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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMlCAS

CARRERA DE QUÍMICA

Definición del comportamiento térmico de Urera laciniata Goudot ex Wedd, para

establecer la metodología de estabilidad de formas farmacéuticas sólidas

Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título

de QUÍMICO

Autor: Villacis Franco Jhonnathan Gonzalo

Tutora: PhD. Martha Azucena Suárez Heredia

Quito, mayo 2018

ii


FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, Jhonnathan Gonzalo Villacis Franco en calidad de autor del trabajo de

investigación “Definición del comportamiento térmico de Urera laciniata Goudot ex

Wedd, para establecer la metodología de estabilidad de formas farmacéuticas

sólidas.”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a hacer uso de todos los

contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines

estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8, 9 y demás pertinentes a la Ley de propiedad Intelectual y su Reglamento.

También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización

y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a

lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

Firma:

Jhonnathan Gonzalo Villacis Franco

CI: 1500619463

iii



CONSTANCIA DE LA APROBACIÓN DE TUTOR

Yo, Martha Azucena Suárez Heredia en calidad de tutora del trabajo de investigación

titulado: “Definición del comportamiento térmico de Urera laciniata Goudot ex

Wedd, para establecer la metodología de estabilidad de formas farmacéuticas

sólidas.” elaborado por el estudiante Jhonnathan Gonzalo Villacis Franco de la carrera

de Química, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador,

considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo

metodológico y en el campo epistemológico, por lo que APRUEBO, a fin de que sea

sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.

Dado en la ciudad de Quito a los 24 días del mes de mayo del 2018.

-------------------------------------------------

Firma

Dra. Martha Azucena Suárez Heredia

C.I. 1707242838

iv



CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL

TRIBUNAL

El tribunal constituido por: Dr. Pablo Bonilla y Dra. Consuelo Andrade, luego de

revisar el trabajo de investigación titulado: Definición del comportamiento térmico de

Urera laciniata Goudot ex Wedd, para establecer la metodología de estabilidad de

formas farmacéuticas sólidas., previo a la obtención del título de Químico presentado

por el señor Jhonnathan Gonzalo Villacis Franco. Aprueba el trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman.

----------------------------------

Dr. Pablo Bonilla Dra. Consuelo Andrade

C.I: 1709888240 C.I. 1001057650

---------------------------

Dra. Martha Suárez

C.I: 1707242838

v

DEDICATORIA

A mis padres Gonzalo y Piedad, pilares fundamentales

en mi vida. Sin ellos, jamás hubiese podido llegar a mis metas.

También dedico este proyecto a uno de

mis mejores amigos, Moris, más que un amigo es un hermano

que representó gran apoyo en los buenos y malos momentos.

Jhonnathan Gonzalo Villacis Franco

vi

AGRADECIMIENTOS

Mis sinceros agradecimientos están dirigidos hacia la empresa FARCOL, y a su Gerente

el Señor Luis Cola, quien, con su ayuda desinteresada, nos brindó apoyo para el desarrollo

de la investigación.

A mi tutora, Dra. Martha Suárez, por confiar en mí y darme la oportunidad de formar

parte de su equipo de investigación, por guiarme y aconsejarme en cada etapa de la

investigación.

Al Dr. Pablo Bonilla y a la Dra. Consuelo Andrade por sus valiosas aportaciones y

comentarios críticos sobre el trabajo de investigación, sobre todo por siempre estar

dispuestos a ayudar.

A mi familia por siempre brindarme su apoyo.

A mis más cercanos amigos Moris, Sebastián, Nathy, Mathius, Jose, Gabriela, Liss,

Magaly, Alexander, Henry, Kathe y Luis, que siempre han estado ahí cuando más los

necesité.

vii

LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN

La presente investigación referida a “Definición del comportamiento térmico de Urera

laciniata Goudot ex Wedd, para establecer la metodología de estabilidad de formas

farmacéuticas sólidas”, se realizó en el Laboratorio de Investigación de Productos

Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, en

la ciudad de Quito, como parte del Proyecto Semilla: “Estudio de estabilidad térmica de

fitofármacos utilizando calorimetría diferencial de barrido”.

viii

Índice de contenidos

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1

CAPÍTULO I ..................................................................................................................... 2

El Problema ....................................................................................................................... 2

Planteamiento del problema ........................................................................................... 2

Formulación del problema ............................................................................................. 3

Preguntas directrices ...................................................................................................... 4

Objetivos ........................................................................................................................ 4

Objetivo General ........................................................................................................ 4

Objetivos Específicos ................................................................................................. 4

Justificación e Importancia ............................................................................................ 4

CAPÍTULO II .................................................................................................................... 7

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA ................................................................................... 7

Antecedentes .................................................................................................................. 7

Fundamento Teórico ...................................................................................................... 8

Estabilidad de fármacos. ............................................................................................ 8

Estabilidad de productos naturales de uso medicinal. .............................................. 14

Fundamento Metodológico .......................................................................................... 19

Preparación de la muestra. ....................................................................................... 19

Extracción de Compuestos fenólicos. ...................................................................... 20

Cuantificación de compuestos fenólicos. ................................................................. 21

Estabilidad térmica por Calorimetría Diferencial de Barrido. ................................. 22

Capacidad Antioxidante. .......................................................................................... 23

Hipótesis ...................................................................................................................... 23

Hipótesis de trabajo Hi. ............................................................................................ 23

Hipótesis Nula Ho. ................................................................................................... 24

Sistema de variables ..................................................................................................... 24

ix

CAPÍTULO III ................................................................................................................ 25

MARCO METODOLÓGICO ......................................................................................... 25

Diseño de la investigación (Enfoque, nivel y tipos) .................................................... 25

Población y muestra ..................................................................................................... 25

Muestra. .................................................................................................................... 25

Métodos y materiales ................................................................................................... 25

Equipos y materiales. ............................................................................................... 25

Reactivos y estándares. ............................................................................................ 26

Diseño experimental .................................................................................................... 27

Matriz de Operacionalización de variables. ............................................................. 29

Técnica de procesamiento de datos ............................................................................. 30

Significancia estadística de los efectos. ................................................................... 30

Procedimientos ............................................................................................................. 30

Acondicionamiento de la materia vegetal. ............................................................... 30

Obtención de extractos. ............................................................................................ 31

Análisis Térmico. ..................................................................................................... 39

Estabilidad. ............................................................................................................... 41

CAPÍTULO IV ................................................................................................................ 43

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ........................................................... 43

Acondicionamiento de la materia vegetal .................................................................... 43

Obtención del extracto ................................................................................................. 43

Análisis cualitativo ...................................................................................................... 43

Marcha fitoquímica. ................................................................................................. 43

Perfil cromatográfico................................................................................................ 45

Análisis cuantitativo .................................................................................................... 45

Cuantificación de compuestos fenólicos. ................................................................. 45

Determinacion de Capacidad Antioxidante del extracto etanólico. ......................... 47

Análisis térmico ........................................................................................................... 50

x

Análisis de reproducibilidad de picos del extracto de Urera laciniata Goudot ex

Wedd. ....................................................................................................................... 50

Análisis de reproducibilidad de picos del comprimido. ........................................... 51

Análisis térmico de los excipientes .......................................................................... 52

Definicion de las condiciones de corrido ................................................................. 54

Análisis estadístico ...................................................................................................... 58

Estabilidad ................................................................................................................... 62

Condiciones del estudio de estabilidad. ................................................................... 62

Cuantificación de compuestos fenólicos en los comprimidos. ................................ 62

Determinación de la Capacidad Antioxidante. ......................................................... 66

Análisis térmico de los comprimidos al final del estudio de estabilidad. ................ 67

CAPÍTULO V ................................................................................................................. 71

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .............................................................. 71

Conclusiones ................................................................................................................ 71

Recomendaciones ........................................................................................................ 72

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 73

ANEXOS ......................................................................................................................... 79

xi

Índice de tablas

Tabla 1. Condiciones de las pruebas de estabilidad por zona climática ......................... 10

Tabla 2. Comparación de la ecuación cinética integrada con la regresión lineal ............ 13

Tabla 3. Compuestos fenólicos ........................................................................................ 18

Tabla 4. Equipos y materiales.......................................................................................... 26

Tabla 5. Reactivos ........................................................................................................... 27

Tabla 6. Estándares ......................................................................................................... 27

Tabla 7. Factores y dominio experimental ...................................................................... 28

Tabla 8. Diseño factorial completo 22 ............................................................................. 28

Tabla 9. Algoritmo de Yates: cálculo de los efectos de los factores y de su

interacción. ...................................................................................................................... 29

Tabla 10. Matriz de Operacionalización de variables ..................................................... 29

Tabla 11. Metodologías para la marcha fitoquímica ....................................................... 32

Tabla 12. Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC para el

extracto. ........................................................................................................................... 34

Tabla 13. Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC para la

comparación del extracto con los estándares. .................................................................. 35

Tabla 14. Curva de calibración de compuestos fenólicos. .............................................. 36

Tabla 15. Curvas para capacidad antioxidante ................................................................ 38

Tabla 16. Aleatorización del experimento y su réplica, y datos para calorimetría

(Extracto) ......................................................................................................................... 39

Tabla 17. Fórmula unitaria par comprimidos de 450 mg. ............................................... 40

Tabla 18. Aleatorización del experimento y su réplica, y datos para calorimetría

(pastillas) ......................................................................................................................... 41

Tabla 19. Análisis fitoquímico cualitativo de la especie Urera laciniata Goudot ex

Wedd ................................................................................................................................ 44

Tabla 20. Datos para la curva de calibración media de compuestos fenólicos totales .... 46

Tabla 21. Valores de absorbancia y % de inhibición para ácido ascórbico..................... 47

Tabla 22. Valores de absorbancia y % de inhibición para el extracto de Urera laciniata

Goudot x Wedd ................................................................................................................ 48

Tabla 23. Ecuaciones y pendientes para ácido ascórbico y extracto de Urera laciniata

Goudot ex Wedd para determinar capacidad antioxidante. ............................................. 49

Tabla 24. Ecuaciones del porcentaje de inhibición para el ácido ascórbico y el extracto

de Urera laciniata Goudot ex Wedd. .............................................................................. 50

xii

Tabla 25. Temperaturas de las réplicas para verificar reproducibilidad de los picos del

extracto de Urera laciniata Goudo ex Wedd. ................................................................. 51


comprimido. ..................................................................................................................... 52

Tabla 27. Variación de temperatura obtenida en los tratamientos .................................. 59

Tabla 28. Efectos obtenidos mediante el algoritmo de Yates.......................................... 59

Tabla 29. Calculo de la varianza de las respuestas por diferencia de duplicados. .......... 60

Tabla 30. Significancia estadística de los efectos y su interacción sobre la variación de

la temperatura de degradación ......................................................................................... 60

Tabla 31. Efectos calculados y error estándar para el diseño factorial 22 del estudio

calorimétrico. ................................................................................................................... 61

Tabla 32. Datos para análisis t ......................................................................................... 61

Tabla 33. Concentración de compuestos fenólicos en el estudio de estabilidad ............. 62

Tabla 34. Ecuaciones obtenidas por regresión lineal para cada orden cinético y

coeficiente de correlación. ............................................................................................... 64

Tabla 35. % de Inhibición de comprimidos en estudio ................................................... 67

Tabla 36. Temperaturas de degradación a las diferentes condiciones del estudio de

estabilidad. ....................................................................................................................... 68

Tabla 37. Taxonomía de la ortiga .................................................................................... 83

xiii

Índice de figuras

Figura 1. Vista mundial de la determinación de la zona climática por país. ................... 10

Figura 2. Regresión Lineal de la ecuación de Arrhenius. ................................................ 12

Figura 3. Heterósido de ácido gálico con glucosa. .......................................................... 19

Figura 4. Ramnoglucosido de quercetol. ......................................................................... 19

Figura 5. Reacción de identificación de compuestos fenólicos. ...................................... 21

Figura 6. Mecanismo de acción del reactivo de Folin-Denis. ......................................... 22

Figura 7. Ejemplo de termograma. .................................................................................. 23

Figura 8 Representación gráfica con las variables del diseño. ........................................ 29

Figura 9. Coordenadas geográficas del lugar de recolección de la especie vegetal ........ 43

Figura 10. Perfil cromatógrafico del extracto de Urera laciniata Goudos ex Weed a

diferentes longitudes de onda: A. 254nm; B. Luz blanca ................................................ 45

Figura 11. Comparación de los Rf de los estándares con el extracto. De izquierda a

derecha: Extracto, ácido caféico, ácido gálico, extracto, acido tánico, ácido ferúlico,

ácido rosmarínico y extracto. A. 254nm y B. luz blanca. Placa revelada con FeCl3 al

5% .................................................................................................................................... 45

Figura 12. Curva de calibración promedio de compuestos fenólicos totales expresados

como ácido caféico. ......................................................................................................... 46

Figura 13. Determinación de capacidad antioxidante. Ácido ascórbico (rojo), extracto

(azul). ............................................................................................................................... 49

Figura 14. Curva %inhibición vs concentración de ácido ascórbico (azul) y extracto

(rojo). ............................................................................................................................... 50

Figura 15. Termogramas de las cuatro réplicas del extracto puro, a 10ºC/min y 1mg de

muestra. ........................................................................................................................... 51

Figura 16. Termogramas de los comprimidos para reproducibilidad. ............................. 52

Figura 17. Termogramas de excipientes. ......................................................................... 53

Figura 18. Termograma de la mezcla de exipientes: aerosíl, estearato de magnesio,

almidón y lactosa. ............................................................................................................ 53

Figura 19. Termograma del tratamiento 1: 10 °C/min y 0,5 mg (- -); Izquierda:

Extracto etanólico de Urera laciniata Goudot ex Wedd; Derecha: Comprimido. .......... 54

Figura 20. Termograma de la réplica del tratamiento 1 tratamiento 1: 10 °C/min y 0,5

mg (- -); Izquierda: Extracto etanólico de Urera laciniata Goudot ex Wedd; Derecha:

Comprimido. .................................................................................................................... 55

xiv

Figura 21. Termograma del tratamiento 2: 20 °C/min y 0,5 mg (+ -); Izquierda: Extracto

etanólico de Urera laciniata Goudot ex Wedd; Derecha: Comprimido. ........................ 55

Figura 22. Termograma de la réplica del tratamiento 2: 20 °C/min y 0,5 mg (+ -);

Izquierda: Extracto etanólico de Urera laciniata Goudot ex Wedd; Derecha:

Comprimido. .................................................................................................................... 56

Figura 23. Termograma del tratamiento 3: 10 °C/min y 1,5 mg (- +); Izquierda:


Figura 24. Termograma de la réplica del tratamiento 3: 10 °C/min y 1,5 mg (- +);


Comprimido. .................................................................................................................... 57

Figura 25. Termograma del tratamiento 4: 20 °C/min y 1,5 mg (+ +); Izquierda:


Figura 26. Termograma de la réplica del tratamiento 4: 20 °C/min y 1,5 mg (+ +);


Comprimido. .................................................................................................................... 58

Figura 35. Termogramas de los comprimidos a las diferentes condiciones al final del

estudio de estabilidad comparados con el termograma del comprimido inicial en el

tratamiento 4 .................................................................................................................... 68

Figura 36. Termogramas de los comprimidos en el frasco ámbar a las diferentes

temperaturas de estudio. .................................................................................................. 69

Figura 37. Termogramas de los comprimidos en el frasco blanco a las diferentes


Figura 38. Termogramas de los comprimidos en el frasco transparente a las diferentes


Figura 39. Ortiga(Urera laciniata Goudot. Ex Wedd) ................................................... 83

Figura 40. Ortiga (Urera laciniata Goudot ex Wedd.).................................................... 83

Figura 41. Dos compuestos fenólicos presentes en la ortiga. ......................................... 85

Figura 42. Termograma réplica 1 .................................................................................... 89

Figura 43. Termograma réplica 2. ................................................................................... 89



Figura 46. Termograma réplica 1 comprimido ................................................................ 91



xv

Figura 49Termograma réplica 4 comprimido .................................................................. 92

Figura 50. Termograma Lactosa ...................................................................................... 93

Figura 51. Termograma almidón ..................................................................................... 93

Figura 52. Termograma estearato de magnesio ............................................................... 94

Figura 53. Termograma aerosil ....................................................................................... 94

xvi

Índice de anexos

Anexo 1. Esquema de Causa-Efecto ............................................................................... 79

Anexo 2. Diagrama de flujo ............................................................................................ 80

Anexo 3. Monografía de la planta en estudio .................................................................. 82

Anexo 4. Preparación de reactivos .................................................................................. 88

Anexo 5. Termogramas de estandarización del extracto puro......................................... 88

Anexo 6. Termogramas de estandarización del comprimido. ......................................... 91

Anexo 7. Termogramas de excipientes............................................................................ 93

xvii

Índice de Ecuaciones

(Ecuación 1) Ecuación de Arrhenius .............................................................................. 12

(Ecuación 2) Ecuación de Arrhenius reescrita para linealizar ........................................ 12

(Ecuación 3) Determinación del porccentaje de inhibición............................................ 23

(Ecuación 4) Cálculo de la varianza de los efectos ........................................................ 30

(Ecuación 5) Ecuación para calcular la concentración de compuestos fenólicos totales

en ppm. ........................................................................................................................... 46

xviii

“DEFINICIÓN DEL COMPORTAMIENTO TÉRMICO DE Urera laciniata

Goudot ex Wedd., PARA ESTABLECER LA METODOLOGÍA DE

ESTABILIDAD DE FORMAS FARMACÉUTICAS SÓLIDAS.”

Autor: Jhonnathan Gonzalo Villacis Franco

([email protected])

Tutora: Dra. Martha Azucena Suárez Heredia

([email protected])

Se determinaron las condiciones para realizar un barrido térmico en el extracto etanólico

y comprimidos de Urera laciniata Goudot ex Wedd, utilizando un diseño factorial

completo 22 al 95% de confianza. Los factores de estudio fueron la velocidad de

calentamiento y la cantidad de muestra. El análisis estadístico definió que los factores

analizados son no significativos en la zona experimental de estudio y por tanto se

seleccionaron condiciones utilizando criterios de costo-beneficio en el análisis. En las

condiciones establecidas, se obtuvieron termogramas que determinaron que el extracto

etanólico de la especie estudiada presenta temperaturas de degradación superiores a

100°C y en los comprimidos, la temperatura se desplaza una media de 70°C, hacia

temperaturas superiores. El estudio de estabilidad utilizó el análisis de compuestos

fenólicos como marcador fitoquímico y se comprobó que, en 54 días, no se tienen

variaciones significativas en la concentración inicial de fenoles, en la temperatura de

degradación y en la capacidad antioxidante de los comprimidos. De esta manera, se

estableció que la ecuación de Arrhenius y las condiciones de zona climática utilizadas

para los estudios de estabilidad no son aplicables en comprimidos de Urera laciniata

Goudot ex Wedd.

