terapia celular con cÉlulas de epitelio...
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TERAPIA CELULAR CON CÉLULAS DE EPITELIO
PIGMENTADO DE RETINA Y FOTORRECEPTORES
DIFERENCIADOS A PARTIR DE CÉLULAS MADRE
PLURIPOTENTES EN UN MODELO DE RATA CON
RETINOSIS PIGMENTARIA
Josep García Arumí
Hospital Universitari Vall d'Hebron
Anna M. Veiga Lluch
CMRB Centre Medicina Regenerativa de Barcelona
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1. Resumen del proyecto
Las degeneraciones de la retina que involucran los fotorreceptores son la principal
causa de ceguera y afectan a millones de personas. En particular, la retinosis
pigmentaria (RP) es la patología ocular hereditaria más prevalente en humanos, ya que
afecta a 1 de cada 4000 personas con 1,5 millones de afligidos.
La RP es una degeneración irreversible de la retina, específicamente de los
fotorreceptores bastones primarios que entran en apoptosis y deriva en alteraciones en
el epitelio pigmentado de la retina (EPR) y la glía de la retina. En general, es una
enfermedad progresiva con un descenso aparentemente exponencial en el área de
campo visual y en la amplitud del electrorretinograma. Muchos pacientes caen en un
patrón clásico de dificultades en la adaptación a la oscuridad y ceguera nocturna
durante la adolescencia, y pérdida del campo visual medio periférico en la edad adulta
joven. A medida que avanza la enfermedad, pierden la visión periférica, desarrollan
visión de túnel y finalmente pierden la visión central, por lo general alrededor de los 60
años.
Algunas de las aproximaciones para el tratamiento de la RP actualmente incluyen la
terapia génica, factores de crecimiento neurotróficos, agentes antiapoptóticos, terapia
con ribozima, RNAi y suplementos dietéticos. Sin embargo, la mayoría de estos
tratamientos solo son efectivos previniendo o enlenteciendo la progresión de la
distrofia, y son menos efectivos cuando la patología se encuentra en fases más
avanzadas. Una vez los fotorreceptores han degenerado, la sustitución o los
dispositivos prostéticos son las únicas opciones. En este sentido, la terapia basada en
células madre se está situando como una alternativa potencial.
El objetivo principal de este proyecto es la evaluación de una terapia celular
combinada con fotorreceptores y células de epitelio pigmentado de retina (EPR)
diferenciadas a partir de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) o células madre
embrionarias (hESC), utilizando un modelo de rata con retinosis pigmentaria (la rata
RCS). Se pretende evaluar la integración de estas células una vez trasplantadas en la
retina de la rata RCS, así como la posible mejora de la función visual en este modelo
animal.
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Durante el desarrollo del proyecto se ha pretendido abordar los siguientes objetivos
específicos:
- Diferenciación de hESC y hiPSC a fotorreceptores y células EPR
- Trasplante de las células diferenciadas en la retina del modelo de rata
- Evaluación de la integración del trasplante celular
- Evaluación del tiempo de supervivencia del trasplante celular
- Valoración de la función visual después del trasplante celular
- Valoración de la seguridad del procedimiento (formación de tumores)
Este proyecto se ha basado en el trabajo coordinado de dos centros altamente
cualificados y especializados para llevar a cabo cada una de las fases del proyecto: el
Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona (centro 1), concretamente en el Banco
de Líneas Celulares, liderado por la Dra. Anna Veiga Lluch, y el Vall d’Hebron Institut
de Recerca (centro 2), concretamente en el grupo de Oftalmología, dirigido por el Dr.
José García Arumí (IP del proyecto).
El diseño del proyecto se basa en 4 fases, 3 experimentales y 1 de análisis de datos
y presentación de los resultados:
Fase 1 (centro 1). Diferenciación a fotorreceptores y célula EPR a partir de dos líneas
celulares hiPSC y una línea hESC, utilizando dos protocolos diferentes a partir de
cultivo adherente o mediante cuerpos embrionarios. Evaluación de la morfología de los
dos tipos celulares durante todo el proceso de diferenciación celular y análisis de la
expresión de marcadores específicos del tipo celular.
Fase 2 (centro 2). Experimentos in vivo: trasplante de las células diferenciadas a EPR
y fotorreceptores en la retina de un modelo de rata con retinosis pigmentaria, la rata
Royal College of Surgeons (RCS). Este modelo es portador de una mutación en la
proteína MERTK que provoca una degeneración progresiva del EPR, la cual conduce
eventualmente tanto el EPR como las células fotorreceptoras a entrar en apoptosis.
