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2. - RESUMEN:

Los accidentes que conllevan la contaminación del mar por petróleo requieren estrategias amigables con el medioambiente. Nuestra propuesta une el uso de nuevos sustratos biológicos adherentes de crudo más corynobacterias recién aisladas de alta eficacia que se potencian en un efecto conjunto para limpiar una contaminación por crudo de petróleo.

3.- RESUMEN EJECUTIVO

El petróleo es un elemento químico esencial en el desarrollo de nuestra sociedad, sin embargo, durante su extracción, transporte y utilización se producen derrames de distinta magnitud que contaminan con gran intensidad ríos y mares. El uso de métodos físicos no logra detener el total de los derrames y los métodos químicos están produciendo desequilibrios en el medioambiente que frecuentemente son más dañinos que el mismo petróleo. Los métodos naturales que permiten limpiar derrames requieren ser potenciados para que ellos adquieran un protagonismo que evite el uso de los actuales químicos que son inyectados en derrames que traen consigo efectos tóxicos para la vida acuática y humana cuya magnitud se encuentra aún en estudio.

Es necesario que el método de limpieza de un evento contaminante sea de tal manera amigable con el medioambiente que pueda dar oportunidad a seres vivos de recuperar su entorno de forma segura, con una rapidez que entregue aguas limpias en el menor tiempo posible y con un costo que pueda ser asequible por cualquier economía. Dos enfoques lideran en los actuales métodos naturales, uno de ellos se basa en la capacidad bioremediadora de algunos microorganismos que toman el contaminante y lo usan para su ruta metabólica para poder degradarlo, crecer y a su vez eliminarlo del ecosistema. Trabajos científicos han descrito principalmente bacterias del género Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Chryseomonas, Agrobacterium y Aeromonas, las cuales han sido aisladas de suelos y aguas contaminadas con petróleo o sus derivados. Lamentablemente, la velocidad de limpieza por bacterias en un determinado ambiente natural no es lo suficientemente rápida porque la mayoría de ellas no están en la cantidad suficiente, o son oxígeno dependientes y el crudo no siempre se encuentra en la superficie del mar. Por lo tanto, se buscan, aíslan y examinan nuevos microorganismos y cepas bacterianas que posean mejores capacidades degradadoras de hidrocarburos.

En este trabajo de investigación descubrimos nuevas bacterias degradadoras de petróleo, aisladas de tierras contaminadas con hidrocarburos, utilizamos medios de cultivo selectivos con sólo crudo como fuente de carbono. En un modelo de biorreactor a microescala, construido con elementos de desecho y acuarios, cultivamos bacterias. Nuestras mediciones demostraron aumento de concentración bacteriana

en el tiempo, llegando a 2 x 106 UFC/ml (unidades formadoras de colonias por mililitro) en estudios de dilución. Luego se estudiaron las cepas de bacterias presentes y fueron separadas y nominadas como R1, R2, R3 y A1. De ellas, R1 y R2 poseían gran actividad degradadora de hidrocarburos. R1 posee la mayor velocidad para digerir derrames y 2 ml de bacterias logran degradar 1 gr crudo/lt en tan solo 3 - 4 días. Ante esta medición tan sorprendente, solicitamos la ayuda de científicos de la universidad Andrés Bello para la identificación de R1. Estudios de parámetros bioquímicos demostraron que R1 es un bacilo Gram positivo del género Corynobacterium, anaerobia facultativa (NO3).

La segunda estrategia de limpieza natural de petróleo ha utilizado sustratos que son capaces de adherir crudo, que son reutilizados, pero que requieren de grandes cantidades de material que por costo o existencia limitan su uso. En Chile, se utilizan pequeños paños de algodón, sobre derrames pequeños (menos de 5000 lt) de crudo, se aplican sobre la superficie del agua, retirados a mano, estrujados sobre contenedores que llevan el crudo a lugares predeterminados y nuevamente utilizados para recoger el máximo de crudo. En el mundo la organización Matter of Trust en conjunto con el estilista de Alabama, Phil McCory comenzaron una gran campaña mundial para recolectar cabello de salones de belleza y a fabricar “esponjas” recolectoras para limpiar los mantos acuíferos del planeta. El cabello humano se introduce en mangas de nylon reciclable y se utiliza para absorber el petróleo y aceite dejando el agua clara y limpia. Las mangas de cabello se someten a presión y/o centrifugado para extraer todo el petróleo en contenedores.