Palabras clave:

CALORIMETRÍA, ESTABILIDAD, CAPACIDAD ANTIOXIDANTE,

COMPUESTOS FENÓLICOS, ORTIGA, TERMOGRAMAS.

xix

"DEFINITION OF THE THERMAL BEHAVIOR OF Urera laciniata

Goudot ex Wedd., TO ESTABLISH THE METHODOLOGY OF STABILITY OF

SOLID PHARMACEUTICAL FORMS."

Author: Jhonnathan Gonzalo Villacis Franco

([email protected])

Tutor: Dra. Martha Azucena Suárez Heredia

([email protected])

The working variables to define the thermal behavior of the vegetable species Urera

laciniata Goudot ex Wedd in the calorimeter are: heating rate and the sample amount. By

using a complete factorial design 22 to 95% confidence it was determined the conditions

to perform a thermal scanning in the ethanolic extract and tablets of Urera laciniata

Goudot ex Wedd. The study factors were the heating rate and the sample amount. The

statistical analysis defined that the analyzed factors are not significant in the experimental

zone of study and therefore conditions were selected using cost-benefit criteria in the

analysis. Under the established conditions, were obtained thermograms which determined

that the ethanolic extract of the studied species has degradation temperatures above 100

° C and in the tablets, the temperature shifts to an average of 70 °C, towards higher

temperatures. The stability study used the analysis of phenolic compounds as a

phytochemical marker and it was found that in 54 days, there are no significant variations

in the initial concentration of phenols, neither the degradation temperature and in the

antioxidant capacity of the tablets. By this way, it was established that the Arrhenius

equation and the climatic zone conditions used for the stability studies are not applicable

in tablets of Urera laciniata Goudot ex Wedd.

Keywords:

CALORIMETRY, STABILITY, ANTIOXIDANT ACTIVITY, PHENOLIC

COMPOUNDS, NETTLE, THERMOGRAMS.

1

INTRODUCCIÓN

La calorimetría diferencial de barrido ha sido muy utilizada en la última década para

determinar temperaturas en las que existen cambios térmicos en los productos farmacéuticos,

puesto que con esta temperatura se pueden realizar estudios de estabilidad que optimicen el

método de determinación de la vida útil de un producto.

El contenido del presente trabajo de investigación se distribuyó de la siguiente manera:

En el capítulo I se plantea el problema en el cual se define la necesidad de realizar el

estudio de estabilidad en base a la degradación de los principios activos, además de la

formulación del problema, los objetivos y la justificación e importancia de la investigación. En

el capítulo II se aborda los aspectos teóricos que sustentan la investigación. Además, se

muestran las hipótesis formuladas para la investigación. En el capítulo III se establece la

metodología, se define el diseño experimental y las variables que fueron analizadas, además se

detallan los reactivos, equipos y procedimientos utilizados en la investigación.

Para finalizar, los capítulos IV y V establecen las discusiones de los resultados

alcanzados en la investigación, las conclusiones las cuales indican el cumplimiento de los

objetivos planteados y las recomendaciones que se pueden utilizar para trabajos posteriores

relacionados con esta línea de investigación.

2

CAPÍTULO I

El Problema

Planteamiento del problema

Las pruebas de estabilidad de fármacos se realizan según la zona climática a la que se

desee comercializar el producto, estas pruebas pueden ser: aceleradas, a largo plazo o

intermedias. Según la Conferencia Internacional de Armonización y la Organización Mundial

de la Salud (ICH), la temperatura recomendada para hacer una prueba de estabilidad acelerada

es de 40±2 °C con una humedad relativa de 75±5 %, y para realizar una prueba a largo plazo

es de 30±2 °C con una humedad relativa de 75±5 %. Estos parámetros son adecuados para los

4 tipos de zonas climáticas existentes (Bajaj, Singla, & Sakhuja, 2012).

Los métodos tradicionales para determinar el tiempo de vida media y vida útil, se basan

en modelos matemáticos de la teoría cinética de gases aplicados a muestras sólidas. Además,

la guía ICH Q1A (R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products (2003)

recomienda procesos que son isotermales, durante un periodo mínimo de 12 meses en caso de

estudios a largo plazo y 6 meses para estudios acelerados.

En la “Guía para la realización y presentación de estudios de estabilidad de productos

farmacéuticos en chile” se describen las condiciones a las que se realizan estudios de

estabilidad de productos farmacéuticos para pruebas a tiempo real, aceleradas e intermedias las

cuales se efectúan a una temperatura de 25 °C, 40 °C y 30 °C respectivamente por un tiempo

de 6 meses para los tres casos. Se define que un cambio significativo en los parámetros de

estabilidad es la disminución del 5 % en la valoración del principio activo comparado a tiempo

cero. (Ministerio de Salud, 2003)

En Panamá en el 2009 por decreto ejecutivo No. 197 se establece que las condiciones

para realizar estudios de estabilidad de productos farmacéuticos son las condiciones

armonizadas para la zona climática IV -30 °C-. (Ministerio de Salud, 2009)

En países como Perú, Uruguay, España, Francia existen decretos y guías para productos

fitofarmacéuticos las cuales contemplan los estudios de estabilidad y mencionan que estos

estudios de estabilidad deben realizarse según la armonización de las zonas climáticas que

presenta la ICH.

En un estudio realizado en Cuba se efectuaron pruebas de estabilidad por 90 días a

temperaturas de 30°C y 40ºC, de tabletas de Tamarindus indica L. Obteniendo como resultado

una estabilidad química de las tabletas a estas temperaturas ya que el porcentaje de compuestos

3

fenólicos en los 3 meses de estudio disminuyó 1,17 % a 30 °C y 1,36 a 40 °C (Rodríguez,

Escalona, & Lafourcade, 2010).

El Reglamento y Control de Productos Naturales de uso Medicinal vigente en el

Ecuador por Acuerdo Ministerial 244 establecido en octubre del 2006, en el Anexo 7 determina

que, para obtener el registro sanitario de productos medicinales naturales es necesario realizar

las pruebas de estabilidad natural y acelerada según los criterios de la OMS, considerando que

el Ecuador se encuentra en una zona climática IV. (Ministerio de Salud Publica, 2006)

En la Universidad Técnica de Machala se determinó la vida media para un producto

acuoso elaborado con extracto de Moringa oleifera el cual da como resultado 5 días. El análisis

de estabilidad se lo realizó por 8 días a temperatura ambiente (Pulla, 2014).

En la Pontificia Universidad Católica del Ecuador se efectuó un estudio de estabilidad

de un producto liquido en base de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm, el cual duró 14 días a una

temperatura de 19ºC, temperatura ambiente para la ciudad de Quito (Jibaja, Dehesa, &

Miranda, 2012).

Los datos presentados anteriormente muestran que se toma en consideración una

temperatura definida para estudios de estabilidad de medicamentos sin justificar el porqué de

esta temperatura. Además, no se toma en cuenta las posibles interacciones de los compuestos

presentes en la matriz vegetal con los excipientes, ni cómo afectan estos al estudio.

Estos procedimientos realizados sin justificar la temperatura definida, pueden ocasionar que la

temperatura utilizada para los análisis de estabilidad esté por arriba o por debajo de la

temperatura en la que existen cambios térmicos en los fitofármacos lo que provocaría una

variación en el marcador fitoquímico analizado.

La Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) presenta una alternativa al análisis de

tiempo de vida útil, ya que proporciona una temperatura en la cual empiezan a haber cambios

térmicos. Esta temperatura permitiría realizar un estudio de estabilidad tradicional tomando en

cuenta los cambios térmicos que puede sufrir el fitofármaco. Además, el DSC permite realizar

un tratamiento no isotermal que reduce el tiempo de estudio, de meses o años, a días.

Formulación del problema

¿Permite el estudio térmico mediante calorimetría diferencial de barrido, a través de la

determinación de la temperatura inicial de degradación verificar la utilidad del método de

Arrhenius y, de los criterios de zona climática para definir el tiempo de vida útil de un

fitofármaco a base de Urera laciniata Goudot ex Wedd?

4

Preguntas directrices

¿Se puede desarrollar termogramas del extracto de Urera laciniata Goudot ex

Wedd?

¿Es posible desarrollar termogramas de comprimidos a base de Urera laciniata

Goudot ex Wedd?

¿Con qué método se puede cuantificar fenoles totales del extracto y

comprimidos?

¿Se puede medir capacidad antioxidante en las diferentes muestras?

¿Con que marcador fitoquímico se puede realizar un estudio de estabilidad de los

comprimidos?

¿Es posible aplicar la ecuación de Arrhenius para determinar el tiempo de vida

media y vida útil?

Objetivos

Objetivo General

Definir el comportamiento térmico de la especie Urera laciniata Goudot ex Wedd, y

evaluar la estabilidad de comprimidos mediante la cuantificación de compuestos

fenólicos totales.

Objetivos Específicos

Desarrollar los termogramas del extracto etanólico total y de los comprimidos

elaborados de la especie Urera laciniata Goudot ex Wedd, utilizando dos conjuntos de

condiciones de corrido en el Calorímetro Diferencial de Barrido.

Cuantificar fenoles totales en extracto etanólico total por el método de Folin-Denis.

Medir la capacidad antioxidante mediante el método de DPPH en extracto etanólico

total y en comprimidos sometidos a estudio de estabilidad.

Someter a estudio de estabilidad a los comprimidos utilizando como marcador

fitoquímico los fenoles totales presentes en la especie estudiada.

Aplicar la ecuación de Arrhenius para determinar el tiempo de vida media y vida útil.

Justificación e Importancia

Los estudios de estabilidad generan una gran importancia para la obtención de

información necesaria con la cual se puede sustentar el período de vida útil y por consiguiente

la fecha de expiración de los productos. Adicionalmente los estudios de estabilidad son

fundamentales para el desarrollo de nuevos productos y la vigilancia de la calidad de los

productos en la etapa de postmercadeo. (Ministerio de la Protección Social, 2010)

5

En otras palabras, los estudios de estabilidad permiten establecer el período en el cual

el medicamento se encuentra en condiciones óptimas para su consumo. Los factores que

pueden inducir un cambio en el producto, ya sea en el procesamiento o almacenamiento son:

hidrólisis, oxidación, racemización, isomerización geométrica, temperatura, humedad y luz.

Pudiendo estos ocasionar: una pérdida en la actividad terapéutica, un cambio de concentración

del componente activo, alteración de la biodisponibilidad, o formación de productos tóxicos.

(Kumar Sachan & Kumar, 2015)

Para productos farmacéuticos terminados -PFT- los estudios de estabilidad se deben

basar en el comportamiento y propiedades del ingrediente farmacéutico activo -IFA-, esta

información proviene de los estudios del IFA y de la experiencia en los estudios de

preformulación del PFT. Se deben incluir los ensayos de los atributos que son susceptibles a

cambiar durante el almacenamiento y que por lo tanto pueden influir en la calidad, seguridad,

y eficacia del PTF. Los ensayos deben cubrir tanto como sea apropiado, los atributos físicos,

químicos, biológicos y microbiológicos, contenido de conservantes y ensayos de

funcionalidad. (Ministerio de la Protección Social, 2010)

En la “Directriz sobre la calidad de los medicamentos a base de plantas” y en el artículo

de la revista de investigación química y farmacéutica: “Pruebas de estabilidad de productos

herbales” se establecen los criterios para realizar los estudios de estabilidad de fitofármacos los

cuales son armonizados con los criterios que la ICH establece para estudios de estabilidad de

productos farmacéuticos, esto da como resultado que las temperaturas a las que se realizan los

estudios de estabilidad de fitofármacos sean iguales a las de fármacos de síntesis. Se debe tener

en cuenta que los fitofármacos difieren de los fármacos de síntesis en que presentan una matriz

más compleja debido a la presencia de un sinnúmero de compuestos extraídos desde la matriz

vegetal. (European Medicines Agency, 2006)

Además, se sabe que existe una gran variedad de medicamentos elaborados a base de

plantas (Buitron, 1999), pero en toda la bibliografía revisada no se presenta evidencia de

medicamentos elaborados con extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd, y tampoco un

estudio de estabilidad de fitofármacos con presencia de dicho extracto. Pese a que se sabe que

esta planta también llamada ortiga, es conocida desde la antigüedad por habitantes de la región

amazónica del Ecuador y ha sido utilizada por los indígenas contra enfermedades reumáticas,

malaria, fiebre, dolores musculares (Luziatelli, Sørensen, Theilade, & Mølgaard, 2010). No

existe información en la bibliografía consultada sobre procesos de extracción o de estudio de

estabilidad de un fitofármaco con esta planta. Lo anteriormente expuesto conduce a la

6

necesidad de realizar la elaboración y estudio de un fitofármaco a base de Urera laciniata

Goudot ex Wedd.

Cuando en una sustancia ocurre un cambio de fase, de estructura, alotropía o existen

reacciones, hay un cambio termoquímico, y para todo cambio termoquímico existe un cambio

entálpico, puesto que el DSC mide aquel cambio, se puede usar como instrumento de medición

para determinar la temperatura en la cual se produzca un cambio termoquímico; principalmente

las de reacciones de degradación ya que este proceso químicamente hablando es un proceso

entálpico. (Metter Toledo, 2010)

Campanella y colaboradores realizaron un estudio utilizando Calorimetría Diferencial

de Barrido para determinar el tiempo de vida útil de Ácido acetilsalicílico (Campanella,

Micieli, Tomassetti, & Vecchio, 2011); aquello indica que es de importancia plantear una

metodología utilizando el DSC para fitofármacos, los cuales son matrices complejas y muy

diferentes a los medicamentos que provienen de principios activos puros y de síntesis.

La investigación es una alternativa para realizar estudios de estabilidad, considerando

una temperatura de degradación de principios activos presentes en un fitofármaco a base de

Urera laciniata Goudot es Wedd y poder determinar el tiempo de vida media y vida útil.

Además, esta investigación es de importancia en el campo de fitofármacos ya que

mediante la calorimetría diferencial de barrido se podrá verificar la utilidad del método de

Arrhenius y, de los criterios de zona climática para determinar el tiempo de vida media y útil

de un fitofármaco a base de Urera laciniata Goudot ex Wedd

7

CAPÍTULO II

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA

Antecedentes

Las plantas medicinales han sido muy utilizadas a lo largo de la historia por la

humanidad, volviéndose contribuyentes importantes en el desarrollo de las poblaciones, ya

sean como fuente de ingresos o para mejorar la salud. El 80 % de la población mundial utiliza

medicina a base de plantas, lo que ha provocado que la industria farmacéutica herbal vaya en

aumento. Se estima que la producción anual de fitofármacos es de 35 mil millones de dólares,

de esto se traduce que gran parte de la población consume estos productos, es por ello que la

calidad de la medicina herbal debe estar garantizada. (Buitron, 1999)

Tanto los productos farmacéuticos sintéticos y los fármacos a base de plantas

medicinales deben contar con estudios que permitan asegurar la calidad de estos, es por ello

que, en 1990 en Bruselas, tres regiones del mundo: Estados Unidos de América, Europa y Japón

crean como proyecto la “Conferencia Internacional sobre la Armonización de los requisitos

técnicos para el registro de productos farmacéuticos para uso humano”, ICH. Este organismo

establece directrices estandarizadas para realizar pruebas que aseguren la calidad, eficacia e

inocuidad de productos farmacéuticos, una de estas pruebas son los estudios de estabilidad.

(ONG Human Info, 2017).

En el caso de Ecuador, Marco Dehesa en el 2009 publica en el boletín Latinoamericano

y del Caribe de plantas medicinales y aromáticas, acerca de la legislación vigente sobre la

fabricación, uso y comercialización de plantas medicinales y fitofármacos; en el cual menciona

los acuerdos donde se establecen las normas y los procedimientos que se necesitan para el

registro sanitario y el control de los productos de uso medicinal, siendo uno de los principales

requisitos para la obtención del registro sanitario las pruebas de estabilidad. Además, hace

referencia a que en el Ecuador en la mayoría de casos no se cumplen con las normas técnicas

para la elaboración de estos productos con calidad, por lo que es necesario armonizar la

legislación a nivel internacional. (Dehesa, 2009)

Luisa Ponce en 1994 resalta que los estudios de estabilidad acelerada sirven para tener

información sobre el tiempo de vida útil tentativo, por esta razón son aceptados únicamente en

forma temporal, estos estudios se los desarrollan por un tiempo no inferior a tres meses y bajo

condiciones de almacenamiento que son intemperantes, las cuales deben ser elegidas con un

criterio muy claro para que los resultados sean confiables y así se puedan determinar los

8

parámetros cinéticos que permitan evaluar el tiempo de vida útil tentativo propuesto para el

producto. (Ponce, 1994)

Cabe indicar que la calorimetría diferencial de barrido se ha utilizado en el análisis de

estabilidad térmica de aceites (Jiménez, Beltrán, Aguilera, & M., 2007), en la obtención de

parámetros cinéticos para grado de curado de una pintura al horno y estabilidad de extractos

secos de plantas.

Luigi Campanella junto a sus colaboradores en el 2011 publicaron ¨Kinetic

investigation and predictive model for the isothermal degradation time in two commercial

acetylsalicylic acid-based pharmaceutical tablet formulations¨ en donde realizan un estudio

cinético isotermal en el cual miden la concentración de ASA en periodos de tiempo

establecidos (25, 50 y 75 días) a temperatura no fluctuante (70º C), para luego comparar con el

estudio cinético no isotermal obtenido mediante calorimetría diferencial de barrido y predecir

el tiempo de degradación de ácido acetilsalicílico (ASA) mediante un modelo matemático.

(Campanella, Micieli, Tomassetti, & Vecchio, 2011)

En el 2013, Alencar y colaboradores realizan un estudio calorimétrico mediante DSC

de extractos secos de Ximenia americana L. y Schinopsis brasiliensis Engl., en donde obtienen

temperaturas de degradación mayores a 100 °C. En el estudio los autores concluyen que el

DSC es una herramienta que se puede usar en productos de origen vegetal, obteniendo

resultados que brindan información sobre su estabilidad, composición, estandarización y otros.

Esta información puede usarse para establecer parámetros sobre el desarrollo de

fitomedicamentos, ayudando a asegurar su calidad y, por lo tanto, su seguridad y eficacia.

