoculação da G.
stearothermophilus em meio de cultura BHI a 60ºC em estufa microbiológica pelo período de
48 horas. Fez-se testes de impregnação da população bacteriana em papel filtro faixa azul, e
utilizou-se uma solução de meio de cultura com o indicador de pH púrpura de bromocresol
com concentração de 0,031 g/L. O teste de validação do método foi realizado utilizando os
dois indicadores biológicos produzidos, passando um deles pelo processo de esterilização em
autoclave, e o outro não. Os dois foram colocados em estufa a 60ºC e pós 48 horas fez-se a
leitura dos resultados. Concluiu-se que o método de produção dos indicadores biológicos é
válido, através da observação da viragem da coloração do indicador que não sofreu o processo
de esterilização. Porém, como a coloração obtida foi muito discreta, estudos devem ser feitos
para melhorar a intensidade da viragem da coloração do indicador de pH e também para
diminuir o tempo de leitura do resultado.
Palavras-chave: Esterilização. Geobacillus stearothermophilus. Indicador Biológico.
7
ABSTRACT
In Brazil, the National Sanitary Surveillance Agency demands the use of biological indicators
to control the sterilization process in companies that provide health services. These biological
indicators have a high market value and their use is abundant in the country. It’s made of a
disk impregnated with a spore population of Geobacillus stearothermophilus and a solution
with a culture medium and a pH indicator. This report aimed to produce biological indicators
in a microbiology laboratory in order to find the method of manufacturing them. An
inoculation of G. stearothermophilus was carried out in a BHI culture medium at 60 ° C was
carried out in a microbiological oven for 48 hours. Bacterial population impregnation tests
were performed on blue band filter paper and a solution of the culture medium was used with
the bromocresol purple pH indicator at a concentration of 0.031 g / L. The validation test of
the method was performed using the two biological indicators produced, where one of them
was autoclaved and the other was not. Both were placed in an oven at 60 ° C and after 48
hours the results were read. It was concluded that the method of production of the biological
indicators is valid by observing the color change of the indicator that did not undergo the
sterilization process. However, as the coloration obtained was very discreet, studies should be
done to improve the intensity of the pH indicator color change and also to decrease the
reading time of the result.
Keywords : Sterilization. Geobacillus stearothermophilus. Biological Indicator.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Diferentes formas bacterianas .................................................................................. 16
Figura 2 - Curva de crescimento típica de uma população bacteriana ..................................... 19
Figura 3 - Coloração de Gram – A. Bacillus subtilis Gram positivos e B. Escherichia coli
Gram negativas. ........................................................................................................................ 22
Figura 4 - Exemplos da relação da taxa de crescimento com a temperatura. ........................... 23
Figura 5 - A escala de Ph e os microrganismos. ....................................................................... 24
Figura 6 - Geobacillus Stearothermophilus .............................................................................. 25
Figura 7- Autoclave .................................................................................................................. 28
Figura 8 - Caixa plástica vedada com fita termossensível (A) antes e (B) depois da
autoclavação. ............................................................................................................................ 29
Figura 9 - Indicador biológico Clean-Test. .............................................................................. 30
Figura 10 - Exemplos do comportamento do indicador biológico ........................................... 31
Figura 11 - Fluxograma das etapas da pesquisa ....................................................................... 33
Figura 12 - Estufa microbiológica ............................................................................................ 35
Figura 13 - Reagentes utilizados no Teste de Gram. Da esquerda para a direita: Violeta
Genciana, Lugol Fraco, Ácool Cetona e Fucsina Fenicada. ..................................................... 36
Figura 14 – Frascos de vidro com tampa de rosca ................................................................... 37
Figura 15- Inserindo os papeis filtros na solução bacteriana.................................................... 38
Figura 16 - Fitas de papel filtro faixa azul em solução bacteriana após 96 horas. ................... 38
Figura 17 - Indicador púrpura de bromocresol e balança analítica. ......................................... 39
Figura 18 – Indicadores biológicos produzidos ........................................................................ 40
Figura 19 - Coloração do BHI antes (esquerda) e depois (direita) do crescimento microbiano
.................................................................................................................................................. 41
Figura 20 - Confirmação do crescimento de G. Stearothermophilus após a coloração de Gram.
.................................................................................................................................................. 42
Figura 21 - Solução de BHI e purpura de bromocresol ............................................................ 43
Figura 22 - A esquerda solução preparada e a direta solução do indicador biológico Clean-
Test. .......................................................................................................................................... 43
Figura 23 - Indicadores biológicos após 48 h de incubação ..................................................... 44
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Métodos físicos e químicos de controle do crescimento microbiano ...................... 26
Tabela 2 - Materiais, reagentes e equipamentos utilizados. ..................................................... 32
Tabela 3- Tempo de permanência dos reagentes na lâmina para o Teste de Gram. ................. 36
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 12
1.1 JUSTIFICATIVA E PROBLEMA .................................................................................. 13
1.1.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 14
1.1.1.1 Objetivos Específicos ................................................................................................. 14
2 REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................... 15
2.1 MICRORGANISMOS ..................................................................................................... 15
2.2 BACTÉRIAS ................................................................................................................... 15
2.3 MEIOS DE CULTURA E CULTIVO ............................................................................. 17
2.4 CRECIMENTO MICROBIANO ..................................................................................... 18
2.5 TURBIDEZ ...................................................................................................................... 21
2.6 COLORAÇÃO DE GRAM ............................................................................................. 21
2.7 EFEITOS DA TEMPERATURA E DO PH NO CRESCIMENTO MICROBIANO ..... 22
2.8 GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS .................................................................. 25
2.9 CONTROLE MICROBIOLÓGICO ................................................................................ 26
2.10 TESTE DE VALIDAÇÃO DA AUTOCLAVAGEM – INDICADORES BIOLÓGICOS
29
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 32
3.1 MATERIAIS .................................................................................................................... 32
3.2 MÉTODOS ...................................................................................................................... 33
3.2.1 Fases de desenvolvimento da pesquisa ...................................................................... 33
3.2.2 Cultivo das células ....................................................................................................... 34
3.2.3 Acompanhamento do crescimento microbiano ........................................................ 35
3.2.4 Escolha dos materiais para a estrutura do protótipo do indicador biológico........ 36
3.2.5 Ensaio de impregnação em papel filtro ..................................................................... 37
3.2.6 Preparo da solução com meio de cultura e indicador de pH ................................... 39
3.2.7 Estudo de validação e comprovação da eficácia do método .................................... 40
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 41
4.1 ANÁLISE DO CRESIMENTO MICROBIANO ............................................................ 41
4.2 COLORAÇÃO DA SOLUÇÃO CONTENDO BHI E PÚRPURA DE
BROMOCRESOL .................................................................................................................... 42
4.3 COMPROVAÇÃO DA EFICÁCIA DO MÉTODO ....................................................... 44
11
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 45
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................................... 46
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 47
12
1 INTRODUÇÃO
Esterilização é o processo de eliminação de microrganismos vivos. O processo de
esterilização é muito importante em empresas de serviços da saúde, como hospitais e
laboratórios de análises clínicas, assim como indústrias farmacêuticas e alimentícias. O rejeito
ou consumo de material infectado por má eficiência do processo de esterilização gera riscos à
saúde humana e ao meio ambiente.