Debido al costo de paños de algodón y la existencia limitada de cabellos humanos nuestro estudió evaluó nuevos sustratos adherentes de petróleo. La captación de petróleo fue cuantificada y el cabello demostró su gran capacidad adherente, la cual fue mayor que plantas secas, pero la planta acuática Lemna Minor mostró un mayor poder adherente que el pelo y el mayor de todos fue el uso de plumas de aves. Este último sustrato es un elemento de desecho de criadoras de aves.

Al unir la Biorremediación por microorganismos (R1) y la acción natural de sustratos adherentes de petróleo (plumas), observamos que ambos agentes se potencian en su efecto. Creemos por esto que sustratos biológicos al ser unidos a una cepa bacteriana como R1, son económicos, naturales, eficientes y pueden ser promisorios para ser utilizados in situ sobre derrames como el que actualmente afecta las costas marinas del Golfo de México.

4. Establecimiento Educacional:

‐ Nombre: Instituto de Humanidades Luis Campino

‐ Comuna: Providencia

‐ Región: Metropolitana

‐ Dirección: Pedro de Valdivia 290

‐ Teléfono: 4904300

‐ Web: www.lcampino.cl

5. Participantes (Máximo 2 personas)

‐ Nombre Completo: Rolf Sommer Catalán

‐ RUT: 18.754.739-3

‐ Fecha de Nacimiento: 5 de agosto de 1994

‐ Establecimiento Educacional (Nombre, Dirección y Teléfono): Instituto de Humanidades Luis Campino, Pedro de Valdivia 290, Providencia, 4904300.

‐ Curso: 2° año E. Media B

‐ Dirección Particular (Calle, Número, Comuna y Región): Avenida Pedro de Valdivia 090, depto. 204, Providencia, RM.

‐ Teléfono Particular:

‐ Teléfono Celular: 09-95483427

‐ E‐Mail:            anubiscard@yahoo.com

‐ Nombre Completo: Bruno León Campos Cabrera

‐ RUT: 19.054.206-8

‐ Fecha de Nacimiento: 3 de marzo de 1995

‐ Establecimiento Educacional (Nombre, Dirección y Teléfono): Instituto de Humanidades Luis Campino, Pedro de Valdivia 290, Providencia, 4904300.

‐ Curso: 2° año E. Media B

‐ Dirección Particular (Calle, Número, Comuna y Región): Av. Las Torres 300, Maipú depto. 133, RM.

‐ Teléfono Particular:

‐ Teléfono Celular: 93826555

‐ E‐Mail:            brunocampos@vtr.net

6. Profesor/a Guía

‐ Nombre Completo: Patricio Kim Núñez Barnier

‐ RUT: 8.963.889-5

‐ Especialidad: Biología

‐ Establecimiento Educacional: Instituto de Humanidades Luis Campino, 4904300.

‐ Dirección Establecimiento Educacional: Pedro de Valdivia 290, Providencia,

‐ Dirección Particular: Pirámide 932, San Miguel

‐ Teléfono Particular: 4599295

‐ Teléfono Celular: 99433977

‐ E‐Mail: patriciokim@gmail.com

7. Asesor/a Científico/a Externo/a

‐ Nombre Completo: Juan Carlos Ríos Quezada

‐ RUT: 12.194.259-3

‐ Especialidad: Bioquímico, Magister en Bioquímica y candidato a doctor en Biotecnología

‐ Institución: Universidad Andrés Bello

‐ Cargo o Curso: Asistente académico en Biología Celular, Bioquímica vegetal, Fisiología vegetal e Ingeniería genética y Biotecnología vegetal

‐ Dirección Institución: República 217, Santiago, RM.

‐ Dirección Particular: Renato Zanelli 143, dpto. 202

‐ Comuna y Región: Santiago centro, Metropolitana

‐ Teléfono Particular: 2226916

‐ Teléfono Celular: 62168619

‐ E‐mail: juancarlos.rios@gmail.com

‐ Declaración de Asesoría otorgada: Caracterización Bioquímica y Genética de la cepa Bacteriana R1(corynobacterium).

