BIOTEHNOLOGII NOTE DE CURSBiotehnologie provine din doi termeni bio deriva din grec. bios = viata tehnologia studiul al masinilor si uneltelor (termen utilizat inca de Plutarh si Cicero) Se pare ca notiunea a aparut pentru prima data in Danemarca in 1908 (unii autori considera ca a fost introdusa pentru prima data in 1919). Definitie Biotehnologia este o stiinta inginereasca, pluridisciplinara ce utilizeaza materia vie pentru degradarea, sinteza si producerea de materiale noi utilizate in activitatile umane. Foloseste microorganisme, enzime, structuri celulare si subcelulare, biocatalizatori, tehnici de inginerie genetica etc.

1 BIOTEHNOLOGIILE CLASICE nc din antichitate erau utilizate, n mod empiric, unele metode biotehnologice cum ar fi fermentaiile cu ajutorul microorganismelor, cunoscute cu cteva milenii nainte de era noastr. Babilonienii cunoateau, nc din mileniul VI .H., modul de preparare a berii precum i bioconversia alcoolului etilic n acid acetic (oet). Mai trziu, n mileniul III .H., sumerienii cunoteau tehnologia fabricrii a peste 20 de tipuri de bere. Descoperirile au demonstrat c majoritatea popoarelor antice utilizau drojdiile pentru fabricarea unor produse alimentare (pine, vin, bere etc) precum i bacteriile pentru obinerea derivatelor lactate. Progrese nsemnate sunt realizate ncepnd din secolul XVII cnd olandezul ANTON VAN LEEUWENHOEK (1632- 1723) a descoperit, n anul 1680, la microscopul ce l-a inventat, existena unei lumi microbiene, necunoscut pn atunci. La microscopul su cu putere de mrire de circa 300 de ori, a observat micile vieti pe care le-a numit animalcule, cu forme sferice, drepte sau spiralate, care triesc n apa de ru, decoctul de fn, saliv i mustul de bere. Cercetrile sale au fcut obiectul a 112 comunicri tiinifice, prezentate la Royal Society of London. n secolul XIX, savantul francez LOUIS PASTEUR (1822 - 1895) a demonstrat c n procesul de fermentaie alcoolic are loc transformarea glucidelor n alcool etilic, cu degajare de CO2, proces care furnizeaz energia necesar celulelor de drojdii ce se dezvolt chiar n absena O2. Concomitent extinde studiile asupra fermentaiilor butiric i lactic. n timpul primului rzboi mondial, WEIZMANN a descoperit fermentaia acetono- butanolic iar produii derivai i-a folosit la sinteza cauciucului sintetic (butadien) i a unui exploziv denumit cordi. Cercetrile biologului scoian ALEXANDER FLEMING, iniiate n anul 1929, au deschis era microbiologiei industriale moderne, prin elaborarea bazelor de obinere a penicilinei. A urmat descoperirea streptomicinei de ctre colectivul condus de WAKSMAN (1943) i al chloramphenicolului creat de SMITH i WORREL (1953). Pn n anul 1959 s-au elaborat peste 4000 de antibiotice, perfecionndu-se tehnicile i instrumentarul necesar n industria ffarmaceutic (bioreactoare automatizate). Ca rezultat al acestor descoperiri, la jumtatea anilor 60 a aprut, cu o mare for de dezvoltare, biologia industrial, capabil s produc o schimbare fundamental a tehnicilor de fabricare a unui numr mare de produse alimentare, farmaceutice i chimice. Folosind microorganisme specifice, implicate n diferite fermentaii anaerobe, s-au produs proteine alimentare i furajere, aminoacizi, aromatizani, acizi organici, ndulcitori alimentari, solveni organici, enzime, medicamente precum i noi surse energetice.

1

2 BIOTEHNOLOGIILE MODERNE n centrul ateniei specialitilor n biotehnologii st asigurarea necesarului de alimente pentru populaia globului, mai ales proteine i aminoacizi, producerea de medicamente pentru sntatea public, pentru profilaxia i tratamentul celor 300 de boli ereditare i a celor dou maladii grave ale sfritului de secol (cancerul i SIDA), combaterea efectelor nocive ale polurii mediului de via precum i obinerea de biocombustibili. 2.1 Scurt istoric al biotehnologiilor moderne Dup cel de al doilea rzboi mondial, n fruntea rilor care au iniiat dezvoltarea biotehnologiilor moderne a fost Japonia care, ca i alte ri asiatice, avea o foarte veche tradiie n domeniul producerii buturilor i a alimentelor fermentate, folosind ca materii prime orezul i soia. Pe baza unui imens volum de date experimentale de biochimie microbian, microbiologia industrial japonez a devenit rapid unul din principalele domenii ale cercetrilor tiinifice i tehnologice, mai ales dup anul 1953 cnd s-a creat Institutul de Microbilogie aplicat din Tokyo. Creterea preului petrolului, dup anul 1973, a stimulat industriile nipone s gseasc alte materii prime, n afara celor de natur petrochimic, pentru a pstra avansul tehnologic n unele sectoare prioritare. n aceste condiii, Japonia a trecut la industrializarea modern a fermentaiior microbiene, satisfcnd rapid necesarul intern i devenind exportatorul principal cu produse de fermentaie spre rile asiatice. Pn n anul 1980, Japonia a ajuns la o producie anual de 50 mil hl bere, 27 mil.hl sake, 12 mil.hl sos de soia i 3 mil hl oet. Dezvoltnd rapid ingineria genetic, orientat spre recombinare ADN din unele sue de microorganisme, cercettorii japonezi i ulterior americanii, au devenit, nc din anul 1957, posesorii primelor licene de fabricare a aminoacizilor eseniali ca: acid glutamic (1957), lizin (1957), treonin (1960), fenilalanin (1961), producnd, nc din anul 1980, peste 85.000 tone anual de aminoacizi proteici, precum i a licenelor de fabricare a vitaminei B12 (1959), a unor antibiotice, a interferonului, a primelor medicamente de lupt mpotriva cancerului i a multor produse alimentare, farmaceutice, cosmetice i chimice. Miracolul japonez n lansarea biotehnologiilor se datorete i investiiilor de zeci de miliarde de yeni anual, prin cele 70 de mari companii implicate. n prezent, microbiologia face parte din cultura cotidian i obligatorie a tuturor universitilor i ntreprinderilor japoneze. Aici exist peste 1.500 de specialiti cu doctorat n microbiologie. Biotehnologiile de producere a diferitelor substane utile s-au extins rapid i n alte ri dezvoltate sub spect industrial, respectiv S.U.A., rile vest-europene, China, fosta U.R.S.S. n S.U.A., activitatea uzinelor biotehnologice s-a concentrat, iniial, pe producerea siropului de fructoz prin fermentarea porumbului, realizndu-se anual peste 500.000 tone High Fructose Corn Syrup, cu multiple utilizri n industria alimentar i farmaceutic. Fructoza are o putere de ndulcire superioar zaharozei i glucozei, fiind unicul glucid acceptat n alimentaia diabeticilor. Alte programe naionale americane au urmrit obinerea, prin biotehnologii, a necesarului de medicamente, vaccinuri, acizi organici (citric, acetic, fumaric, lactic), a unor aminoacizi, a proteinelor macromoleculare i a drojdiilor de panificaie. Randamentele ridicate ale biotehnologiilor americane s-au datorat aplicrii n producie a rezultatelor celor 45 companii de inginerie genetic, orientate n direcia recombinrii acizilor nucleici din diferite specii vegetale i a celor circa 700 de societi specializate n biotehnologii (firmele Cetus- 1970, Genentech- 1976, Eli Lilly, Genex, Genencor, Biogen, Centocor, Immunex, Genzyme, Hybritech, Syntex etc). n fosta U.R.S.S. existau n anii 80 peste 100 de uzine biotehnologice dintre care 86 produceau proteine monocelulare pentru consum zootehnic iar celelalte produceau aminoacizi, hormoni, vitamine, antibiotice, enzime i lipide. Ca substrat nutritiv pentru microorganisme se foloseau, cu precdere, deeuri cu origine forestier, agricol i industrial. n Europa de Vest programele naionale de investiii au stimulat apariia unor mari uzine biotehnologice la Braunschweig (Germania), Cambridge, Mill Hill, Porton Down, Slough (Anglia), Delft (Olanda), Strasbourg, Compigne, Toulouse, Rhne- Poulenc (Frana), Pavia (Italia) etc.2

n uzinele biotehnologice, bazate pe tehnici moderne de microbiologie industrial, se folosesc bioreactoare speciale cu factori dirijai, cu capaciti ntre 10.000-250.000 litri (cele mai frecvente de 20.000 litri). Prin perfecionarea tehnicii de cultivare s-a ajuns la un flux continuu n care se menin constante condiiile de via microbian (temperatur, pH, oxigenare, nutriie mineral i organic), folosind un sistem modern de programare pe computere. Coordonarea activitii uzinelor biotehnologice i elaborarea programelor naionale de investiii intr n atribuiile societilor specializate care devin, treptat, prioriti locale i naionale, asigurnd legturi indispensabile ntre biotiine i bioindustrii precum i transferul de tehnologii ultramoderne. Dac n anul 1983 existau, pe plan mondial, 450 societi de biotehnologie, n urmtorii 10 ani s-a ajuns la 1.700 societi n S.U.A., Europa i Asia. O activitate intens desfoar cele peste 60 societi biotehnologice din Frana: Immunotech, Genset, Transgne- Mrieux, Calliope, Zymogenetics, Germe, Coletica, Gist- Brocades, Bio- Europe etc . Bilanul activitii acestor societi i uzine specializate a fost prezentat la cel de al VII-lea Congres European de Biotehnologie, inut la Nisa n februarie 1995, la care au participat 70 de societi naionale, inclusiv din Romnia. Evaluarea produselor tehnologice obinute pe plan mondial la nivelul anului 1990 totaliza cifra de 250 miliarde de dolari din care: 50 miliarde din producerea de etanol, 42,8 miliarde dolari din produse agroalimentare provenite din porumb, 40,7 miliarde de dolari din antibiotice, 21,3 miliarde dolari din vaccinuri, 7,5 miliarde dolari din aminoacizi, 6,1 miliarde dolari din hormoni, 4,6 miliarde de dolari din acizi organici etc . Extinderea biotehnologiilor n toate rile dezvoltate i slab dezvoltate, ar putea conduce nu numai la rezolvarea unor probleme economice locale ci i la modificri radicale n structura industriilor alimentare, chimice i farmaceutice, cu efecte benefice imediate, pe plan naional i mondial. Alegerea profilului de activitate pentru fiecare uzin biotehnologic, din diferite sau macrozone populate, merit o atenie deosebit, urmrindu-se ca grefarea sistemelor tehnologice s corespund cu situaiile economice i sociale ale populaiilor respective. Astfel, crearea de cicluri scurte de producere a proteinelor monocelulare prin biotehnologii poate prezenta avantaje foarte mari n rezolvarea problemei alimentaiei umane, n dezvoltarea sectorului zootehnic, protecia solului, reducerea ritmului de despdurire i valorificarea eficient a forei de munc rmas disponibil. Ca o imagine retrospectiv a evoluiei biotehnologiilor clasice i moderne se poate sublinia c prima revoluie biotehnologic lansat prin lucrrile savantului LOUIS PASTEUR, a asigurat difuzarea vaccinurilor i a primelor antibiotice, avnd ca efect imediat salvarea multor viei omeneti. Cea de a doua revoluie biotehnologic, declanat de colile microbiologice japoneze i americane, n ultimele 3 decenii, a nceput s-i fac simit contribuia benefic n asigurarea alimentaiei i a dreptului la via a sute de milioane de oameni, mai ales a copiilor din lumea a III- a, care pier anual din cauza subnutriiei cronice. Progresele imense nregistrate n microbiologia mondial, dup cel de al doilea rzboi mondial, l-au determinat pe ilustrul genetician FRANOIS JACOB, laureat al Premiului Nobel, s scrie: n civa ani, omul a avut surpriza s constate c, fr microorganisme, aceast lume n-ar fi fost ceea ce este n prezent.