Para assegurar a eficácia do processo de esterilização em autoclaves são utilizados
indicadores biológicos, que fornecem resultado de confirmação de morte de uma população
conhecida de bactérias através da viragem da coloração de um indicador de pH.
Controlar a eficácia de qualquer processo é fundamental por vários motivos,
inclusive a monitoração de muitos processos são exigidas e regulamentadas por lei e/ou
normativas. No caso do indicador biológico é exigido seu uso semanal pela RDC Nº 15, de 15
de março de 2012 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA para monitoração
de esterilização de autoclaves. Visualizando o montante de clínicas, hospitais, laboratórios,
indústrias farmacêuticas e alimentícias existentes, pode-se presumir que este produto é
abundantemente consumido pelo tipo de empresas citadas. O indicador biológico possui uma
tecnologia de funcionamento muito simples, porém seu custo de venda é alto, devido ao
elevado custo de cepas de bactérias como a Geobacillus stearothermophilus – bactéria
formadora de esporos mais utilizadas em indicadores biológicos. A resistência apresentada
por esta bactéria faz da mesma a ideal para controle microbiológico justamente por ser umas
das últimas que irá ser esterilizada em um processo de esterilização em laboratório.
Como parte da formação de Engenheiros Químicos da Universidade do Sul de
Santa Catarina tem-se a valorização do empreendedorismo. A engenharia em geral é razão
importante no desenvolvimento de produtos e cada vez mais a inovação e o desenvolvimento
de produtos de alto valor agregado alteram significativamente a economia mundial. A função
de um engenheiro e de um empreendedor coexistem em muitos momentos, pois ambos são
tomadores de decisões que definem a qualidade de um produto ou serviço. Portanto, estudos
dos processos de produtos ou serviços são importantes para o desenvolvimento da balança
comercial e consequentemente melhor qualidade de vida para população.
13
1.1 JUSTIFICATIVA E PROBLEMA
A Microbiologia, ciência que estuda os microrganismos, é de extrema
importância em diferentes áreas, devido às várias alterações que estes podem causar quando
inseridos em um ser vivo, produto e/ou processo industrial. Seu estudo possibilita minimizar
os efeitos dos microrganismos contaminantes contribuindo para com a humanidade e o meio
ambiente.
No campo de Análises Clínicas a Microbiologia é utilizada para realização de
exames que ajudam no diagnóstico de doenças infecciosas, principalmente causadas por
bactérias. Para que os materiais utilizados nessas análises possam ser reutilizados ou
descartados, sem risco de contaminação, faz-se necessário o processo de esterilização.
Os métodos utilizados são: esterilização por vapor, por calor seco, por óxido de
etileno e por radiação ionizante. Dentre estes, o mais comum é o método de esterilização por
vapor, que se utiliza da pressão reduzida pelo equipamento chamado Autoclave. O processo
de esterilização por Autoclave necessita de um tempo de 15 a 30 minutos à temperatura
mínima de 121°C e tem como principal objetivo promover a eliminação de bactérias
causadoras de esporos.
Independentemente do método de esterilização, é importante que se faça o
controle do equipamento utilizado para garantir a eficácia do processo. Além disso, o
monitoramento do processo de esterilização é exigência de órgãos certificadores e órgãos
fiscalizadores como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, que se baseia na
Resolução - RDC Nº 15, de 15 de março de 2012, que dispõe sobre requisitos de boas práticas
para o processamento de produtos para saúde.
No controle da Autoclave são monitorados os parâmetros físicos (temperatura e
pressão) e biológicos. O método de controle biológico mais aceito atualmente, devido a sua
confiabilidade, é o que utiliza o indicador biológico. Esse indicador é uma ampola teste que
contém um disco impregnado com uma população de esporos de Geobacillus
stearothermophilus e uma solução líquida roxa com indicador de pH e o meio nutriente. Esse
bacilo é utilizado devido a sua capacidade de formar esporos, portanto possui uma alta
resistência e, se o mesmo é eliminado, então todas as outras bactérias também o serão.
Esta ampola teste tem um alto custo de mercado e é abundantemente utilizada,
uma vez que a resolução já citada recomenda a realização semanal do controle biológico.
Basta realizar uma rápida pesquisa na internet para conhecer 11 marcas diferentes de
indicador biológico disponíveis no mercado brasileiro. Dentro destas podemos citar:
14
BIONOVA, Maquira, Medstéril, Clean-up, Sispack, Cristófoli, etc. Há também, pelo menos
13 tipos de indicadores biológicos, formulados para oferecer diferentes tempos de resposta e
para diferentes tipos de esterilização. O mais utilizado é o indicador biológico para verificar o
funcionamento da autoclave à vapor com tempo de leitura final em 24 horas.
Em função do exposto a questão central desta investigação: qual a metodologia
adequada para a fabricação do indicador biológico de controle de esterilização de
autoclaves em estudo descritivo realizado em Tubarão, sul catarinense, no ano de 2017
para o estágio supervisionado em Engenharia Química.
1.1.1 Objetivo Geral
Desenvolver o indicador biológico usado para o controle da esterilização de
materiais autoclavados utilizando materiais e métodos disponíveis em laboratórios de
microbiologia de uma empresa de análises clínicas e da Universidade do Sul de Santa
Catarina.
1.1.1.1 Objetivos Específicos
a) Conhecer os parâmetros de cultivo ótimos da bactéria Geobacillus
Stearothermophilus em consulta e comparação entre bibliografias
especializadas;
b) Cultivar a bactéria Geobacillus Stearothermophilus em meio BHI de
forma a obter suspensão de células adequada para o processo de
impregnação na fibra do teste de esterilização;
c) Acompanhar o crescimento microbiano realizando o monitoramento do
desenvolvimento de microrganismos invasores;
d) Realizar o processo de impregnação da bactéria em um de papel filtro
esterilizado;
e) Adequar o método desenvolvido para ser encapsulado e conservado;
f) Realizar teste de eficácia através de teste de esterilização em comparação
com o produto disponível comercialmente.
15
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 MICRORGANISMOS
Os microrganismos são seres microscópicos, capazes de crescer e se reproduzir.
Podem apresentar variadas formas celulares e são metabolicamente capazes de realizar todos
os tipos de reações bioquímicas que conhecemos.
Eles estão presentes praticamente em todos os ambientes e interagem a todo
tempo com outros seres vivos. Os microrganismos possuem múltiplas funções, podendo
causar consequências negativas ou positivas, em relação à saúde do homem ou ao meio
ambiente.
Responsáveis por contaminações de águas, alimentos e medicamentos, os
microrganismos são capazes de causar doenças em animais, humanos, plantas e outros seres
vivos.