Es por estos antecedentes, que los estudios de estabilidad son muy importantes para la

calidad de productos fitofarmacéuticos, ya que estos determinan tiempos de vida útil para el

producto; pero cabe mencionar que no existe una metodología en la cual se use una temperatura

de degradación de compuestos activos para realizar dichos estudios de estabilidad.

Fundamento Teórico

Estabilidad de fármacos.

La estabilidad de un fármaco es su capacidad para mantenerse dentro de las

especificaciones físicas, químicas, microbiológicas, terapéuticas y toxicológicas, durante su

vida útil en un envase especifico. En otras palabras, se puede afirmar que la estabilidad es el

lapso de tiempo en el cual el medicamento conserva las mismas propiedades y características

con las que se fabricó. (Bhagyashree, y otros, 2015)

9

Para definir la estabilidad se realizan estudios, sean acelerados, intermedios y normales

que se diferencian únicamente por el tiempo y condiciones de temperatura, y permiten

establecer la vida útil del producto.

Definiciones.

Estudio de estabilidad.

Es el estudio en el cual se investigan qué efectos sobre el producto farmacéutico puede

haber si se varía la temperatura, el tiempo, la humedad, la intensidad de la luz.

En este estudio se evalúan los efectos de los factores ambientales sobre la calidad de la

sustancia, fármaco o un producto formulado. Los estudios de estabilidad se utilizan para la

predicción de la vida útil y para determinar las condiciones de almacenamiento, que se

especifican en la etiqueta. (Bhagyashree, y otros, 2015)

Métodos para pruebas de estabilidad.

Los métodos de estabilidad son procedimientos que se siguen en varias etapas del desarrollo

del producto. En etapas tempranas se utilizan ensayos de estabilidad acelerada lo que permitirá

encontrar productos de degradación en el almacenamiento a largo plazo. Dependiendo del

objetivo y los pasos seguidos, los procedimientos para las pruebas de estabilidad tienen cuatro

categorías: (Bajaj, Singla, & Sakhuja, 2012)

Prueba de estabilidad en tiempo real,

Prueba de estabilidad de muestra retenida,

Prueba de estrés en temperatura cíclica y

Pruebas de estabilidad acelerada.

Estabilidad acelerada.

Es un estudio en el cual se aumenta la velocidad de degradación química y la

modificación física de una sustancia, consecuentemente alterando las características de la

forma farmacéutica. El estudio se realiza usando condiciones forzadas de almacenamiento con

el propósito de monitorear las reacciones de degradación y poder establecer el plazo de validez

en las condiciones normales de almacenamiento. (Maldonado, 2013)

Zonas climáticas para pruebas de estabilidad.

Para el estudio de estabilidad el mundo ha sido divido en cuatro zonas climáticas (I, II,

III y IV), esta división se ha obtenido de datos de temperatura media anual y humedad relativa

en estas regiones. En la figura 1 se presenta un mapa donde se marcan las zonas climáticas

según la OMS y la Conferencia Internacional de Armonización.

10

Figura 1. Vista mundial de la determinación de la zona climática por país. Modificado:

(Garre, 2017)

Para las zonas climáticas delimitadas en la figura 1, se han definido las condiciones

para las pruebas de estabilidad definidas en la tabla 1

Tabla 1. Condiciones de las pruebas de estabilidad por zona climática

Ambiente Puntos en los

tiempos de muestreo

(meses)

Método y zona climática

25ºC/60% Humedad

Relativa

3, 6, 9, 12, 18, 24,36 Largo plazo para zonas I y IV

30ºC/35% Humedad

Relativa

3, 6, 9, 12, 18, 24,36 Largo plazo para zonas III

30ºC/65% Humedad

Relativa

3, 6, 9, 12, 18, 24,36 Largo plazo para zonas IV, o

condición intermedia para

zonas I y II

30ºC/75% Humedad

Relativa

3, 6, 9, 12, 18, 24,36 Largo plazo para zonas IV, o

condición intermedia para

zonas I y II

40ºC/75% Humedad

Relativa

3, 6 Condición acelerada para

todas las zonas

Fuente: (Bajaj, Singla, & Sakhuja, 2012)

11

Tipos de formas farmacéuticas

Una forma farmacéutica es la disposición individualizada a la que se adaptan las

sustancias medicinales -principios activos- y excipientes para constituir un medicamento. En

otras palabras, es el producto resultante del proceso tecnológico que confiere a los

medicamentos características adecuadas de: dosificación, eficacia terapéutica y estabilidad en

el tiempo (Asociación Española de Medicamentos Genéricos, 2012).

Las formas farmacéuticas se pueden clasificar según su estado físico en:

Sólidas: donde se encuentran polvos, granulados, grageas, cápsulas, comprimidos,

sellos, tabletas, suspensorios, óvulos e implantes.

Semi-sólidas: como pomadas, pastas, cremas y geles.

Líquidas: tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, lociones,

linimentos e inyectables.

Comprimidos.

Los comprimidos son preparaciones sólidas que se obtienen aglomerando por

compresión un volumen constante de partículas. Estas partículas están constituidas por uno o

más principios activos, los cuales pueden ir en asociación con excipientes tales como:

aglutinantes, diluyentes, disgregantes, lubricantes, colorantes y aromatizantes.

Los comprimidos se administran por vía oral y son generalmente cilindros compactos

con los extremos planos o convexos y con bordes que pueden estar biselados. A veces, pueden

llevar hendiduras para su división o algún tipo de símbolo o marca dependiendo de la casa

farmacéutica que los elabora. (Ministerio de Sanidad y Consumo, 2002)

Los comprimidos se los pueden clasificar como: no recubiertos, recubiertos,

efervescentes, solubles, dispersables, gastroresistentes y de liberación controlada.

Métodos para determinar la estabilidad

Método de Arrhenius para estudio de estabilidad.

Este método es muy utilizado para estudios de estabilidad y se basa en que: en una

reacción química solo las moléculas que se encuentran sobre su energía de activación son las

que intervienen en la reacción. Esta energía de activación puede variar de una reacción a otra

y también depende de la naturaleza del proceso. Con esto Arrhenius planteó la existencia de

una constante de velocidad -K- que únicamente depende de la temperatura en el cambio

químico, y esta es proporcional a la energía de activación de la reacción; dicha

proporcionalidad se encuentra expresada en una constante llamada factor de Arrhenius -A-. Y

tiene relación con el número de moléculas activadas que varía de acuerdo a la reacción, si una

12

molécula quiere reaccionar debe adquirir energía extra, esta es proporcionada por las colisiones

intermoleculares (Maldonado, 2013).

La expresión matemática de esta relación está reflejada en la ecuación 1 que muestra la

dependencia que tiene la constante cinética o de velocidad con la temperatura y la energía de

activación y el factor de Arrhenius.

K = A ∗ e− Ea RT

(Ecuación 1)

La ecuación 1 puede ser linealizada y utilizada como modelo de regresión lineal entre

las variables lnK y T-1, obteniéndose la ecuación 2. Con esta linealización se pueden obtener

los valores de los parámetros de Arrhenius A y Ea, el valor de la intersección con el eje -y-

corresponde a Ln(A) y la pendiente de la recta será igual al negativo de -Ea/R-

LnK = LnA −Ea

R∗

1

T

(Ecuación 2)

En donde:

K: constante de velocidad o constante cinética, es una constante de proporcionalidad

entre la velocidad de la reacción o proceso y la concentración de los reactivos.

A: Factor de Arrhenius o factor de frecuencia del choque de las moléculas.

Ea: Energía de activación -J/mol-, es la energía mínima que necesita un sistema para

poder iniciar un determinado proceso.

R = Constante universal de los gases -8,314J/mol*K-

T = Temperatura en grados absolutos

Un gráfico de Arrhenius muestra el logaritmo natural de las constantes cinéticas en el

eje de las ordenadas, con respecto al inverso de la temperatura en el eje de las abscisas como

lo muestra la figura 2.

Figura 2. Regresión Lineal de la ecuación de Arrhenius. Fuente: (Maldonado, 2013)

Para aplicar la ecuación de Arrhenius se deben conocer las constantes de velocidad a

las temperaturas que se realizará el estudio, para esto existen varias formas de obtenerlas. Para

13

esta investigación se utilizó una de ellas la cual es el método del tanteo, que consiste en ir

probando las diversas regresiones lineales que existen: concentración de la especie A -[A]-

frente a tiempo -t-, ln[A] vs t, [A]-1 vs t, [A]-2 vs t, raíz[A] vs t, 1/raíz[A] vs t y 1/[A]3/2 vs t;

según sea el orden de reacción 0, 1, 2, 3, ½, 3/2 o 5/2 respectivamente, donde [A] es la

concentración del reactivo A en un tiempo t determinado. Luego para definir el orden cinético

de la reacción se tiene que establecer cuál de las regresiones genera un coeficiente de

correlación cercano a 1. Este método presenta el inconveniente de que a menudo es difícil

decidir cuál de las regresiones se acerca más a la línea recta. (Levine, 2004)

Una vez obtenido el orden de reacción se puede obtener -K- mediante la regresión lineal

comparada con la ecuación cinética integrada del orden correspondiente, y distinguiendo que

componente de la regresión equivale a -K-, por ejemplo para una cinética de primer orden se

tiene la ecuación integrada ln[A]=ln[Ao]–a*K*t y la regresión lineal que se obtiene es ln[A] =

b - m*t; donde m es la pendiente y por lo tanto al compararla se obtiene que m = a*K en donde

a es el coeficiente estequiométrico de la especie A y -K- es la constante de velocidad.

En la tabla 2 se presentan las ecuaciones cinéticas integradas con su respectiva ecuación

de regresión lineal. Se puede observar que al comparar la ecuación cinética integrada con la

ecuación lineal correspondiente se puede obtener el valor de la constante de velocidad. Cabe

mencionar que las unidades de la constante de velocidad varían para cada orden cinético.

Tabla 2. Comparación de la ecuación cinética integrada con la regresión lineal

Orden

cinético

Ecuación cinética

integrada

Ecuación de

regresión

lineal

Valor de la

constante de

velocidad

Unidades de

K

0 [A] = [Ao]-a*K*t [A] = b-m*t m=a*K mol*L-1*s-1

1 ln[A] = ln[Ao]–a*K*t ln[A]=b-m*t m=a*K s-1

2 1/[A] = 1/[Ao]+a*K*t 1/[A]=b+m*t m=a*K L*mol-1*s-1

3 1/[A]2=1/[Ao]2+2*a*K*t 1/[A]2=b+m*t m=2*a*K L2*mol-2*s-1

½ [A]1/2=[Ao]1/2-1/2*a*K*t [A]1/2= b-m*t m=1/2*a*K mol1/2L-1/2*s-1

Elaborado por: Jhonnathan Villacis

El procedimiento para el método de Arrhenius consiste en someter la muestra de estudio

a diferentes condiciones de temperatura, por lo general tres temperaturas, para determinar

periódicamente la degradación del principio activo. Con los datos obtenidos se calcula la

14

constante de velocidad a cada temperatura, para luego graficar la ecuación de Arrhenius (figura

2), -LnK- en el eje de las ordenadas y -1/T- en el de las abscisas para los análisis

correspondientes. Obtenidos los parámetros de Arrhenius se puede calcular la constante de

velocidad a la temperatura que se desee determinar la vida media. Al igual que se puede deducir

el orden cinético de la reacción dependiendo de las unidades que esta posea y así aplicar la

ecuación cinética integrada del orden de reacción correspondiente para calcular la vida media.

(Cruz, 2009).

Calorimetría diferencial de barrido, DSC.

La primera ley de la termodinámica establece que los cambios químicos o físicos que

ocurren en la materia vienen acompañados con cambios de energía. Fourier a principios del

siglo XIX establece la ley de transferencia de calor, lo que permite entender que el flujo de

calor entre dos cuerpos es directamente proporcional a la diferencia de temperatura que existe

entre ambos y que este flujo puede ir en un solo sentido, desde el más caliente hacia el más

frio.

La calorimetría está basada en la medición de los cambios de calor que ocurren en un

proceso. Para reacciones químicas y para la mayoría de transiciones físicas, el calor absorbido

o desprendido se determina experimentalmente mediante un calorímetro. Este concepto es en

el que se basa la calorimetría diferencial de barrido, que es una técnica experimental que

permite determinar el calor ganado o liberado por una sustancia al ser mantenida a temperatura

constante en un tiempo determinado, o al ser calentada o enfriada en un intervalo de

temperatura. Mediante la calorimetría diferencial de barrido se pueden estudiar procesos

inducidos por el cambio de temperatura tales como: cambios de fase, desnaturalización de

proteínas, transformaciones alotrópicas, gelatinización de almidones, curado de resinas,

estudio de procesos de calentamiento y congelación de alimentos, estabilidad térmica de

medicamentos, etc. (Suriñach, Baro, Bordas, & Clavaguerra, 1992)

Estabilidad de productos naturales de uso medicinal.

Los estudios de estabilidad de productos medicinales herbales son un reto ya que en

estos casos se considera como materia activa a toda la planta o las partes de la planta con que

se ha elaborado el producto. como todo estudio de estabilidad el propósito de este definir las

condiciones en las que la calidad de los productos a base de hierbas varía con el tiempo, bajo

la influencia de factores ambientales.

En un análisis de estabilidad se debe definir un marcador el cual es un compuesto

químico conocido que puede tener o no actividad terapéutica, denominándose así marcadores

activos o analíticos respectivamente. El marcador es utilizado para determinar la cantidad del

15

ingrediente medicinal en los productos terminados, este marcador debe ser elegido

correctamente para su análisis, ya que debe existir una metodología para cuantificarlo.

Por otro lado, el tiempo de vida útil de productos farmacéuticos herbales se debe tomar

en consideración que la cantidad del componente que tiene actividad terapéutica no debe

disminuir más del 5% de la cantidad inicial presente en el fármaco. Se puede aceptar hasta una

disminución del 10%, ya que existen efectos de la matriz -efecto placebo-, falta de precisión y

selectividad por la combinación de productos y bajas concentraciones del analito. (Kumar

Sachan & Kumar, 2015)

En productos herbales se pueden obviar los análisis a condiciones aceleradas, ya que se

conoce que muchos de los productos naturales empiezan a degradarse a los 30ºC. pero es

necesario definir si el producto puede o no soportar temperaturas más elevadas ya que pueden

haber compuestos en el fitofármaco que no sufran daños a esas condiciones y por lo tanto sigan

teniendo sus propiedades terapéuticas. (Kumar Sachan & Kumar, 2015)

Producto natural de uso medicinal.

Un producto natural de uso medicinal es aquel que se utiliza con fines terapéuticos y

proviene de un recurso natural, tomándose como recurso natural las plantas. Un producto

natural para uso medicinal contiene ingredientes activos los cuales le asignan su función

terapéutica. Este producto puede presentarse como droga cruda, extracto o en una forma

farmacéutica reconocida. (Dehesa, 2009)

Categoría de productos naturales.

Según el Ministerio de Salud Pública (2006), existen en consideración tres categorías

de productos naturales procesados para uso medicinal:

Productos de categoría A.

Son aquellos que están respaldados por estudios farmacológicos y toxicológicos

experimentales preclínicos y clínicos.

Productos de categoría B

Son aquellos respaldados por estudios farmacológicos y toxicológicos experimentales

y preclínicos

Productos de categoría C

Son aquellos provenientes del recurso natural de uso medicinal, que no han sufrido

transformaciones químicas solo procesos físicos (lavado, secado o molienda), y que están

respaldados por referencias bibliográficas de su uso tradicional y de estudios de toxicidad y

16

autenticidad botánica, y que no presenten formas farmacéuticas definidas. (Ministerio de Salud

Publica, 2006)

Fitomedicamento o Fitofármaco.

“Cualquier medicamento que contenga exclusivamente como sustancias activas una o

varias sustancias herbarias o una o varias preparaciones a base de plantas, o una o varias

sustancias herbarias en combinación con una o varias de estas preparaciones a base de hierbas.”

(European Medicines Agency, 2006)

Además, según la Organización mundial de la Salud define a un fitofármaco como:

“producto medicinal que está elaborado con droga vegetal pura, preparados de extractos

estandarizados obtenidos del insumo natural vegetal de uso en salud con actividad y seguridad

farmacológica comprobada, cuya sustancia activa resulta de las partes de dicho recurso o de

asociaciones, combinaciones o mezclas de extractos naturales estandarizados.” (Cruz, 2009)

Al tener fines terapéuticos los fitofármacos deben cumplir con condiciones de

seguridad, calidad y eficacia.

Extracto.

“Producto que se obtiene del recurso natural de uso medicinal por la acción de un

disolvente de acuerdo a los métodos de extracción reconocidos” (Dehesa, 2009)

Según la Farmacopea de Estados Unidos SE DEFINEN los extractos como

preparaciones concentradas de drogas de origen vegetal o animal obtenidas mediante remoción

de los componentes activos de las drogas respectivas con solventes apropiados los cuales deben

ser evaporados para que cumplan las normas prescritas (Remington, 2003).

Material Vegetal

El material vegetal es la planta medicinal completa o cualquier órgano o exudado de la

misma, pulverizada o triturada, utilizada en la elaboración de fitofármacos. (Dehesa, 2009)

Plantas Medicinales.

Las plantas medicinales son los vegetales cuyos principios activos ejercen acción

farmacológica beneficiosa sobre un organismo vivo, su utilidad es la de disminuir o neutralizar

el desequilibrio orgánico que es la enfermedad, constituyen aproximadamente la séptima parte

de las especies existentes (Muñoz, 2002).

Marcador fitoquímico

Un marcador fitoquímico es una sustancia contenida en un vegetal que lo caracteriza

fitoquímicamente, y puede ser cualquier metabolito vegetal que se pueda cuantificar. (Kumar

Sachan & Kumar, 2015)

17

Metabolitos Vegetales.

Las plantas son matrices complejas en las cuales se tiene la presencia de un sinnúmero

de compuestos, producto de la síntesis o degradación de biomoléculas, estos se encuentran en

concentraciones casi constantes ya que las velocidades de síntesis y las de degradación están

en equilibrio. (Ringuelet & Viña, 2013)

Estos compuestos químicos celulares se los clasifica en primarios y secundarios, siendo

los primarios aquellos que son vitales para el desarrollo de la planta y los secundarios

representan compuestos de desecho del metabolismo, pero que pueden ser utilizados para

interactuar con el medio, cumpliendo así funciones ecológicas. (Ringuelet & Viña, 2013)

La gran variedad de metabolitos secundarios ha permitido utilizarlos en distintas áreas

industriales como en farmacéutica, alimentos, cosmética, perfumería, etc. Éstos son los

denominados productos naturales vegetales y son moléculas con variadas estructuras,

diferentes propiedades y distintos orígenes biosintéticos. (Ringuelet & Viña, 2013)

Entre los metabolitos secundarios presentes en las plantas se encuentran: terpenos,

alcaloides, carotenoides, aceites esenciales, saponinas, glicósidos cardiacos, entre otros.