2.2. BIOTEHNOLOGIILE PENTRU ASIGURAREA SNTII Pentru sectorul de sntate uman i animalier, cercetrile de biotehnologie aplicativ vizeaz trei cmpuri de activitate: producerea de molecule cu efecte terapeutice, producerea de vaccinuri i elaborarea unor metode mai eficiente de diagnosticare a bolilor. Asociaia fabricanilor de produse farmaceutice din Frana nregistra noi creaii pe cale biotehnologic (exceptnd antibioticele): - hormoni de cretere 12 - interferoni 13 - interleucine 14 - anticorpi monoclonali 41 - vaccinuri 15

3

2.3. PRODUCEREA DE ANTIBIOTICE Antibioticele sunt substane produse de diferite microorganisme care au capacitatea de a inhiba sau distruge alte microorganisme, unele implicate n declanarea anumitor maladii infecioase. Istoricul producerii de antibiotice coboar nc n antichitate. Pe un papirus rmas din timpul celei de a 11- a dinastie egiptean (n urm cu 4.000 de ani), se descrie utilizarea unor ciuperci i mucegaiuri care creteau pe suprafaa iazurilor i erau utilizate n tratamentul rnilor deschise i infectate. Tot pentru vindecarea rnilor i a furunculelor, grecii i chinezii din antichitate foloseau sucul de soia i lutul fierbinte. Venind din vremuri mai apropiate, doctorul MOSSE (1852) propunea tratamentul furunculozelor epidemice cu drojdie de bere (Saccharomyces cerevisiae) (o linguri de 3 ori pe zi), care asigur o vindecare fr recidive. Baza teoretic a producerii antibioticelor a fost prezentat de savantul romn VICTOR BABE, n anul 1885, care scria c unele microorganisme pot produce substane chimice capabile s inhibe dezvoltarea altora iar o boal cauzat de unele bacterii va putea fi tratat cu ajutorul altor bacterii. La scurt timp dup formularea teoretic a lui BABE apare descoperirea, din anul 1888, cnd CHARDIN i GUIGNARD au demonstrat c bacteria Pseudomonas pyocyanea produce un pigment solubil care este toxic pentru bacteria Bacillus anthracis, fr a cauza hemoliza globulelor roii din sngele organismului gazd. Tot n acel timp, VUILLEMIN propune termenul de antibioz (contrar simbiozei) care st la baza aciunii antibioticelor ce vor fi descoperite ulterior. Dup unele experimentri cu rezultate contradictorii (SCHAPIRO- 1908, PORTER- 1924 la actinomicete, PRAT i BOYLE la mucegaiuri), apare marea descoperire a scoianului ALEXANDER FLEMING (1929) care demonstra c o cultur de stafilococ auriu a fost distrus prin suprainfectarea cu mucegaiul Penicillium rubrum (notatum). Era antibioticelor a fost inaugurat prin comunicarea despre penicilin prezentat de FLEMING la Medical Research Club, n ziua de 13 februarie 1929. Comunicarea a fost primit de bacteriologi cu mult rceal i zmbete de bunvoin. Ulterior, o serie de cercettori s-au ocupat de perfecionarea peniciline (LOVELL, RAISTRICK, CLUTERBRUCK). Obiectivul acestei munci a fost finalizat abia n anul 1939 cnd australianul FLOREZ i germanul CHAIN au reuit purificarea penicilinei, n stare cristalizat, folosind procedeul liofilizrii. Prin infectarea animalelor de experien cu stafilococi, streptococi i Clostridium, ei au reuit distrugerea acestora prin tratamente cu penicilin pur. Pentru aceast extraordinar realizare, FLEMING, FLOREY i CHAIN au primit premiul Nobel pentru medicin, n anul 1945. Din aproape 5.500 de antibiotice cunoscute n prezent, circa 1.000 de tipuri sunt produse de 6 genuri de ciuperci filamentoase, dintre care cele mai importante sunt Penicillium, Streptomyces i Cephalosporium. Peste 500 de forme sunt sintetizate de dou tipuri de bacterii nefilamentoase, iar 3.000 de forme sunt produse de 3 genuri de actinomicete. Aceste specii de microorganisme sunt mai eficiente n cazul suelor ameliorate prin mutaii, recombinri de ADN i, eventual, prin inginerie genetic. Antibioticele au cptat o foarte larg utilizare medical, cu extindere rapid n ultima jumtate de secol, cele mai mult comercializate fiind penicilinele (produse de mucegaiul Penicillium chrysogenum), cefalosporinele (produse de mucegaiul Cephalosporium acremonium), streptomicinele i tetraciclinele (produse de bacteriile din genul Streptomyces) la care se adaug, n cantiti mai reduse, anthracidinele, aureomicinele, canamicinele i neomicinele. 2.4. PRODUCEREA DE HORMONI a. Insulina. Este hormonul a crui absen din organismul uman provoac diabetul, boal rspndit pe glob la peste 60 milioane de locuitori. Pentru corectarea acestei insuficiene hormonale, insulina a fost extras, iniial, din pancreasul de cine (n 1921) i experimentat, n 1922, la un biat de 9 ani, cu rezultate spectaculoase. Din anul 1923 firma american Eli Lilly a produs insulina pe cale industrial, prin extragerea din pancreasul de bovine i porc, cu un randament de 100g insulin cristalizat la 100 kg pancreas (0,01 %) Perfecionri aduse tehnicilor de preparare au permis obinerea unor produse cristalizate cu aciune lent i ultralent, fiind absorbite n 48 de ore. Aceast insulin, extras din bovine i porcine, provoac unele efecte secundare iar unii diabetici fac intoleran la hormonul animal: pentru aceasta a fost necesar purificarea insulinei animale pn la calitatea celei umane, procedeu realizat de firma4

danez Novo Industrie (1981) prin substituirea aminoacidului alanina cu treonin, pe cale enzimatic i separare cromatografic. Ca structur chimic s-a constatat c insulina are dou catene polipeptidice (A i B), lungi de 21 i 30 de aminoacizi. Sinteza celor dou gene implicate n producerea catenelor polipeptidice a fost realizat la universitatea din California (n 1979), prin includerea genei mutante ntr-o plasmid, cu rol de vector i transferul n bacteria Escherichia coli care produce circa 100.000 molecule de insulin la o celul bacterian. Pe aceast cale microbiologic, firma Eli Lilly a dezvoltat, n anul 1977, sistemul industrial de producere a proinsulinei i insulinei identice cu cea uman, fr a provoca eventuale efecte secundare (tulburri renale i oculare). La Centrul de microbiologie aplicat din Porton Down (Anglia), folosind un bioreactor de 1.000 litri mediu de cultur, s-au obinut 200 g insulin, echivalentul al cantitii extrase din 1.600 kg pancreas de bovine sau porcine: Insulina produs prin aceast tehnic de inginerie genetic poart denumirea de humulin, nlocuind pe cea extras din organismele animale. b. Somatostatina. Este un hormon produs n organismul uman de gland hipotalamus, situat la baza creierului, avnd rol n eliberarea insulinei i a unor hormoni de cretere. Pentru suplinirea carenei organismului n somatostatin, ncepnd din anul 1977, a fost sintetizat hormonul respectiv cu ajutorul bacteriilor recombinate genetic. Gena somatostatinei, sintetizat artificial de ITAKURA (California), este alctuit din 52 de nucleotide, avnd la baz 14 aminoacizi. Aceast gen a fost introdus ntr-o plasmid i transferat n bacteria Escherichia coli care poate sintetiza circa 10.000 molecule de somatostatin la o celul bacterian. Este posibil sinteza a 1 mg hormon la 1 litru de cultur bacterian, cantitate ce s-ar extrage din 5 milioane creiere de oaie. Firma Genentech din San Francisco (S.U.A.) a obinut un randament care poate ajunge la 3% somatostatin. c. Somatotropina. Este hormonul uman de cretere (HCU), secretat de celulele lobului anterior al hipofazei, ntr-o cantitate foarte redus (4-6 mg/ hipofiz). n absena sa se provoac nanismul hipofizar (piticirea), frecvent n lume la 7-10 persoane dintr-un milion de indivizi. Administrarea de somatotropin prin injecii intramusculare n doze de 10 mg/ kg corp/ an, fracionate n cte 3 injecii pe sptmn, ar asigura un ritm normal de cretere a copiilor suferinzi de piticire. Condiia reuitei tratamentului este nceperea la vrsta de 4-5 ani, cu continuare pn la sfritul pubertii i chiar dup aceasta. Extragerea i purufucarea somatotropinei umane (HCU) a fost realizat de ROSS i colab. (1963) din hipofiza cadavrelor, cu un randament foarte redus (4-5 mg hormon dintr-o hipofiz uman). Societatea de inginerie genetic Genentech (S.U.A.) a reuit sinteza chimic a genei care determin formarea acestui hormon, respectiv o protein complex alctuit dintr-o secven de 191 aminoacizi. Dup clonare n celula bacterian de Escherichia coli, a rezultat o su selecionat (K12) care poate produce circa 100.000 de molecule de somatotropin la o celul bacterian. Acest hormon de cretere, obinut prin inginerie genetic, este pur din punct de vedere chimic, foarte omogen, liber de viroze i cu o metionin n plus fa de hormonul uman. Firma Kabi Vitrum din Suedia a preluat sua american K-12 i a produs hormonul pe cale industrial astfel c 1 litru de cultur bacterian s realizeze, n 7 ore, o cantitate de hormon egal cu cea extras din 60 hipofize umane i la un pre de cost mai redus de 3 ori. Hormonul obinut prin biotehnologie poate fi folosit la stimularea creterii, att la oameni ct i la animale domestice. d. Interferonul. A fost descoperit de ISAACS i LINDENMANN (1957), n Anglia, sub forma unei proteine globular, produs de leucocitele din celula animal sau uman, avnd rol de aprare antiviral i antitumoral, atunci cnd un virus ptrunde n organism. Interferonul endogen, ct i cel administrat prin injecii, stimuleaz sistemul imunitar, nhib nmulirea celulelor anormale i combate bolile de origine viral (grip, hepatit, zona Zoster). ntruct producerea interferonului prin extracii din celule sanguine i fibroblaste este foarte scump i laborioas, W. GILBERT (1980) din Boston (S.U.A.) a ncercat procedeul de sintez a secvenelor de ADN corespunztoare unor gene modificate, pe care le-a inclus ntr-o plasmid i le-a transferat n celulele bacteriene de Escherichia coli. Ulterior, n anul 1981, cercettori de la universitatea Seattle-Washington, n colaborare cu firma Genentech din California, au reuit s transfere genele interferonului leucocitar n celulele drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae) cu genom modificat. Randamentul a devenit destul de mare n sensul c la 1 litru de mediu nutritiv de celule de levuri s-au produs 25.000 de uniti de interferon.5