No entanto, segundo Vermelho et al (2006), os micróbios são grandes amigos do
homem, sendo agentes de uma ampla gama de processos que vão desde a produção de
alimentos, incluindo vinhos, pães, queijos e iogurtes, até a manutenção da ciclagem dos
elementos químicos, como por exemplo, o nitrogênio na superfície do globo terrestre. Podem
também ser produtores dos mais diversos compostos de interesses médico, comercial e
ambiental.
Os principais grupos de microrganismos são: as algas, as arqueas, as bactérias, os
fungos, os protozoários e os vírus.
2.2 BACTÉRIAS
São seres unicelulares, que podem apresentar-se de três formas: esféricas (cocos),
cilíndricas (bacilos) ou espiraladas (espirilos ou vibriões).
16
Figura 1 - Diferentes formas bacterianas
Fonte: Fonte: Vermelho et al., 2006, p. 05.
As bactérias apresentam uma organização celular bastante simples,
compreendendo uma parede celular rígida, formada de peptideoglicana, e uma membrana
citoplasmática, composta basicamente de fosfolipídeos e proteínas, mas gliceroglicolipídeos,
hopanóides e outros tipos de lipídeos também podem ser encontrados. O DNA se encontra no
citoplasma, formando a região conhecida como nucleóide. (VERMELHO et al., 2006, p.05).
É importante destacar uma estrutura particular apresentada por alguns grupos
de bactérias: o esporo. Corresponde a uma fase na vida de certas bactérias que se transformam
em esporos, por motivos ainda incompletamente conhecidos. “Além da membrana
citoplasmática, o esporo é envolvido por várias camadas, que lhe confere um revestimento
bastante espesso.” (BORZANI et al., 2001, p.09). A particularidade dos esporos bacterianos é
sua alta resistência a condições externas, principalmente a temperatura. Alguns esporos
resistem por horas a temperaturas maiores que 100°C.
A reprodução das bactérias, normalmente, é feita pelo processo de fissão
binária, no qual uma célula, após atingir um determinado tamanho, se divide em duas. Quanto
a sua nutrição, elas utilizam compostos orgânicos ou inorgânicos como fonte de carbono e
energia, como também a energia luminosa.
Alguns exemplos de grupos de bactérias são: Gram-positivas, Gram-negativas,
espiroquetas, clamídias, micobactérias, cianobactérias, etc.
17
2.3 MEIOS DE CULTURA E CULTIVO
Na natureza os microrganismos se encontram, quase sempre, em conjunto com
diferentes espécies. Sendo assim, para que seja possível estudar as características de um
determinado microrganismo que compõe estas misturas, faz-se necessário realizar seu
isolamento. Para isso, precisamos de um meio de cultura e de condições de incubação que
favoreçam o crescimento da espécie desejada.
As condições necessárias para o crescimento microbiano podem ser divididas
em duas categorias principais: as condições físicas, tais como temperatura, pH e pressão, e as
condições químicas. Dentre as condições químicas, temos a água e as diversas fontes de
carbono (C), nitrogênio (N), fósforo (P), enxofre (S) e sais minerais.
“O meio de cultura consiste em um material nutritivo, preparado em
laboratório, que se destina ao cultivo artificial dos microrganismos, devendo, portanto,
fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. Pode ser líquido, sólido ou semi-
solido”. (VERMELHO et al., 2006, p.130).
Conforme a espécie que será cultivada, o meio de cultura poderá ser sintético,
também chamado de quimicamente definido. Neste contexto, todos os elementos são
conhecidos, possuindo composição química exata.
No entanto, o meio de cultura também poderá ser complexo e conter ingredientes
complexos, como extrato de carne, rico em vitaminas e outros fatores de
crescimento orgânicos, e cuja composição química exata não é conhecida. Além do
extrato de carne, vários outros extratos também são muito utilizados nos meios de
cultura complexos. Os extratos de levedura e de malte, bem como as peptonas e
outros hidrolisados parciais de proteínas, como a caseína, que é a proteína
encontrada no leite. A grande vantagem dos meios complexos é que a adição de um
ingrediente já garante a presença de uma ampla gama de substâncias necessárias ao
crescimento do microrganismo. (id ibid., p.132).
Há também os meios diferenciais, elaborados para destacar uma característica
fisiológica ou bioquímica do microrganismo em questão, permitindo distinguir suas colônias
das de outros microrganismos que cresçam no mesmo meio. A inclusão de um indicador de
pH ao meio de cultura possibilita evidenciar as colônias de microrganismos que geram ácidos
a partir do uso daquele carboidrato, pois a cor do indicador irá alterar-se em resultado da
acidificação do meio em torno da colônia.
2.3.1 Caldo BHI – Brain Heart Infusion
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária em “Descrição dos meios de
cultura empregados nos exames microbiológicos” - Módulo IV, o meio de cultura BHI é
18
oriundo de peptona e dextrose, que são nutrientes de cérebro e coração respectivamente,
justificando o seu nome. A peptona e a infusão (processo de mergulhar qualquer substância
em água fervente) são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. A dextrose é um
carboidrato que os microrganismos usufruem para a fermentação.
Este meio é adequado para o cultivo de estreptococcos, enterobactérias, não
fermentadores, meningococos, pneumococos, leveduras e fungos. O BHI pode ser utilizado na
preparação do inoculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para a realização de
teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano e para teste de motilidade em
lâmina.
Sua cor original é amarela clara e límpida, e quando turva é positivo para presença
de crescimento bacteriano. Deve-se conserva-lo a temperatura de 4 a 10°C por no máximo 6
meses.
2.4 CRECIMENTO MICROBIANO
No estudo dos microrganismos, a palavra crescimento significa um aumento do
número de células. O crescimento equivale a um constituinte fundamental da função
microbiana, já que todas as células contêm tempo de vida delimitado na natureza. Nesse
contexto, as espécies apenas são conservadas devido ao crescimento constante das populações
microbianas. A maioria dos casos práticos requer o controle desse crescimento microbiano.
Desta forma, o conhecimento sobre como as populações microbianas podem se multiplicar
aceleradamente é muito importante na elaboração de métodos de controle do crescimento
microbianos.
Na maioria dos procariotos, o crescimento de uma célula individual ocorre até que
esta se divida – processo denominado fissão binária, como já mencionado no item 2.2.
Durante o ciclo do crescimento há um aumento no número de todos os constituintes celulares,
de modo que cada célula filha fique com um cromossomo completo e cópias satisfatórias de
todas as outras macromoléculas, monômeros e íons inorgânicos, assegurando assim sua
sobrevivência como célula independente.
Ao longo do ciclo de divisão celular, todos os integrantes estruturais de uma
célula são duplicados. O período em que uma célula gera duas novas é chamado geração.
19
Desta maneira, o tempo de geração é igual ao tempo necessário para uma população
multiplicar-se. Os tempos de geração são variados nos diversos organismos.
Muitas bactérias têm tempo de geração de 1 a 3 horas, embora sejam conhecidos
organismos que se dividem a cada 10 minutos e outros que levam vários dias para se
dividir. Além disso, o tempo de geração de determinado organismo depende, até
certo ponto, do meio de cultura utilizado e das condições de incubação empregadas. (MADIGAN, MARTINKO e PARKER, 2004, p.132).