(García & Pérez, 2009)

Compuestos fenólicos.

Son compuestos químicos que se encuentran ampliamente distribuidos en el reino

vegetal, son uno de los principales metabolitos secundarios de las plantas. En la planta actúan

como fitoalexinas es decir que los fenoles se secretan cuando la planta tiene una herida para

defenderse de posibles ataques fúngicos o bacterianos (Gimeno, 2004).

Existen varias formas de clasificar a los compuestos fenólicos, según su estructura

química se tienen dos grandes grupos:

No Flavonoides: Corresponden a fenoles simples y ácidos fenólicos que pueden ser

derivados del ácido benzoico o del ácido cinámico; y

Flavonoides, que están formados por un grupo fenilo unido al carbono en posición 2

de un anillo benzopirano, estos se pueden dividir en subgrupos como: antocianos; flavonas,

flavononas y flavanonoles; y flavanoles, taninos condensados y lignanos (Gimeno, 2004).

En la tabla 3 se presentan los principales compuestos fenólicos de acuerdo a su y la

clase de compuestos a la que pertenecen.

Los ácidos cinámicos, como el ácido caféico, raramente se encuentran libres. El ácido caféico

puede estar esterificados con el ácido quínico formando el ácido clorogénico. Además, los

compuestos fenólicos generalmente se encuentran como glicósidos (Porras & López, 2009).

18

Tabla 3. Compuestos fenólicos

Esqueleto básico Clase de compuesto fenólicos

C6 Fenoles simples, benzoquinonas

C6-C1 Ácidos fenólicos

C6-C2 Acetofenonas y ác. Fenilacéticos

C6-C3 Fenilpropanoides: ác. cinámicos y compuestos análogos, fenilpropenos,

cumarinas, isocumarinas y cromonas

C6-C4 Naftoquinonas

C6-C1-C6 Xantonas

C6-C2-C6 Estilbenos, antraquinonas

C6-C3-C6 Flavonoides, isoflavonoides

(C6-C3)2 Lignanos

(C6-C3-C6)2 Biflavonoides

(C6)n Melaninas vegetales

(C6-C3)n Ligninas

(C6-C1)n Taninos hidrolizables

(C6-C3-C6)n Taninos condensados

Fuente: (Debenedetti & Wilson)

Una de las propiedades más destacables de los compuestos fenólicos es su capacidad

antioxidante, ya que son muy susceptibles a ser oxidados e impiden que los metales catalicen

reacciones de oxidación ya que actúan como quelantes de estos, esta capacidad la tienen los

compuestos fenólicos no flavonoides. Otra de las propiedades que poseen los compuestos

fenólicos, en específico los taninos es la astringencia, ya que son capaces de unirse a las

proteínas lubricantes de la saliva y de otros tejidos del tracto digestivo por medio de puentes

de hidrógeno.

Otros de los beneficios de los compuestos fenólicos son: su capacidad estrogénica/

antiestrogénica, inhibición de la proliferación celular, inhibición del daño oxidativo del ADN,

activación de las enzimas de detoxificación de carcinógenos, entre otros (Gimeno, 2004).

Heterósidos fenólicos.

Los glicósidos o heterósidos constituyen uno de los grupos más grandes de principios

activos en el reino vegetal y están formados por la combinación de la parte reductora de un

glicón -una osa o azúcar- con una aglicona o genina que es una sustancia no glucídica,

19

formando así un enlace O-heterósido -éter-, y produciendo la eliminación de una molécula de

agua (Delporte, 2010).

Los heterósidos de compuestos fenólicos simples están constituidos por la unión de

ácidos fenólicos y un azúcar constituyendo un éster, esta unión se da a través del grupo

carboxilo del ácido con la parte reductora del azúcar como lo muestra la figura 3.

Figura 3. Heterósido de ácido gálico con glucosa. Fuente: (Delporte, 2010)

También son muy abundantes los heterósidos flavónicos que son los responsables de la

coloración amarilla además poseen variada acción farmacológica. En la figura 4 se presenta un

heterósido de quercetol con ramnosa.

Figura 4. Ramnoglucósido de quercetol. Fuente: (Delporte, 2010)

Fundamento Metodológico

Preparación de la muestra.

Selección de la materia prima.

La selección de materia prima es un procedimiento en el que se separan hojas, frutos,

raíces, o la parte de interés de las partes que por alguna razón ya sea física o biológica no estén

aptas para los tratamientos posteriores, o que puedan generar alteración en los análisis

(Sharapin, 2000).

20

Secado.

El proceso de secado consiste en la eliminación progresiva de la humedad contenida en

las muestras vegetales. Al eliminar el agua se impiden los procesos degradación enzimática, se

evitan las reacciones oxidativas e hidrolíticas, SE evita el desarrollo de microorganismos y

además se favorece el almacenamiento y molienda. (Narváez & Suárez, 2016) El secado se

puede hacer a temperatura ambiente o en estufas con aire circulante, la temperatura elegida

para procedimientos de extracción en muestras vegetales es de 40ºC hasta llegar a un porcentaje

de humedad relativa del 11%. (Suárez M. , 2015)

Molienda.

La molienda reduce el tamaño de partícula para que se incremente la superficie de

contacto con el solvente y así la extracción se facilite. Las partículas no deben ser demasiado

pequeñas ya que se forman conglomerados que impiden la circulación del solvente dificultando

así la extracción de los compuestos activos. (Narváez & Suárez, 2016)

Tamizaje.

Consiste en pasar la muestra molida por una serie de tamices, separando así las

partículas gruesas de las finas y así evitar la compactación de materia prima durante la

extracción. Para que la extracción sea idónea se utiliza partículas moderadamente gruesas o

semifinas. (Narváez & Suárez, 2016)

Extracción de Compuestos fenólicos.

La extracción de compuestos fenólicos significa separarlos de la matriz vegetal

mediante una técnica la cual permita lograr extraerlos e identificarlos. (Narváez & Suárez,

2016)

Percolación.

Consiste en la extracción de componentes solubles de un medio solido mediante el

contacto con un solvente líquido selectivo. Este método consiste, si bien en una maceración

previa a cabo de cierto tiempo se renueva el solvente manteniendo así un gradiente de

concentración alto y evitando la sobresaturación del solvente, esto reduce el tiempo de

extracción. La percolación es una técnica cuantitativa ya que extrae completamente los

principios activos. Se pueden realizar pruebas colocando reactivos precipitantes o formadores

de color -acomplejantes- para determinar si se ha extraído completamente los principios activos

que reaccionen con dichos acomplejantes. La elección del solvente se la hace en función de la

solubilidad de la sustancia a extraer. (Narváez & Suárez, 2016)

21

Identificación cualitativa de compuestos fenólicos.

Se fundamenta en la capacidad de los compuestos fenólicos para formar complejos

coloreados con metales, la mayor parte de los fenoles dan disoluciones vivamente coloreadas

(azul, violeta, verde, etc.) al reaccionar con FeCl3. Esta respuesta se produce por el ataque del

ion cloruro al hidrogeno del grupo hidroxilo provocando la ruptura del enlace y la unión del

grupo fenóxido al hierro (formación de complejos). (Arrieta, Hoyos, Fuentes, & Tovar, 2014)

La figura 5 muestra la reacción que ocurre entre el cloruro férrico y un fenol simple.

Figura 5. Reacción de identificación de compuestos fenólicos. Modificado: (Arrieta, Hoyos,

Fuentes, & Tovar, 2014)

Cuantificación de compuestos fenólicos.

Método de Folin-Denis.

Este método se utiliza para la cuantificación de compuestos fenólicos totales en

muestras vegetales, se basa en la reacción de éstos con el reactivo de Folin-Denis a pH básico

dando lugar una solución de coloración azul cuya absorbancia se puede determinar

espectrofotométricamente a 765 nm y relacionarla con una curva de calibración. El reactivo de

Folin-Denis es una mezcla de wolframato sódico y ácido fosomolíbdico en ácido fosfórico.

Como se muestra en la figura 6, el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo al ser

reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso. (García,

Fernández, & Fuentes, 2015) W6+, Mo6+)

22

Figura 6. Mecanismo de acción del reactivo de Folin-Denis. Fuente: (García, Fernández, &

Fuentes, 2015)

Al poder determinar el máximo de absorción del complejo formado a 765nm, se puede

cuantificar por espectrofotometría a base de una recta patrón de un estándar de compuesto

fenólico.

Estabilidad térmica por Calorimetría Diferencial de Barrido.

La calorimetría diferencial de barrido, o DSC, es una técnica experimental dinámica

que nos permite determinar la cantidad de calor que absorbe o libera una sustancia, cuando es

mantenida a temperatura constante, durante un tiempo determinado, o cuando es calentada o

enfriada a velocidad constante, en un determinado intervalo de temperaturas. En la técnica

experimental de Calorimetría Diferencial de Barrido se dispone de dos cápsulas. Una de ellas

contiene la muestra a analizar y la otra está generalmente vacía y es la llamada cápsula de

referencia. Se usan calefactores individuales para cada cápsula y un sistema de control

comprueba si se producen diferencias de temperatura entre la muestra y la referencia. Si se

detecta cualquier diferencia, los calefactores individuales se corregirán de tal manera que la

temperatura se mantendrá igual en ambas cápsulas. Es decir, cuando tiene lugar un proceso

exotérmico o endotérmico, el instrumento compensa la energía necesaria para mantener la

misma temperatura en ambas cápsulas. (Suriñach, Baro, Bordas, & Clavaguerra, 1992)

Los cambios de energía son detectados dando como señal una serie de picos que en

conjunto forman un termograma. En la figura 7 se observa un ejemplo de termograma obtenido

mediante DSC.

23

Figura 7. Ejemplo de termograma. Fuente: (Parada, Estupiñán, Peña, Vásquez, & Laverde,

2009)

Capacidad Antioxidante.

La capacidad antioxidante no se la puede medir directamente, pero es posible

determinarla por efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación controlada.

Existen varios métodos para determinar la capacidad antioxidante, los ensayos basados en la

transferencia de electrones (ET) y los ensayos basados en transferencia de átomos de hidrogeno

(HAT), los más utilizados son el método de inhibición del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo

(DPPH·) que es el más rápido, y el método de inhibición del radical ácido 2,2'-azino-bis (3-

etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS·+) que se puede aplicar a antioxidantes hidrofílicos y

lipofílicos. Estos dos métodos son ensayos basados en ET.

El método de inhibición del radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo), consiste en

medir la decoloración del radical en su máximo de absorbancia 517nm y compararlo con la

referencia que debe contener el radical y el medio en que se disolvió la muestra. Posteriormente

con los respectivos datos de absorbancia se cuantifica cuanto del DPPH ha reaccionado como

consecuencia del efecto antioxidante de la muestra. (De La Ossa, 2017)

La ecuación 3 se puede utilizar para la determinación del porcentaje de inhibición del

radical DPPH, en donde A es la absorbancia del blanco y A1 es la absorbancia de la muestra

(Gutiérrez, Ortiz, & Cisneros, 2008).

%Inhibición = %I =A − A1

AX100

(Ecuación 3)

Hipótesis

Hipótesis de trabajo Hi.

El estudio térmico mediante calorimetría diferencial de barrido permite, a través de la



fitofármaco a base de Urera laciniata Goudot ex Wedd.

24

Hipótesis Nula Ho.

El estudio térmico mediante calorimetría diferencial de barrido permite, a través de la



fitofármaco a base de Urera laciniata Goudot ex Wedd.

Sistema de variables

Factor1: Velocidad de calentamiento

Factor2: Cantidad de muestra

Variable respuesta: Variación de la temperatura de degradación

25

CAPÍTULO III

MARCO METODOLÓGICO

Diseño de la investigación (Enfoque, nivel y tipos)

El presente proyecto de investigación tiene un enfoque cuantitativo, puesto que en su

desarrollo se utilizaron métodos experimentales que siguen procedimientos establecidos,

utilizando instrumentos y equipos los cuales dieron datos numéricos que se analizaron a través

de la estadística para, dar solución, verificar o refutar la hipótesis planteada. (Tamayo, 1999)

El nivel de la investigación es evaluativo debido a que se evaluaron los resultados de

la experimentación en función de los objetivos y así poder tomar decisiones sobre sus posibles

aplicaciones en el futuro. (Tamayo, 1999)

La investigación es de tipo exploratoria porque busca examinar un tema que ha sido

poco estudiado con el fin de ampliar la información sobre el mismo, y así tener un panorama

más claro en futuras investigaciones. De igual forma se puede definir a la investigación como

de carácter experimental por la manipulación de las variables independientes con lo cual se

podrá determinar el efecto que se produce en la variable respuesta. (Tamayo, 1999)

Población y muestra

Muestra.

La muestra utilizada para esta investigación son las hojas de la especie Urera laciniata

Goudot ex Wedd, en el anexo 1 se presenta la monografía de la especie.

Métodos y materiales

Equipos y materiales.

Los equipos y materiales necesarios para realizar la investigación se presentan en la

tabla 4.

26

Tabla 4. Equipos y materiales

Equipo Marca Modelo

Equipo de extracción Soxhlet - -

Equipo de percolación - -

Rotavapor Selecta RS 3000-V

Espectrofotómetro UV-vis Varian Cary 50 Bio

Balanza analítica Denver PI 214

Balanza de precisión Ohaus PA 1502

Microbalanza analítica Metter-Toledo

Calorímetro diferencial de barrido TA Instruments Q 2000

HPTLC CAMAG

Molino mecánico Victoria

Estufa de convección forzada Binder BF 53

Estufa Binder ED-240-Dl

Tamizadora Gilson SS-15

Agitador magnético

Tamices

Corning

Humboldt

PC-420 D

-

Materiales Marca Modelo

Cápsulas herméticas de aluminio TA Instruments -

Material de vidrio - -

Placas cromatográficas Macherey-Nagel

HPTLC-Fertigplatten nano-Sil

C18-50/UV254 y nano-adamant

UV254

Micropipetas Glassco -


Reactivos y estándares.

Los reactivos que serán utilizados en la investigación se presentan en la tabla 5

27

Tabla 5. Reactivos

Reactivos Marca Grado Lote

Metanol - QP -

n-hexano≥ 96% EMSURE® Merck Analítico K45866274

Dimetilsulfóxido EMSURE® Merck Analítico K45797152

Ácido fosfórico 85% EMSURE® Merck Analítico K45618673

Tungstato dihidratado

de sodio

EMSURE® Merck Analítico K45199473

Etanol 96% - QP -

Ácido fosfomolíbdico EMSURE® Merck Analítico -

Cloruro férrico Fisher Analítico 722801

Permanganato de

potasio

Chimix Analítico 081119


Los estándares se presentan en la tabla 6.

Tabla 6. Estándares

Estándar Marca Grado CAS

Ácido caféico Sigma-Aldrich HPLC SLBN1752V

Ácido gálico Fisher Scientific Secundario

Ácido tánico J.T.Baker, Analítico 1401-55-44

Ácido rosmarínico Sigma-Aldrich Analítico 20283-92-5

Ácido ferúlico Sigma-Aldrich Analítico 537-98-4

Ácido ascórbico Sigma-Aldrich Analítico 50-81-7

2,2-difenil-1-picril-hidrazilo Sigma-Aldrich Analítico STBF5975V


Diseño experimental

En la determinación de la variación de la temperatura de degradación se analizó la

influencia de la velocidad de calentamiento y la cantidad de muestra sobre la variación de la

posición del pico de temperatura a la que empieza a degradarse el extracto etanólico y el

extracto etanólico como parte de los comprimidos utilizados como forma farmacéutica de

estudio. Mediante un diseño factorial completo 22 se obtuvo información sobre la influencia de

28

los dos factores analizados y su interacción. Se realizó una réplica del diseño completo, que a

diferencia de los modelos estadísticos clásicos varia todos los factores de forma simultánea y

ordenada, permitiendo obtener información acerca del efecto que tienen los factores y sus

interacciones sobre la variable respuesta (Sabino, 2014).

Los factores de estudio y dominio experimental que se presentan en la tabla 7 han sido

seleccionados en base a pruebas preliminares realizadas experimentalmente y a bibliografía

consultada, como por ejemplo en un artículo publicado por Metter Toledo (2010) en la revista

Thermal Analysis Application, menciona que la temperatura obtenida en el DSC se ve afectada

por la velocidad de calentamiento y la cantidad de muestra que se coloque en las cápsulas para

el análisis.

Tabla 7. Factores y dominio experimental

Factores Dominio

- +

X1 Velocidad de

calentamiento (VC) (ºC/min)

10 20

X2 Cantidad de muestra (CM)

(mg)

0,5 1,5


La matriz de experimentos del diseño (tabla 8), se obtiende al combinar los niveles de

los factores de estudio, en este caso seria dos niveles para los dos factores, mediante el criterio

de los signos. A la combinación de los niveles de los factores se le denomina tratamiento.

Tabla 8. Diseño factorial completo 22

Matriz de experimentos

Tratamiento X1 X2

1 10 ºC/min 0,5 mg

2 20 ºC/min 0,5 mg

3 10 ºC/min 1,5 mg

4 20 ºC/min 1,5 mg


En el cálculo de la magnitud y signo de los factores se utilizó el algoritmo de Yates y

la estimación de la significacia mediante la réplica del diseño completo a un nivel de confianza

del 95%.

29

El orden de las corridas experimentales fue aleatorizado para disminuir y homogenizar

el ruido experimental, tanto para la corrida original y la réplica. Para la aleatorización se usó el

programa estadístico JMP Statistical Discovery®.

A partir de la figura 8 se pueden calcular los magnitudes y signos de los efectos de cada

factor y de la interacción entre ellos mediante la tabla 9.

Con dichos efectos se puede llegar a determinar la significancia estadística mediante la

comparación con el error estándar de los mismos.

Figura 8 Representación gráfica con las variables del diseño.

Tabla 9. Algoritmo de Yates: cálculo de los efectos de los factores y de su interacción.

Cálculo de los efectos por el algoritmo de Yates.

Tratamiento Factores Respuesta Columna Efecto Efecto del

A B o media 1 Total Factor (E)

1 (1) - - y1 y1+y2 y4+y2+y3+y1 Promedio =(+y1+y2+y3+y4)/4

2 (a) + - y2 y3+y4 y4-y3+y2-y1 Factor A =(-y1+y2-y3+y4)/2

3 (b) - + y3 y2-y1 y3+y4-y1-y2 Factor B =(-y1-y2+y3+y4)/2

4 (ab) + + y4 y4-y3 y4-y3-y2+y1 Interacción

AB

=(+y1-y2-y3+y4)/2

Modificado: (Brito, 2017)

Matriz de Operacionalización de variables.