n prezent, interferonul leucocitar i fibroblastic se produce la un pre de cost destul de redus, n urma reuitei de transfer a genelor n celulele bacteriene de Escherichia coli i Methylophilus methylotrophus. Purificarea i testele chimice i farmacologice s-au fcut n uniti de profil din S.U.A., Japonia, Anglia, Frana, Suedia i Israel, urmrindu-se efectele n combaterea cancerului, prin aprarea limfocitelor capabile s distrug celulele canceroase. De asemenea s-a testat, cu bune rezultate, eficacitatea n tratarea altor boli cum ar fi keratita herpetic, papilomul laringian, scleroza n plci, guturaiul, gripa, hepatita i zona Zoster. Mai recent, firma internaional de biotehnologie Biogen din S.U.A. a reuit s perfecioneze o tehnologie prin care se produce o cantitate de interferon de 1.000 de ori mai mare dect cantitatea obinut prin prelucrarea aceluiai volum de snge uman, produsul fiind utilizat, cu mare succes, i n combaterea hepatitei (B, C) e. Cortizonul- Este un hormon steroidic cu o eficacitate foarte ridicat n tratamentul reumatismului articular. Sinteza chimic a cortizonului se realizeaz n 37 de etape. Folosind calea biotehnologiilor, prin nmuliea ciupercii Rhizopus arhizus care hidrolizeaz progesteronul, sinteza cortizonului s-a redus la numai 11 etape, cu un pre de cost mai redus de 400 de ori. f. Hormonii sexuali. Numeroase microorganisme eucariote conin molecule de tip hormonal care joac un mare rol n manifestrile sexualitii, unele dintre ele fiind de natur steroid. O mare parte dintre hormonii sexuali sunt sintetizai prin metabolismul bacterian dar, n majoritatea cazurilor, aciunea microbian const dintr-o simpl bioconversie a unui compus natural sau obinut printr-o sintez chimic. Sterozii sexuali, cu aplicaii n chimia farmaceutic, sunt transformai (bioconvertii) prin procese de oxidare, reducere, hidroliz, condensare i izomerizare. Reaciile de oxidare sunt de 4 tipuri: hidroxilarea, dehidroxilarea, n oxidarea gruprilor hidroxil i degradarea oxidativ a catenelor laterale, n urma crora se obin corticosteron, hidroxiprogesteron, homoprogesteron, hidrocortizon etc. La aceste reacii particip, dup caz, microorganisme din genurile Aspergillus, Curvularia, Fusarium, Flavobacterium, Glomerella, Mycobacterium, Pellicularia i Rhizopus. Reaciile de reducere se realizeaz prin hidrogenarea la nivelul gruprilor cetonice sub aciunea microorganismelor din speciile Rhodotorula glutinis i Kloeckera jensenii, implicate n sinteza unor prostaglandine (sulprostone). Reaciile hidrolitice au aciune asupra esterilor, cu eliberarea gruprii OH din steroid sau asupra eterilor, cu transformarea saponinelor, n prezena mucegaiului Penicillium chrysogenum, activnd compuii cu proprieti terapeutice. 2.5. BIOSINTEZA VITAMINELOR nc din anul 1906, HOPKINS a stabilit c n alimentaia animalelor sunt absolut necesari factori accesorii care se gsesc n drojdia de bere. Ulterior, CAZIMIR FUNK (1912) a izolat din drojdie acidul nicotinic i a dat denumirea de vitamine pentru acest grup de substane. Majoritatea microorganismelor sunt capabile s sintetizeze toate vitaminele sau provitaminele de care au nevoie, uneori n cantiti mult superioare fa de necesarul propriu, pentru procesele de cretere. Astfel bacteria Ashbya gossypii, cultivat pe un mediu mbogit n lipide, sintetizeaz de 20.000 de ori mai mult riboflavin (vitamina B2) fa de necesarul propriu, iar bacteria Pseudomonas denitrificans produce de 50.000 de ori mai mult cianocobalamin (vitamina B12) dect i este necesar. De altfel, vitamina B12 are ca surs unic biosinteza microbian. De asemenea, betacarotenul, precursorul vitaminei A, este sintetizat, n cantiti foarte mari, pe cale biotehnologic. n corpul microorganismelor s-a constatat prezena provitaminelor A, C i D precum i a vitaminelor B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B5 (acidul pantotenic), B12 (cianocobalamina), C (acidul ascorbic), F (acidul folic), H (biotina), K (acidul para-aminobenzoic), PP (nicotinamida). Vitamina B1 (tiamina, aneurina) este sintetizat de drojdii (mai ales Endomyces vernalis) i de mucegaiuri din genul Aspergillus. Se pare c levurile au i capacitatea de a concentra vitamina B1 dispersat n mediul de cultur. Este indicat n numeroase afeciuni maladive, gastro-intestinale, renale, hepatice, diabetice, alcoolism, psihopatii, stri de nervozitate, hipertiroidie, pelagr, precum i dup tratamente prelungite cu sulfamide i antiobitice. Tiamina este cunoscut i sub denumirea de vitamina performanei intelectuale deoarece are efecte pozitive asupra activitii sistemului nervos, asigurnd creterea randamentului intelectual.6

Vitamina B2 (riboflavina). Este sintetizat de numeroase microorganisme: bacterii (Aerobacter, Azobacter, Mycobacterium i, mai ales, Clostridium la care riboflavina este un subprodus al fermentaiei acetono-butilice), levuri (mai ales Candida floreri i Mycocandida riboflavina) i mucegaiuri. S-a constatat c cele mai bune productoare de riboflavin sunt mucegaiurile (Ashbya gossypii i Eremothecium ashbyii) cnd sunt cultivate ntr-un mediu agitat, suplimentat cu lipide i la temperatura de 300C, metaboliznd riboza i un compus triciclic flavinic. Dup 5 zile se obin cantiti de riboflavin care ajung la 5.000- 6.000 uniti / ml mediu de cultur i se izoleaz prin cristalizare. Conform recomandrilor O.M.S., necesarul mediu de vitamin B2 este de 0,6 mg la 1000 kcal i este indicat n numeroase afeciuni maladive ca: stomatite, dermatite, conjuctivite, cataracte, keratoze, psoriazis etc. Riboflavina are rol determinant n fixarea fierului la nivelul hemoglobinei, n sinteza proteinelor precum i n degradarea lipidelor i glucidelor. mbuntete vederea prin mrimea sensibilitii retinei i contribuie la dezvoltarea fizic a organismului. Vitamina B5 (acidul pantotenic). Este produs prin cultur de Sporobolomyces holsaticus ca urmare a condensrii beta-alaninei i a acidului pantoic, care deriv din valin. Prin cuplri fosforilate cu riboza i adenina intr n structura coenzimei A, produs de diferite bacterii. Acidul pantotenic are rol n catabolismul glucidelor i lipidelor, cu eliberarea energiei necesare proceselor fiziologice i n desfurarea multor reacii enzimatice. Favorizeaz meninerea structurii normale a pielii i stimuleaz creterea i pigmentarea prului. Vitamina B12 (cianocobolamina). Este cel mai eficient factor de prevenire i combatere a anemiei pernicioase. Are un ciclu pseudoporfirinic, legat de un atom de cobalt. Este produs intracelular de microorganisme din genul Streptomyces i din speciile Bacillus megaterium i Propionibacterium freundenreichii, ncepnd din anul 1949. Vitamina B12 a fost izolat prima dat din ficat de ctre FOLKERS i SMITH (1948) (din o ton de ficat au rezultat numai 28 mg vitamin B12). Cea mai important surs de vitamin B12 este microflora din intestinul rumegtoarelor sau din cecul i colonul erbivorelor nerumegtoare. Producerea pe cale fermentativ a fost realizat, pentru prima dat, de STOKSTAND (1948) prin cultivarea bacteriei Flavobacterium solare. Ulterior, cercetrile au progresat rapid obinndu-se culturi de Propionibacterium shermanii, P.freundenreichii etc. care sintetizeaz cantiti mari de vitamin. Mediul nutritiv este format din glucoz, extract de drojdie, hidrolizat de casein, sruri de cobalt etc. Necesarul uman de vitamin B12 , recomandat de O.M.S., este de 2g/ zi. Este cunoscut i sub denumirea de vitamina roie deoarece favorizeaz formarea i regenerarea globulelor roii (hematii), prevenind anemia. Intensific procesul de cretere n greutate a copiilor, mrind pofta de mncare. Menine funcionalitatea normal a sistemului nervos, scade iritabilitatea, mbuntete capacitatea de concentrare i memorare la copii, cu pstrarea echilibrului psihic. Vitamina exercit o aciune de detoxifiere a ficatului, bazat pe capacitatea de activare a enzimelor tiolofore. Are i efecte lipotrofe, prin intensificarea biosintezei colinei. Vitamina C (acidul L-ascorbic, vitamina antiscorbutic) a fost descoperit de A. SZENTGYRGYI, n anul 1927, la nivelul cortexului glandelor suprarenale, iar biochimitii americani KING i WANGH (1932) au gsit vitamina C n sucul citricelor. Acidul ascorbic este obinut pe cale industrial prin oxidarea substratului nutritiv cu ajutorul bacteriei Acetobacter suboxidans. D- glucoza din substrat este transformat, prin reducere electrolitic, n D-sorbitol care se oxideaz, pe cale microbian, n L-sorboz. Urmeaz tratarea cu acton i formarea complexului diaceton- L- sorboz care este oxidat n acid 2-cetogluconic i apoi transformat, prin fenolizare, n acid ascorbic. Un alt procedeu de sintez a vitaminei C are la baz oxidarea, pe cale bacterian, a D- glucozei n acid 5- ceto- D- gluconic, urmat de o alt oxidare a acidului L- idonic n acid 1,2- ceto- gulonic. n aceste reacii intervin mai multe specii din genurile Acetobacter, Aerobacter i Pseudomonas. Rolul fiziologic al vitaminei C este multilateral, cuprinznd majoritatea proceselor metabolice eseniale care au loc la nivelul organismelor. Este implicat n procesele de biosintez a ADN, respectiv n biosinteza substanelor proteice din esuturile de cretere. Acidul ascorbic acioneaz ca transportor de hidrogen la nivel intracelular. Vitamina C stimuleaz sistemul imunitar i mrete rezistena organismului la bolile infecto-contagioase i fa de substanele cancerigene. Accelereaz vindecarea rnilor, regenerarea esuturilor, a cartilagiilor i a oaselor. Faciliteaz absorbia fierului i stimuleaz maturarea hematiilor.7