O crescimento de microrganismos em batelada possibilita a elaboração de uma
curva de crescimento específica, exemplificada na figura x. Essa curva de crescimento pode
ser separada em diversas fases nomeadas: fase lag, fase exponencial, fase estacionária e fase
de morte (ou de declínio).
Figura 2 - Curva de crescimento típica de uma população bacteriana
Fonte: Madigan, Martinko e Parker, 2004, p.134.
Quando uma população microbiana é inoculada em um novo meio de cultura a
partir de uma cultura antiga, o crescimento não se inicia imediatamente, mesmo que todas as
células do inoculo sejam capazes de se reproduzir. Esse período de inexistente crescimento
microbiano equivale à fase lag, que pode ser longa ou curta, dependendo do estado da cultura
e das condições de cultivo. Isso ocorre porque, normalmente, nessas circunstâncias, as células
do inoculo estão deficientes de vários elementos primordiais e necessitam de tempo para
produzi-los novamente. “Se uma cultura em fase exponencial for inoculada em um mesmo
20
meio, nas mesmas condições de cultivo, a fase lag não ocorrerá, havendo o estabelecimento
imediato de um crescimento exponencial.” (id ibid., p. 134).
A fase exponencial é resultado da divisão binária. Células em crescimento
exponencial em geral encontram-se em estado mais “saudável”. A maior parte dos
microrganismos unicelulares apresenta crescimento exponencial, apesar de taxas de
crescimento bastante variáveis. A fase exponencial define-se por conter inicialmente uma taxa
lenta do aumento do número de células que, mais tarde, é acelerada.
Com isso, observa-se um aumento explosivo no número de células nos estágios
finais. A taxa de crescimento exponencial é influenciada pelas condições ambientais
(temperatura, composição do meio de cultura) e pelas características genéticas do
próprio organismo. (id ibid., p.132).
Em uma cultura em batelada não pode haver o crescimento exponencial
ilimitadamente. Cálculos apontam que, se uma única bactéria, com tempo de geração de 20
minutos, possuir crescimento exponencial constante por 48 horas, renderia uma população
com peso cerca de 4.000 vezes maior que o peso da Terra. Logicamente, algo deve acontecer,
determinando a interrupção do crescimento da população. Geralmente, o que se sucede é (1) o
término de um nutriente fundamental existente no meio de cultura e/ou (2) quando algum
produto de excreção celular impacta uma concentração inibitória e proporciona o fim do
crescimento exponencial. Neste instante, a população alcançou a fase estacionária. Nessa
fase, geralmente, não acontece crescimento do número de células, porém em alguns
organismos, pode decorrer um baixo crescimento; onde algumas células se fracionam, na
mesma proporção que outras morrem e os dois processos se compensam, não ocasionando
modificação no número de células.
Se uma população que entrou na fase estacionária continuar nas mesmas
condições de incubação, notaremos que as células irão morrer, ou seja, alcançaram a fase de
morte. A fase de morte é também exponencial, todavia, a taxa de morte celular é muito menor
do que à taxa de crescimento exponencial.
Existem vários métodos que pode ser empregados para visualizar o crescimento
microbiano em um meio de cultura; posteriormente trataremos de dois métodos: turbidez e
coloração de Gram.
21
2.5 TURBIDEZ
Segundo Madigan, Martinko e Parker (2004), um procedimento rápido e de
grande utilidade para observar o crescimento microbiano é a turbidez. Uma suspensão celular
tem aparência turva porque as células dispersam a luz que penetra a suspensão. Quanto maior
o número de células existentes, maior a quantidade de luz dispersa e, consequentemente, mais
turva a suspensão. A turbidez pode ser visualizada a olho nu e também medida com o auxílio
de um espectrofotômetro, instrumento que proporciona a passagem de luz por uma suspensão
celular, identificando a quantidade de luz emergente não dispersa. Os comprimentos de onda
geralmente usados para medir a turbidez de culturas bacterianas são: 540 nm (verde), 600 nm
(laranja)ou 660 nm (vermelho).
2.6 COLORAÇÃO DE GRAM
Um corante é uma molécula que pode se ligar a uma estrutura celular e conferir-
lhe cor. Os métodos de coloração fazem com que os microrganismos se realcem em relação
ao fundo da placa o qual ele se encontra, ajudando os pesquisadores na identificação da
existência de crescimento microbiano, como também examinar diferenças estruturais e
químicas nas estruturas celulares.
A maioria das bactérias possuem membranas celulares com superfícies
negativamente carregadas, portanto atraem corantes básicos positivamente carregados. Os
corantes mais utilizados são o azul de metileno, o cristal violeta, a safranina e o verde de
malaquita.
Em microbiologia, são utilizados dois tipos principais de coloração: a coloração
simples e a diferencial. A coloração simples utiliza um único corante e revela os formatos
básicos das células e seus arranjos. A coloração diferencial utiliza dois ou mais corantes e
diferencia dois tipos de organismos ou duas partes diferentes de um mesmo organismo.
A coloração de Gram, certamente a coloração diferencial mais utilizada, foi criada
pelo médico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884.
Neste método de coloração, as células bacterianas primeiramente absorvem o cristal
violeta, e então acrescenta-se o iodo. O iodo reage age como um mordente, ou seja,
uma substância química que ajuda na retenção do corante em determinadas células.
Aquelas estruturas que não retêm o cristal violeta são descoradas por etanol a 95%
ou por uma solução etanol-acetona; são então lavadas e coradas com safranina. (BLACK, 2002, p.60).
22
Figura 3 - Coloração de Gram – A. Bacillus subtilis Gram positivos e B. Escherichia
coli Gram negativas.
Fonte: Vermelho et al., 2006, p. 95.
Quatro grupos de organismos podem identificados através da coloração de Gram:
1. Gram-positivos, cuja parede celular retém o corante cristal violeta;
2. Gram-negativos, cuja parede celular não retém o corante cristal violeta;
3. Gram-não-reativos, que não se coram ou se coram fracamente e;
4. Gram-variáveis, que se coram de maneira desigual.
2.7 EFEITOS DA TEMPERATURA E DO PH NO CRESCIMENTO MICROBIANO
A temperatura é o fator ambiental mais importante que influencia no crescimento
e sobrevivência dos microrganismos. Ela pode atingi-los de duas formas distintas. À medida
que a temperatura aumenta, as reações químicas e enzimáticas passam a acontecer mais
rapidamente. Porém, acima de certa temperatura, algumas proteínas podem deteriorar-se.
Cada organismo possui três temperaturas chamadas de temperaturas cardeais:
1) Uma temperatura mínima, abaixo da qual é incapaz de crescer;
2) Uma temperatura ótima, em que o crescimento ocorre rapidamente e;
3) Uma temperatura máxima, acima da qual o crescimento torna-se
impossível.