Tabla 10. Matriz de Operacionalización de variables

Variable Dimesión Indicador

Independiente Cantidad de muestra Mg

Velocidad de calentamiento ºC/ min

Dependiente Variacion de temperatura de

degradación

ºC


30

Técnica de procesamiento de datos

El análisis estadístico se realizó en base a los datos obtenidos en el diseño experimental

de la tabla 8.

Significancia estadística de los efectos.

Un efecto es significativo cuando su variabilidad es mayor a la variabilidad producida

por el error aleatorio, es decir por aquellas variables no controladas que afectaron al proceso,

dicha comparación se realiza a un nivel de confianza que para el caso de la investigación es al

95%.

Dicho error aleatorio se calcula mediante la media de las varianzas de cada tratamiento,

la cual corresponde a la varianza de las respuestas (SR2), por lo que:

“La variabilidad de los efectos viene dentro de la variabilidad de la respuesta, junto con

la variabilidad producida por el ruido experimental, si la variabilidad del ruido es la misma en

todas las corridas experimentales, se puede concluir que la variabilidad de todos los efectos

también es la misma.” (Box, Hunter, & Hunter, 2005)

Tomando en cuenta esta condición, la varianza de los efectos (s𝐸2) puede calcularse a

partir de la ecuación 4.

(SE)2 = (1

4+

1

4) SR

2

(Ecuación 4)

A partir de la varianza se puede determinar el error estándar de los efectos con el

cálculo de su raíz cuadrada (SE), según (Box, Hunter, & Hunter, 2005) la relación entre el

efecto y el error estándar del efecto (E/SE), se comporta según una distribución t de student, es

decir que dicha relación esta próxima a un valor t a dicho intervalo de confianza y grados de

libertad totales. Esto significa que si el valor absoluto del efecto es mayor al producto entre

estadístico t y el error estándar del efecto ( |𝐸| > k s𝐸), sí existe una significancia estadística

generada por dicho factor o interacción que genera el efecto.

Procedimientos

Acondicionamiento de la materia vegetal.

Para el acondicionamiento de la materia vegetal se procedió de acuerdo a los

procedimientos que utilizan Narváez y Suárez (2016), los cuales se detalla a continuación.

Se realizó una limpieza manual del material vegetal y se seleccionaron las hojas que no

presentaron daño físico o presencia de hongos. Las hojas seleccionadas se lavaron con agua

potable y se desinfectaron por inmersión en solución de KMnO4 al 0,0001% durante cinco

minutos, se enjuagaron con abundante agua potable.

31

La materia prima lavada y desinfectada se sometió a un proceso de secado en estufa de

convección forzada (Binder, BF 53) a 40ºC±1ºC durante 48 horas para tener una humedad

relativa por debajo del 10%.

Utilizando un molino mecánico (Victoria) se redujo el tamaño de las hojas, para luego

homogeneizar el tamaño de partícula en una tamizadora (Gilson, SS-15), posteriormente se

recogieron las fracciones retenidas en el tamiz (Humboldt) N.30 y el tamiz ciego.

La materia prima homogénea se envasó en frascos de vidrio hermético, forrados con

papel aluminio para evitar el efecto de la luz y se almacenaron en un desecador.

Obtención de extractos.

El material vegetal se desengrasó por medio de extracción Söxhlet con hexano grado

analítico marca EMSURE® Merck por 3 horas 15 minutos. Posteriormente los capuchones se

secaron en una estufa con aire circulante a 40° C por 24 horas.

Separada la fase apolar se maceró el contenido de los capuchones durante 24 horas con

etanol 96%, luego de aquel tiempo, mediante percolación se extrajeron los compuestos

fenólicos hasta que la reacción con cloruro férrico al 5% no genere precipitado de color negro

–reacción negativa-. La percolación se llevó a cabo en ausencia de luz a una velocidad de flujo

de extracción de 20 gotas/min por un tiempo de 5 días. Los extractos fluidos se almacenaron

en frascos ámbar y se conservaron en un lugar seco y protegido de luz. Los extractos fluidos

se concentraron en un rotavapor marca Selecta y los residuos se secaron en cajas Petri de cristal

hasta peso constante en estufa con aire circulante a 40º C.

Análisis cualitativo de los extractos

Marcha fitoquímica

El extracto etanólico total del material fresco, se obtuvo mediante maceración por 48

horas, se filtró. Luego se analizaron cualitativamente los metabolitos secundarios según (Lock,

1988) y (Domínguez, 1985) mediante operaciones que se exponen en la tabla 11.

32

Tabla 11. Metodologías para la marcha fitoquímica

Metabolitos

secundarios

Prueba realizada Metodología

Flavonoides Shinoda En un tubo de ensayo Se colocaron 2 mL del

extracto, se añadieron unas gotas de HCl

concentrado y trocitos de magnesio. Se

observó la coloración formada.

H2SO4© A un tubo que contenía 2 mL extracto se

añadieron 3 gotas de H2SO4© y se observó la

coloración que forma.

HCl 2N En un vaso de precipitación se hirvieron hojas

de la planta con HCl 2N por 5 minutos, y se

observó la coloración formada.

NaOH diluido En un tubo de ensayo se añadieron 2 mL de

extracto y 2 mL de NaOH diluido, se agitó la

mezcla y se observó la coloración formada.

Zn/HCl Se repitió el mismo procedimiento que en

Shinoda pero se utilizó Zn en vez de Mg.

SbCl3/CHCl3 En un tubo de ensayo que contiene 2 mL de

extracto se añadieron 5 gotas de SbCl3

disuelto en cloroformo, se agitó y se observó

la mezcla.

Compuestos

fenólicos

FeCl3 5% A un tubo de ensayo que contenía 2 mL de

extracto se añadieron gotas de FeCl3 al 5%

hasta formar un precipitado negro.

Saponinas Espuma En un tubo de ensayo se colocaron pedazos de

hoja, y se llenó con agua hasta que cubra a las

hojas. Se calentó el tubo a baño María hasta

que hirvió. Se dejó enfriar el tubo y se agitó

hasta formar espuma. Se midió el tiempo que

duró la espuma formada.

33

Tabla 11. Continuación.

Carotenoides Carr-Price En una placa de porcelana para reacción se

colocaron 3 gotas del extracto y 2 gotas del

reactivo de Carr-Price -SbCl3/CHCl3-, se

esperó por un minuto y se observó.

Taninos Precipitación de

proteína

Se realizó una solución etanólica de zeína, se

añadieron 1 mL de extracto a 3 mL de la

solución de zeína y se observó si hay

formación de precipitado.

Esteroles/terpenoides Liebermann Se mezclaron 2 mL del extracto el reactivo de

Liebermann que se obtiene al mezclar 1 mL

de anhídrido acético y 1 mL de cloroformo y

se añade unas gotas de H2SO4©, se observó la

cloración formada.

Alcaloides Dragendorff En un tubo de ensayo se mezclaron 3 mL de

extracto con 1 mL del reactivo de

Dragendorff, se agitó y se observó si hay

presencia de precipitado.

La manera de preparar el reactivo de

Dragendorff se presenta en el anexo 2

Elaborado por: Jhonnathan Villacis, Fuente: (Lock, 1988) (Domínguez, 1985)

Perfil cromatográfico.

EL perfil cromatográfico del extracto total se desarrolló tomando como referencia las

mejores condiciones descritas por Venegas y Suárez (2016). Para lo cual se programó el

software del equipo HPTLC (CAMAG, Linomat 5) según la taba 12, en donde se presenta las

condiciones del desarrollo cromatográfico para el extracto, el cual se lo disolvió en metanol

grado HPTLC. Con el módulo de aplicación (CAMAG, Linomat 5) se inyectaron los

volúmenes de extracto presentados en la tabla 12. La placa se desarrolló en el módulo

automatizado (CAMAG, ADC 2) configurando los parámetros de humedad, tiempo, secado y

desarrollo en el software Wincats, estos parámetros se muestran en la tabla 12. La

fotodocumentación de las placas cromatográficas se la realizó en el módulo (CAMAG, TLC

Visualizer).

34

Tabla 12. Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC para el

extracto.

Parámetros Condiciones de desarrollo

Inyección Placa Macherey-Nagel de silicagel,

HPTLC-Fertigplatten nano-

adamant UV254

Área de la placa 10 x 10

Volumen de la jeringa 100 uL

Volumen de inyección

del extracto

1,0-1,5-2,0-2,5-3,0-4,0 uL

Velocidad de inyección 140 nL/s

Control de humedad Tiempo 3 minutos

Solución Cloruro de magnesio

Pre acondicionamiento de

la placa

Tiempo 20 minutos

Saturación Volumen fase móvil 25 mL

Solvente Tolueno:Hexano:Metanol

(18:18:4)

Tiempo 20 minutos

Desarrollo Distancia de migración 70 mm

Ancho de banda 6 mm

Volumen fase móvil 10 mL

Fase móvil Tolueno:Hexano:Metanol

(18:18:4)

Foto-documentación Longitudes de onda 254 nm, 366nm, y luz blanca

Revelado Agente revelador Cloruro férrico al 5%

Fuente: (Narváez & Suárez, 2016)- Modificado por: Jhonnathan Villacis

Se compararon los compuestos separados con soluciones patrón de 100 ppm DE

estándares de ácido caféico (Sigma-Aldrich, CAS: 331-39-5), ácido gálico (Fisher Scientific,

estándar secundario), ácido tánico (J.T.Baker, CAS:1401-55-44), ácido rosmarínico (Sigma-

Aldrich, CAS: 20283-92-5), y ácido ferúlico (Sigma-Aldrich, CAS: 537-98-4) disueltos en

metanol grado HPTLC para compararlos con el extracto, para lo cual se utilizaron los mismos

35

módulos del equipo de HPTLC pero con las condiciones de corrido cromatográfico presentadas

en la tabla 13.

Tabla 13. Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC para la

comparación del extracto con los estándares.

Parámetros Condiciones de desarrollo

Inyección Placa Placa Macherey-Nagel de

silicagel, HPTLC-

Fertigplatten nano-Sil C18-

100/UV254

Área de la placa 10 x 10

Volumen de la jeringa 100 uL

Volumen de inyección del

extracto

2 uL

Volumen de inyección de

estándares

4 uL

Velocidad de inyección 140 nL/s

Control de humedad Tiempo 3 minutos

Solución Cloruro de magnesio

Pre acondicionamiento de

la placa

Tiempo 20 minutos

Saturación Volumen fase móvil 25 mL

Solvente Metanol:THF:Hexano

(17,5:17,5:5)

Tiempo 20 minutos

Desarrollo Distancia de migración 70 mm

Ancho de banda 6 mm

Volumen fase móvil 10 mL

Fase móvil Metanol:THF:Hexano

(17,5:17,5:5)

Foto-documentación Longitudes de onda 254 nm, 366nm, y luz

blanca

Revelado Agente revelador Cloruro férrico al 5%

Fuente: (Narváez & Suárez, 2016)- Modificado por: Jhonnathan Villacis

36

Análisis cuantitativo.

Compuestos fenólicos.

La cuantificación de compuestos fenólicos totales se la realizó por el método de Folin-

Denis.

Elaboración de la curva media de calibración.

Se preparó una solución madre de ácido caféico de 100 ppm a partir de la cual se prepararon

estándares de acuerdo a la tabla 14.

Los tubos de ensayo se dejaron reposar por 8 minutos en oscuridad y se añadió solución

saturada de carbonato de sodio y agua. Se agitaron los tubos de ensayo para homogenizar la

solución obtenida y se mantuvieron en oscuridad por 2 horas. Posteriormente se midieron las

absorbancias de los estándares en el espectrofotómetro (Varian, BIO Cary 50) a 765 nm. Se

realizaron 6 curvas de calibración para obtener una media.

Tabla 14. Curva de calibración de compuestos fenólicos.

Estándar

Volumen ácido

caféico(100ppm)

uL

Volumen

reactivo

Folin-

Denis

mL

Volumen

H2O

mL

Volumen

Na2CO3

Ml

Volumen

H2O

mL

Concentración

teórica

Ppm

0 - 0,250 3,050 0,750 0,950 0

1 25 0,250 3,025 0,750 0,950 0,5

2 50 0,250 3,000 0,750 0,950 1,0

3 75 0,250 2,975 0,750 0,950 1,5

4 100 0,250 2,950 0,750 0,950 2,0

5 125 0,250 2,925 0,750 0,950 2,5

6 150 0,250 2,900 0,750 0,950 3,0

7 175 0,250 2,875 0,750 0,950 3,5

8 200 0,250 2,850 0,750 0,950 4,0

9 225 0,250 2,825 0,750 0,950 4,5

10 250 0,250 2,800 0,750 0,950 5,0

11 275 0,250 2,775 0,750 0,950 5,5

12 300 0,250 2,750 0,750 0,950 6,0


37

Cuantificación de fenoles totales como ácido caféico en extracto etanólico de Urera

laciniata Goudot ex Wedd.

En una balanza analítica se pesó 10 mg de extracto en 8 tubos de ensayo, se disolvieron

con 100uL de Dimetilsulfóxido (DMSO) EMSURE® Merck grado analítico, y se dejó en

reposo por 24 horas. En las soluciones obtenidas se añadieron 1,4 mL de etanol al 96%. En 8

tubos de ensayo diferentes se transfirieron 25 uL de las soluciones anteriores, a partir de estas

se siguió el procedimiento anterior para la cuantificación de compuestos fenólicos, agregando

los reactivos adecuadamente y llevando todo a un volumen final de 5 mL. Transcurridas las 2

horas se midieron las absorbancias de la solución de cada tubo de ensayo en el

espectrofotómetro UV-Vis.

Determinación de la capacidad antioxidante del extracto etanólico de Urera laciniata

Goudot ex Wedd.

En la determinación se comparó la capacidad antioxidante de soluciones estándar de

ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, CAS: 50-81-7) con mismas cantidades de solución de extracto

cuya preparación se explica más adelante. Dicha comparación se realizó mediante la

decoloración del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Para esto se preparó una solución

etanólica de DPPH (Sigma-Aldrich, CAS:1898-66-4) a una concentración de 20 ppm y una

solución madre de ácido ascórbico de 30ppm. En 8 tubos de ensayo se pesaron

aproximadamente 5 mg del extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd, se añadieron 100 uL

de DMSO para disolver el extracto seco. Los tubos de ensayo se aforaron con un volumen de

etanol 96% suficiente para obtener una solución de 2500 ppm -en relación peso de extracto y

volumen de solución-. Una vez disuelto el extracto se tomó 0,1 mL de los primeros 4 tubos y

se mezclaron obteniendo un volumen de 0,4 mL, este se llevó a 2mL con etanol 96%; dicho

procedimiento se realizó de igual manera con los 4 tubos restantes.

A las dos soluciones de extracto y a la solución estándar de ácido ascórbico se les agregó

DPPH y etanol en volúmenes mostrados en la tabla 15.

38

Tabla 15. Curvas para capacidad antioxidante

Tubo Volumen de

estándar y

extractos (uL)

Volumen DPPH

(mL)

Volumen Etanol

(uL)

1 0 2,9 1100

2 10 2,9 1090

3 15 2,9 1085

4 25 2,9 1075

5 75 2,9 1025

6 80 2,9 1020

7 85 2,9 1015

8 100 2,9 1000

9 110 2,9 990

10 120 2,9 980

11 125 2,9 975

12 130 2,9 970

13 145 2,9 955

14 165 2,9 935

15 170 2,9 930

16 195 2,9 905

17 200 2,9 900


Mientras la reacción se daba, se mantuvo por 30 minutos en completa oscuridad, y luego

se leyó la absorbancia en el espectrofotómetro UV-Vis a una longitud de 517,0 nm.

Con los datos experimentales se obtuvieron curvas de Absorbancia vs Concentración, y curvas

de %Inhibición vs Concentración que muestran cuanto del radical DPPH se consume cuando

esta frente a una molécula antioxidante; en donde se estableció una relación entre el estándar

de ácido ascórbico y el extracto. El parámetro que se utilizo fue el de comparación de

pendientes de las curvas, ya que al ser obtenidas bajo una misma metodología es posible

relacionarlas, a este procedimiento se lo conoce como comparación directa o nula (Skoog,

2015).

39

Análisis Térmico.

Antes de usar el calorímetro diferencial de barrido (TA Instruments, Q 2000) se verificó

que haya sido calibrado por los encargados del equipo. Para la calibración se pesa 7mg de

estándar de indio en una capsula de aluminio, y una cápsula vacía para usarla de referencia,

calentar la cápsula de 90 a 300ºC a una velocidad de 10ºC/min empleando atmósfera de

nitrógeno a un flujo de 25ml/min.

Se verificó la reproducibilidad de los picos de temperatura en los termogramas del

extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd en el calorímetro, pesando primero la cápsula de

aluminio vacía y la tapa marca TA Instruments, se taró y se pesó aproximadamente 1 mg de

extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd dentro de la cápsula, se colocó la tapa en la

cápsula y con una prensa de marca Tzero press se selló la cápsula. La cápsula de referencia y

la cápsula con la muestra se ubicaron en el horno del calorímetro y se procedió a calentar a una

velocidad de 10 °C/min, desde 80 a 260 °C. Se realizaron 4 réplicas de este procedimiento.

Realizada la verificación de la reproducibilidad de los picos, se sometió el extracto al

estudio térmico en el calorímetro según el diseño experimental y la aleatorización que resultó

del programa estadístico JMP Statistical Discovery® como lo muestra la tabla 16.

Tabla 16. Aleatorización del experimento y su réplica, y datos para calorimetría (Extracto)

Tratamiento Factor A Factor B Velocidad de

calentamiento

Peso de la

muestra

1 - - 10 0,503

2 + + 20 1,514

3 - + 10 0,503

4 + - 20 1,515

Réplica 1 + + 20 1,516

Réplica 2 - + 10 1,516

Réplica 3 - - 10 0,502

Réplica 4 + - 20 0,503


Se procedió de la misma manera que en la verificación de reproducibilidad de picos. Se

pesaron las cápsulas vacías junto con las tapas de las cápsulas, se tararon y pesaron los valores

correspondientes de extracto para cada tratamiento, se taparon y se sellaron con la ayuda de la

prensa. Se colocaron la cápsula de referencia y la capsula de cada tratamiento en el horno del

40

calorímetro, y se programó el calorímetro según el tratamiento que se estuviese analizando,

obteniéndose los termogramas correspondientes de cada tratamiento.