Evaluación periódica mediante seguimiento in vivo del trasplante en la zona de
intervención mediante retinografía, angiografía fluoresceínica y estudio de la función
visual por electrorretinograma.
Fase 3 (centro 2). Estudios post mortem a diferentes tiempos de postintervención
(desde 1 mes hasta 1 año), evaluando la migración, integridad y funcionalidad de las
células trasplantadas. Análisis histológico e inmunohistoquímico para observar la
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localización del trasplante celular y evaluar la integridad estructural de la retina.
Estudio de la expresión de los marcadores específicos correspondientes a las células
trasplantadas y estudio de la supervivencia celular mediante marcadores de apoptosis.
Fase 4 (centros 1 y 2). Análisis de los datos obtenidos y presentación de los resultados
en congresos internacionales, así como la publicación de estos en revistas científicas.
2. Resultados
Durante la primera anualidad del proyecto, el centro 1 (Centro de Medicina
Regenerativa de Barcelona) puso a punto el protocolo de diferenciación de las células
EPR a partir de hESC e hiPSC. Se realizaron un total de 6 experimentos utilizando dos
líneas de células madre embrionarias, ES[6] y ES[4], y dos líneas de células madre de
pluripotencia inducida, FiPS-3F-1 y CBiPS-30-4F-5. Las muestras se analizaron para
inmunofluorescencia de los marcadores OCT4, Pax6, ZO-1, CHX10, OTX2, MITF y
bestrophin. Se extrajo ARN de las células al cabo de 1 y 2 semanas y se realizó RT-PCR
para los marcadores siguientes: BEST, CHX10, CRLBP, DKK-1, MERKT, KRT8, MITF,
NOG, OCT3/4, PAX, PEDF, RRH y Rx. Finalmente se consiguió establecer un protocolo
de diferenciación funcional, estable y reproducible para la obtención de células que
expresan marcadores específicos de epitelio pigmentado de retina (EPR) a partir de
hESCs y hiPSC.
Paralelamente, el centro 2 (Vall d’Hebron Institut de Recerca) estableció una colonia de
ratas RCS así como el método de trasplante mediante inyección subretiniana de las
células mencionadas en los ojos de las ratas. El centro 2 también optimizó alguno de
los procedimientos in vivo y post mortem necesarios para el estudio oftalmológico de la
viabilidad y eficiencia de la terapia celular.
Durante la segunda anualidad, el centro 1 consiguió establecer un protocolo óptimo
de diferenciación de hESC e hiPSC a células fotorreceptoras de la retina.
Paralelamente, el centro 2 amplificó la colonia de ratas RCS y realizó un estudio
exhaustivo del efecto del trasplante de células EPR en el modelo de degeneración de
retina. En el estudio se realizaron trasplantes con células derivadas a EPR en un total
de 71 animales (58 trasplantados y 13 controles). En el caso de los animales
trasplantados, se evaluó la integridad y el tiempo de supervivencia de los trasplantes,
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los efectos de los injertos celulares sobre la degeneración retiniana inherente al modelo
RCS, además de los efectos del tratamiento sobre la función visual de estos animales.
Tomando como tiempo cero el momento del trasplante, cada uno de los parámetros
estudiados se determinó a 5, 8 y 12 semanas. En este experimento se trasplantaron
con éxito las dos líneas celulares de EPR diferenciadas de hESC e hiPSC. El trasplante
de las dos líneas celulares derivadas a EPR se integró correctamente en el EPR
endógeno de la rata y se comprobó que ambos tipos celulares, endógeno y exógeno,
presentaban la capacidad de formar uniones fuertes entre ellos. Se evaluó la
supervivencia de las dos líneas celulares diferenciadas a EPR en el espacio subretiniano
del modelo de rata RCS a distintos puntos temporales a partir del momento del
trasplante y se determinó que los injertos sobreviven favorablemente al cabo de 5, 8 y
12 semanas después de la cirugía. El posible efecto en la restauración de los defectos
de la función visual del modelo de RP fue evaluado periódicamente mediante
electrorretinograma focal, comparando la respuesta eléctrica de las zonas de la retina
trasplantadas con las zonas de la misma retina y de ojos control sin trasplante celular.