A temperatura ótima encontra-se sempre mais perto da temperatura máxima do
que da mínima. “A temperatura máxima de crescimento equivale ao instante em que uma ou
mais proteínas-chave da célula são inativadas. No entanto, os fatores que controlam a
23
temperatura mínima de crescimento de um organismo são ainda pouco conhecidos.”
(MADIGAN, MARTINKO E PARKER, 2004, p.141.).
As temperaturas cardeais são muito variáveis nos diversos tipos de
microrganismos; alguns possuem temperatura ótima de 4°C, já outros, de 100°C.
Por mais que os microrganismos tenham inúmeras regiões de temperatura ótimas
de crescimento, estes podem ser separados em quatro grupos:
Psicrófilos: com ótimo em baixas temperaturas, encontrados em ambientes
muito frios;
Mesófilos: com ótimo em temperaturas medianas, encontrados em animais
de sangue quente e ambientes terrestres e aquáticos de latitudes tropicais;
Termófilos: com ótimo em altas temperaturas, encontrados em ambientes
muito quentes e;
Hipertermófilos: com ótimo em temperaturas muito elevadas, encontrados
em ambientes extremamente quentes, como fontes termais, gêiseres e
fendas hidrotermais no fundo do mar.
Figura 4 - Exemplos da relação da taxa de crescimento com a temperatura.
Fonte: Madigan, Martinko e Parker, 2004; p.141.
Termófilos e Hipertermófilos são aptos a se reproduzir em altas temperaturas por
conta de suas enzimas e outras proteínas conterem termoestabilidade extremamente maior a
de mesófilos. Mas qual a razão dessa termoestabilidade? Os termófilos, por exemplo,
possuem lipídeos repletos de ácidos graxos saturados, que estabilizam e viabilizam a
24
resistência térmica. Ácidos graxos saturados produzem ambientes mais hidrofóbicos que os
insaturados, que facilitam a estabilidade da membrana.
Esses dois grupos de microrganismos são muito interessantes em processos
industriais e biotecnológicos, pois muitos destes são favorecidos a altas temperaturas.
Um exemplo prático de uma enzima termoestável de grande aplicação corresponde a
DNA polimerase, isolada do termófilo Termus aquaticus. Essa enzima é utilizada na
reação de polimerização em cadeia, um método extremamente importante para a
amplificação de sequencias específicas de DNA. (id ibid., p.147).
Enfim, visando sua utilidade industrial, é importante o estudo e desenvolvimento
sobre a aplicação de enzimas e outros produtos celulares termoestáveis.
É também característica individual de cada microrganismo possuir uma faixa de
pH onde ocorre seu crescimento, e um determinado pH ótimo – ponto de maior velocidade de
reprodução. Os microrganismos mais comuns crescem em pH variando de 5 a 9, pois a
maioria dos ambientes naturais apresenta pH dentro deste intervalo. Apenas certas espécies
podem crescer em pHs menores que 2 ou maiores que 10. Os microrganismos que crescem
em pHs baixos são chamados de acidófilos, enquanto os que crescem em pHs altos são
nominados alcalifílicos.
Figura 5 - A escala de Ph e os microrganismos.
Fonte: Madigan, Martinko e Parker, 2004, p.147.
25
Apesar de os microrganismos possuírem valores de pHs específicos para o seu
crescimento, o pH ótimo é apenas o pH do meio externo. O pH interno da célula permanece
próximo a neutralidade impedindo a exterminação de macromoléculas sensíveis as bases ou
ácidos.
Em culturas em batelada o pH pode alterar durante o crescimento, como
consequência das funções metabólicas que consomem ou produzem elementos básicos ou
ácidos. Por este motivo, soluções tampões são muito utilizadas na produção dos meios de
cultura, com o objetivo de manter o pH constante.
2.8 GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS
Geobacillus stearothermophilus é uma bactéria termófila, formadora de esporos,
gram positiva, caracterizada por uma membrana celular interna e uma parede celular espessa.
Ela é anaeróbica, ou seja, não necessita do oxigênio para sobreviver, e possui forma de bastão.
A G. stearothermophilus é encontrada em ambientes muito quentes, como aberturas térmicas
e solos desérticos. Algumas enzimas resistentes ao calor, como a xilanase para tratamento de
polpa e protease tipo termolisina para produção de aspartame artificial, foram isoladas desta
bactéria termófila.
Figura 6 - Geobacillus Stearothermophilus
Fonte: microbewiki, 2017.
A estirpe 10 de Geobacillus stearothermophilus é uma cepa que foi isolada do
material de uma fonte termal no Parque Nacional de Yellowstone, no norte dos Estados
Unidos. Esta bactéria é constantemente utilizada na indústria de biotecnologia para
26
comprovar a eficácia dos ciclos de esterilização a vapor, devido a sua alta resistência ao calor.
(TIMKO, 2010).
2.9 CONTROLE MICROBIOLÓGICO
O controle do crescimento dos microrganismos é importantíssimo e obrigatório na
Medicina e em outras áreas das Ciências da Saúde como Biologia, Enfermagem, Farmácia,
Nutrição e Odontologia. Como exemplos do emprego dos métodos de controle, temos a
prevenção das infecções hospitalares por procedimentos adequados que vão desde o modo
correto de lavar as mãos até as técnicas indicadas, de acordo com normas do Ministério da
Saúde, para limpar, esterilizar e/ou desinfetar instrumentos e superfícies hospitalares. Se
realizado de maneira correta, estes procedimentos garantem devido nível de microrganismos,
o que é indispensável para a segurança dos pacientes e da equipe de trabalho.
Na indústria, diversos métodos de controle microbiológico podem ser utilizados, e
este controle faz parte das fases que asseguram a qualidade dos produtos como alimentos,
cosméticos, medicamentos, água, etc.
Em laboratórios de análises clínicas e também de pesquisa estes métodos são
usados no preparo de meios de cultura, esterilização de vidraria como pipetas, placas de Petri,
ponteiras e outros materiais.
Os microrganismos podem ter seu crescimento controlado por agentes químicos e
físicos, os quais podem eliminar totalmente os microrganismos (esterilização) ou impedir a
sua reprodução, gerando condições nas quais eles não podem se crescer (desinfecção).
Diferentes métodos podem ser utilizados, como por exemplo, calor e radiação ionizante.
Contudo, a forma de controle mais utilizada é a esterilização, que normalmente se dá pela
aplicação de métodos físicos como vapor e calor sob pressão, operado na autoclave.
Tabela 1- Métodos físicos e químicos de controle do crescimento microbiano
MÉTODOS FÍSICOS
Temperatura
Radiação
Filtração
Dessecação
Remoção de O2
27
Vibração ultra-sônica
MÉTODOS QUÍMICOS
Desinfetantes
Anti-sépticos
Preservativos usados em alimentos
Fonte: adaptado de Vermelho et al, 2006, p. 38.
Assim, observamos a relevância do emprego dos métodos de controle dos
microrganismos em diversos campos. A seleção dos métodos depende da finalidade, da
característica do material e do grau de controle almejado. A seguir nos métodos que utilizam a
temperatura no controle microbiano.