Elaboración de comprimidos.

Los comprimidos se obtuvieron mediante granulación por vía húmeda según la

metodología descrita por Suárez y Mora (2016); en el Laboratorio farmacéutico FARCOL.

El peso promedio de los comprimidos fue de 443,00 ± 3,18, hay que mencionar además

las características organolépticas que los comprimidos presentan y estas son: coloración verde

con manchas claras, sabor característico, olor característico y aspecto característico.

En la tabla 17 se presentan los excipientes usados para la formulación del comprimido

y la cantidad de excipientes que presenta cada comprimido.

Tabla 17. Fórmula unitaria par comprimidos de 450 mg.

Sustancia Cantidad/tableta

Extracto seco 53,29mg

Lactosa monohidratada 384,87mg

Almidón 5,92mg

Aerosil 2,96mg

Estearato de magnesio 2,96mg


Análisis térmico de los comprimidos

Se molió un comprimido en un mortero de ágata y en cuatro capsulas de aluminio se

pesó aproximadamente 1mg de polvo para realizar la verificación de reproducibilidad de picos

de los termogramas para los comprimidos, a una velocidad de calentamiento de 10°C/min. Se

realizó el estudio calorimétrico de los excipientes mostrados en la tabla 17 a las condiciones de

10 °C/min para la velocidad de calentamiento y 1 mg de muestra.

Una vez obtenida la reproducibilidad de los picos de temperatura en los termogramas

del comprimido, se realizó el estudio térmico aplicando el diseño experimental para lo cual se

pesó en las capsulas de aluminio el polvo obtenido de la molienda, según la tabla 18.

41

Tabla 18. Aleatorización del experimento y su réplica, y datos para calorimetría (pastillas)

Tratamiento Factor A Factor B Velocidad de

calentamiento

Peso de la

muestra

1 - - 10 0,505

2 + + 20 1,508

3 - + 10 0,505

4 + - 20 1,504

Réplica 1 + + 20 1,504

Réplica 2 - + 10 1,508

Réplica 3 - - 10 0,502

Réplica 4 + - 20 0,501


Estabilidad.

Condiciones del estudio de estabilidad.

Adquiridas las tabletas se las sometió a un estudio de estabilidad por 54 días a 3

temperaturas distintas: 30°C en una estufa Binder modelo ED-240-Dl, 40°C en una estufa de

convección forzada (Binder, BF 53) y temperatura ambiente (el laboratorio tiene una

temperatura promedio de 18,5°C). Para cada temperatura se utilizaron 3 tipos de frascos en

donde se almacenaron 30 comprimidos en cada frasco. Los frascos fueron de tereftalato de

polietileno -PET-, de color: ámbar, transparente y blanco, con una capacidad de 150 mL.

Cuantificación de compuestos fenólicos en los comprimidos.

La cuantificación de compuestos fenólicos se la realizó a: 0, 5, 10, 12, 14, 17, 20, 24,

27, 31, 46 y 54 días. Para cada día se molió una pastilla de cada tratamiento en mortero de

ágata para reducir el tamaño de partícula, del polvo resultante de cada pastilla se pesaron 100mg

en tubo de ensayo diferente y se agregaron 5mL de etanol al 96%. Los tubos con el polvo y el

etanol se sonicaron en el ultrasonido (KENDAL, HB-S-49DHT) por 30 minutos agitando de

vez en cuando para una mejor extracción. Transcurrido este tiempo se dejaron reposar hasta

que decanten los excipientes, se filtró y se aforó a 10mL. Los extractos obtenidos se filtraron

por un filtro de membrana marca Whatman, en vasos de precipitación, para evitar que existan

trazas de los excipientes en suspensión. De los filtrados obtenidos se trasvasaron 0,100 mL a

otros tubos de ensayo. A cada tubo de ensayo se añadieron 0,250 mL del reactivo de Folin-

Denis y 2,950 mL de agua, se dejó reposar 8 minutos en oscuridad y se añadieron 0,750 mL de

solución saturada de carbonato de sodio y 0,950 mL de agua. Transcurrido el tiempo de

42

reacción para Folin-Denis (2horas) se leyó la solución de cada tubo en el espectrofotómetro

UV-Vis a una longitud de onda de 765,0 nm.

Determinación de la Capacidad Antioxidante en los comprimidos.

La determinación de la capacidad antioxidante se realizó a 0, 10, 20, 31, 46 y 54 días.

De los extractos obtenidos para la cuantificación de compuestos fenólicos en los comprimidos

en los días antes mencionados, se trasvasaron 100 uL de cada extracto y se colocaron en tubos

de ensayo, se añadieron 2,9 mL de la solución de DPPH a 20 ppm y 1 mL de etanol a cada tubo

de ensayo y se guardó en oscuridad por 30 minutos, transcurrido el tiempo se leyó la solución

de cada tubo en el espectrofotómetro UV-vis a una longitud de onda de 517,0 nm.

Análisis térmico de los comprimidos al final del estudio de estabilidad

A los 54 días del estudio de estabilidad se tomó una pastilla de cada condición de estudio

y se molieron por separado en mortero de ágata. Del polvo resultante de cada pastilla se pesaron

aproximadamente 1,5 mg en una capsula de aluminio, la cual se pesó previamente vacía con la

tapa, y se selló con una prensa manual TA Instruments. La cápsula de referencia y cada capsula

con la muestra correspondiente se colocaron en el horno del calorímetro y se calentaron a una

velocidad de 20 °C/min.

43

CAPÍTULO IV

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Acondicionamiento de la materia vegetal

La especie vegetal Urera laciniata Goudot ex Wedd, se recolectó en las coordenadas

mostradas en la figura 9.

Figura 9. Coordenadas geográficas del lugar de recolección de la especie vegetal Fuente:

Google maps

Obtención del extracto

El porcentaje de la fracción apolar presente en la especie Urera laciniata Goudot ex

Wedd es de 3,43±0,30 % en materia vegetal seca, esta fracción se extrajo para evitar

interferencias con los compuestos polares. El porcentaje de extracto etanólico seco obtenido a

partir de la materia vegetal seca es de 9,88±0,86 %.

Análisis cualitativo

Marcha fitoquímica.

No se han encontrado estudios fitoquímicos de la especie Urera laciniata Goudot ex

Wedd en la bibliografía consultada, por lo que fue necesario hacer una marcha fitoquímica

cualitativa. En la tabla 19 se presentan los resultados de dicho análisis.

44

Tabla 19. Análisis fitoquímico cualitativo de la especie Urera laciniata Goudot ex Wedd

Metabolito

secundario

Prueba/ reactivo Observación Resultado

Saponinas Espuma Formó espuma por más de 4

minutos

+

Carotenoides Carr-Price Formó un anillo azul verdoso +

Compuestos

fenólicos

FeCl3 Precipitado negro +

Flavonoides

HCl 2N Se tornó de una coloración

café amarillento

+

H2SO4 © Formo una coloración

amarillenta propia de

flavonas, y también una

coloración rojo azuloso

propia de chalconas y

auronas

+

Álcalis Formo coloración amarillenta

propia de flavonas

+

Shinoda Coloración anaranjada +

Zn/HCl Coloración anaranjada ±

SbCl3 precipitado amarillo, flavonas +

Esteroles/

terpenoides

Liebermann Coloración verde +

Taninos Proteína -

Alcaloides Dragendorff -


De los compuestos analizados en la tabla 19 se seleccionaron como marcador

fitoquímico los compuestos fenólicos a la información etnobotánica obtenida de la especie

Urera laciniata Goudot ex Wedd, anexo 3.

45

Perfil cromatográfico.

El perfil cromatográfico o huella digital que identifica a la planta se presenta en la figura

10. El perfil cromatográfico permite caracterizar a la planta, mediante la secuencia de manchas

obtenidas.

Figura 10. Perfil cromatográfico del extracto de Urera laciniata Goudot ex Weed a

diferentes longitudes de onda: A. 254nm; B. Luz blanca

Se corrió un cromatograma del extracto etanólico comparando con los estándares de

ácido caféico, ácido gálico, ácido tánico, ácido ferúlico y ácido rosmarínico, definiendose la

presencia de ácido caféico por coincidencia del factor de retención (Rf) a 0,88 coincidente con

el estándar (figura 11).

Figura 11. Comparación de los Rf de los estándares con el extracto. De izquierda a derecha:

Extracto, ácido caféico, ácido gálico, extracto, acido tánico, ácido ferúlico, ácido rosmarínico

y extracto. A. 254nm y B. luz blanca. Placa revelada con FeCl3 al 5%

Análisis cuantitativo

Cuantificación de compuestos fenólicos.

La curva de calibración media se la realizó con los datos presentados en la tabla 20,

(figura 12) en donde se observa un comportamiento lineal entre las variables: absorbancia y

concentración de compuestos fenólicos en el extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd. La

expresión matemática obtenida de la regresión lineal corresponde a la ecuación 5, en donde A

es la absorbancia y C es la concentración en ppm obteniéndose un coeficiente de correlación

entre las variables de R=0,9974.

46

Abs = 0,0779C + 0,0151 (Ecuación 5)

Tabla 20. Datos para la curva de calibración media de compuestos fenólicos totales

Concentración

(ppm)

Absorbancia

0,00 0,0001

0,50 0,0464

1,00 0,0925

1,50 0,1386

2,00 0,1829

2,50 0,2023

3,00 0,2594

3,50 0,2971

4,00 0,3417

4,50 0,3677

5,00 0,4108

5,50 0,4308

6,00 0,4665


Aplicando la ecuación 5 y utilizando la absorbancia experimental del extracto se calculó

la concentración de compuestos fenólicos totales en el extracto seco y en muestra vegetal seca,

obteniéndose valores de 145,43±7,46 mg equivalentes a ácido caféico (EAC)/ g extracto seco

(E.S) y 1430,93±88,03 mg EAC/100 g de materia seca (MS).

Figura 12. Curva de calibración promedio de compuestos fenólicos totales

expresados como ácido caféico.

-

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0 1 2 3 4 5 6 7

Abso

rban

cia

(A)

Concentración (C) (ppm)

47

Determinación de Capacidad Antioxidante del extracto etanólico.

La capacidad antioxidante del extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd se comparó

con la del ácido ascórbico mediante la relación de pendientes para definir las características

antioxidantes del extracto en relación con el estándar. Para una mayor claridad de la

interpretación de datos se ha calculado una relación porcentual entre la pendiente del ácido

ascórbico y la del extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd analizados como incremento o

decremento de la capacidad antioxidante. Para una interpretación química del resultado

obtenido se aplicó el inverso de la relación entre la pendiente del ácido ascórbico y del extracto

de Urera laciniata Goudot ex Wedd, a este valor se le asigno las unidades de medición

Capacidad Antioxidante Equivalente al Ácido ascórbico.

Se debe considerar que cuando los valores de las pendientes son menores al valor de la

pendiente estándar, las curvas tienden a ser paralelas al eje de la concentración esto se debe a

que la absorbancia inicial del radical DPPH no se ve afectada por el escaso efecto antioxidante

del compuesto (Yazan, 2016).

En la tabla 21 se presentan los valores de absorbancia, porcentaje de inhibición y

concentración para el ácido ascórbico.

Tabla 21. Valores de absorbancia y % de inhibición para ácido ascórbico

Concentración

(ppm)

Absorbancia %

Inhibición

0 0.3956 0

0.075 0.3803 3.87

0.1125 0.3831 3.16

0.1875 0.3475 12.16

0.5625 0.2425 38.70

0.6000 0.2245 43.25

0.6375 0.2115 46.54

0.7500 0.1786 54.85

0.8250 0.1711 56.75

0.9000 0.1198 69.72

0.9375 0.1066 73.05

0.9750 0.1109 71.97


48

La tabla 22 presenta los datos de concentración, absorbancia y porcentaje de inhibición

en función de la concentración del extracto.

Tabla 22. Valores de absorbancia y % de inhibición para el extracto de Urera laciniata

Goudot x Wedd

Concentración Absorbancia %Inhibición

0.0000 0.4239 0

1.2500 0.3965 3.12

1.8750 0.3822 6.61

3.1250 0.3586 12.37

9.3750 0.2362 42.29

10.0000 0.2192 46.43

10.6250 0.2108 48.50

12.5000 0.1850 54.80

13.7500 0.1659 59.47

15.0000 0.1494 63.50

15.6250 0.1445 64.69

16.2500 0.1297 68.32


Las curvas de capacidad antioxidante para el estándar de ácido ascórbico y extracto se

muestran en la figura 13 las cuales se obtuvieron con los datos de concentración y absorbancia

presentados en las tablas 21 y 22 respectivamente. Comparando los valores de las pendientes

de las ecuaciones matemáticas presentadas en la tabla 23 se puede observar que respecto al

ácido ascórbico el extracto tiene una menor pendiente correspondiendo a un decremento de la

capacidad antioxidante del 94,08%. El valor obtenido del inverso de la relación entre la

pendiente del ácido ascórbico y del extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd fue de 16,88

CAEA, esto quiere decir que 16,88 moles de extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd

tienen la misma capacidad antioxidante que 1 mol de ácido ascórbico.

Los coeficientes de correlación mostrados en la tabla 23 muestran una adecuada

correlación entre las variables con lo que se ajusta a una recta.

49

Tabla 23. Ecuaciones y pendientes para ácido ascórbico y extracto de Urera laciniata

Goudot ex Wedd para determinar capacidad antioxidante.

Ecuación Coeficiente de

correlación

Pendiente Relación

Estándar A= -0,3055C + 0,4064 0,9966 0,3055 1,0000

Extracto A= -0,0181C+0,4149 0,9968 0,0181 0,0592


Figura 13. Determinación de capacidad antioxidante. Ácido ascórbico (rojo), extracto (azul).

Las curvas del porcentaje de inhibición en función de la concentración del ácido

ascórbico y del extracto se muestran en la figura 14 las cuales se obtuvieron con los datos de

concentración y % de inhibición presentados en las tablas 21 y 22 respectivamente. Las

ecuaciones matemáticas que rigen a estas curvas se presentan en la tabla 24 junto con los

coeficientes de correlación los cuales permiten establecer que las variables se ajustan a una

línea recta.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.000 5.000 10.000 15.000 20.000

Abso

rban

cia

(A)


50

Figura 14. Curva %inhibición vs concentración de ácido ascórbico (azul) y extracto (rojo).

Las ecuaciones del porcentaje de inhibición que se muestran en la tabla 24 permiten

obtener la concentración inhibidora 50 (IC50). Los valores de IC50 muestran la concentración

mínima del compuesto antioxidante que permite inhibir el 50% de la especie radicalaria

(DPPH.). Para el ácido ascórbico se obtiene un IC50 de 0,6828 ppm y para el extracto de Urera

laciniata Goudot ex Wedd un IC50 de 11,6112 ppm, esta inhibición se debe a la generación de

la forma no radicalaria DPPH-H, la cual se genera por la presencia de un antioxidante donante

de hidrógeno (Álvarez E. , y otros, 2008). El extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd

comparado con el estándar de ácido ascórbico posee un porcentaje de inhibición 17 veces

menor.

Tabla 24. Ecuaciones del porcentaje de inhibición para el ácido ascórbico y el extracto de

Urera laciniata Goudot ex Wedd.

Ecuación Coeficiente de

correlación

Estándar %In = 77,232C – 2,7349 0,9966

Extracto %In = 4,3362C – 0,3487 0,9972


Análisis térmico

Análisis de reproducibilidad de picos del extracto de Urera laciniata Goudot ex

Wedd.

Se verificó la reproducibilidad de los picos que genera el extracto en un análisis por

cuadruplicado a las condiciones de calibración del calorímetro: velocidad de calentamiento de

10°C/min y 1mg de muestra. La temperatura en la que empieza a degradarse el extracto es

0102030405060708090

100

0 5 10 15 20

% I

nh

ibic

ión

(%

In)


51

125,46 ± 0,38 °C. En la figura 15 se muestran los termogramas de las réplicas y en la tabla 25

se presentan las temperaturas donde aparece el primer pico, el análisis de reproducibilidad

define que se encuentran dentro del límite de confianza establecido para el experimento (95%).


extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd.

Réplica Temperatura

1 125,64

2 125,68

3 125,21

4 125,30

Media 125,46

Desviación estándar 0,38


Figura 15. Termogramas de las cuatro réplicas del extracto puro, a 10ºC/min y 1mg de

muestra.

En el anexo 5 se presentan los termogramas de las cuatro réplicas por separado.

Análisis de reproducibilidad de picos del comprimido.

La verificación de la reproducibilidad de los picos de temperatura de los comprimidos

se observa en la tabla 26 en donde se obtiene una temperatura de 205,12 ± 1,06 °C, los valores

de las réplicas se encuentran dentro del límite de confianza del 95 %, esto quiere decir que los

picos para el comprimido son reproducibles. En la figura 16 se muestran los termogramas de

las réplicas realizadas para los comprimidos.

52


comprimido.

Réplica Temperatura

1 204,14

2 205,29

3 205,52

4 205,54

Media 205,12

Desviación estándar 1,06


Figura 16. Termogramas de los comprimidos para reproducibilidad.

El anexo 6 presenta los termogramas de las cuatro réplicas por separado señalando las

temperaturas de interés.

Análisis térmico de los excipientes

Los termogramas de los excipientes utilizados en la elaboración de los comprimidos se

obtuvieron con el fin de determinar la presencia de picos de degradación, y poder definir si

estos picos aparecen cuando se utilizan en la forma farmacéutica, si estos se desplazan, si

generan interferencia o existe menor o mayor estabilidad por la interacción con el extracto. En

la figura 17 se muestran los termogramas de cada excipiente y en la figura 18 se presenta el

53

termograma de la mezcla de excipientes con las proporciones utilizadas para formular los

comprimidos. En los termogramas de reproducibilidad de pico del comprimido -figura 16- se

puede observar un pico promedio de 146,06 °C que se debe al primer cambio térmico de la

lactosa. Además, existen picos del extracto sobre el pico debido al segundo cambio térmico

para la lactosa, estos picos aparecen a una temperatura de 205,12 °C, esto se debe a las

interacciones que presenta el extracto con la lactosa.

Figura 17. Termogramas de excipientes.

Figura 18. Termograma de la mezcla de excipientes: aerosíl, estearato de magnesio, almidón

y lactosa.

En el anexo 7 se muestra los termogramas de cada excipiente con las temperaturas a las

que sufren cambios térmicos.