Sucul de lmie, proaspt recoltat, servete la oprirea hemoragiilor scorbutice (scorbutul), deoarece coninutul n acid ascorbic i bioflavonoide micoreaz permiabilitatea i mresc rezistena capilarelor sanguine. Vitamina D (calciferol-vitamina antirahitic). Este constituit din substane care provin prin iradierea microsterolilor (ergosterol, zimosterol, escosterol etc). Cel mai cunoscut este ergosterolul care a fost izolat, prima dat, din Claviceps purpurea i ulterior din miceliile unor mucegaiuri ca Penicillium, Fusarium i Aspergillus. La o cultur de Aspergillus fischerii, pe un mediu nutritiv cu 10% glucoz, se obine 1,1% ergosterol, n condiiile unui raport optim C/N de 20/ 4. Pe cale biotehnologic, ergosterolul se obine prin culturi de drojdii sau micelii de Aspergillus niger i Penicillium notatum. Urmeaz operaia de transformare a ergosterolului n vitamina D prin iradiere cu lmpi de mercur sau cu srm incadescent de magneziu. Are rol esenial n fixarea calciului i fosforului cu implicaii directe n formarea sistemului osos i a dentiiei, prevenind rahitismul la copii, osteoporoza i cariile severe. Ajut la tratarea rcelilor i a conjuctivitelor. Vitamina H (biotina) este sintetizat, pe cale microbiologic, n prezena unor microorganisme ca: Phycomyces blakesleana, Torulopsis utilis, Hansenula anomala i Aspergillus niger. Se prezint sub trei forme: bios I (mezoinozitol), bios II- A (acid pantotenic) i bios II- B (biotina). Din mediu de cultur, separarea se face prin filtrare i absorbie pe norit. Biotina este component a unor enzime implicate n metabolismul proteic, lipidic i glucidic. Amelioreaz durerile musculare dup oboseal excesiv i contribuie la meninerea integritii pielii. mpiedic ncrunirea prului i previne alopecia (chelia). Vitamina K (acidul para-aminobenzoic). Deriv din menadion, prin cultura algei Chlorella sau a anumitor specii din genul Bacillus. n organismul uman contribuie la metabolismul fierului i la formarea hematiilor, prevenind sngerrile i hemoragiile interne prin coagularea rapid a sngelui. Vitamina PP (nicotinamida). Nu este realizat prin culturi de microorganisme ci este sintetizat numai n plantele superioare. n schimb, niacina, o form dezaminat a vitaminei PP, poate fi obinut prin culturi de bacterii din genul Corynebacterium. Are rol n prevenirea pelagrei i a dermatitelor severe, intensific circulaia sangvin, reduce tensiunea arterial i atenueaz tulburrile gastrointestinale, meninnd starea de sntate a aparatului digestiv, a creierului i a sistemului nervos. Este o vitamin esenial n sinteza hormonilor sexuali (estrogeni, progesteron, testosteron), a cortizonului i insulinei. Provitamina A (carotenul). Este un pigment carotenoidic de natur terpenic, sintetizat din izopentil- pirofosfat. Se gsete n anumite alge, n Mucoraceae i n mucegaiul Choanephora. Betacarotenul protejeaz mucoasa nazal, bucal, faringian, laringian, traheal i pulmonar, constituind un bun remediu n tratamentul infeciilor respiratorii i emfizemului pulmonar. Are rol profilactic n bolile maligne (cancer gastric i esofagian, cancer de prostat), transformnd metaboliii cancerigeni n substane mai solubile i mai puin nocive. Vitamina A contribuie la profilaxia tulburrilor de vedere, este un factor n meninerea sntii pielii, prului, danturii i gingiilor. Totodat stimuleaz activitatea sistemului imunitar i previne pigmentrile cauzate de bolile ficatului sau de btrnee. Tot prin culturi microbiene pot fi produse: vitamina B6 (piridoxina), vitamina F (acidul folic) i acidul lipoic, fr a prezenta o mare importan pentru producia industrial i farmacologic. Biosinteza multor vitamine pe cale biotehnologic poate fi realizat prin anumite intervenii genetice (mutaii) sau prin reglarea proceselor metabolice din celulele diferitelor microorganisme. 2.6. PRODUCEREA DE VACCINURI SI SUBSTANTE IMUNOGENE Primul vaccin a fost obtinut de Louis Pasteur a salvat un copil muscat de un caine turbat. In trei ani, a tratat 5374 persoane (sub 1% mortalitate) Ulterior s-au elaborat vaccinuri pentru diferite maladii: - Hepatita B, rujeola, turbarea, poliomelita, holera, lepra, malaria, pseudopesta aviara, pseudoturbarea, pesta porcina, leucemia felina etc.

8

3. Biotehnologiile n agricultura modern Intr-o lume n care creterea populaiei este accelerat (se preconizeaz c pn n anul 2050 populaia globului va numra aproximativ 10 miliarde de locuitori), iar producia agricol crete ntrun ritm mai lent este necesar gsirea unor soluii moderne prin care agricultura s asigure cantiti suficiente de hran, cu o calitate corespunztoare. Agricultura tradiional se confrunt n prezent cu o serie de limitri extrem de serioase: - limitri ce in de pia: n condiiile globalizrii, regulile unei piee libere ngrdesc politicile locale de preuri, acestea fiind dictate de tendinele i politicile internaionale - resursele naturale devin, din ce n ce mai mult, factori limitativi ai dezvoltrii agriculturii tradiionale datorit modificrilor climatice, a industrializrii i urbanizrii care determin deteriorri ale solului, apei i a calitii aerului. - resursele biologice (genetice) sunt, n mod inevitabil, limitate. Astfel, dei considerat la nceput foarte eficient, obinerea i eliberarea n mediu a plantelor ameliorate prin metode tradiionale a devenit extrem de nceat, nu fac fa cerinelor, iar numrul de nsuiri naturale care pot fi mbuntite prin aceste metode este foarte mic. Specialitii consider c pentru depirea acestor probleme, pe lng mbuntirea continu a practicii agricole, exist dou soluii: gsirea unor surse alternative de hran (de exemplu, valorificarea resurselor marine) sau ameliorarea plantelor prin metode biotehnologice (Altman, 1999).

Evoluia populatiei planetei (estimativ):

Acum 240.000 ani 10.000 locuitori 4000 Hr. - 30 milioane 1 dHr. - 210 milioane 1900 1.650 milioane 2008 6.7 md. 2011 7 md. 2050 10 md.Tendinta de evolutie a populatiei modiale (04.07.2010, http://www.xist.org/earth/population1.aspx)rank country area sq.km. population (all estimates) 2010-07-01 yearly growth yesterday daily increase today

World 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. China India USA Indonesia Brazil Pakistan Bangladesh Nigeria Russia Japan Mexico Philippines

510,072,000 9,596,960 3,287,590 9,826,630 1,919,440 8,511,965 803,940 144,000 923,768 17,075,200 377,835 1,972,550 300,000

6,830,586,985 1.13% 1,330,141,295 0.49% 1,173,108,018 1.38% 310,232,863 242,968,342 201,103,330 177,276,594 158,065,841 152,217,341 139,390,205 126,804,433 112,468,855 99,900,177 0.97% 1.10% 1.17% 1.51% 1.27% 1.97% -0.47% -0.24% 1.12% 1.93%

6,925,112,952 211,467 1,338,123,236 17,857 1,192,933,865 44,353 313,918,174 246,241,425 203,984,838 180,554,851 160,524,263 155,889,699 138,587,890 126,431,732 114,011,496 102,261,407 8,245 7,322 6,446 7,334 5,500 8,216 -1,795 -834 3,451 5,282

6,925,324,419 1,338,141,093 1,192,978,218 313,926,419 246,248,747 203,991,284 180,562,185 160,529,763 155,897,915 138,586,095 126,430,898 114,014,947 102,266,689

53.

Romania

237,500

22181,287 -0.16%

22,137,824

-97

22,137,727

9

Cresterea populaiei pe continente pn n 2020

.Former Soviet Union 0%

Europe 0% North America 5% Africa 35% South America 8% Asia 51%

Benefits of biotechnology More food

Declinul cresterii productiei agricole3Percentage per year

19671982 19821994 19952020

2

1

0

Developing countries

World

Developed countries

10

Consumul de calorii in lume (2001 - 2003)

11

4. Biotehnologiile n agricultura modern Prima revolutie verde, initiata dupa cel de al doilea razboi mondial de Norman Borlaug pentru a incerca sa rezolve o parte din probleme grave ale nutriiei omenirii pentru care a primit Premiul Nobel pentru Pace. Cercetrile au fost dezvoltate in Mexic si Filipine la grau, orez, porumb, sorg, mei etc. A doua revoluie verde este considerata a fi reprezentata de Biotehnologiile moderne 4.1.Tendinte actuale in agricultura Msuri diversificarea cultivarelor i a speciilor cultivate Introducerea biotehnologiilor (10% din necesarul de fora de munc din agricultura pentru producerea aceleiai cantiti de proteine) Fixarea azotului atmosferic Valorificarea solurilor srturoase Prevenirea efectelor toxice ale pesticidelor (anual la cele 200 mii de produse chimice se adauga 1-2 mii noi, se nregistreaz 1 mil intoxicatii acute soldate cu 20 mii mori ) Folosirea biotehnologiilor in ameliorarea plantelor Schimbarea treptat a tuturor modelelor de producie Promovarea conceptului de dezvoltare durabil Modificarea legislaiei privitoare la OMG (ORGANISME MODIFICATE GENETIC) 4.2 Suprafete cultivate cu plante modificate genetice Peste 90 si, respectiv 120 de milioane de hectare cu plante modificate genetic au fost cultivate n anul 2005 si 2008, n ntreaga lume. Potrivit raportului dat publicitii de Internaional Service of the Acquisition of Agribiotech Applications (ISAAA), suprafeele nsmnate cu plante modificate genetic au crescut cu 11%, fa de anul 2004. Creterea din 2005 nu este att de nsemnat precum cea nregistrat pe parcursul anului 2004 (20%), dar s-a previzionat c se va menine de-a lungul ntregului deceniu. n 1996, anul introducerii acestor plante, doar ase ri le utilizau, iar suprafeele erau de doar 1,7 milioane de hectare. n 2005 ase ri au cultivat 98% din suprafaa mondial de plante modificat genetic. Pe primul loc se situeaz SUA, cu 48 milioane hectare, urmate de Argentina 17 milioane hectare, Canada 6 milioane ha, Brazilia 6 milioane ha, China 4 milioane ha, Paraguay 1,4 milioane ha. Restul de 2% din suprafaa estimat cultivat de 15 ri, printre care Mexic, Spania, Germania, Romnia, Africa de Sud. Estimrile ISAAA sunt puternic contestate de organizaiile ecologiste, contestaii cu marea caren de a nu avea nici o prob practic. Aflate de civa ani n centrul unor dezbateri contradictorii aprinse, organismele modificate genetic i continu expansiunea fulminant preconizat de oamenii de tiin. n mai puin de 10 ani ele au nregistrat un ritm mediu de dezvoltare realizat n agricultura tuturor timpurilor. Cantitativ acest ritm nregistreaz o cretere anual de peste 10 milioane hectare, iar analitii anticipeaz o extindere a suprafeelor cultivate la orizontul anului 2020 la dimensiunea total de 350 milioane hectare, adic de aproape trei ori mai mult ct reprezint suprafaa cultivat a rilor UE 15. Reticena europenilor fa de aceste plante pare a fi una fals din punct de vedere tiinific, singura explicaie plauzibil innd de imposibilitatea acestora de a valorifica eficient actuala abunden alimentar. Din acest punct de vedere, Romnia este o ar european atipic, dac avem n vedere c ea este incapabil, n momentul de fa, s-i asigure securitatea alimentar din resurse proprii. Cea mai mare parte a suprafeelor cultivate cu varieti modificate genetic este acoperit de soia (60%). Valoarea pe pia a culturilor transgenice a atins, n 2005, 5,25 miliarde de dolari. Raportul ISAAA remarc faptul c agricultorii francezi i portughezi au reintrodus, n 2005, cultura de porumb Bt, la care renunaser de 2 i respectiv 5 ani. Cehia a introdus pentru prima dat cultura de porumb Bt. Pn n 2005, culturile de porumb Bt au ptruns n cinci ri din Uniunea European (Cehia, Frana, Germania, Portugalia, Spania). Spania ar membr a UE cultiv, nc din anul 1998, porumb modificat genetic pe suprafee care n timp ar permite transformarea acestei ri n principalul furnizor de semine de porumb modificat genetic al Europei.12