2.8.1 Métodos que empregam o calor úmido
2.8.1.1 Autoclave
A autoclave é um instrumento que utiliza o vapor d’agua sob pressão que gera a
temperatura mínima de 121°C. Este método extermina as formas vegetativas e esporuladas de
bactérias e fungos, ocasionando a esterilização.
A autoclavação é um procedimento muito utilizado em laboratórios e hospitais.
Algumas autoclaves contem dispositivos para retirar o ar, pois o mesmo normalmente
impossibilita uma esterilização eficaz, dificultando o contato direto do vapor com o material.
Porém, autoclaves sem mecanismo de remoção do vapor também são muito empregadas.
Neste caso, o material pode ser seco posteriormente em estufa. (VERMELHO; et al, 2006,
p.39 e 40)
A monitoração da eficiência da autoclavação deve ser feita com indicador
biológico diariamente segundo a RDC Nº 15, de 15 de março de 2012 da ANVISA.
Trataremos melhor sobre o monitoramento da esterilização posteriormente no item 2.10.
28
Figura 7- Autoclave
Fonte: da autora, 2017.
2.8.1.2 Pasteurização
Técnica muito utilizada na indústria de alimentos que só devem ser expostos ao
calor em circunstâncias reguladas para não degenerar os nutrientes. Na pasteurização acontece
uma redução do número dos microrganismos pela submissão rápida a uma temperatura
relativamente alta. Este método não esteriliza. Como exemplos de alimentos pasteurizados
podemos citar o leite e a cerveja. Na indústria de laticínios é usual empregar um teste para
verificar se o produto foi pasteurizado, que é o teste da fosfatase alcalina, uma enzima
proveniente do leite que é inativada após a pasteurização.
2.8.2 Métodos que empregam o calor seco
2.8.2.1 Estufas e Fornos
Possui menor capacidade de penetração do que o calor úmido e necessitam altas
temperaturas e tempos maiores. “A característica comum entre os métodos que utilizam o
calor seco é ausência de umidade, o que torna o processo menos eficiente e demorado. Na
estufa o material é aquecido por convecção e por condução.” (id ibid., 2006, p.44). O calor
seco não corrói instrumentos metálicos e não atinge a superfície dos vidros. Para controlar a
29
eficiência, devem ser aplicados testes semanais utilizando o Bacillus subtilis e usadas fitas
termossensíveis específicas para o calor seco.
2.10 TESTE DE VALIDAÇÃO DA AUTOCLAVAGEM – INDICADORES BIOLÓGICOS
Teste de validação são sistemas criados para verificar a confiabilidade do
processo, assegurando resultado fidedigno. A validação testa a eficiência do equipamento, ou
seja, se o mesmo desempenha as especificações para ele exigidas. Existem dois tipos de
indicadores utilizados para a validação, os indicadores químicos (fitas termossensíveis) e os
indicadores biológicos.
As fitas termossensíveis são fabricadas com uma substancia impregnada que
permite o aparecimento de faixas pretas após as mesmas serem expostas a altas temperaturas.
Estas fitas tem menor confiabilidade em relação ao indicador biológico, pois não garantem a
exterminação de bactérias, e as mesmas não podem ser mais utilizadas para teste do
monitoramento da esterilização em autoclaves.
Figura 8 - Caixa plástica vedada com fita termossensível (A) antes e (B) depois da
autoclavação.
Fonte: Vermelho et al., 2006, p.43.
Como já mencionado no item 2.8.1.1, a RDC Nº 15, de 15 de março de 2012 da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, dispões sobre requisitos de boas
práticas para o processamento de produtos para saúde, incluindo os de monitoração da
eficiência da autoclavação.
Art. 98 No monitoramento do processo de esterilização dos produtos para saúde
implantáveis deve ser adicionado um indicador biológico, a cada carga. Parágrafo
30
único. A carga só deve ser liberada para utilização após leitura negativa do
indicador biológico. Art. 99 O monitoramento do processo de esterilização com
indicador biológico deve ser feito diariamente, em pacote desafio disponível
comercialmente ou construído pelo CME ou pela empresa processadora, que deve
ser posicionado no ponto de maior desafio ao processo de esterilização, definido
durante os estudos térmicos na qualificação de desempenho do equipamento de
esterilização. (RDC Nº 15, de 15 de março de 2012 – ANVISA).
O indicador biológico é composto por uma fita de esporos de Bacillus
Stearothermophilus, e uma ampola contendo o meio de cultura e um indicador de pH. Abaixo
um exemplo de indicador biológico comercializado atualmente.
Figura 9 - Indicador biológico Clean-Test.
Fonte: da autora, 2017.
Para se verificar se uma autoclave está funcionando apropriadamente, coloca-se
no equipamento o indicador biológico juntamente com os outros materiais a serem
esterilizados. Após a autoclavação, o frasco interno do indicador é quebrado para liberar o
meio de cultura sobre a fita contendo os esporos e coloca-se o mesmo sob suas condições de
incubação. Após algumas horas, se a ampola continuar com a coloração inicial do indicador
de pH, significa que a esterilização foi eficaz, ou seja, não houve crescimento do Bacillus
Stearothermófilus. Caso o meio de cultura tenha alterado a sua cor, significa crescimento
bacteriano, ou seja, esterilização ineficaz.
31
Figura 10 - Exemplos do comportamento do indicador biológico
Fonte: Google imagens, 2017.
O indicador de pH mais utilizado em indicadores biológicos comercializados
atualmente é a púrpura de bromocresol. Este indicador mantém sua coloração roxa em pH
alcalino ou levemente ácidos (entre 6 e 8) e altera para coloração amarela em pHs ácidos
(abaixo de 5,5). Desta forma, o indicador que apresentar coloração roxa indica ausência de
crescimento bacteriano, e amarela presença de crescimento bacteriano.
32
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
Segue abaixo a relação de materiais, reagentes e equipamentos utilizados para as
práticas dos métodos realizados.
Tabela 2 - Materiais, reagentes e equipamentos utilizados.
NOME FABRICANTE QUANTIDADE
MATERIAIS
Papel Filtro Unifil 1 disco
Geobacillus
Stearothermofilos ATCC
7953
Plast Labor ----------------
Meio de cultura BHI HiMedia Laboratories 300 mL
Fraco de vidro com tampa Desconhecido 2
Indicador Púrpura de
Bromocresol Vetec 6 mg
Cartucho Plástico
Autoclavável Detrilab 1
Pote de vidro Desconhecido 2
Bico de Bunsen Desconhecido 1
Alça de Níquel-Cromo Desconhecido 1
Lâmina de vidro Desconhecido 2
REAGENTES
Violeta Genciana Laborclin ----------------
Lugol Fraco Laborclin ----------------
Álcool Cetona NewProv ----------------
Fucsina Fenicada Laborclin ----------------
EQUIPAMENTOS
Microscópio Eclipse E 200 Nikon 1
Estufa Microbiológica Soc.Fabbe 1
33
Autoclave Soc.Fabbe 1
Balança Analítica Voyeger 1
Fonte: da autora, 2017.