8. Introducción (5%):

En Chile y el mundo se registran derrames de petróleo desde hace varias décadas, los cuales contaminan aguas de mar, ríos y suelos. Ante este problema se utilizan extracciones por barcos especializados, quema de combustibles, uso de dispersantes químicos y métodos como la “Microbiorremediación” basado en la capacidad de digerir hidrocarburos por microorganismos. El derrame del Golfo de México, que ocurrió este año, es el peor en la historia de EE.UU. y mayor que el que provocó el accidente del petrolero Exxon Valdez en Alaska en 1989, que vertió más de 40 millones de litros de crudo, según los científicos. Marcia McNutt, directora del Servicio Geológico de EE.UU., dijo que los cálculos preliminares señalan que el pozo abierto en el Golfo de México ha lanzado entre 71 y 147 millones de litros de petróleo al mar.

Las bacterias degradadoras de petróleo conocidas no son lo suficientemente rápidas como para hacer innecesarias técnicas químicas. Algunas explicaciones de este fenómeno se ha relacionado con las bajas temperaturas del agua del mar o si existe un bajo suministro de oxígeno.

Para detener el efecto contaminante del crudo se ha lanzado arena, pelos humanos y otros, pero su efecto es limitado. La cantidad de pelo humano es insuficiente, sin embargo en estos métodos no dañan el medioambiente, y pueden ser utilizados sin temor a efectos ambientales.

Son estas últimas estrategias que debieran ser estudiadas, reforzadas para ser implementadas para lograr éxito no sólo en el corto plazo sino también con una visión de futuro.

9. Antecedentes Bibliográficos o Investigaciones Previas (5%):

Arne Jernelöv (2010), del Instituto de Estudios Futuros de Estocolmo, escribió en la revista científica Nature, que el riesgo de accidentes será cada mayor, principalmente, en los países cuyas relaciones con el lobby petrolero son muy estrechas, debido a perforaciones cada vez más profundas y en zonas más complicadas. El problema es mayor porque las reparaciones y limpieza de vertidos no avanzan tan rápido como la de perforación, de manera que se hace cada vez más urgente un trabajo internacional conjunto y una intensa labor investigadora.

Los métodos de limpieza de vertidos en uso actual han incluido sustancias químicas que habitualmente presentan una toxicidad que originalmente no se pensaba. En el caso del Corexit 9500 (Corexit) que ha sido agregado al derrame del Exxon Valdez y del Golfo de México en grandes volúmenes y es parte del protocolo de limpieza en Chile, sin embargo, Corexit es letal en tan solo 2,6 partes por millón, donde el petróleo es letal en 11 partes por millón, lo que significa que Corexit es más de 4 veces más tóxico que el petróleo (Blum D. 2010). De manera que se requiere buscar o sustituir estas sustancias por formas más amigables con el medio ambiente.

El uso de microorganismos como herramientas de descontaminación es reciente. Los avances más grandes en el tema se realizaron luego del derrame de petróleo del Exxon Valdez en las costas de Prince

William, en Alaska (1990). Este desastre ecológico dejó gran cantidad de petróleo en el agua, (Parrish et al. 1999) y debido a que otros sistemas de descontaminación, son muchísimo más costosos e involucran la aplicación de productos que pueden tener un mayor impacto ecológico que el mismo derrame de petróleo, se buscaron formas alternativas de lidiar con la contaminación. (Korda et al. 1998)

Esta premisa se cumplió en Alaska y en casi todos los casos estudiados posteriormente. (Lopolito et al. 2007)

Otros casos ocurridos como el del Golfo de México (Varela 2010), son de tal gravedad que, exigen la búsqueda de bacterias más eficaces. Lamentablemente, los lugares contaminados por primera vez obtienen una respuesta de la flora microbiana autóctona de menos del 1%, lo que hace habitualmente, un remedial ineficiente. Por lo cual, se debiera tener otros microorganismos que sean inocuos y específicos que logren acelerar el proceso biodegradación.