Din cele 21 de ri care cultivau varieti modificate genetic n anul 2005, 13 o fceau pe suprafee care depeau 50.000 de hectare. Potrivit ISAAA, rile n cauz erau: Africa de Sud, Argentina, Australia, Brazilia, Canada, China, Filipine, India, Mexic, Paraguay, Spania, Statele Unite, Uruguay. n anul 2005, Brazilia este ara care a recunoscut cea mai important cretere de suprafeelor cultivate cu organisme modificate genetic: culturile de soia transgenic au progresat cu 88%, ajungnd s acopere 9,4 milioane de hectare. n India, suprafeele cultivate cu bumbac Bt (modificat genetic) au crescut de la 500.000 de hectare, n 2004, la 1,3 milioane de hectare, n 2005. Potrivit Institutului Service of the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA), Iranul i China sunt rile cu potenialul cel mai mare n comercializarea de orez modificat genetic. 250 de milioane de agricultori din ntreaga lume, cultiv orezul transgenic, care se constituie n aliment de baz pentru 1,3 miliarde de persoane. International Service of the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA), asociaie sponsorizat, ntr-o anumit msur, de industria biotehnologiilor, se autocaracterizeaz ca fiind un organism caritabil, fr a avea ca scop obinerea de profit, care lucreaz pentru nlturarea srciei din rile n curs de dezvoltare. Acest scop ar putea fi atins prin facilitarea transferului de cunotine i prin transferarea aplicaiilor din domeniul geneticii vegetale. In Romnia, in 2006 s-au cultivat in jur de 100 de mii de hectare cu organisme modificate genetic Ministerului Agriculturii a interzis a cultivarii de soia modificata genetic (Roundup Ready) n Romnia ncepnd cu anul 2007, pe motivul c UE nu ar permite acest lucru.

Situatia suprafetelor cultivate si principalele specii utilizate in 2007

13

n 2010, existau 17 tri care cultivau PMG pe mai mult de 50000 ha, Romania a cultivat numai porumb Bt pe aproximativ 850 ha. Suprafete cultivate cu plante modificate genetic in lume 1996-2010

Evolutia principalelor specii cultivate (1996-2010)

14

Evolutia suprafetelor cultivate cu pricipalele modificari (1996-2010)

Raportul dintre plantele transgenice si cele non-transgenice 2010

15

5. BAZELE MOLECULARE ALE INGINERIEI GENETICE Ereditatea: transmiterea caracterelor codificate de materialul genetic ADN Celula la celulele fiice Individ la descendenti Genotip: totalitatea materialului genetic al unui organism Fenotip: totalitatea trasaturilor observabile ale unui organism, determinate de materialul genetic si de mediul inconjurator Dogma central a geneticiiADN-ARN-proteine

Replicatie ADN Transcriere ARN Translatie Proteina Citoplasma5.1. Structura acizilor nucleici Compozitia chimica a ARN Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), uracilul (U) Riboza (monozaharid) Radicali fosfat Compozitia chimica a ADN Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), timina (T) Dezoxiriboza (derivat mai stabil al ribozei) Radicali fosfatBazele purinice: A, G (dublu nucleu aromatic) Bazele pirimidinice: C, T, U (un singur nucleu hexagonal)

Nucleu

.

Structura nucleozidelor si a nucleotidelor Nucleozide = baze azotate + monozaharid (pentoza) Baze azotate + riboza (ribo-nucleozide) Baze azotate + dezoxiriboza (dezoxiribo-nucleozide) Nucleotide = nucleozide + fosfat Hibridizarea bazelor azotate Nucleotidele formeaza intre ele legaturi de hidrogen Aceste legaturi se realizeaza intre bazele azotate, care se asociaza 2 cate 2 (hibridizare) astfel: A = T (ADN) sau A = U (ARN), C G Legaturile se stabilesc intotdeauna intre o baza purinica si o baza pirimidinica Hibridizarea A = T este mai putin stabila (mai usor de disociat) decat hibridizarea C G16

Structura acidului dezoxiribonucleic (ADN) ADN este format din nucleotide (A, G, C, T), ale caror pentoze sunt dezoxiriboze. Legaturile dintre

nucleotide sunt de tip fosfodiester. Molecula ADN este formata din 2 lanturi polinucleotidice ale caror nucleotide sunt unite intre ele, 2 cate 2, prin legaturi de hidrogen, pe toata lungimea Bazele azotate sunt orientate spre interior Ribozele si resturile fosfat formeaza un schelet exterior Cele 2 lanturi sunt antiparalele: extremitatea 5 a unui lant se hibridizeaza cu extremitatea 3 a celuilalt lant Secventele lor sunt complementare: pentru ca toate nucleotidele sa poata fi hibridizate, trebuie ca ordinea legarii lor pe un lant (secventa) sa fie complementara cu cea a lantului opus Lanturile polinucleotidice sunt spiralate unul in jurul celuilat dubla spirala (modelul J.D. Watson si F.H.C. Crick, 1953) Cele doua lanturi unite prin legaturi de hidrogen pot fi disociate la cald: denaturarea ADN; refacerea legaturilor: renaturarea

Replicarea: sinteza ADN identic cu materialul genetic al celulei, inainte de diviziunea mitoticadublarea cantitatii de ADN

Replicarea este semiconservativa: fiecare lant este matrita pentru sinteza lantului complementar: 1molecula ADN 2 molecule, fiecare avand un lant vechi si unul nou sintetizat Comparaie dintre ADN i ARN

17

5.2. Codul genetic si caracteristicile sale Marshall Nirenberg a descifrat codul genetic in 1961, realizare pentru care a primit premiul Nobel.

Caracteristicile codului genetic: 1. UNIVERSAL - in toate organismele aceeasi codoni codifica aceeasi aminoacizi. 2. NEACOPERIT / NESUPRAPUS - 2 codoni vecini nu au nucleotide comune. 3. FARA VIRGULE - nu exista spatii libere intre nucleotide si nici alte semne de punctuatie. 4. DEGENERAT - un acelasi aminoacid poate fi codificat de mai multi codoni. 5. AMBIGUU - un anumit codon poate sa includa mai multe tipuri de aminoacizi intr-o proteina in functie de pozitia lui in catena.

5.3. Expresia genica Transcriptia si translatia genereaza expresia genica Informatia genetica codificata in ADN unui embrion include toate genele necesare pentru a mentine si dezvolta organismul. Diferite tipuri de celule exprima diferite tipuri de gene Expresia genica diferita in timpul dezvoltarii stabileste rolul celulei in corp Initierea transcriptiei Transcriptia Prin intermediul ARN polimerazei se sintetizeaza o molecula de ARN m complementara Procesul citirii ARM mesager si transformarea informatiei in prioteine se numeste translatie

18

5.4.Structura genelor la eucariote Caracteristicile celulelor eucariote: Celulele au un nucleu protejat de o membrana dubla ADN este complexat de "histone," si este organizat in cromozomi Contin un numar fix de cromozomi in nucleu ADN este linear Gena: secventa de nucleotide care contine informatia necesara sintezei unei proteine sau a unei molecule de ARN Alcatuirea unei gene 1. promotorul (Elemente reglatoare) secventa situata inaintea genei, leaga ARN polimeraza si determina locul de unde incepe transcrierea 2. Secventa codificatoare (informationala) formata dintr-o succesiune de exoni (secvente transcrise, pastrate in ARNm si traduse sau exprimate in proteine) si introni (secvente eliminate, absente din ARNm) 3. Secventa terminala (terminator)- O secventa semnal (AAUAAA) pentru terminarea transcrierii la sfarsitul ultimului exon

PROMOTOR

INTRON

Secventa codificatoare

poly A signal

6. INGINERIA GENETIC, ETAPELE TRANSGENEZEI Ingineria genetica poate fi definita ca un ansamblu de metode si tehnici care permit fie introducerea in patrimoniul genetic al unei celule a uneia sau mai multor gene noi, de interes, fie modificarea expresiei unei/unor gene prezente, deja, in celula. Genele transferate sunt denumite transgene. Ingineria genetica mai este numita, uneori, si modificare genetica, transformare genetica sau transgeneza, iar produsele obtinute poarta numele de organisme modificate genetic (OMG) sau organisme transgenice (Badea, 2000). In Germania, definitia data organismelor modificate genetic este urmatoarea: OMG sunt organisme al caror material genetic a fost modificat intr-un mod care nu exista in natura in conditii naturale sau de recombinare naturala. Organismul modificat genetic trebuie sa fie o unitate capabila de autoreplicare sau transmitere a materialului genetic. In Statele Unite, termenul de organism modificat genetic se refera la plante si la animale care contin gene transferate de la alte specii, pentru a obtine anumite caractere, precum rezistenta la anumite pesticide si erbicide. In Romania (conform OG nr. 49/2000), organismul modificat generic este un organism care contine o combinatie noua de material genetic, obtinut prin tehnicile biotehnologiilor moderne care ii confera noi caracteristici. 6.1. Autoritati in domeniul biotehnologiei In SUA, obtinerea prin biotehnologii si utilizarea organismelor modificate genetic se afla sub controlul strict al US Food and Drug Administration (USFDA). In Europa, pe baza modelului USFDA, a fost stabilit un cadru de lucru pentru regimul de siguranta al alimentelor in Europa. Legea pentru infiintarea autoritatii in domeniu, European Food Authority (EFA), a fost aprobata de catre Ministerele Consiliului si Parlamentului European

19

SARCINILE EFA - EFA are 6 sarcini principale: Furnizeaza opinii stiintifice independente (pentru aspectele de siguranta alimentara, nutritie, sanatate/bunastare a animalelor, sanatatea plantelor, organisme modificate genetic) la cererea Comisiei, Parlamentului European (PE), Statelor Membre sau organismelor nationale pentru alimentatie in scopul acordarii suportului pentru managementul riscului; Furnizeaza opinii asupra aspectelor de tehnologie alimentara pentru a sprijini dezvoltarea reglementarilor si legislatiei problemelor de siguranta in fluxul alimentar; Colecteaza si analizeaza datele asupra modelelor dietetice, expune articole din programele monitorizate si orice alte date relevante pentru orice risc potential in vederea monitorizarii sigurantei de-a lungul lantului alimentar in UE; Identificarea si avertizarea timpurie a riscurilor potentiale; Functionarea unui sistem de alertare rapid care acopera atat alimentele, cat si furajele; Comunica publicului general toate sarcinile care i-au fost alocate ROMANIA este prima tara din Balcani care a stabilit legea organismelor modificate genetic. Ordonanta Guvernului nr. 49/2000 a stabilit infiintarea Comisiei Nationale pentru Securitate Biologica (CNSB), care a fost abilitata sa puna in aplicare dispozitiile legislatiei nationale si internationale referitoare la regimul activitatilor care implica utilizarea organismelor modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, numai dupa avizarea scrisa, emisa de Punctul Focal National.

Organismele implicate n reglementare n Romnia (Legea 214/2002) Ministerul Mediului i Gospodririi Apelor (autoritatea naional competent).