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Fases de desenvolvimento da pesquisa
Para desenvolver o estudo sobre a metodologia de produção do indicador
biológico foram realizadas as etapas descritas no fluxograma abaixo:
Figura 11 - Fluxograma das etapas da pesquisa
Fonte: da autora, 2017.
Levantamento dos dados
bibliográficos
Teste de crescimento da
Geobacillus S. em BHI
Definição da metodologia a ser executada
1ª execução da metodologia
Estudo de ajustes na metodologia
2ª execução da metodologia
Análise dos resultados
34
O levantamento dos dados bibliográficos foi realizado a partir de livros,
dissertações, normativas e legislações disponíveis na biblioteca e base de dados da
Universidade do Sul de Santa Catarina e na internet.
Antes de iniciar qualquer função metodológica, fez-se um teste de crescimento
com a cepa de Geobacillus Stearothermophilus e o meio de cultura BHI disponíveis.
Confirmado o crescimento da cepa no caldo BHI, iniciou-se então o estudo para
definição da metodologia que seria executada a fim de produzir o indicador biológico.
Com a metodologia definida e todos os materiais reunidos, realizou-se o método
em laboratório de microbiologia da empresa concessora do estágio.
Como os resultados da metodologia executada não foram os esperados, ou seja,
não alcançou a viragem da coloração, estudou-se novamente a metodologia a fim de encontrar
os possíveis problemas e soluciona-los. Desta forma, aumentou-se o tamanho do recorte dos
papeis filtros, aumentou-se também o tempo de permanência dos mesmo em solução
bacteriana e também definiu-se a concentração da solução de meio de cultura e indicador de
pH.
Executou-se a metodologia com os ajustes em laboratório de microbiologia da
Universidade do Sul de Santa Catarina, e fez-se a análise dos resultados.
3.2.2 Cultivo das células
A população de Geobacillus Stearothermofilos ATCC 7953 foi cultivada em 100
mL de meio de cultura BHI. O meio de cultura foi preparado pelo Laboratório Didático da
Saúde da Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL.
A suspensão bactéria e meio de cultura foi inoculada em estufa microbiológica a
60°C pelo período de 48 horas.
Após este período, a suspensão foi armazenada em temperatura ambiente durante
15 dias.
35
Figura 12 - Estufa microbiológica
Fonte: da autora, 2017.
3.2.3 Acompanhamento do crescimento microbiano
Após o período de 48 horas de incubação da bactéria, verificou-se a existência de
turvação do meio de cultura e realizou-se o Teste de Coloração de Gram (ver item 2.6) para
comprovar a existência de crescimento bacteriano e verificar a possível presença de
microrganismos invasores.
O método do teste de Coloração de Gram consiste em “sujar” uma lâmina de
vidro com uma porção do material onde se quer verificar a existência de crescimento
microbiano. A lâmina foi corada com os regentes da Figura 13.
36
Figura 13 - Reagentes utilizados no Teste de Gram. Da esquerda para a direita: Violeta
Genciana, Lugol Fraco, Ácool Cetona e Fucsina Fenicada.
Fonte: da autora, 2017.
Tabela 3- Tempo de permanência dos reagentes na lâmina para o Teste de Gram.
REAGENTE TEMPO
Violeta Genciana 1 min
Lugol Fraco 1 min
Álcool Cetona 15 s
Fucsina Fenicada 30 s
Fonte: da autora, 2017.
Para cada reagente existe um tempo de permanência do mesmo na lâmina,
expostos na Tabela 3. Entre um reagente e outro lavou-se a lâmina com água corrente. Após,
deixou-se a lâmina secar para posterior análise em microscópio.
3.2.4 Escolha dos materiais para a estrutura do protótipo do indicador biológico
A fim de aproximar o protótipo dos indicadores biológicos já comercializados
atualmente, definiu-se impregnar uma população de Geobacillus Stearothermophilus em
papel filtro faixa azul. A escolha do papel filtro deve-se a porosidade do mesmo que é de 2
µm, estando adequado para reter bactérias que variam de 2 a 6 µm.
37
Figura 14 – Frascos de vidro com tampa de rosca
Fonte: da autora, 2017.
Decidiu-se utilizar frasco de vidro pequenos com tampa de rosca para substituir o
tubo externo do indicador comercial, onde o papel filtro já impregnado é depositado para
posterior contato com o meio de cultura após a autoclavação.
3.2.5 Ensaio de impregnação em papel filtro
Recortaram-se retângulos de papel filtro Faixa Azul no tamanho 2,5 x 0,5 cm,
colocou-se os mesmos em saco plástico autoclavável e esterilizou-se em autoclave. Após a
autoclavagem deixou-se o plástico contendo os retângulos de papel filtro em estufa de
secagem por 5 horas.
38
Figura 15- Inserindo os papeis filtros na solução bacteriana
Fonte: da autora, 2017.
Em bancada de laboratório, ligou-se o bico de Bunsen para criar um ambiente
estéril, pegou-se o frasco contendo a população de Geobacillus Stearothermofilos e com o
auxílio de uma pinça estéril foi-se coletando cuidadosamente os retângulos de papel filtro de
dentro do saco estéril e transferindo os mesmos para o frasco contendo o meio de cultura e
bactérias.
Figura 16 - Fitas de papel filtro faixa azul em solução bacteriana após 96 horas.
Fonte: da autora, 2017.
39
Deixou-se papel filtro e solução bacteriana em contato pelo período de 96 horas a
temperatura ambiente.
3.2.6 Preparo da solução com meio de cultura e indicador de pH
Segundo GUIZELINI (2010), a concentração ideal para o indicador de pH
púrpura de bromocresol é entre 0,016 e 0,031 g/L.
Figura 17 - Indicador púrpura de bromocresol e balança analítica.
Fonte: da autora, 2017.
Desta forma pesou-se em balança analítica 6,2 mg de indicador púrpura de
bromocresol e dilui-se em 200 mL de BHI. Esterilizou-se a solução em autoclave a 121°C
por 40 minutos.
40
3.2.7 Estudo de validação e comprovação da eficácia do método
Com o auxílio de uma pinça, retirou-se 2 (dois) retângulos da solução bacteriana e
colocou-se um em cada frasco - já estéril. Adicionou-se 1 mL da solução meio de cultura +
indicador de pH em cada frasco.
Identificou-se um dos tubos com a letra “P” de padrão, e este tubo foi colocado
em estufa microbiológica a 60 °C. O outro tubo foi esterilizado em autoclave e após, também
foi colocado na mesma estufa microbiológica sob a mesma temperatura.
Figura 18 – Indicadores biológicos produzidos
Fonte: da autora, 2017.
Os tubos permaneceram em estufa pelo período de 48 horas para posterior leitura
de comprovação da eficácia do método de validação.
41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ANÁLISE DO CRESIMENTO MICROBIANO
Após as 48 horas de incubação da solução bacteriana percebeu-se turvação do
meio de cultura. A figura 18 demonstra do lado esquerdo um exemplo da coloração original
do meio de cultura e do lado direito a solução bacteriana com aspecto turvo indicando
crescimento microbiano.