Los hidrocarburos tienen diferente capacidad de ser degradados, los derrames de estos en el agua tienden a formar láminas en la superficie en donde el viento y el oleaje crean microscópicas emulsiones. Esto permite que los microorganismos predominantemente bacterias (pseudomonas, corinebacterias y micobacterias), algunas levaduras y hasta algas verdes tengan una mayor superficie de contacto con la partícula, facilitando el acceso a la misma y permitiendo su degradación. (Fernández, 2008)

En estudios de búsqueda de cepas bacterianas con la capacidad degradativa sobre hidrocarburos ha sido determinante evaluar, desde un primer momento, la prueba de actividad bioemulsionante (Korda et al. 1998), ya que bacterias con producción de bioemulsificantes y biosurfactantes disminuyen la tensión superficial entre el petróleo y el medio acuoso por tanto facilitan el acceso multi-microbiano a la fuente de carbono insoluble para su degradación. (Fernández et al. 2008)

Otro sistema de limpieza es el uso del sustrato pelo humano; La organización Matter of Trust (ecoosfera.com) y el estilista Phil McCory comenzaron a recolectar cabello al observar a las nutrias marinas cubiertas de petróleo procedente del derrame del buque "Exxon Valdez" en Alaska, en 1989. Se tiene una interesante propuesta de limpiar el petróleo con alfombras y escobas de pelo que absorben este material. Esta propuesta se basa en que sustratos como pelos adhieren y retienen con mucha facilidad crudo de petróleo. Pero el proceso de separar el crudo del pelo es complejo y requiere centrifugados para no dejar este pelo el mar. (http://www.matteroftrust.org/)

En Chile, según lo informado por la gobernación marítima, en el Puerto de San Antonio, se utilizaron paños de algodón, sobre un derrame de 2000 litros (definido como derrame pequeño) de crudo, fueron aplicados sobre la superficie del agua, retirados a mano, estrujados sobre contenedores que llevan el crudo a botaderos predeterminados y nuevamente utilizados para recoger el máximo de crudo.

Aún no se han presentado proyectos que combinen el uso de sustratos que adhieren crudo con microorganismos degradadores del petróleo.

10. Hipótesis y Objetivos (10%):

• Si bacterias que sean eficientes digestoras de hidrocarburos las concentramos sobre sustratos naturales que aglutinen crudo de petróleo entonces su acción será sinérgica y mantiene el respeto del medioambiente.

Objetivo General:

• Limpiar naturalmente agua de mar contaminada por crudo por medio de extraer el hidrocarburo con sustratos y eliminarlo con bacterias biorremediadoras.

Objetivos Específicos:

• Montar un prototipo de biorreactor en microescala, con materiales de bajo precio, que logre procesos aeróbicos y anaeróbicos para aislar bacterias capaces de digerir petróleo.

• Seleccionar líneas celulares bacterianos puros que sean capaces de actuar en agua de mar contaminada con hidrocarburos

• Evaluar el uso de sustratos recolectores de hidrocarburos y la posterior activación por bacterias para degradar crudo de petróleo.

11. Plan de Trabajo (15%)

‐ Método de Investigación y/o Experimentación:

Armado biorreactor y aislar bacterias: Muestras de tierra contaminadas obtenidas del estacionamiento del colegio se procesan con buffer PBS (PBS: 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4. pH a 7.4 con HCl), y luego por cultivo en medios selectivos de agar-PBS con crudo de petróleo. Aislamos cepas que demuestran in vitro la limpieza de PBS contaminado con crudo (Ver secuencia en imagen 1, anexos). Posteriormente, la mezcla de bacterias se aplica en un biorreactor (Imagen 2, anexos). El proceso de selección consistió en multiplicar las bacterias con única fuente de carbono el petróleo, con volúmenes crecientes en proporción, con agua de mar (estéril). Al medio acuático contaminado con crudo se le realizó estudios de Gram y UFC/ml por dilución (Unidades Formadoras de Colonias por mililitro) (Tabla 1). Las colonias separadas por dilución son aisladas y amplificadas en cultivos líquidos (caldo de carne). Se evaluó las cepas que muestran capacidad de limpiar petróleo, para lo cual se sembraron placas petri con agar no nutritivo más una capa de petróleo diluido, en condiciones estériles. Se guardan colonias que dejan alrededor de ellas áreas limpias de crudo de petróleo. Luego se reinoculó el biorreactor con los bacilos aparentemente más eficientes, también en agua de mar contaminada con crudo. El biorreactor que combina fase aeróbica y anaeróbica tenía flujo regulado (5,15 ml/minuto) a temperatura ambiental (Invierno, 10º - 12ºC). La preparación del biorreactor requirió sucesivas limpiezas incluyendo esterilización química que tuvo que ser más tarde eliminada por medio de agua destilada y PBS estéril. Realizamos un estudio de proliferación bacteriana

y degradación de crudo por medio de evaluar pH y densitometrías a 500nm (Spectronic 20D), día a día. (Gráfico 1, anexos) Se repite, procedimiento con cepa R1, con agua recién traída del Puerto de San Antonio sujeto a una reciente contaminación por crudo (Imagen 3) (Gráfico 2, anexos). Luego de lo cual se lleva a estudio que permitió la caracterización de R1; gentileza de Juan Carlos Ríos y Boris Barrera del Doctorado de la Universidad Andrés Bello (Tabla 2, anexos).