Atribuii

Emite autorizaii/acorduri, controleaz, informeaz i consult publicul, solicit avize celorlalte autoriti. Comisia Naional pentru Securitate Biologic Emite o concluzie tiinific (autoritate tiinific) Avizeaz Ministerul Agriculturii, Pdurilor i Dezvoltrii Avizeaz i controleaz Rurale Ministerul Sntii Agenia Naional pentru Protecia Consumatorilor Avizeaz i controleaz Avizeaz i controleaz

COMISIA NAIONAL PENTRU SECURITATE BIOLOGIC are drept obiect de activitate: punerea n aplicare a dispoziiilor legislative naionale n domeniu i a actelor juridice internaionale la care Romnia este parte; s organizeze i s realizeze msurile prevzute de legislaie n domeniu; s exercite controlul privind regimul OMG prin tehnicile biotehnologiilor moderne i ale produselor rezultate din acestea. Comisia se organizeaz, funcioneaz ca un organism interdepartamental i este compus dintr-un numr de 19 membri.

20

6.2. Avantajele transgenezei Comparativ cu metodele clasice de ameliorare, transformarea prin ingineria genetica prezinta, cel putin,doua avantaje: - ofera posibilitatea introducerii unui singur caracter la o varietate, deja evaluata ca performanta; - gena transferata poate proveni din orice sursa, ceea ce extinde, practic, in mod nelimitat, posibilitatile de ameliorare. 6.3.Elementele necesare pentru modificarea genetica a plantelor: - gene de interes; - metode care sa permita patrunderea si integrarea transgenelor in nucleul celulei care va fi la originea unei noi plante; - - selectia plantelor in care transgena se exprima la un nivel adecvat scopului urmarit (toleranta la erbicid, rezistenta la atacul unui daunator etc.).

6.4. Transgeneza presupune parcurgerea a trei etape: - identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes; - transferul genelor de interes la plantele de cultura ; - selectia plantelor care exprima, la un nivel optim, caracterul transferat si testarea acestora in camp pentru evaluarea stabilitatii expresiei transgenei in timp, in conditii naturale. 6.4.1. Identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes Pentru obtinerea enzimelor de restrictie (substante de natura proteica ce pot sectiona fragmentul de ADN): - Peste 10.000 de specii de bacterii au fost evaluate - Peste 2500 de enzime au fost identificate - Peste 250 de secvente specifice Exemple de enzime de restricie i secvenele recunoscute de acestea

21

Identificarea i izolarea genelor se face cu ajutorul enzimelor de restricie

Clonarea genelor de interes

1. Vectorul de clonare (de obicei un plasmid) este secionat cu ajutorul enzimelor de restricie 2. Fragmentul de ADN de interes este detaat de din cromozom cu ajutorul aceleiai enzime de restricie 3. Fragmentele rezultate sunt ataate vectorului de clonare cu ajutorul ligazelor rezultnd un vector recombinant

22

4. Vectorul recombinant este introdus (de exemplu prin metoda biolistic) n celula gazd (de regul o bacterie)

5. Bacteria mpreun cu vectorul recombinant se nmulete (cloneaz) producnd multe copii de ADN recombinant 6. ADN recombinant se extrage si se purific

23

Obtinerea unui construct

Constructia unei transgeneintrerupator PROMOTOR INTRON Sinteza proteinei Secventa codificatoare Gena de interes Semnal stoppoly A signal

Gena marker pentru selectia plantei

Plasmid ADN ConstructGene bacterieneantibiotic marker replication origin

6.4.2.Transferul genelor de interes la plantele de cultura ; Principalele metode utilizate pentru transferul genelor de interes METODE INDIRECTE TRANSFORMAREA MEDIATA 1. Transformarea mediata de bacterii Agrobaterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes 2. Transformarea mediata de virusuri METODE DIRECTE 1. Metoda biolistics mpucarea direct a ADN n celule 2.Transformarea protoplastelor a.Microinjectarea b.Electroporarea c.Sonicarea3. Electroforeza4. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu

6.4.2.1. TRANSFORMAREA MEDIAT DE AGROBACTERIUM Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes realizez ceea ce adeseori s-a numit inginerie genetic natural. Aceaste bacterii sunt capabile s transfere n esutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (tumor inducing) n cazul speciei A. tumefaciens sau Ri (root inducing) n cazul speciei A. rhizogenes, care se integreaz n genomul plantei. Ca urmare bacteria A. tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului (crown gall disease) iar A. rhizogenes formarea de rdcini firoase (hairy roots). In decursul coevoluiei plant microorganism aceste bacterii au devenit capabile s transforme plantele pentru a le exploata mai bine ca i surse de energie. ADN T se transmite dup legile Mendeliene, ca gen dominant. Exist date care confirm faptul c o astfel de transformare genetic are loc n natur fr intervenia omului.24

Astfel, s-a demonstrat c plasmida Ri poate purta una sau dou copii de ADN-T, iar o parte din una dintre aceste secvene a fost regsit n genomul unor plante nemodificate genetic. Celulele vegetale care poart ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conine gene cu efect oncogen. Deleia acestor gene din ADN-T nu interfer, din fericire, cu transferul i integrarea ADN-T n genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aa numitele latur dreapt i stng constnd din o secven alctuit din 24 de nucleotide care se repet, reprezint situri de recunoatere pentru sistemul de transfer. Prin nlocuirea oncogenelor din ADN-T cu gene de interes este posibil transferul acestora n celule vegetale int, celule care nu mai dobndesc caracter tumoral i deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes fie ele gene marker sau raportoare sau gene cu importan economic pot fi introduse n plante fie prin linkage cu regiunea ADN-T dezarmat prin recombinare, obinndu-se un aa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor ntre secvenele repetate laterale ntr-un replicon independent, ceea ce se numete vector binar. Existena mai multor regiuni T n celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora n celula vegetal int cu eficien crescut. Pe de alt parte pentru integrarea ADN-T n celula vegetal se pot utiliza secvene omoloage ADN vegetal int care induc, cu frecven relativ sczut, recombinarea omolog ntre ADN-T i ADN vegetal. Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dac unele dintre acestea nu formeaz tumori. Dei spectrul de gazde pentru aceast bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obinut tulpini supervirulente, capabile s infecteze eficient i celulele plantelor monocotiledonate. S-a deschis, astfel, calea transformrii cerealelor i prin intermediul acestui vector bacterian. Eficiena transformrii celulei vegetale de ctre A. tumefaciens, variaz destul de mult n funcie de specie, genotip sau chiar de esutul int. Este foarte important, totodat, ca esutul supus transformrii s fie totipotent i deci s regenereze plante transformate genetic. De cele mai multe ori, ns, dintr-un esut doar un numr limitat de celule sunt totipotente i nu ntodeauna acestea sunt i cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficient mediat de A. tumefaciens. Ca esuturi int pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rdcini, hipocotile, peiol, cotiledoane sau semine ntregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate n 1983, succesele iniiale limitndu-se la solanacee, n particular la sistemul model tutunul (Nicotiana tabacum L.). Ulterior au fost transformate: soia, bumbacul, orezul, ovzul, sorgul, trestia de zahr, grul i multe altele. Eficiena transformrii variaz foarte mult de la o specie la alta n funcie de: identificarea metodei optime de cultur a esutului int, condiiile de cultur a materialului surs, sau sua bacterian utilizat. Aceti factori afecteaz i numrul de copii de ADN-T care se integreaz n genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetrile au vizat descifrarea mecanismelor implicate n colonizarea esuturilor vegetale de ctre bacterii, relevndu-se noi detalii privind controlul genetic al virulenei bacteriene . Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oar pentru transformarea plantelor de tutun n anul 1977. Aceast bacterie transfernd ADN-T de pe plamida Ri determin formarea rdcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rdcini care pot purta gene de interes, dac acestea au fost integrate n ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etap intermediar, n procesul de transformare mediat de A. rhizogenes, este cultura rdcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi i ramifica. Astfel, prin cultura rdcinilor firoase se pot obine metabolii secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creterea i dezvoltarea rdcinilor. Acest sistem experimental este foarte potrivit i pentru analize biochimice, rdcinile prezentnd ci biochimice mai simple i, deci, mai uor de analizat. Rdcinile firoase pot fi cultivate uor, folosind un echipament simplu i ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vedere genetic. Asemntor sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate cotranfera ADN-T de pe plasmida Ri i un vector binar, de obicei o plasmid mai mic. Aceasta din urm poate purta n ADN-T o gen marker, de exemplu o gen care confer rezisten la un antibiotic, o gen raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipic i o gen cu importan economic. Avantajul acestui sistem este acela c cele dou tipuri de ADN-T, cel care determin dezvoltarea rdcinilor firoase, i ADN-T de pe vectorul binar, se integreaz de obicei pe cromozomi diferii n plantele transformate i deci, vor segrega independent n descenden. Un avantaj aparte al sistemului25

de transformare Ri este faptul c toate celulele vegetale care integreaz ADN-T de pe plasmida Ri pot fi uor identificate i selectate prin prezena fenotipului de rdcin firoas. Sistemul de transformare mediat de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare numr de specii de plante (n jur de 200 nc n 1989), dar asemntor sistemului A. tumefaciens rspunsul optim variaz n funcie de specie, genotip sau sua bacterian. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente de tulpin de la plante tinere, fragmente de peiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezerv cum ar fi rdcinile de morcov sau tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezint un rspuns polar, formnd rdcini firoase numai la una din extremele explantului, rdcini capabile s ignore fora gravitaional. Mai mult, exist date experimentale care sugereaz efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulen, rolA, de la A. rhizogenes, efect cu importan practic mai ales pentru unele plante horticole

6.4.2.2. TRANSFORMAREA MEDIAT DE VIRUSURI Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, n ciuda numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Dei, n 1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistena la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN cercetrile ulterioare au demonstrat c genomul viral nu poate accepta i transfera fragmente mai lungi de ADN strin. Descoperirea faptului c virusurile ARN pot genera ADN prin transcripie invers a generat sperana c, mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetal. Din pcate, ns, s-au ntmpinat alte dificulti. ADN viral nu se integreaz n genomul vegetal iar meristemele, principala surs de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizai n experimentele de transformare genetic a plantelor.