Figura 19 - Coloração do BHI antes (esquerda) e depois (direita) do crescimento microbiano
Fonte: da autora, 2017.
Para confirmar o crescimento microbiano e detectar a possível presença de
microrganismos invasores, realizou-se o teste de coloração de Gram.
42
Figura 20 - Confirmação do crescimento de G. Stearothermophilus após a coloração de Gram.
Fonte: da autora, 2017.
Pode-se verificar em análise microscópica a presença dos bacilos Gram positivos,
devido a sua forma alongada e sua coloração roxa. Não foram detectados microrganismos
invasores.
4.2 COLORAÇÃO DA SOLUÇÃO CONTENDO BHI E PÚRPURA DE
BROMOCRESOL
Ao diluir o indicador de pH púrpura de bromocresol no meio de cultura BHI com
base na concentração de 0,031 g/L, primeiramente pensou-se que a coloração estaria muito
forte, diferente da coloração da solução presente no indicador biológico Clean-Test. Porém
como o volume (200 mL) era bem maior do que o presente na ampola referência, a coloração
tende a parecer mais intensa. Por este motivo, a fim de realizar a comparação da coloração da
solução preparada com a solução do indicador biológico Clean-Test, pegou-se
aproximadamente 0,5 mL da solução e colocou-se ao lado da ampola do indicador referência.
43
Figura 21 - Solução de BHI e purpura de bromocresol
Fonte: da autora, 2017.
Figura 22 - A esquerda solução preparada e a direta solução do indicador biológico Clean-
Test.
Fonte: da autora, 2017.
Nota-se que a coloração da solução preparada se aproximou bastante da solução
do indicador referência.
44
4.3 COMPROVAÇÃO DA EFICÁCIA DO MÉTODO
Após 48 horas de incubação os indicadores biológicos apresentaram a seguinte
aparência:
Figura 23 - Indicadores biológicos após 48 h de incubação
Fonte: da autora, 2017.
A esquerda, o indicador biológico autoclavado permaneceu com a coloração roxa
indicando não crescimento microbiano. A direita, nota-se mudança discreta na coloração do
indicador não autoclavado.
A mudança na coloração do indicador foi muito discreta em relação a mudança de
coloração que ocorre nos indicadores biológicos comercializados atualmente. Porém, mesmo
que discreta, pode-se afirmar que há presença de crescimento microbiano neste meio.
Pode-se levantar algumas hipóteses do motivo pelo qual a mudança de coloração
que ocorreu foi discreta.
1. O crescimento microbiano pode estar ocorrendo de forma muito lenta, de
maneira que o tempo de leitura para a validação do método seja longo.
2. O método de impregnação das bactérias na fita de papel filtro pode não ter
sido eficiente ao ponto de reter esporos viáveis o suficiente para realizar a
viragem completa do indicador.
45
5 CONCLUSÃO
Este relatório realizou estudo em várias etapas na produção de um indicador
biológico para teste de esterilização em autoclaves, e pode-se concluir que as condições de
incubação da Geobacillus Stearothermophilus, ou seja, 60°C em estufa em meio BHI pelo
período de 48 horas, fornecem um bom crescimento de células.
O primeiro teste da metodologia não forneceram resultados satisfatórios, ou seja,
não alcançou-se a viragem do pH do indicador padrão. O insucesso da primeira tentativa da
metodologia foi atribuído a não absorção de células pelo papel filtro e pela utilização
incorreta da concentração da solução contendo meio de cultura e indicador de pH. Portanto
mostrou-se importantíssimo para o sucesso da metodologia o tempo de permanência dos
papeis filtros em solução bacteriana e a concentração do indicador de pH.
O segundo teste do método, discutido detalhadamente neste relatório, utilizou
impregnação em fita de papel filtro faixa azul durante 96 horas em contato com a solução
bacteriana, e solução do indicador púrpura de bromocresol com concentração de 0,031 g/L.
Esta metodologia mostrou resultado satisfatório e suficiente para validar o método,
observando a mudança da coloração do indicador biológico não autoclavado.
Contudo, mais estudos devem ser realizados a fim de obter um produto que
apresente mudança de coloração mais estável e em um período menor de resposta.
46
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
A fim de produzir um indicador biológico a nível de comercializá-lo deve-se
realizar mais estudos para melhorar a leitura do resultado do controle da esterilização e
poder realmente garantir a eficiência do processo. Sugere-se as seguintes ações:
Estudar um método para quantificar o número de esporos viáveis presentes no papel filtro;
Realizar o teste de impregnação em outros tipos de papel filtro com diferentes porosidades;
Realizar o teste de validação com diferentes concentrações da solução de meio de cultura e
indicador de pH.
Estudar a possibilidade de adição de algum produto na solução com o indicador de pH que
auxilie na estabilidade da mudança de coloração;
Realizar o crescimento da G. Stearothermophilus em outro meio de cultura;
Estudar a razão dos tempos de resposta, e como proceder para diminuí-lo.
Realizar estudo de custos e viabilidade econômica.
47
REFERÊNCIAS
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS-ABNT. NBR ISO 11134.
Esterilização de Produtos Hospitalares - Requisitos para Validação e Controle de Rotina
- Esterilização pelo Calor Úmido. São Paulo, 2001.
BLACK, Jaqueline G. Microbiologia –Fundamentos e Perspectivas. 4. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan S.A., 2002, p 856.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC Nº 15, de 15 de março
de 2012. Regulamento Técnico que estabelece os requisitos de boas práticas para o
processamento de produtos para saúde.
BORZANI, Water. et al. Biotecnologia Industrial. Vol.1. 1. ed. São Paulo: Edgard Blucher,
2001, p. 288.
CORRÊA, E.G.; CASTILHO, A.R.F. de; PEREIRA, C.V. Indicadores químicos e
biológicos da eficácia de esterilização por autoclave ou estufa. Revista Odonto Ciência, v.
24, n.2, p.156-160, 2009.
GUIZELINI, Belquis Palácio. Desenvolvimento de um novo processo de produção de
esporos de geobacillus stearothermophilus e sua utilização em indicador biológico para
esterilização a vapor. Curitiba: Universidade Federal do Paraná, 2010.
LEHNINGER, A. L. Bioquímica. 4. ed. São Paulo: Edgard Blücher, 2007.
MADIGAN, Michel T. ; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de Brock.
10. ed. São Paulo: Prentice Hall, 2004, p. 624.
TORTORA, Gerard J. ; FUNKE, Berdell R. ; CASE, Christine L. Microbiologia. 8. ed. Porto
Alegre: Artmed, 2005, p. 894.
TIMKO, Sam. Geobacillus stearothermophilus. 2010.
https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/geobacillus_stearothermophilus. Acesso em: 16 de
novembro de 2017.
VERMELHO, Alane Beatriz. et al. Práticas de Microbiologia. 1. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan S.A., 2006, p. 256.