Por otro lado, se realizaron estudios de sustratos capaces de recolectar el petróleo sobre agua de mar, en placas de petri. Los sustratos a evaluar fueron plumas, pelos y la planta acuática Lemna Minor viva y seca. (Imagen 5, gráfico 3)

Para estudiar el efecto de sustratos más bacterias, pusimos agua de mar contaminada con crudo de petróleo en placas de petri, sobre ellas pusimos plumas de aves con bacterias R1 y otras con R2. Al agitar con una barra de vidrio todo el crudo se adhiere a las plumas luego de lo cual se dejan incubando para que ejerzan las bacterias su acción digestora. Se colecta con gotarios parte de la solución para la medición de A500 nm y los resultados se muestran en el Gráfico 4.

‐ Materiales: Tubo plástico de 2 litros de capacidad (proviene de un portaplanos), 1 botella de vidrio de 1 litro de capacidad, 3 metros de manguera de acuario, bomba de aireación de acuario, bajadas de suero, una minibomba impelente de agua cap. 60 cm., soporte universal, pinzas, Scotch, silicona líquida para sellar, buffer phosphate saline (NaH2PO4 2g/lt, NaCl 3g/lt,+ NaOH pH 7,1) (PBS), agua de mar, placas de petri y medios de cultivo.

12. Factibilidad del Plan de Trabajo (5%):

La bacteria R1 pudo ser multiplicada rápidamente en medios de cultivo líquidos (temperatura ambiente) y sin perder su capacidad degradadora de hidrocarburos por lo cual si quisiéramos obtener grandes volúmenes de ella no debiéramos tener dificultades. Se mantiene por plazos largos en refrigerador y sin requerir aireación, agrega así la posibilidad de ser guardada y acumulada antes de aplicar.

En la presente investigación se demuestra que existen sustratos que adsorben petróleo, diferentes al conocido sustrato pelo humano, pero que le aventajan en dos aspectos, primero la mayor capacidad adherente por unidad de masa, y en segundo lugar porque en el caso de la planta acuática Lemna Minor, ésta puede ser obtenida de manera ilimitada, ya que en su desarrollo no se requieren aguas purificadas, su tasa de proliferación es tan alta que triplica su cantidad en una semana (datos no mostrados), es capaz de sobrevivir en agua de mar por más de una semana (datos no mostrados) y su degradación es más simple que la que puede tener el pelo u otro sustrato. En el otro caso, la pluma de ave aventajó a todos los sustratos en la adherencia de petróleo, la captación de crudo es instantánea y se relaciona con lo visto en aves que se sumergen en petróleo, cuyo aumento de peso les impide volar y les puede llevar a la muerte. Debe destacarse que las plumas de aves, como gallinas, es un producto de desecho de la avicultura porque poseen un bajo valor nutritivo.

De manera que montar un protocolo de limpieza con bacterias R1 más sustratos recolectores, supone un método de muy rápida acción extractora y segura limpieza digestora de bajo costo de implementación,

fácil mantención y manipulación y representaría la estrategia más amigable con el medio ambiente, dejando aguas limpias y claras.