26

METODE DIRECTE 6.4.2.3. METODA BIOLISTICS mpucarea direct a ADN n celule Metoda biolistic (biolistics) sau particle gun, de mpucare direct a ADN n esuturi int este o metod de transformare genetic a plantelor foarte rapida. Metoda const n accelerarea unor particule foarte mici (1m diametru) din tungsten, wolfram sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, n esuturi vegetale int. Aceast tehnic are numeroase avantaje care o recomand pentru aplicabilitate general: este o metod uor de aplicat, printr-o mpuctur pot fi intite mai multe celule, celulele supravieuiesc dup mpucare, genele purtate de particule i pstreaz activitatea biologic, particulele pot fi mpucate n straturile superficiale sau n profunzimea unui organ vegetal. Celulele int pot fi foarte diferite: polen, celule n suspensie, embrioni imaturi, celule din esuturi difereniate sau chiar meristeme. Datorit avantajelor sale biolistica a devenit metoda favorit n numeroase laboratoare, permind transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovzul, orezul, sorgul, trestia de zahr, grul, plante forestiere etc. O aplicaie aparte a fost utilizarea mpucrii de microproiectile pentru rnirea apexurilor la floarea soarelui, eficientiznd astfel transformarea mediat de Agrobacterium tumefaciens. Mai mult, s-a reuit mpucarea direct n esuturi vegetale a celulelor bacteriene ntregi

6.4.2.4. Utilizarea protoplastelor (protoplastilor) pentru transferul direct de ADN Dintre sistemele de transformare, transformarea utiliznd protoplaste este una dintre metodele care necesit mare finee. Protoplastele sunt izolate fiecare printr-un proces mecanic sau enzimatic prin ndeprtarea peretelui celular. Protoplastele sunt frecvent obinute dintr-o suspensie de linii celulare, de la calus obinut din embrioni imaturi, inflorescene imature, mezocotil, frunze imature bazale i antere. Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezint limita de expresie a totipotenialitii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate pn astzi numrul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibil a crescut permanent, ajungnd actualmente la aproximativ 400 de specii de plante. Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN i selecia transformanilor. Indeprtarea peretelui celular elimin principala barier n calea ptrunderii ADN strin n celula vegetal. Izolarea enzimatic a protoplastelor acioneaz ca un factor de stress care induce reacii de rspuns la rnire reacii presupuse a declana starea de competen att de important pentru transformarea eficient. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamn cu o suspensie bacterian avand avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populaii mari de celule individuale n medii de cultur bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au n general origine27

clonal provenind din celule individuale. Eficiena seleciei transformanilor este maxim n cazul protoplastelor deoarece se evit formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, n protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, i anume: a. Microinjectarea const n introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct n protoplaste, acestea fiind fixate cu o alt micropipet. Microinjectarea celulei vegetale ntregi sau a esuturilor este, de asemenea posibil, dar se realizeaz mai greu din punct de vedere tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent i const n imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun ntr-un strat foarte subire de mediu solidificat cu agaroz sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea i monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea. b. Electroporarea implic permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice n prezena unor pulsuri de curent continuu avnd amplitudine crescut i durat foarte scurt, porii formai n membran permind intrarea ADN strin n citoplasm . Electroporarea a devenit o metod de rutin pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar i pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La plante, electroporarea protoplastelor se folosete eficient pentru transformarea permanent la numeroase specii de plante incluznd cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimin necesitatea utilizrii unor gene marker, ceea ce reprezint un avantaj deosebit n condiiile oponenei acerbe a opiniei publice fat de eliberarea n cmp a unor plante purtnd gene marker. Avantajele electroporrii constau n eficiena crescut a incorporrii ADN strin, reproductibilitatea i simplitatea acestei metode. Singura limitare a aplicrii electroporrii o reprezint capacitatea de regenerare a protoplastelor, dar i acest dezavantaj a fost depit prin extinderea aplicrii electroporrii celulelor sau chiar esuturilor ntregi c. Sonicarea permeabilizarea membranei protoplastelor n prezena ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metod eficient pentru transferul ADN n protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicat i celulelor sau esuturilor ntregi, dar este utilizat pe scar mai redus comparativ cu electroporarea 6.4.2.5. ALTE METODE DE TRANSFER DIRECT AL ADN N CELULELE VEGETALE Electroforeza Migrarea ADN printr-un esut vegetal int a fost o alt idee interesant pentru transferul de gene i a fost aplicat pentru prima oar embrionilor de orz.

Principalul avantaj al metodei consta in posibilitatea de a realiza plante modificate genetic fara parcurgerea fazei de cultura in vitro

Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu (silicon carbide technology) Fibrele de carbur de siliciu se utilizeaz n industrie. Transformarea genetic prin aceast tehnologie este relativ simpl, constnd n vortexarea (agitarea) esuturilor mpreun cu ADN i fibre de carbur de siliciu. Astfel, fibrele penetreaz pereii celulari permind ADN s ptrund n28

citoplasm. Metoda a fost aplicat iniial transformrii embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit eficient i n transformarea celulelor vegetale. Cercetrile de microscopie electronic au relevat penetrarea peretelui celular de ctre astfel de fibre, sugernd c ADN ader de suprafaa fibrelor i este introdus odat cu acestea n celul. Avnd proprieti fizice asemntoare azbestului fibrele de carbur de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetic a fost raportat folosind aceast tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovz, tutun i Agrostis alba. Transformarea stabil a fost, de asemenea posibil folosind suspensii celulare de porumb i tutun. Datele obinute au indicat transformarea preponderent a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercetri ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezint avantajul de a fi foarte simpl i ieftin, dar datorit riscurilor poteniale pentru sntatea uman se caut materiale alternative, eventual biodegradabile . Alte metode cu aplicabilitate restrns de transformare a celulei vegetale sunt: mbibarea ADN n esuturi utiliznd semine uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic, macroinjectarea ADN n esuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular i plasmalema. Astfel de metode se afl, actualmente, n diferite faze de experimentare. De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesit faze de cultur in vitro. O astfel de metod, cu potenial deosebit este transformarea gruncioarelor de polen, dar deocamdat rezultatele n acest domeniu sunt relativ modeste

6.7.3. SELECIA TRANSFORMANILOR Selecia este o parte importan a proceselor de transformare. n general, genele de interes sunt co-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uurin a celulelor recipiente transformate. Markerii de selecie cei mai utilizai confer rezisten la ageni chimici, cum ar fi antibiotice i erbicide. Genele de selecie pot fi utilizate ntr-o prim generaie i eliminate mai trziu prin ncruciare convenional. O posibilitate este de a obine dou ADN-T separate; una cu gene de interes i alta cu markeri de selecie, n aceeai sau dou celule diferite de Agrobacterium. Cele dou ADN-T sunt inserate n situsuri ne-link-ate n genomul plantei gazd, permind mai trziu segregarea genetic. Transformarea optim se caracterizeaz printr-o singur copie a transgenei care va segrega mendelian cu o expresie uniform de la o generaie la alta. Transformanii ideali pot fi identificai cu dificultate, depinznd de materialul vegetal care va fi transformat i de cantitatea i complexitatea transgenelor. O gen inserat este esenial randomizat n genom, se observ o variabilitate de la o plant transgenic la alta, fenomen cunoscut sub numele de variaie cu efect de poziie. Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizat gena nptII, sau neo, gen izolat din transpozonul Tn5 de la Escherichia coli K12. Aceast gen codific neomicinfosfotransferaza enzima implicat n detoxificarea unor antibiotice aminoglucozidice cum ar fi:neomicina, kanamicina, paramomicina sau geneticina. Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII, cum ar fi tutunul, cartoful, Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul ca s le amintim pe cele mai importante. Pentru aceast gen ca ageni de selecie se utilizeaz cel mai mult kanamicina (50 100 mg/l) sau geneticina. Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-au dovedit insensibile la kanamicin, n acest caz geneticina dnd rezultate mai bune. De asemenea, s-a observat c la unele specii kanamicina poate interfera cu procesele de organogenez, afectnd eficiena regenerrii plantelor transformate. O alt gen marker mult utilizat este gena hpt sau hph, gen izolat tot de la bacteria E. coli codificnd enzima HPT (higromicinfosfotransferaza). Aceast enzim detoxific antibioticul higromicin B, antibiotic fa de care majoritatea esuturilor vegetale sunt foarte sensibile. De aceea, aceast gen marker a fost utilizat pentru transformarea multor specii de plante, cum ar fi: tutunul, Arabidopsis, porumbul, orezul sau gramineele perene. Higromicina este ndeosebi foarte potrivit ca agent de selecie pentru cereale, folosindu-se n concentraii de 25-200 mg/l. Secvena codant a genei a fost, de asemenea, modificat pentru o expresie mai bun n celula vegtal.Dintre genele care confer29

rezisten la erbicide cel mai mult a fost utilizat gena bar, izolat de la bacteria Streptomyces hygroscopicus i gena pat de la S. viridochromogenes, ambele codificnd enzima fosfinotricinacetiltransferaza. Fosfinotricina este compusul activ cel mai mult utilizat ca erbicid de selecie a plantelor transformate genetic, genele amintite fiind transferate cu succes la plante ca: tutunul, rapia, porumbul, orezul, grul i altele. O alt gen marker este gena dhfr pentru enzima dihidrofolatreductaz (DHFR), izolat tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR confer rezistena la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la concentraii mici ale acestui compus. Gena dhfr a fost transferat la specii cum ar fi: tutunul, petunia i grul. Genele raportoare, spre deosebire de markerii de selecie, nu confer celulelor rezisten fa de un anumit compus. Ele codific proteine care pot fi detectate direct sau catalizeaz reacii specifice ai cror produi pot fi detectai prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul factorilor de transcripie cis sau trans, n condiiile transformrii tranziente sau permanente, precum i monitorizarea i optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoare sunt: gena gus (uidA) codific -glucuronidaza (GUS) i a fost izolat de la E. coli K12 (Jefferson i colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizat la plante. Exist pentru aceast hidrolaz compui substat pentru evidenierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice la nivelul esuturilor rezultnd un compus de culoare albastr uor de evideniat. La pHul utilizat pentru determinarea GUS nu exist activitate -glucuronidazic detectabil n nici un esut vegetal. Toate metodele de determinare se aplic ns, numai celulelor fixate, nonviabile. gena raportoare luc pentru enzima luciferaz folosete un sistem substrat-enzim care produce bioluminescen. Gena luc a fost izolat de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimat n plante. Produsul genei, luciferaza poate fi extras din esuturi iar activitatea ei poate fi determinat n prezena luciferinei. Dar, exist i o metod de determinare non-letal i neinvaziv direct n esuturile i organele plantelor transformate, pentru msurarea bioluminescenei fiind necesar un luminometru. gena gfp pentru proteina cu fluorescen verde (GFP) reprezint cea mei nou gen raportoare i totodat cea mai spectaculoas i avantajoas. Gena a fost izolat de la o meduz, Aequarea victoria, fiind transferat la cteva specii de plante. GFP prezint o serie de avantaje i anume: nu necesit un substrat, proteina se evideniaz n esuturi intacte in vitro i in vivo, prin excitarea n UV, proteina poate fi fuzionat cu alte proteine permind monitorizarea traficului proteic i a metabolismului. gena cat izolat de la E. coli, codific enzima cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizat ca gen raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretenioas bazndu-se pe monitorizarea acetilrii cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetilCoA, fie a cloramfenicolului, produii fiind separai prin cromatografie n strat subire (TLC) i msurai prin densitometrie sau prin scintilaie. Uneori poate exista activitate CAT i n unele esuturi vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ce afecteaz eficiena acestui sistem. antocianii sunt pigmeni roii sau purpurii care se acumuleaz n vacuole n unele esuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlat de gene structurale i reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate i clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare n esuturile i organele unor genotipuri care conin gene structurale dar nu sintetizeaz antociani. Utilizarea antocianilor ca markeri prezint o serie de avantaje: nu necesit un substrat, se exprim doar n celulele viabile i metabolic active, sunt uor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de transcripie R i C1 de la porumb. genele care confer rezisten la streptomicin i/sau spectinomicin au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe care l au, prin inactivarea cloroplastelor

30

7. PRIMA GENERAIE DE PLANTE TRANSGENICE Prima generaie de plante transgenice este constituita din cultivare care au fost modificate prin introducerea unuia sau cel mult dou caractere noi, cum sunt tolerana la unul sau mai multe erbicide, toleran la insecte sau la duntori sau tolerana combinat (caractere input).Ponderea pierderilor produse de diferii factori din producia potenial

13 14 Productia realizata Boli Insecte Buruieni

15

63

Ponderea diferitelor caractere obtinute prin transgeneza in cadrul suprafetelor total cultivate cu OMG In anul 2002