La metodología de electrorretinograma focal se puso a punto durante esta etapa del
proyecto y permitió detectar una mejora de la función visual en zonas trasplantadas 5
y 8 semanas después del momento de la cirugía. La formación de tumores a partir de
injertos de células de EPR derivadas tanto de hESC como de hiPSC se estudió mediante
el seguimiento in vivo del fondo del ojo y a través de técnicas de inmunofluorescencia
detectando marcadores de proliferación celular como Ki67 al cabo tanto de 5 y 8
semanas como de 12 después del trasplante. No se detectó ninguna formación celular
con características proliferativas en ninguno de los puntos temporales estudiados.
Durante la tercera y última anualidad, el centro 1 siguió diferenciando hESC e hiPSC
a EPR y células fotorreceptoras de la retina siguiendo los protocolos optimizados
durante las anualidades anteriores. Las células obtenidas de EPR y fotorreceptores
fueron usadas por el centro 2 para realizar un experimento de comparativa de
cotrasplante de los dos tipos celulares frente al trasplante solo de EPR. Se realizó
cotrasplante en un total de 50 animales (100 ojos), trasplante únicamente con células
de EPR en un total de 16 animales (31 ojos), además de la inyección de 27 ojos con
medio de cultivo como control sin terapia. Se realizó el seguimiento in vivo de los tres
grupos de estudio de la misma manera que se hizo en el experimento anterior,
incluyendo electrorretinograma Ganzfeld. Siguiendo el mismo procedimiento que en
estudios posteriores, se eutanasiaron animales al cabo de 5, 8 y 12 semanas después
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del trasplante, se enuclearon los ojos y se usaron en estudios de histología y de
inmunofluorescencia que permitieron determinar el grado de integridad y el tiempo de
supervivencia de las células trasplantadas así como los posibles efectos de los injertos
celulares sobre la degeneración retiniana. Con este último experimento se concluyó
que las células derivadas a EPR y a precursores de fotorreceptores a partir de hiPSC e
hESC sobreviven en el espacio subretiniano de las ratas RCS una vez trasplantadas,
que la terapia celular combinada es más efectiva en la preservación de la degeneración
de los fotorreceptores huésped que la terapia celular única con EPR y, finalmente, que
los ojos que reciben la terapia celular combinada responden mejor a los estímulos
lumínicos que los ojos trasplantados con terapia celular única con EPR.
En conclusión, el desarrollo de este proyecto ha permitido establecer un método
eficiente y reproducible para diferenciar EPR y fotorreceptores a partir de dos fuentes
de células madre humanas: hESC e hiPSC. Además, se ha podido demostrar que la
combinación de EPR y fotorreceptores es una terapia ideal para realizar trasplantes, ya
que las células sobreviven en la retina huésped y enlentecen el proceso degenerativo
de este tejido.
No obstante, debido a que el proceso degenerativo de la retina en el modelo de rata
RCS es grave, los beneficios de esta terapia celular combinada solo se mantienen en el
tiempo hasta las 12 semanas postinyección. En este sentido, más estudios se hacen
necesarios para asegurar la integración y funcionalidad de las células humanas
precursoras de fotorreceptores en la retina huésped.
3. Relevancia y posibles implicaciones
La terapia celular combinada constituye una aproximación novedosa e idónea para el
tratamiento de degeneraciones retinianas. Con el reemplazo de fotorreceptores
degenerados por nuevos sanos así como la integración de células de EPR funcional que
ofrecen soporte a las anteriores, se consigue el enlentecimiento del proceso de pérdida
progresiva de visión. En comparación con las terapias celulares que utilizan
fotorreceptores o EPR por separado, la terapia celular combinada presenta una mayor
capacidad de retrasar el declive funcional de la retina.
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El impacto que un estudio preclínico de estas características supone en el desarrollo de
nuevas terapias para patologías degenerativas de la retina es de suma importancia, ya
que la investigación preclínica con células madre es un recurso versátil que se puede
aplicar no solo en la enfermedad de la retinosis pigmentaria, sino también en otras
neurodegeneraciones de la retina, como la degeneración macular asociada a la edad
(DMAE) o la retinopatía diabética.
En los últimos años se han desarrollado diversos estudios usando hiPSC e hESC para
generar células fotorreceptoras y EPR, y ser trasplantadas como posible tratamiento de
enfermedades degenerativas. En este proyecto hemos dado un paso más, combinando
fotorreceptores y EPR con el objetivo de conseguir una mejor reestructuración de la
retina dañada, ya que ambos tipos celulares son necesarios para la función visual. Los
resultados obtenidos en este proyecto ponen de relieve el valor de la terapia celular
combinada como estrategia clínica para personas que sufren degeneración de retina.