13. Presentación y Análisis de Resultados (5%)

El aislamiento de las cepas que estaban en la tierra contaminada permitió obtener una mezcla de microorganismos. Seleccionamos los que fueran aptos para utilizar el hidrocarburo como nutriente y más tarde sobrevivir en agua de mar. Esto requirió sucesivas amplificaciones en soluciones que tenían mayor proporción de esta agua con respecto al buffer PBS. Esto fue realizado en el biorreactor a microescala. El medio de cultivo fue diferencial bajo la premisa de que la única fuente de carbono era el crudo de petróleo. El recuento de bacterias que se desarrollaron en el bioreactor se evaluó por estudios de UFC/ml (Unidades Formadoras de Colonias por mililitro) por dilución. En un principio fue lenta la aparición de bacterias con dichas características pero a la cuarta semana de incubar el medio líquido del biorreactor se enturbió y desapareció la mancha de petróleo depositada en él. (Tabla 1). Se hizo densitometría con espectrofotómetro (lecturas de absorbancia a 500nm: A500) y estos estudios tenían concordancia con los de UFC/ml en diferentes diluciones. De manera que los siguientes estudios nos regimos sólo por A500. Los tipos bacterianos que eran capaces de multiplicarse en estas condiciones, formaron colonias algunas eran de color amarillo y otras blancas y se llamaron R1, R2 y R3 las amarillas y A1 las blancas.

Las cepas bacterianas se multiplicaron en medio líquido enriquecido y a partir de él se hizo cultivos en placas para visualizar si algunas de ellas tenían efecto sobre una lámina de crudo. En este punto, nos quedamos con R1 y R2, que resembramos en el biorreactor limpio. En esta situación evaluamos nuevamente su aplicabilidad en agua de mar según lo indicado en el gráfico 1. Como se observa R2 no logró digerir el crudo inclusive después de 9 días en cambio R1 lo hace en sólo 3. Ambas no afectaron el pH de la solución.

Una segunda experimentación realizamos con R1. Quisimos poner a prueba su capacidad utilizando agua de mar sin esterilizar, recién traída de San Antonio porque deseábamos ver de qué manera afectaban los microorganismos nativos a R1 en su acción digestiva. Según lo muestra el gráfico 2, R1 logra limpiar el agua contaminada en 7 días en un matraz sin agitar, en cambio el control mantiene las manchas de crudo en su superficie.

Muestras de R1, son llevadas a la Universidad Andrés Bello y entregadas al Bioquímico Juan Carlos Ríos que junto al alumno del Doctorado Boris Barrera someten a estudios a R1, entregándonos como resultado de que se trata de un tipo Corynebacterium.

El otro aspecto de nuestra investigación era el uso de sustratos adherentes, entre ellos pelos, plumas, Lemna Minor viva y seca. De acuerdo a lo indicado en el gráfico 3, las plumas son el mejor captador de crudo, seguido por Lemna Minor viva y pelo humano, última es la Lemna seca que en la imagen 5, se revela que hay gran cantidad de crudo sobre el agua.

Acción sustrato – bacterias: Cuando plumas que han adherido petróleo son limpiadas por bacterias se observa que el lavado de las plumas se efectuó en pocos días (4 – 5 días) sin requerir agitación de las placas de petri en las que se depositó las plumas. La medición que indica el gráfico 4, en la que se muestra el aumento de A500 debido a la multiplicación bacteriana en conjunto a la degradación del crudo que estaba unido a las plumas. Es notable la capacidad limpiadora que adquiere R2 para limpiar las plumas, recordemos que en el bioreactor su capacidad no logró limpiar una mancha en inclusive 9 días, en cambio en presencia del sustrato plumas su capacidad de asemeja a R1. Creemos que componentes químicos que están presentes en las plumas son necesarios para el desarrollo de R2. Los sustratos son fuente de muchos componentes químico- biológicos que pueden ser requisito en el desarrollo de bacterias.

14. Impacto y Estrategia de Difusión (5%)

Su aplicación pudiera ser masificada dada la fácil implementación, los materiales propuestos son de bajo costo y conocidos por la mayoría de las personas. La pluma de ave es tan eficiente que tan sólo ella puede ser un agente limpiador tan poderoso que motive a empresarios en incorporarlo en sus protocolos de limpieza. En el derrame del puerto de San Antonio (28/9/2010), debió cerrarse el puerto por 15 días y con más de 50 personas trabajando en forma continuada (según información entregada por Gobernación Marina) y con gran despliegue de recursos para un derrame de cerca de 2000 litros de crudo. Pero si se hubiera usado plumas en forma masiva, en horas se hubiera extraído el crudo (in vitro demora segundos), y el uso de bacterias como R1 haría la limpieza de arena y rocas, debido a que las bacterias pueden penetrar con gran eficacia en cada orificio en el que haya escurrido hidrocarburo. Consideramos además que el aislamiento y caracterización de nuevas cepas digestoras de petróleo pueden significar la presentación de una publicación científica como paper o al menos una comunicación libre, en estudio de ello también puede ser interesante la divulgación de las propiedades recolectoras de crudo por parte de las plumas y las mismas sociedades que juntan pelos pueden incluir plumas como un sustrato con todas las ventajas previamente descritas.

