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Tesis de Posgrado

Regulación de enzimas del ciclo deRegulación de enzimas del ciclo deasimilación fotosintética de CO2asimilación fotosintética de CO2

Hertig, Cecilia Margarita

1985

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Hertig, Cecilia Margarita. (1985). Regulación de enzimas del ciclo de asimilación fotosintética deCO2. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1879_Hertig.pdf

Cita tipo Chicago:Hertig, Cecilia Margarita. "Regulación de enzimas del ciclo de asimilación fotosintética de CO2".Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1985.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1879_Hertig.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

REGULACION DE ENZIMAS DEL CICLO DE ASIMILACION

FOTOSINTETICA DE C02

Autor: CECILIA M. HERTIG.

Director: RICARDOA. NOLOSIUK.

Lugar de trabajo: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOQUIMI­

CAS "FUNDACION CAMPOMAR".

TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICAS.

AÑO 1985

Lñï‘B9' ‘2x

,1}M/Wfia,amm7wa MM/ ¡(MMA¡52.2 ' ¡FW 'ya 07flmWWou m‘mwwfiwáb'n.

“Todos ios dias pienso muchisimas veces que mi vida ­exterior o interior - descansa sobre e] trabajo de loshombres de] presente y de ios que ya no se encuentranentre Ios vivos, y que debo reaiizar un esfuerzo pararetribuir en iguai medida todo 10 que he recibido y loque sigo recibiendo."

Aibert Einstein

AGRADECIMIENTOS

A1 Dr. D. Cïar, por haberme iniciado en 1a tareacientifica y a1 Dr. A.A. Boveris, que me permitió rea1i­zar “mi primer experimento en serio".

A1 Dr. L.F. Leïoir y a Ios Miembros de] ConsejoDirectivo, por haberme permitido realizar este trabajo ene] Instituto y acceder a sus invaïorabïes enseñanzas.

A1 Dr. R.A. Noïosiuk, que decididamente me incuïcó suactitud critica y abierta tanto para 1a discusión de lasideas como de la metodo1ogia experimenta] y por su dispo­sición docente en 1a transmisión de su experiencia, 1acua] posibiïitó 1a reaïización de esta tesis.

A1 Dr. C.E. Cardini, Consejero de Estudios, por suapoyo en 1a e1ecci6n de 105 cursos de] Doctorado.

A mis compañeros de 1aboratorio: Mariana Stein, Este­ban Cor1ey y Li1iana Busconi, por brindarme su ayuda, conquienes comparti en amistad los diferentes momentosvivi­dos durante esta etapa.

A1 Dr. A.J. Parodi, por su incesante estimuïo y cola­boración permanente, y a 1os Dres. M.T. Tellez-Iñón y A.Pa1adini, por su generoso aporte en e1 desarro110 deaïgunas experiencias.

A 105 compañeros de] I.I.B., por su permanente dispo­sición ante cuaiquier tarea, y a Daniel Boscoboinik,Danie] Mende120n, Marta B1umenfe1d, Ricardo Attar, MónicaTorrue11a, A1berto Ochoa, Marce1a Ferrer, Angeles Zorre­guieta y Angeï Cataïdi en especia], por 10s gratos momen­tos y e] estimu1o mora] brindado durante estos años.

A Margarita Mazzardi, Mary B. de Iozzoïino, BeiïeNoïf y Francisco Irusta, por 1a eficiente y agradabïe

c01aborací6n proporcionada.

A Norberto Ma1arini, por su eficacia, disposición yconocimiento para 1a rea1ízaci6n de 1os dibujos.

A María Doïores Turró, por su paciencia y profesiona­1ismo en 1a transcripción e impresión de esta tesis.

A0.5¡

Ac'/ACH:ATPasa:ANS:

CAPP:

CoA:

CF1:DCMU:

DEAE:

DHAP:

DNA:

DTT:

EDTA:

EGTA:

E4P:FAD:

FBP:

FBPasa:F6P:Fd:GAP:

GÏUBP:

HEPES:

10.5:

Ko.5=

ABREVIATURAS

Concentración de efector requerida paraa1canzar 1a mitad de 1a máxima actividadespecífica.Acetato, ácido acético.Adenosínatrífosfatasa.Ani]in-nafta1en-su1fónico.2-c10ro-10-(3-aminoprop11) —fenotiazínac1orhidrato.Coenzima A.