54

Definición de las condiciones de corrido

De acuerdo al diseño experimental planteado en la tabla 16 para el extracto etanólico

de Urera laciniata Goudot es Wedd, y en la tabla 18 para los comprimidos, se corrieron los

termogramas presentados desde la figura 19 a la 26 en donde se pueden observar los picos de

temperatura del extracto en la parte izquierda de las figuras y los picos de temperatura del

comprimido en la parte derecha de las mismas. Al comparar los termogramas del extracto con

los termogramas del comprimido se puede observar que existe una variación en la temperatura

a la que aparecen los picos del extracto, incrementándose sensiblemente la temperatura del

primer pico en el comprimido respecto al extracto en las mismas condiciones.

Figura 19. Termograma del tratamiento 1: 10 °C/min y 0,5 mg (- -); Izquierda: Extracto

etanólico de Urera laciniata Goudot ex Wedd; Derecha: Comprimido.

55

Figura 20. Termograma de la réplica del tratamiento 1 tratamiento 1: 10 °C/min y 0,5 mg (-

-); Izquierda: Extracto etanólico de Urera laciniata Goudot ex Wedd; Derecha: Comprimido.

Figura 21. Termograma del tratamiento 2: 20 °C/min y 0,5 mg (+ -); Izquierda: Extracto


56

Figura 22. Termograma de la réplica del tratamiento 2: 20 °C/min y 0,5 mg (+ -); Izquierda:

Extracto etanólico de Urera laciniata Goudot ex Wedd; Derecha: Comprimido.

Figura 23. Termograma del tratamiento 3: 10 °C/min y 1,5 mg (- +); Izquierda: Extracto


57

Figura 24. Termograma de la réplica del tratamiento 3: 10 °C/min y 1,5 mg (- +); Izquierda:


Figura 25. Termograma del tratamiento 4: 20 °C/min y 1,5 mg (+ +); Izquierda: Extracto


58

Figura 26. Termograma de la réplica del tratamiento 4: 20 °C/min y 1,5 mg (+ +); Izquierda:


El desplazamiento de la temperatura en la cual empieza haber cambios térmicos del

extracto cuando forma parte del comprimido, con respecto al extracto puro, puede deberse a la

interacción que existe entre los OH de la lactosa y los OH existentes en los glicósidos que se

encuentran en el extracto, entre ellos los glicósidos fenólicos (Ávila & Mora, 2005). Esto se

puede comprobar con los picos de la lactosa, ya que el segundo pico de ésta en la mezcla de

excipientes en la figura 18 se ve muy definido, mientras que en los comprimidos este mismo

pico empieza a tener otros picos que se deben al extracto, por lo que se comprueba que el

extracto esta interactuando con la lactosa.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se calcula la variación que existe entre el pico de temperatura

del extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd y del extracto dentro del comprimido

mostrados en los termogramas anteriores. En la tabla 27 se muestra la media de la variación de

temperatura (ΔTmedia) obtenida para cada tratamiento y su desviación estándar (Sr). En donde

T1 es la temperatura obtenida de los termogramas para los tratamientos y T2 es la temperatura

obtenida para las réplicas de los tratamientos, ΔT1 y ΔT2 son las variaciones obtenidas al restar

las T1 del comprimido con las T1 del extracto y T2 del comprimido con T2 del extracto

respectivamente.

59

Tabla 27. Variación de temperatura obtenida en los tratamientos

Extracto Comprimidos

#

Tratamiento

T1 T2 T1 T2 ΔT1 ΔT2 ΔT

media

Sr

1(- -) 132,98 132,84 202,00 203,88 69,02 71,04 70,03 1,43

2(+ -) 132,84 132,66 202,32 205,89 69,48 73,23 71,36 2,65

3(- +) 134,66 132,16 212,80 204,77 78,14 72,61 75,38 3,91

4(+ +) 132,45 132,74 205,44 209,90 72,99 77,16 75,08 2,95


Se observa que la interacción entre la lactosa y el extracto desplaza el aparecimiento de

los picos de los comprimidos en un promedio de 70 °C hacia temperaturas mayores.

El cálculo de los efectos de los factores analizados, sobre la variable respuesta, se

presenta en la a tabla 28.

Tabla 28. Efectos obtenidos mediante el algoritmo de Yates

Algoritmo de Yates

Tratamientos Respuesta o

media

Columna

1

Efecto

total

Efecto del factor

-1 70,03 141,39 291,84 Promedio. 72,96

a

71,36 150,45 1,02

Velocidad de

calentamiento. 0,51

b

75,38 1,32 9,07

Cantidad de

muestra. 4,53

ab

75,08 -0,30 -1,63

Temperatura

x masa. -0,81


Los valores calculados de los efectos se aplican únicamente en la zona experimental en

la que se realizó esta investigación. Los efectos individuales (velocidad de calentamiento y

cantidad de muestra) incrementan la variación de temperatura en 0,51 y 4,53 unidades

respectivamente, al pasar del nivel más bajo (10 °C/min y 0,5 mg) al nivel más alto (20 °C/min

y 1,5 mg), mientras que la interacción de los dos factores disminuye la variación de temperatura

en 0,81 unidades.

Para definir la significancia estadística de los efectos, se obtiene la varianza de las

respuestas la cual mediante la ecuación 4 permite calcular el error estándar del efecto, para lo

60

cual se calculó la diferencia entre las respuestas duplicadas (ΔT1 y ΔT2) y se estimó la varianza

de cada tratamiento obteniendo una varianza conjunta de 8,26, los datos se presentan en la tabla

29.

Tabla 29. Calculo de la varianza de las respuestas por diferencia de duplicados.

ΔT1 ΔT2 ΔT

media

Diferencia entre respuestas (d)

(ΔT2- ΔT1)

Varianza estimada

(s2i = d2/2)

69,02 71,04 70,03 2,02 2,04

69,48 73,23 71,36 3,75 7,03

78,14 72,61 75,38 5,53 15,29

72,99 77,16 75,08 4,17 8,69

Suma total 33,06

s2 conjunta (promedio) 8,26


(SE)2 = (1

4+

1

4) 8,26 (SE)2 = 4,13

Con la varianza conjunta y aplicando la ecuación 4 se obtiene la varianza del efecto con

un valor de 4,13, por lo tanto, el error estándar del efecto es: 𝑆𝐸 = 2,03; que se utiliza para

calcular la significancia de cada efecto.

En la tabla 30 se muestra la significancia estadística de cada efecto

Tabla 30. Significancia estadística de los efectos y su interacción sobre la variación de la

temperatura de degradación

Tipo de efecto Efecto 𝑺𝑬 k k*SE Significancia

Velocidad de calentamiento 0,51 2,03 2,776 5,64 No significativo

Cantidad de muestra 4,53 2,03 2,776 5,64 No significativo

Temperatura x Cantidad de

muestra

-0,81 2,03 2,776 5,64 No significativo


En la tabla 30 se define qué; los factores -velocidad de calentamiento y cantidad de

muestra- y la interacción entre estos, no tienen significancia estadística en la variable

respuesta -variación de temperatura-, por lo que estos no tuvieron incidencia en el

experimento en la zona experimental analizada. De acuerdo a este análisis, se acepta la

hipótesis nula planteada.

Al no tener una significancia estadística los factores analizados sobre la variable

respuesta, se utilizó el tratamiento con el nivel alto de velocidad de calentamiento ya que baja

el tiempo en el análisis y el nivel más alto para la cantidad de muestra puesto que al usar los

61

comprimidos la proporción en que se encuentra el extracto dentro del comprimido es del 11.8

%. Al usar el nivel más alto en cantidad de muestra se asegura que el análisis se encuentre

dentro del límite de detección. Las variables a utilizarse fueron 20°C/min y 1,5 mg.

En la tabla 31 se presentan los efectos con su error estándar.

Tabla 31. Efectos calculados y error estándar para el diseño factorial 22 del estudio

calorimétrico.

Media Efecto y error estándar

Efectos principales

Velocidad de calentamiento (VC) 0,51 ± 2,03

Cantidad de muestra (CM) 4,53 ± 2,03

Interacción

VC x CM -0,81 ± 2,03


A fin de comprobar estadísticamente que el extracto puro y el extracto en la pastilla no

tienen una temperatura de degradación igual, es decir, son significativamente diferentes se

realizó una prueba t donde se tomó como factor el extracto, con sus niveles: puro y en pastilla,

y cada tratamiento como la repetición, de la manera descrita en la tabla 32.

A partir de estos datos se realizó un análisis estadístico aplicando la t de student cuyo valor

calculado fue 45,22. Por otro lado el valor t crítico para 6 grados de libertad y un nivel de

confianza de 95 % que se aplicó en la investigación tiene un valor de 2,45. Por tanto, se

demuestra estadísticamente que el extracto dentro de la pastilla tiene una mayor temperatura

de degradación por lo tanto una mayor estabilidad térmica.

Tabla 32. Datos para análisis t

Factor

extracto

Repetición

1

Repetición

2

Repetición

3

Repetición

4

Media Desviación

estándar

Puro 132,91 132,75 133,41 132,60 132,92 0,35189

En

comprimido

202,94 204,11 208,72 207,67 205,86 2,7716


62

Estabilidad

Condiciones del estudio de estabilidad.

Se realizó un estudio de estabilidad a las temperaturas seleccionadas de 40 °C, 30 °C y

temperatura ambiente para la ciudad de Quito -18,5°C-, tomando en cuenta las temperaturas

utilizadas por la ICH para una zona climática IV ya que en el Ecuador las temperaturas

ambientales de zonas como la región Amazónica y la región Costanera pueden superar los 30°C

(Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología, 2016). Asimismo, para la zona climática IV

los estudios acelerados se realizan a 40 °C.

Cuantificación de compuestos fenólicos en los comprimidos.

Se cuantificó los compuestos fenólicos expresados como mg de equivalentes de ácido

caféico por 450 mg de comprimido (mg EAC/450 mg) la cuantificación se realizó por 54 días

a las temperaturas explicadas anteriormente, en tres tipos de frascos PET de diferentes colores

-transparente, blanco y ámbar. - Los valores de concentración de compuestos fenólicos se

presentan en la tabla 33.

Tabla 33. Concentración de compuestos fenólicos en el estudio de estabilidad

Frasco Transparente

Ambiente 30 °C 40°C

Días mg EAC/450mg C Días mg EAC/450mg C Días mg

EAC/450mg C

0 7,26 0 7,26 0 7,26

5 7,26 5 7,04 5 6,80

10 7,32 10 7,38 10 6,87

12 7,44 12 6,74 12 6,02

14 6,56 14 6,43 14 6,83

17 6,91 17 6,74 17 6,64

20 6,58 20 6,26 20 6,60

24 7,27 24 6,79 24 7,06

27 7,08 27 6,94 27 6,84

31 7,16 31 6,52 31 7,03

46 6,71 46 7,01 46 6,98

54 6,97 54 6,69 54 7,36

63

Tabla 33. Continuación

Frasco Blanco

Ambiente 30 °C 40 °C


EAC/450mg C

0 7,26 0 7,26 0 7,26

5 7,09 5 7,13 5 7,24

10 6,61 10 6,81 10 6,97

12 7,27 12 7,22 12 7,15

14 7,27 14 6,65 14 6,51

17 6,97 17 6,72 17 6,52

20 6,53 20 6,38 20 6,44

24 7,21 24 6,96 24 7,08

27 7,32 27 7,12 27 7,05

31 6,91 31 6,89 31 7,09

46 7,01 46 7,77 46 6,67

54 6,97 54 7,20 54 7,14

Frasco Ámbar

Ambiente 30 °C 40 °C


EAC/450mg C

0 7,26 0 7,26 0 7,26

5 6,47 5 7,26 5 6,87

10 7,57 10 7,21 10 7,34

12 7,22 12 7,90 12 7,21

14 6,89 14 6,95 14 6,76

17 6,86 17 6,75 17 6,38

20 6,74 20 6,45 20 6,26

24 7,17 24 6,87 24 7,15

27 6,95 27 7,68 27 6,89

31 7,12 31 6,82 31 6,55

46 7,31 46 6,88 46 6,68

54 7,36 54 7,48 54 7,44


64

Como se puede observar en la tabla 33 los datos de concentración de compuestos

fenólicos no tienen variación en función del tiempo, sino que se obtienen valores alrededor de

la concentración inicial. Esta variación se debe al error experimental que viene asociado al

tratamiento de los comprimidos para obtener el extracto en los días de análisis.

Para aplicar el método de Arrhenius, con los datos de la tabla 33 se obtuvieron las

constantes de velocidad a cada temperatura propuesta y en cada tipo de frasco utilizado en el

estudio. Para obtener el orden de reacción y la constante de velocidad, se aplicó el método

gráfico.

Los resultados obtenidos muestran que no es posible aplicar la ecuación de Arrhenius

debido a que las gráficas no son lineales para ningún orden, como se muestra en la tabla 34,

los coeficientes de correlación para cada orden en cada condición de estudio son menores a

0,500.

Con los datos de concentración de compuestos fenólicos no es posible aplicar la

ecuación de Arrhenius, por lo que no se puede calcular la vida media ni el tiempo de vida útil

por este método, además este procedimiento al utilizar las ecuaciones integradas para calcular

la constante de velocidad según Levine (2004), conduce a resultados inexactos. Se puede

establecer que, si se comparan los análisis de cuantificación de compuestos fenólicos, con los

datos de estabilidad térmica de los extractos y comprimidos las condiciones de los estudios de

estabilidad dadas con parámetros de zona geográfica, no son aplicables en este caso y tampoco

la ecuación de Arrhenius.

Tabla 34. Ecuaciones obtenidas por regresión lineal para cada orden cinético y coeficiente de

correlación.

Frasco Temperatura Orden Ecuación R

Transparente Ambiente

0 y = -0.0067x + 7.1895 0.3617

1 y = -0.0009x + 1.9718 0.3536

2 y = 0.0001x + 0.1393 0.3454

3 y = 4E-05x + 0.0195 0.3370

½ y = -0.0013x + 2.6807 0.3576

3/2 y = 0.0002x + 0.3732 0.3496

5/2 y = 7E-05x + 0.052 0.3412

30 0 y = -0.0058x + 6.9413 0.2825

1 y = -0.0008x + 1.9359 0.2724

2 y = 0.0001x + 0.1445 0.2619

65

3 y = 3E-05x + 0.021 0.2514

½ y = -0.0011x + 2.6336 0.2775

3/2 y = 0.0002x + 0.38 0.2672

5/2 y = 7E-05x + 0.055 0.2567

40

0 y = 0.0082x + 6.6795 0.3796

1 y = 0.0012x + 1.898 0.3726

2 y = -0.0002x + 0.15 0.3652

3 y = -5E-05x + 0.0226 0.3576

½ y = 0.0016x + 2.5838 0.3762

3/2 y = -0.0002x + 0.3872 0.3689

5/2 y = -0.0001x + 0.0582 0.3614

Blanco Ambiente

0 y = -0.002x + 7.0771 0.1233

1 y = -0.0003x + 1.956 0.1153

2 y = 4E-05x + 0.1416 0.1077

3 y = 1E-05x + 0.0201 0.1000

½ y = -0.0004x + 2.6597 0.1196

3/2 y = 5E-05x + 0.3762 0.1114

5/2 y = 2E-05x + 0.0533 0.1039

30

0 y = 0.0078x + 6.84 0.3501

1 y = 0.0011x + 1.9227 0.3403

2 y = -0.0001x + 0.1462 0.3302

3 y = -4E-05x + 0.0214 0.3200

½ y = 0.0015x + 2.6153 0.3453

3/2 y = -0.0002x + 0.3824 0.3353

5/2 y = -8E-05x + 0.0559 0.3251

40

0 y = -0.0022x + 6.9738 0.1149

1 y = -0.0003x + 1.941 0.1086

2 y = 4E-05x + 0.1437 0.1025

3 y = 1E-05x + 0.0207 0.0964

½ y = -0.0004x + 2.64 0.1118

3/2 y = 6E-05x + 0.379 0.1058

5/2 y = 2E-05x + 0.0545 0.0995

66

Ámbar Ambiente

0 y = 0.006x + 6.9464 0.3153

1 y = 0.0009x + 1.937 0.3212

2 y = -0.0001x + 0.1443 0.3268

3 y = -4E-05x + 0.0209 0.3320

½ y = 0.0011x + 2.6348 0.3183

3/2 y = -0.0002x + 0.3798 0.3240

5/2 y = -7E-05x + 0.0549 0.3294

30

0 y = -0.0015x + 7.1602 0.0592

1 y = -0.0002x + 1.967 0.0592

2 y = 3E-05x + 0.1401 0.0600

3 y = 9E-06x + 0.0197 0.0608

½ y = -0.0003x + 2.6748 0.0592

3/2 y = 4E-05x + 0.3741 0.0600

5/2 y = 2E-05x + 0.0525 0.0600

40

0 y = -0.0005x + 6.9088 0.0200

1 y = -8E-05x + 1.9316 0.0245

2 y = 1E-05x + 0.1451 0.0265

3 y = 5E-06x + 0.0211 0.0300

½ y = -0.0001x + 2.6277 0.0224

3/2 y = 2E-05x + 0.3808 0.0265

5/2 y = 8E-06x + 0.0553 0.0283


Determinación de la Capacidad Antioxidante.

En la tabla 35 se muestra el porcentaje de inhibición del radical DPPH. de los

comprimidos obtenido en 54 días de estudio. La capacidad antioxidante, se mantuvo constante

en el tiempo, debido a que no hay degradación de compuestos fenólicos, los principales

responsables de esta propiedad funcional en el extracto.

67

Tabla 35. % de Inhibición de comprimidos en estudio

Temperatura Frasco Inicial 10

Días

20

Días

31

Días

46

Días

54

Días

30

Transparente 82,10 82,01 80,14 77,18 80,46 81,19

Blanco 82,10 77,93 80,95 68,70 82,55 83,11

Ámbar 82,10 82,28 82,18 68,82 79,20 81,36

40

Transparente 82,10 81,75 81,89 74,84 82,12 84,00

Blanco 82,10 83,80 81,39 72,11 76,46 82,69

Ámbar 82,10 82,81 79,69 70,82 79,86 86,28

Ambiente Transparente 82,10 80,90 78,41 75,48 81,60 81,43

Blanco 82,10 84,57 78,12 78,61 83,71 83,04

Ámbar 82,10 83,73 80,48 77,84 80,15 81,98


Los datos del porcentaje de inhibición obtenidos corresponden a una concentración

del comprimido de 250,33 ± 0,50 ppm. Lo que significa que a una concentración de 250 ppm

del comprimido en solución alcohólica se inhibe el 82 % del radical DPPH.

Al igual que en la cuantificación de compuestos fenólicos las pequeñas variaciones

del porcentaje de inhibición se deben al error experimental.

Análisis térmico de los comprimidos al final del estudio de estabilidad.