15. Conclusiones y Proyecciones (10%)

A partir de nuestros estudios podemos concluir que:

• El petróleo crudo puede impregnar objetos inertes o provenientes de seres vivos y puede ser solubilizado en condiciones de laboratorio controladas utilizando cepas de bacterias de origen ambiente natural.

• Estas cepas de bacterias probaron la capacidad de formar halos de “digestión” en una película de petróleo en mezclas de PBS y agua de mar.

• La cepa R1 fue capaz de actuar sobre el petróleo en agua de mar, formando colonias sobre el hidrocarburo, en condiciones de pH neutros y Tº ambiental fría.

• Estas bacterias, in Vitro, permiten rescatar significativamente el agua de mar impregnada de petróleo con respecto a sus controles: sin bacterias, otras bacterias, pelos humanos, plumas de gallina y plantas acuáticas entre otras.

• Estas bacterias, pueden ser fuente de nuevos estudios acerca de los mecanismos que les permiten tales propiedades y estudiar su genética para comparar y tal vez compartir sus genes.

• Su uso puede ser promisorio para ser utilizada in situ sobre derrames como el que actualmente contamina las costas marinas de Luisiana (USA).

16. Relevancia y Originalidad de la Investigación (20%)

La presente investigación ha logrado aislar e identificar un nuevo tipo bacteriano que es capaz de degradar petróleo. Sus características son llamativas porque su origen es de tierras de la ciudad de Santiago contaminadas por combustibles y fueron capaces de proliferar en un ambiente acuático y más aún, agua de mar, por lo que este tipo bacteriano debe poseer numerosas adaptaciones que le permiten tal plasticidad. El tipo bacteriano Corynebacterium ostenta de ser células de gran uso en industrias biotecnológicas, por lo cual, existe la posibilidad de que ella produzca, en forma masiva, los agentes limpiadores de petróleo. Queda también el desafío de estudiar los componentes bioquímicos y enzimáticos que le otorgan sus propiedades, luego de lo cual puede constituir una nueva fuente genética de interesantes capacidades a exportar, por biotecnología, a otras células.

Cuando el peluquero de Alabama, Phil McCrory, hace la observación de la propiedad captadora de crudo por parte del pelo no imaginó las campañas mundiales que generó su observación. Ha sido de gran importancia su rol en extraer petróleo para limpiar aguas de manera amigable con el medio ambiente y creando conciencia del rol que cada persona tiene en sucesos que dañan el medio ambiente, como ocurrió en el accidente del Golfo. Pero parece ser, que no notó que las aves captaban más petróleo que los animales y que la sobrevida de ellas es más compleja luego de un derrame. Nuestro trabajo demuestra que las plumas de aves casi duplican la capacidad del pelo como captador de crudo y de paso hacen uso de un desecho de la avicultura. Nuestras observaciones suman un nuevo agente adherente de crudo que da posibilidad de tener stock de muchas toneladas; Lemna Minor para posibles derrames y un uso de ella mientras no ocurran tales derrames porque su calidad proteica y lipídica la hacen un alimento animal de excelente calidad. Otros estudios realizados en nuestro laboratorio la indican como una notable fertilizante agrícola.

17. Aporte a la Calidad de vida y al desarrollo sustentable del Recurso Hídrico (20%)

El recurso agua se encuentra en peligro, las frecuentes situaciones accidentales relacionadas con la extracción de crudo, el transporte, y el uso hacen que millones de litros de agua de mar se contaminen. Las técnicas actuales se han hecho insuficientes ante los graves accidentes como el ocurrido en el Golfo. Lamentablemente, la incapacidad de sacar por métodos físicos el crudo ha hecho que las autoridades tomen decisiones que conllevan otras contaminaciones, entre las cuales está la quema de combustibles que lanzan a la atmósfera toneladas de contaminantes y el uso de agentes químicos es un tema de gran polémica. El Corexit es un agente dispersante que se consideró como una sustancia limpia de agregar en

el mar pero nuevos estudios han determinado que posee alta toxicidad. El personal de Exxon Valdez que lo aplicó se vio afectado con numerosas afecciones en su salud. Actualmente, se le indica que posee mayor toxicidad que el mismo petróleo, sin embargo informaciones de prensa indican que se han lanzado al Golfo alrededor de un millón de galones para la limpieza del crudo. Informaciones indican que el peligro que tiene esta situación es que inclusive el Corexit puede evaporarse y llegar a las nubes para desplazarse y llover el contaminante en lugares continentales a kilómetros de distancia.

