Sequenzanalyse nach Sanger

Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt.lat.: sequi = folgen

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Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt.lat.: sequi = folgen

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In der Regel verläuft diese in 4 Abschnitten

Vervielfältigung Denaturierung Kettenabbruch-verfahren

Gelelektrophorese

Vervielfältigung Zu untersuchendes Stück der DNA wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion(PCR) vervielfältigt.

1. Schritt: Erwärmen 94oC

Vervielfältigung

2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60oC. 94oC

Vervielfältigung

2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60oC. 94oC

60oC

Vervielfältigung

2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60oC.

A

60oC

Vervielfältigung

3. Schritt: Erhitzen auf 78oC und Zugabe von Nucleotiden.

A

60oC

78oC

Beobachtung: Die Taq-Polymerase synthetisiert ausgehend von den beiden Primer den komplementären Strang

Vervielfältigung

3. Schritt: Erhitzen auf 78oC und Zugabe von Nucleotiden.

A

78oC

Vorgang startet nun erneut mit Schritt 1 aber mit dem Unterschied, dass nun gleichzeitig 2 DNA-Abschnitte dupliziert werden.

Vervielfältigung

1. Schritt: Erwärmen (Wiederholung …) 94oC

94oC

usw.

usw.

VervielfältigungNach einigen Durchläufen der PCR bei denen sich die Menge an DNA jeweils verdoppelt, liegen ausreichende Mengen der zu untersuchenden DNA vor.

Denaturierung

1. Schritt: Erwärmen um die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren zu lösen 94oC

2. Schritt: Zugabe von Natronlauge um eine erneute Zusammenlagerung zu verhindern. Die DNA liegt nun endgültig in Form von Einzelsträngen vor, die sich nicht mehr zusammenlagern können.

3. Schritt: Zugabe eines einzelnen Primers, der eine radioaktive Markierung besitzt und sich nur an den codogenen Strang anlagert. Der komplementärer Strang wird nicht benötigt!

AT G

Hybridisierung

AT G

Damit sind nun automatisch drei Nucleotide bekannt.

A T C

Zum Versuchsansatz werden nun die Taq-Polymerase, die 4 Nucleotide und ein Abbruchnucleotid hinzugefügt.

AT

CG

A

Bei einem Abbruchnucleotid wird am 3`- Ende der Desoxyribose die OH-Gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt. Dadurch entsteht eine Didesoxyribose. An ihr ist keine Kettenverlängerung mehr möglich.

A

HOH

A

HH

Adenosinnukleotid AdenosinabbruchnukleotiddA ddA

200 : 1

Man gibt dA im Überschuss zu damit eine Kettenverlängerung möglich wird. Nur dA würde immer einen Kettenabbruch bei der ersten Thyminbase bewirken.

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf: 1. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 1. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 1. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf: 1. Variante

A T CA

Weitere Kettenverlängerung ist nicht möglich, daher erfolgt ein Kettenabbruch. Trennung der komplementären Stränge durch Temperaturerhöhung.

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf: 1. Variante

A T C

AT G A

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf: 2. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 2. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 2. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 2. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 2. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 2. Variante

A T CAT G A

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 2. Variante

A T C

AT G A

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf: 3. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 3. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 3. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 3. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

AT G

Ablauf 3. Variante

A T C

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T CAT G

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T CAT G

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T CAT G

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T CAT G

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T CAT G

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T CAT G

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T CAT G A

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T C

AT G A

Kettenabbruch-reaktion

Ablauf 3. Variante

A T C

AT G A

Ergebnis nach 3 Durchläufen

AT G A

AT G A

Nun wird das Experiment mit den restlichen 3 Abbruchnucleotiden (ddT, ddG,ddC) durchgeführt.

AT G A

AT G A

AT G A

AT G C

CAT G

AT G C

AT G C

AT G T

AT G T

AT G T

AT G G

AT G G

AT G G

Abbildung aller möglichen Sequenz-Abschnitte.

Könnte man diese optisch nach ihrerLänge sortieren ergäbe sich die gesuchteDNA-Sequenz!

G C A T G T A G C G C T AA T C

AT G A

AT G A

AT G A

AT G C

AT G G

AT G T

CAT G

AT G T

AT G G

AT G C

AT G G

AT G C

AT G T

Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird.(Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte, die mit einer dd-Abbruch- Base erhalten wurden eingefüllt

ddA-Stücke

ddT-Stücke

ddC-Stücke

ddG-Stücke Spannung wird angelegt

DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol).

ddA-Stücke

ddT-Stücke

ddC-Stücke

ddG-Stücke

Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird.(Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt

DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol).

Spannung wird angelegt

Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird.(Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt

DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol).

Da die Primer radioaktiv markiert sind können die DNA-Fragmente über einen Röntgenfilm sichtbar gemacht werden.

Spannung wird angelegtddA-

StückeddT-

StückeddC-

StückeddG-

Stücke

ddA-Stücke

ddT-Stücke

ddC-Stücke

ddG-Stücke

Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird.(Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt

DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol).

Da die Primer radioaktiv markiert sind können die DNA-Fragmente über einen Röntgenfilm sichtbar gemacht werden.

Spannung wird angelegt

ddA-Stücke

ddT-Stücke

ddC-Stücke

ddG-Stücke

Gelelektrophorese Auswertung

Das kürzestes DNA-Stück läuft im Gel am Weitesten. Es hat als Abbruch-BaseCytosin.

Die komplementäre Base des codogenen Stranges lautet also Guanin

G

Das um ein Nukleotid längere DNA-Stück läuft im Gel am Zweitweitesten. Es hat alsAbbruch-Base Guanin.

Die komplementäre Base des codogenen Stranges lautet also Cytosin.

C

usw.

ATG

T

A

G

C

GCT

Da die Taq-Polymerase von 3 5synthetisiert kann man nun auch die Polarität der DNA direkt angeben.

3`

5`

ddA-Stücke

ddT-Stücke

ddC-Stücke

ddG-Stücke

GelelektrophoreseHäufig wird eine andere Art der Darstellung gewählt.Dabei verbindet man die einzelnen Basen mit Linien untereinander und speichert die dabei erhaltenen Kurvenverläufe als Kennlinie der gesuchten DNA-Sequenz ab.