Los termogramas de los comprimidos al final del estudio de estabilidad se obtuvieron

a condiciones recomendadas en el análisis estadístico para confirmar que no hay degradación

del extracto.

Comparando los termogramas de los comprimidos al final del estudio de estabilidad

con los de los comprimidos obtenidos en el tratamiento 4 -velocidad de calentamiento:20

°C/min y cantidad de muestra: 1,5mg- al inicio del estudio, se observa que no hay un cambio

en las temperaturas de degradación de estos al final del estudio de estabilidad con respecto a

dicho tratamiento. La temperatura de degradación de los comprimidos al inicio del estudio de

estabilidad para el tratamiento 4 es de 207,67±3,15 °C, es decir tiene un límite superior de

210,82°C y un límite inferior de 204,52 °C.

68

Tabla 36. Temperaturas de degradación a las diferentes condiciones del estudio de

estabilidad.

Condición Temperatura °C

30°C-Ámbar 207,14

30°C-Blanco 206,18

30°C-Transparente 206,57

40°C-Ámbar 206,18

40°-Blanco 207,08

40°-Transparente 206,82

Temperatura ambiente –Ámbar 206,18

Temperatura ambiente –Blanco 206,44

Temperatura ambiente –Transparente 206,44

Rango 0,96


Como se muestra en la tabla 36, las temperaturas de degradación de los comprimidos

en las diferentes condiciones del estudio de estabilidad están cercanas a la media y se

encuentran en el rango de error.

En la figura 35 se comparan los termogramas de los comprimidos al final del estudio

de estabilidad, con el termograma de los comprimidos del tratamiento cuatro, comprobándose

que su diferencia se encuentra en el intervalo de 207,67±3,15 °C, por ende, las variaciones en

los valores del termograma pueden deberse al error aleatorio, el cuál no se puede controlar.

Figura 27. Termogramas de los comprimidos a las diferentes condiciones al final del estudio

de estabilidad comparados con el termograma del comprimido inicial en el tratamiento 4

69

En las figuras 36, 37 y 38 se presentan los termogramas de los frascos ámbar, blanco y

transparente respectivamente a las diferentes temperaturas de estudio, señalando las

temperaturas de degradación del extracto mostradas en la tabla 35. Se puede observar que para

cada frasco las temperaturas permanecen en el rango de la desviación estándar de la respuesta

para el tratamiento 4, pese a haber pasado 54 días de estudio de estabilidad.

Figura 28. Termogramas de los comprimidos en el frasco ámbar a las diferentes temperaturas

de estudio.

Figura 29. Termogramas de los comprimidos en el frasco blanco a las diferentes

temperaturas de estudio.

70

Figura 30. Termogramas de los comprimidos en el frasco transparente a las diferentes

temperaturas de estudio.

Como se explicó anteriormente las temperaturas luego del estudio de estabilidad

comparadas con la del tratamiento 4, están dentro del rango del error, por ende, se comprueba

que el extracto no se está degradando.

De igual forma los resultados obtenidos en la cuantificación de compuestos fenólicos

de los comprimidos que se sometieron al estudio de estabilidad, se pueden relacionar con el

análisis anterior comprobando que no existe una degradación de los comprimidos en el tiempo

de estudio.

71

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusiones

Se cuantificaron fenoles totales en el extracto etanólico de Urera laciniata Goudot ex

Wedd obteniendo como resultado la concentración de 145,43±7,46 mg EAC/ g E.S y

1430,93±88,03 mg EAC/100g MS. Adicionalmente se confirmó mediante cromatografía de

capa fina de alta resolución la presencia de ácido caféico en la especie vegetal.

Se midió y comparó la capacidad antioxidante entre el extracto etanólico de Urera

laciniata Goudot ex Wedd con la capacidad antioxidante del estándar de ácido ascórbico. El

extracto etanólico de la especie vegetal presenta un decremento del 94,08 % en la capacidad

antioxidante, respecto del estándar. El extracto presentó una Capacidad Antioxidante

Equivalente al Ácido ascórbico de 16,88. El porcentaje de inhibición de los comprimidos

sometidos al estudio de estabilidad mostró que la capacidad antioxidante no varía en el tiempo

y a las temperaturas de estudio.

Mediante el análisis de la temperatura de degradación del extracto puro, del extracto

dentro de los comprimidos y la variación de estas, utilizando el método de Calorimetría

Diferencial de Barrido (DSC) y aplicando un diseño factorial 22, se determinó a un nivel de

confianza del 95% que la velocidad de calentamiento y la cantidad de muestra no influyen en

la determinación de la temperatura de degradación ni en la variación de la misma. Se

desarrollaron termogramas en donde se observó que la temperatura de degradación del extracto

es de 125,46 °C y la temperatura de degradación del extracto dentro del comprimido es de

205,12 °C. Además, la variación de la temperatura del extracto dentro del comprimido con

respecto al extracto puro es de 70°C esto debido a las interacciones de la lactosa con los

glucósidos presentes en el extracto. Se determinó que, para las condiciones de la investigación,

el mejor tratamiento para el estudio térmico es: 20°C/min y 1,5 mg de muestra.

Se realizó el estudio de estabilidad de los comprimidos en base a los datos obtenidos en

el estudio térmico, para lo cual se eligió las temperaturas con el criterio de las zonas climáticas.

Mediante la cuantificación de compuestos fenólicos los comprimidos mostraron un

comportamiento estable a las condiciones de estudio, es decir que no sufrieron degradación.

Los datos obtenidos en la cuantificación de compuestos fenólicos no permitieron

aplicar el método de Arrhenius, ya que, con el método del tanteo las ecuaciones para obtener

las constantes de velocidad presentaron coeficientes de correlación por debajo de 0,5.

72

Al final del estudio de estabilidad se comprobó que los comprimidos no sufrieron

degradación ya que los termogramas obtenidos después de los 54 días de estudio no presentan

cambios en comparación con los termogramas al inicio del estudio.

Del análisis estadístico se puede concluir que:

Para definir una temperatura de degradación de un extracto etanólico de Urera laciniata

Goudot ex Wedd se puede utilizar cualquiera de las condiciones de trabajo del calorímetro

utilizadas en la investigación.

El extracto al encontrarse en una matriz compleja –comprimido-, presentó un

desplazamiento de 70 °C hacia temperaturas más altas, elevando así su estabilidad térmica.

Por lo tanto, el estudio térmico mediante calorimetría diferencial de barrido permitió, a

través de la determinación de la temperatura inicial de degradación verificar que el método de

Arrhenius y los criterios de zona climática no son de utilidad en esta investigación para definir

el tiempo de vida útil de un fitofármaco a base de Urera laciniata Goudot ex Wedd.

Recomendaciones

A partir de los resultados obtenidos en la investigación se presentan las siguientes

recomendaciones:

Realizar un estudio cambiando la zona experimental -velocidad de calentamiento y

cantidad de muestra- con la misma especie para determinar si a otras velocidades y a diferentes

cantidades de muestra existe una significancia estadística para la determinación de las

temperaturas de degradación del extracto puro y el extracto dentro de comprimidos y su

variación.

Plantear estudios con extractos de diferentes plantas y fitofármacos elaborados a partir

de estos extractos, y observar si la temperatura de degradación del extracto aumenta o

disminuye dentro de la matriz del fitofármaco.

Al observar que la lactosa interacciona con el extracto, se puede realizar un estudio en

el que se varíen las proporciones de los excipientes en la formulación para obtener información

de cómo afectan los excipientes a la temperatura de degradación del extracto.

Efectuar un estudio de estabilidad a un tiempo mayor al de esta investigación a las

temperaturas estudiadas.

Realizar un estudio en donde se aplique la ecuación de Kissinger para obtener el tiempo

de vida media y útil de los fitofármacos utilizados en esta investigación.

73

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ANEXOS

Anexo 1. Esquema de Causa-Efecto

Muestra de análisis

Planta de ortiga (Urera

laciniata Goudot ex

Wedd)

Fármaco a base de Urera

Temperatura

Método de determinación de

temperatura de degradación

Calorimetría

diferencial de barrido

80

Anexo 2. Diagrama de flujo

Pretratamiento de la muestra Calorimetría diferencial Estudio de estabilidad

Temperatura

Ecuación de

Arrhenius

DPPH

Vida

media Estabilidad

acelerada

Tres temperaturas

de estudio

Temperatura inicial

de degradación

Capacidad

antioxidante

Estudio de

estabilidad

Método de Folin-

Denis

Cuantificación

compuestos

81

E1. Secar la muestra previamente lavada a 40ºC en la estufa con aire circulante.

E2. Moler en el molino mecánico y tamizar.

E3. Desengrasar, separando la parte polar de las muestras con hexano.

E4. Extraer los compuestos fenólicos con etanol mediante percolación y

rotavaporar.

E5. Pesar el extracto de cada tratamiento en las capsulas de aluminio.

E6. Analizar en el calorímetro diferencial de barrido las condiciones propuestas.

E7. Determinar la temperatura de degradación en los termogramas obtenidos.

E8. Colocar en estufa las muestras a las que se realizará estudio de estabilidad.

82

E9. Cuantificar fenoles a través del método de Folin-Denis a las muestras en

estudio.

E10. Determinar capacidad antioxidante por el método de DPPH de las

muestras.

E11. Con los datos de las temperaturas en estudio y de fenoles y capacidad

antioxidante, con la ecuación de Arrhenius determinar vida media y vida útil.

Anexo 3. Monografía de la planta en estudio

Ortiga

83

Figura 31. Ortiga (Urera laciniata Goudot. Ex Wedd.) Fuente: Fotografía por Jhonnathan

Villacis

Taxonomía

Tabla 37. Taxonomía de la ortiga

Nombre científico Urera laciniata Goudot. Ex Wedd.

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Rosales

Familia: Urticaceae

Género:

Testigo:

Urera

Lehmann, lower, D, 65

Elaborado por: Jhonnathan Villacis Fuente: (EOL.org, 2011)

Nombres vernaculares:

Arara, pica pica, pringamoza, chini, papaia chini, pucachini, ortiga de monte, ortiga negra

Descripción botánica

Figura 32. Ortiga (Urera laciniata Goudot ex Wedd.) Modificado: http://media.e-

taxonomy.eu/flora-guianas/fotg-a-11-540.gif

Es una planta nativa de la región amazónica de países como Ecuador, Colombia, Perú,

Venezuela y países de Mesoamérica (Monro, 2009). Esta especie se puede presentar como

hierba, subarbusto, arbusto, o árbol de 1 a 5 metros de alto. Presenta una lámina de hoja de

84

150-300 × 150-320 mm, ancha ovalada, ovada, cordiforme, profundamente lobulada o

laciniada, su haz presenta 2 clases de tricomas distribuidos al azar y paralelos a las nervaduras

(Ministerio de Medio Ambiente y Agua , 2016). Inflorescencias estables de 1 a 2 por tallo de

80-90 mm, con 128-390 flores en una panícula asimétrica, panícula con 3 o 4 órdenes de

ramificación con flores organizadas en grupos de 4-5 (Monro, 2009).0020

Composición química

La bibliografía consultada no aporta ningún estudio fitoquímico realizado sobre esta

especie.

Las especies de esta familia comparten los mismos principios activos, por lo que se

observa que las ortigas en cualquiera de sus especies poseen características fitoquímicas

similares, los más comunes son el ácido Fórmico, y flavonoides. Un estudio realizado en

Colombia menciona que el ácido fórmico es un componente de las especies de esta familia y

especifica que posee propiedades Antinflamatorios, así mismo los flavonoides se caracterizan

por ser antinflamatorios. (Olivo & Pazmiño, 2016)

Al pertenecer a la familia urticaceae la especie Urera laciniata Goudot ex Wedd podría

presentar una composición química parecida a la especie Urtica dioica L. de la cual hay una

variedad de estudios fitoquímicos, detallados a continuación:

La acción urticante de los tricomas (pelos) de la hoja se debe a la presencia de

acetilcolina, histamina, serotonina y pequeñas cantidades de leucotrienos. (Upton R., 2013)

Además las hojas contienen flavonoides, rutina, isoquercetina, quercetina, kaenferol, ramnetol.

Clorofila a y b, carotenoides; ácidos orgánicos como el acético, fórmico, gálico, caféico;

provitaminas A, B, C y K. Las raíces contienen taninos, fitosteroles, fenilpropanos,

polifenoles. (Quiroz, 2013).

Se han podido identificar derivados del ácido shikímico, los fenilpropanos, ácido

caféico y sus derivados en forma de éster como el ácido clorogénico y el cafeoilmálico, además

se ha encontrado la cumarina escopoletina.

(Pinelli, y otros, 2008) estudiaron el contenido fenólico en hojas de Urtica dioica L. en

muestras cultivadas y salvajes, encontrando grandes cantidades de derivados del ácido caféico,

estos son ácido clorogénico y 2-O-cafeoilmálico que representan el 71,5% de compuestos

fenólicos totales en 1,5g de muestra cultivada y 76,5% en 1,5g de muestras salvajes.

85

Figura 33. Dos compuestos fenólicos presentes en la ortiga. Fuente: Café: Origen, química y

efectos. (SOLUCIONES CORPORATIVAS IP, 2011)

Usos

Los Achuar usan las hojas de Urera laciniata Goudot ex Wedd para tratar el reumatismo y el

dolor corporal, los Sionas del putumayo colombiano la usan para tratar dolores musculares,

existe información que la tribu Yanesha utilizan la planta para el tratamiento de la malaria

(Giovannini, 2015).

El Ministerio de Medio Ambiente y Agua (2016) menciona que esta planta se puede utilizar

para enfermedades como dolor de cabeza, fiebre, dolor de huesos, enfermedades de la piel,

enfermedades del sistema urinario-reproductivo y contra el mal aire.

Luziatelli, Sørensen, Theilade, & Mølgaard (2010) mencionan que esta especie la utilizan los

habitantes de la tribu nativa Ashaninka de Bajo Quimiriki del Perú para la malaria, la

hechicería, lesiones del riñón, próstata, calambres, mal aire, osteoartritis además algunos

hombres lo utilizan para mejorar la libido masculina.

Se ha realizado estudios etnomédicos en la ciudad de Tena, provincia de Napo perteneciente a

Ecuador los cuales reportan que utilizan esta especie para alteraciones del sistema muscular y

óseo, en la enfermedad cultural, enfermedades respiratorias y para patologías y trastornos del

sistema óseo (Lalama, Montes, & Zaldumbide, 2016).

Pino, Caballero, & Valencia (2014), realizaron una investigación en el departamento de Chocó

en Colombia en donde el extracto de Urera laciniata Goudot ex Wedd presenta propiedades

repelentes contra Tribolium castaneum (gorgojo de harina), en especies vegetales, dando como

resultado un 86% de repelencia a una concentración de extracto de 300ug/mL.

Etnobotánica y etnofarmacia

Se realizó una entrevista a 15 personas de la ciudad de Archidona en la provincia de Napo en

donde se les preguntó acerca de la planta Urera laciniata Goudot ex Wedd u Ortiga como los

86

pobladores de la zona la conocen, los datos obtenidos en la entrevista se los presentan a

continuación:

Los pobladores conocen a la planta con otros nombres, los resultados se presentan en

la gráfica 1:

Gráfica 1. Nombres utilizados para Urera laciniata Goudot ex Wedd en porcentaje

Se preguntó los usos que le dan a la planta y en los gráficos siguientes se muestra que

la usan medicinalmente y como castigo para los niños, se tiene que tener en cuenta que

cada poblador dijo algunos usos.

Gráfica 2. Usos medicinales de Urera laciniata Goudot ex Wedd en porcentaje

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

Ortiga Chini Pucachini Biyuchini Picapica

47.4

26.3

5.3 5.3

15.8

Porcentaje

0.05.0

10.015.020.025.030.0 27.0

10.8 10.8

2.7 2.7

10.8

2.75.4

2.7

8.1

2.7 2.7 2.75.4

2.7

Porcentaje

0

50

100

Porcentaje

100

castigo

87

Gráfica 3. Otros usos de Urera laciniata Goudot ex Wedd en porcentaje

Existen varias formas de usar la planta, en la gráfica 4 se muestra los diferentes modos

de uso que los habitantes de la zona aplican.

Gráfica 4. Modos de uso de Urera laciniata Goudot ex Wedd en porcentaje

Se preguntó si usar la planta tiene alguna contraindicación, los resultados se presentan

en la gráfica 5.

Gráfica 5. Contraindicaciones del uso de Urera laciniata Goudot ex Wedd en porcentaje

Al final de la entrevista se preguntó a los habitantes si saben en qué lugar crece la planta,

para lo que respondieron que esta especie crece en todo lado de la provincia de Napo.

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

Cocinada Machacada Ortigazo Ungüento Licuado

34.5

10.3

44.8

6.9

3.4

Porcentaje

0.0

50.0

100.0

Ninguna Embarazo Alergia

80.0

13.3 6.7

Porcentaje

88

Anexo 4. Preparación de reactivos

Reactivo de Dragendorff

En un matraz Erlenmeyer de 125 mL disolver 8 gramos de nitrato de bismuto pentahidratado

con 20 mL de ácido nítrico, en otro matraz colocar 27,2 gramos de yoduro de potasio con 50

mL de agua. Mezclar las dos soluciones y dejarlas en reposo durante 24 horas. Decantar la

solución y aforar con agua 100 mL.

Reactivo de Folin-Denis

Para preparar el reactivo de Folin-Denis se pesaron 10 gramos de Tungstato de sodio

dihidratado (Na2WO4.2H2O) de marca EMSURE® Merck grado analítico y 2 gramos de ácido

fosfomolíbdico (H3P[Mo3O10]4) de marca EMSURE® Merck grado analítico. Se disolvieron en

un balón de fondo redondo con 75 mL de agua tipo I, se añadieron 5 mL de ácido fosfórico de

marca EMSURE® Merck grado analítico y se procedió a reflujar por 2 horas, transcurrido este

tiempo se dejó enfriar y se aforó a 100 mL con agua tipo I. Se almacenó en un frasco ámbar en

refrigeración. El reactivo se preparó cada dos semanas para evitar la degradación del mismo.

Anexo 5. Termogramas de reproducibilidad de pico del extracto puro.

89

Figura 34. Termograma réplica 1

Figura 35. Termograma réplica 2.

90



91

Anexo 6. Termogramas de estandarización del comprimido.

Figura 38. Termograma réplica 1 comprimido


92


Figura 41Termograma réplica 4 comprimido

93

Anexo 7. Termogramas de excipientes

Figura 42. Termograma Lactosa

Figura 43. Termograma almidón

94

Figura 44. Termograma estearato de magnesio

Figura 45. Termograma aerosil

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