Los métodos naturales, no dañan ni al medioambiente ni a las personas y nos proveen de soluciones sustentables en el tiempo y prueba de ello son lugares específicos donde se han realizado estrategias de este tipo.

18. Bibliografía

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http://scienceblogs.com/speakeasyscience/2010/05/a_lethal_concentration.php • Parrish, P., Clark, J., Prince, R. (1999). Alaska Oil Spill Bioremediation Monitoring Program:

An update. USEPA, NHEERL, Gulf Ecology Division, 1 Sabine Island Drive, Gulf Breeze, FL 32561.EPA.

• Fernández, C., Llobregat, M., Jiménez, B., Altomare, V., Labrador, H. (2008). Biodegradación de asfalteno y resinas por microorganismos presentes en suelo contaminado con hidrocarburo. Centro de Investigaciones Ambientales, Av. Universidad, Barbula, Valencia-Venezuela. http://www.scielo.org.ve/img/fbpe/rfiucv/v23n4/body/art01.htm

• Korda, A, Santas, P, Tenente, A, Santas R. (1998). Petroleum hydrocarbon bioremediation: sampling and analytical techniques, in situ treatments and commercial microorganisms currently used. Applied microbiology and biotechnology. 48(6):677-86.

• Lopolito, M., Molina, L., Corbella, M., Cavas, S., García, S., Lanfranchi, D., Gómez, C., Higa, L. 2007. Biodegradación de hidrocarburos de petróleo y compuestos relacionados. http://www.ingenieroambiental.com/info/biohidro.pdf

• Merino, F.1998. Estudio de microorganismos nativos productores de emulsificantes de petróleo. UNMSM. Lima- Perú. (Tesis para optar por el grado de Magister) http://biblioteca.universia.net/html_bura/ficha/params/id/28687.html

• Moreno, C. 2007. Contaminación del agua. http://www.monografias.com/trabajos/contamagua/contamagua.shtml

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• Valente, M. 2007. Bacterias degradan petróleo en la Antártida. Tierramérica 110. http://www.tierramerica.net/2003/1215/articulo.shtml

• Varpetr

• Ecohttpgolf

18. Anexo

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Tabla 1: Estudio de UFC/ml bacterias degradadoras sobre agua de mar.

Primer

Recuento

(1ª semana)

Inóculo Dilución Colonias/placa Cálculo UFC/ml

0,2ml 1:10 13 13x10x5 520

0,2ml 1:100 0 0

0,2ml 1:1000 0 0

Segundo Recuento

(2ª Semana)

0,2ml 1:10 509 509x10x5 25.450

Tercer Recuento

(4ª Semana)

0,2ml 1:10000 35 35x10000x5 1.750.000

Gráfico 1: Gráfico que combina 3 variables (Absorbancia 500nm, tiempo y pH), e indica información de bacterias y el petróleo.

Gráfico 2: Gráfico que muestra la acción de la cepa R1 en agua de mar traída de San Antonio. Se acompaña (abajo) la imagen de la superficie del frasco control aún con manchas de petróleo.

Tabla 2: Parámetros bioquímicos de R1:

Gráfico 3: recolectora de mar.

0

0,2

0,4

0,6

Dcontrol 0R1 0R2 0

Gráfico qude diverso

Día 2 Día 40,045 0,0760,394 0,4440,254 0,386

ue muestra os sustratos

ImnatMi

la acción s en agua

G

control

R1

R2

agen 5: Cturales: Leminor seca y p

Gráfico 4: GR2 sobre su

Captación dmna Minor plumas de a

Gráfico queustratos (plu

de crudo viva, cont

aves.

e muestra laumas) en ag

por mediotrol, pelo hu

a acción diggua de mar

o de sustrumano, Lem

gestora de R

ratos mna

R1 y