8 17 Toleranta la erbicide(TE) Rezistenta la insecte(RI) TE/RI 75

In anul 2010

28 Toletanta la erbicide(TE) Rezistenta la insecte(RI) TE/RI

58 24

31

7.1. PLANTE TRANSGENICE TOLERANTE LA ERBICIDE Erbicidele molecule chimice care actioneaza selectiv, afectand buruienile -Specifice actioneaza selectiv -Totale distrug toate plantele normale Avantajele erbicidelor totale: -toxicitate redusa -efecte minore asupra mediului -costuri reduse Strategii privitoare la obtinerea OMG tolerante la actiunea erbicidelor: -modificarea tintei erbicidului (cantitativ si calitativ) -introducerea in plantele cultivate a unui sistem de degradare a erbicidului I. Erbicidele sikimice (glifosat) sunt sistemice totale si actioneaza avand ca tinta o enzima din calea metabolica ce duce la sinteza aminoacizilor aromatici (prezenta la plante si microorganisme nu si la om sau animale). O gena mutanta care sa determine sinteza unei enzime insensibile la actiunea erbicidului poate fi izolata de la bacterii sau chiar de la plante. Soia Roundup Ready (RR) poseda o gena transferata de la E. coli Porumbul RR poseda o gena transferata de la porumb Roundup (glofosat) aprobat in Romania de 30 de ani II. A doua strategie aplicata in cazul erbicidului glufosinat de amoniu (fosfinotricin) care inhiba o enzima cheie in procesul de asimilare a azotului, rezultand concentratii letale de amoniac la numai cateva ore. Gena cu care au fost obtinute plante tolerante de rapita codifica o enzima ce detoxifica fosfinotricinul, inactivandu-l. Gena izolata de la o actinomiceta din genul Streptomyces a fost transferata cu Agrobacterium 7.2. PLANTE REZISTENTE LA ATACUL INSECTELOR Pierderile globale cauzate de insecte s-ar putea ridica anual la 4000 de md. dolari (daca nu s-ar aplica nici o masura de combatere) actualmente fiind de aproximativ 100 md. Avantaje folosirii PMG tolerante la atacul insectelor: - reducerea poluarii chimice - protejarea entomofaunei utile - eliminarea reziduurilor din apa si alimente Strategia introducerea in plante a unor gene ce determina sinteza unor proteine insecticide (origine vegetala, animala sau microorganisme). Cel mai frecvent se utilizeaza la gene din bacteria de sol Bacillus thuringiensis.In conditii de stress bacteria formeaza un endospor. Pentru constructia endosporului celula bacteriana sintetizeaza proteine specifice. Surplusul este depozitat sub forma unui corp proteic paracristalin. Celula bacteriana se degradeaza eliberandu-se sporul si cristalul. Insectele ingereaza cristalele proteice, iar proteina este fragmentata in doua de enzimele din aparatul digestiv. Un fragment (delta endotoxina) formeaza un complex cu receptori specifici cu membrana epiteliului intestinal. S-au studiat 40000 de tulpini de B. thuringiensis - 1000 toxine diferite fiecare cu spectru specific Genele Bt au fost transferate la peste 26 de specii vegetale. Compania Monsanto porumb Yieldgard ce sintetizeaza Cry I A (b) construind o gene sintetica in proportie de 65%

32

Combaterea sfredelitorului porumbului (Ostrinia nubilalis)A) Bacillus thuringiensis

B) Bt - PorumbBt-Mais

Zellkern mit DNA

Bt-Gen Wirkstoff Bt-Eiwei

8. A DOUA GENERATIE DE PLANTE TRANSGENICE

A doua generatie de plante transgenice se refera la noi cultivare (hibrizi, soiuri) care au modificate caractere legate de calitatea produselor obtinute (caractere output). Exemple: -modificarea continutului de amidon, proteine, zaharuri -modificarea insusirilor de panificatie -cresterea duratei de pastrare a fructelor -sporirea continutului de beta-caroten -imbunatatirea digestibilitatii furajelor

33

8.1. Modificarea procesul de coacere a fructelor Tomatele comercializate in stare proasp\t\ sub numele FLAVRSAVRR sunt primul produs alimentar recoltat de pe plante transgenice care a fost aprobat pentru consum. Acest a fost primul produs OMG comercializat pe piata SUA in 1994 si primul in Europa (UK) 1996.~n general, tomatele sunt culese cnd sunt `nc\ necoapte [i tari - stadiu pe care cultivatorii `l numesc matur-verde. Coacerea este indus\ dup\ ajungerea la destina]ie, printr-un tratament cu etilen\ (hormon natural implicat `n coacerea fructelor). Din cauza recolt\rii timpurii, aceste tomate nu au arome [i gustul maturate pe plant\. Evident, o recoltare ceva mai trzie ar ameliora considerabil calitatea tomatelor proaspete. ~n consecin]\, s-a procedat la modificarea genetic\ `n sensul p\str\rii consisten]ei dup\ cules, fapt ce face posibil\ nu numai recoltarea `ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat, cnd s-au acumulat [i aromele specifice, ci [i reducera pierderilor determinate de zdrobirea `n timpul transportului.Pentru modificarea procesului de coacere al tomatelor, au fost aplicate dou\ strategii. Prima a fost conceput\ pornind de la faptul c\ `nmuierea fructelor, `n general, se produce atunci cnd pere]ii celulelor sunt degrada]i de enzime specifice; dou\ dintre aceste enzime au fost identificate [i la tomate. Cercet\torii de la Calgene, din Davis (California), au blocat sinteza uneia dintre ele - poligalacturonaza (PG)- [i, ca urmare, procesul de degradare a pere]ilor celulari a fost `ntrziat, iar fructele [i-au conservat fermitatea mai mult timp. A doua strategie se bazeaz\ pe faptul c\, `ntr-o anumit\ faz\ a dezvolt\rii lor, fructele produc etilen\ - hormonul men]ionat mai sus, care declan[eaz\ [i accelereaz\ procesul de coacere. Evident, dac\ se suprim\ sinteza acestui hormon- sinteza `n care sunt implicate tot dou\ enzime - `ntregul proces de coacere este `ntrziat. Mai precis, se folosesc genele care codific\ una sau alta dintre cele dou\ enzime implicate `n sinteza etilenei, dar orientate `n sens invers. Transferate la tomate, aceste transgene antisens determin\ reducerea cu 95% (!) a cantit\]ii de etilen\ sintetizate [i prelungirea duratei coacerii de la una la patru s\pt\mni. ~n Fran]a, a fost ob]inut\ o linie de pepene galben care exprim\ o gen\ antisens ACC oxidaz\. Fructele acestei linii se `nmoaie mult mai trziu dect fructele variet\]ilor conven]ionale. Prin urmare, ele pot r\mne mai mult timp pe plant\, acumulnd zaharuri solubile [i componente ale aromei `n cantit\]i superioare. 8.2. Cresterea continutului in substanta uscata Tomatele constituie materia prim\ pentru o industrie care produce ketchup, supe, paste, sosuri, conserve etc. Toate acestea se ob]in din variet\]i special create pentru industrializare. Totu[i, 95% din fruct este ap\, care trebuie par]ial eliminat\ `n procesul prelucr\rii. Ca urmare a acestui fapt, o parte din pre]ul produselor pe baz\ de tomate este reprezentat\ de costul elimin\rii apei. Cre[terea ponderii substan]elor solide solubile (`n principal, zaharuri, acizi organici [i compu[i aromatici) `n fruct cu numai un procent- de la 5% la 6%- ar permite economisirea `n industria tomatelor din SUA a nu mai pu]in de 75 de milioane de dolari anual. Evident, [i acest obiectiv poate fi atins tot prin modificare genetic\, adoptndu-se diferite strategii. 8.3.Tipuri noi de amidon De[i amidonul este prezent `n `ntreaga lume vegetal\, sunt exploatate industrial doar cteva surse: porumbul, cartoful, grul, maniocul [i orezul. Produc]ia european\ se ridic\ la 10 milioane de tone, iar cea mondial\ - la 35 milioane de tone. 60% din amidonul produs provine din porumb, 25% din gru [i 15% - din cartof. O treime dintre produse sunt naturale, iar dou\ treimi sunt derivate, dintre care 20% - amidonuri modificate [i 55% - zaharuri. Exist\ deja numeroase brevete referitoare la aplica]ii ale amidonului modificat prin transgenez\.~n SUA, cartofii se consum\ sub form\ de chips sau cartofi pr\ji]i. Pentru a putea fi folosi]i `n acest scop, ei trebuie s\ con]in\ amidon `n propor]ie de 25%. Un con]inut mai mic - de exemplu, 21- 22% - impune evaporarea unei cantit\]i mari de ap\, fapt ce duce la absorb]ia gr\similor `n timpul prepar\rii. Recurgnd la o gen\ bacterian\, cercet\torii de la Monsanto au reu[it s\ sporeasc\ con]inutul de amidon al tuberculilor de cartof de la 22 la 25%.

34

Amidonul - glucid puternic polimerizat- are doi constituien]i esen]iali: amiloza [i amilopectina. Diferen]ele de structur\ molecular\ le confer\ acestora [i propriet\]i reologice foarte diferite, care sunt exploatate `n industria agroalimentar\: amiloza formeaz\ u[or geluri, `n timp ce amilopectina este un agent de `ngro[are foarte eficace. ~n amidonurile cerealelor predomin\ amilopectina, raportul amiloz\/amilopectin\ variind `ntre 20/80 [i 30/70. Avnd `n vedere faptul c\ amiloza prezint\ avantaje, `n prezent se `ncearc\ r\sturnarea acestui raport prin inginerie genetic\. 8.4.Sinteza unor glucide de interes industrial Metabolismul plantelor poate fi deturnat `n sensul sintetiz\rii unor molecule de interes pentru industrie prin introducerea unor noi echipamente enzimatice. O strategie de acest tip a fost aplicat\ pentru sinteza unor oligozaharide - ciclodextrinele. Acestea au o structur\ ce le confer\ capacit\]i de adsorb]ie utilizate `n industriile cosmetic\ [i farmaceutic\, `n agrochimie sau `n industria agroalimentar\, pentru stabilizarea parfumurilor [i aromelor, pentru complexarea produ[ilor cu eliberare treptat\, ca [i pentru extragerea unor substan]e speciale (cofein\, colesterol) din amestecuri. De exemplu, o gen\ izolat\ de la o bacterie a fost introdus\ `n genomul cartofului [i a determinat sinteza enzimei ce condi]ioneaz\ formarea ciclodextrinelor `n tuberculi. Evident, aceast\ tentativ\ reu[it\ atest\ viabilitatea conceptului [i deschide calea spre alte `ncerc\ri de a produce, cu ajutorul plantelor, moleculare cu mare valoare ad\ugat\, derivate din amidon.~n cadrul unui alt proiect, a fost ob]inut\ sfecla de zah\r transgenic\ ce produce fructan, un `ndulcitor necaloric: O alt\ cale de a spori dulcea]a fructelor const\ `n a face plantele s\ sintetizeze proteine naturale dulci, cum sunt monelina [i taumatina-proteine prezente `n fructele unor specii de plante tropicale. Gena pentru monelin\ a fost transferat\ la tomate [i salat\, iar gena care codific\ precursorul taumatinei - la cartof [i castravete. Evident, pe aceast\ cale devine posibil\ [i reducerea cantit\]ilor de zaharuri ad\ugate `n unele preparate alimentare. Un alt `ndulcitor proteic este brazeina. Unul deosebit de performant. De 500 pn\ la 2000 de