Métodos de sequenciamento de DNA

Método de Sanger

Frederick Sanger

• Bioquímico Inglês

• Ganhou 2 Prêmio Nobel em química

• 1958 ele foi premiado por seu trabalho sobre a estrutura das proteínas, especialmente o de insulina

• 1980, Walter Gilbert e Sanger compartilharam metade do prêmio "por suas contribuições relativas à determinação de seqüências de bases em ácidos nucléicos"

Jay Shendure & Hanlee Ji. 2008. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26(10).

Metodo de término da cadeia (chain termination method)

• O método consiste na síntese de cadeias a partir do fragmento de DNA a ser sequenciado - cadeias estas que são marcadas radioativamente numa extremidade e diferem entre si por um nucleotídeo.

• Permite determinar a sequência exata de uma cadeia de DNA com até 500 nucleotídeos.

• Por separação das cadeias clivadas através da eletroforese, pode estabelecer-se a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA original.

• São necessários primers para que se inicie a reação pela DNA polimerase.

• O primer é que define qual a cadeia que é usada como molde.

não permitem a formação de uma ligação fosfodiéster com outro

nucleotídeo trifosfato, pelo qual a sua incorporação na cadeia resulta numa cadeia clivada, nesse ponto.

dNTPs (desoxirribonucleosídeos trifosfatados)

ddNTPs (didesoxirribonucleosídeos trifosfatados)

dATPdGTPdCTPdTTP

ddATPddGTPddCTPddTTP

Sintese da cadeia com nucleotídeos modificados

DNA polimerase é inespecífica para ambos

Altas Concentrações Baixas Concentrações

Em cada reação, um ddNTP é incorporado aleatoriamente na posição do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização

Sanger et al., 1977

A inclusão de marcadores fluorescentes com diferentes cores para cada tipo de ddNTP permite a distinção das cadeias marcadas pela respectiva fluorescência. Por exemplo, todas as sequências clivadas que terminem com um ddGTP podem ter fluorescência de cor amarela, as terminadas com ddATP com cor verde, etc., independentemente dos seus tamanhos.

Por electroforese das sequências de nucleotídeos em gel de poliacrilamida, separam-se as diferentes cadeias simples de DNA (as quais diferem entre si apenas por um nucleotídeo).

• Simplificou o sequenciamento de DNA – kits disponíveis comercialmente

• 1985- Leroy Hood e colaboradores desenvolveram marcadores de ddNTPs fluorescentes - automação da técnica para o seqüenciamento de DNA, com alto rendimento.

• As limitações: ligação não específica do primer com o DNA, afetando a precisão da leitura e estruturas secundárias de DNA que afetam a fidelidade da sequência.

• Clonagem das sequencias, nem sempre são as desejadas e também demandam tempo

Método de Sanger

Depois de três décadas de melhoria gradual, a bioquímica Sanger pode ser aplicada para conseguir ler os comprimentos de até ~ 1.000 pb e precisões tão elevadas como 99,999%.

No contexto de alto rendimento no sequenciamento genômico por shotgun, os custos de sequenciar pelo método de Sanger chega a $ 0,50 por quilobases.

Jay Shendure & Hanlee Ji. 2008. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26(10).