No obstante, la continuación de estos estudios se hace necesaria para conseguir una
caracterización molecular completa de las retinas trasplantadas para llegar a
comprender si los fotorreceptores trasplantados son capaces de intervenir en el
proceso de sinapsis necesario para activar la cascada visual y, por tanto, necesario
para restablecer la visión.
En conclusión, los resultados de este proyecto colocan la terapia celular combinada
más cerca de la implementación de un ensayo clínico, hecho que tendría un amplio
impacto social, ya que a día de hoy la retinosis pigmentaria no dispone de ninguna
cura.
4. Bibliografía científica generada
El trabajo de investigación realizado en este proyecto ha generado la publicación de un
artículo y la presentación de cuatro pósteres, tres en un congreso internacional de
oftalmología durante tres anualidades consecutivas y el cuarto en una sesión de debate
científico.
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• Artículo publicado en la revista Molecular Therapy Methods & Clinical
Development (Nature Publishing Group) en que se menciona La Marató de TV3
como una de las entidades financiadoras de esta investigación.
Título: Comparative study of human embryonic stem cells (hESC) and human induced
pluripotent stem cells (hiPSC) as a treatment for retinal dystrophies.
Autores: Riera M, Fontrodona L, Albert S, Ramírez DM, Seriola A, Salas A, Muñoz Y,
Ramos D, Villegas-Pérez MP, Zapata MA, Raya A, Ruberte J, Veiga A, García-Arumí J.
Revista: Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 2016 Mar 16;3:16010.
doi: 10.1038/mtm.2016.10.
• Póster presentado durante el año 2014 en el congreso internacional de
la Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO 2014,
“Leading Eye and Vision Research”, en que se menciona La Marató de TV3 como
una de les entidades financiadoras de esta investigación.
Título: Differentiation and transplantation of human ESC and iPSC-derived RPE cells
for the treatment of retinitis pigmentosa
Autores: Riera M1, Salas Torras A1, Seriola A2, Muñoz Y2, Zapata MA1, Veiga A2,
García-Arumí J1.
1. Oftalmología, Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR), Barcelona, España.
2. Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona, Barcelona, España.
• Póster presentado durante el año 2015 en el congreso internacional
ARVO 2015, “Powerful Connections: Vision Research and Online Networking”,
en que se menciona La Marató de TV3 como una de les entidades financiadoras de esta
investigación.
Título: Cell therapy with pluripotent stem cells differentiated to retinal pigment
epithelium and photoreceptor cells in a rat model of Retinitis Pigmentosa.
Autores: Fontrodona L1, Riera M1, Salas Torras A1, Seriola A2, Muñoz Y2, Mora Ramírez
D1, Zapata MA1, Veiga A2, García-Arumí J1.
1. Oftalmología, Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR), Barcelona, España.
2. Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona, Barcelona, España.
• Póster presentado durante el año 2016 en el congreso internacional
ARVO 2016, “Research: A Vision for Hope”, en que se menciona La Marató de TV3
como una de les entidades financiadoras de esta investigación.
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Título: Towards an improvement of the visual function preservation in RCS rats by
transplantation of human stem cell-derived RPE and photoreceptor precursor cells.
Autores: Fontrodona L1, Miquel L2, Muñoz Y2, Mora Ramírez D1, Salas Torras A1,
Ferreira-de-Souza B1, Riera M1, Veiga A2, García-Arumí J1.
1. Oftalmología, Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR), Barcelona, España.
2. Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona, Barcelona, España
• Póster presentado durante el año 2016 en la sesión B-Debate “Fighting
blindness”, organizada por BioCat, en el cual se menciona La Marató de TV3 como
una de las entidades financiadoras de esta investigación.
Título: Mixing RPE with photoreceptor precursor cells to cook an improved stem-cell
based therapy for retinal degenerative diseases.
Autores: Fontrodona L1, Miquel L2, Duarri A2, Muñoz Y2, Mora Ramírez D1, Ferreira-de-
Souza B1, Salas Torras A1, Veiga A2, García-Arumí J1.
1. Oftalmología, Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR), Barcelona, España.
2. Banco de Líneas Celulares, Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona (CMRB),
Barcelona, España.