Factor ac0p1ante de cïoropïastos.3-(3,4-dic10rofení1)-1,1,-dimetí]urea.Dietilaminoetil.Díhídroxíacetona fosfato.Acido desoxirribonucïeico.Dítíotreito].Etiïendiamino tetraaCetato.Etílengïícoï-bis-(B-aminoetiï eter)-te­traacetato.Eritrosa 4-fosfato.Flavfn adenin dinucïeótíco.Fructosa-1,6-bisfosfato.Fructosa-1,6-bisfosfatasa.Fructosa-G-fosfato.Ferredoxina.G]iceraïdehído-3-fosfato.G1ucosa-1,6-bisfosfato.N-2-hidroxieti1píperazina-N'-2-etanosu1fónico.Concentración de moduïadores requeridapara 1acanzar 1a mitad de 1a inhibición.Concentración de cofactor requerido paraa1canzar 1a mayor veïocidad máxima.

Ma]:MES:

B-met:NAD+, NADH:

NADP+, NADPH:

OAA:

PCMB:

PEP:

PGA:

P1:Pir:PzeA:PPi:PSA:

RuBP:

R5P:RuSP:SBP;

SBPasa:S7P:SDS:

TEMED:

TEAE:

XuSP:

Ma1ato.Acido 2-(N-morfo]íno)-etano-su1f6nico.B-mercaptoetano].Formas oxidada y reducida de nicotfnamfn dinucïeótido.Formas oxidada y reducida de nicotfnamfn dínucïeótído 2‘fosfato.0xa1oacetato.p-cïoro mercuribenzoato.Fosfoeno1piruvato.3-fosfog1icerato.Fosfato inorgánico.Piruvato.1,3-dífosfogïícerato.Pirofosfato.Persu1fato de amonio.Ríbu1osa-1,5-bísfosfato.Ríbosa-S-fosfato.Ribuïose-S-foáïato.Sedoheptu]osa-1,7-bisfosfato.Sedoheptu]osa-1,7-bisfosfatasa.Sedoheptuïosa-7-fosfato.Dodeci1 su1fato de sodio.N,N,N‘N‘tetrametiïetiïenedíamina.Trietílamínoetiï.Xí1u1osa-5-fosfato.

INDICE

RESUMEN

1. INTRODUCCION.

1.1. Significado genera] de 1a fotosíntesis.

1.2. Fotosintesis en términos de organizaciónceiuiar y mo1ecu1ar.

. E1 cioropïasto.1.3.1. Estructura y función.

cioropïastos de1.3.2. Origen de ios p1antassuperiores.

1.4. Bioquímica de 1a fotosintesis.1.4.1. Conversión de 1a energia.1.4.1.1. Sistema transportador de e1ectrones foto­

sintéticos.Conservación de 1a energia..2

¡2.12.2. Generación de ATP.

s

. Generación de] poder reductor.

..A imiïación fotosintética de C02.. . Cicio de Benson-Caivin..1.

. .2. Metaboïismo de C4.

. .3. Tipo CAMo variante de} sindrome C4.Regu1aci6n de 1a fotosíntesis.

bb-hJ5-D-D-b-DbHHHHHHH

.

MWNNNNb-J

C

.1. Reguïación de 10s procesos de 1a conver­sión energética.

1.4.3.2. Reguïación de 1a asimiïación foto­sintética de C02.

1.4.3.2.1. Activación por 1uz.1.4.3.2.2. Reiación c10r0p1asto-citop1a5ma.1.4.3.2.3. Interacción de ios mecanismos modu1a­

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SO

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_ VI _

dores mediados por 1uz.1.4.3.2.2. Mecanismos de desactivación en 1a

oscuridad.1.4.4. Regu1ación de otros procesos metabólicos

mediados por luz.1.4.4.1. La qu comodesactivador enzimático.1.4.4.2. Metabo1ismo de 02 dependiente de 1a iuz.1.4.4.3. Asimiïación de N03-.1.4.4.4. Asimiiación fotosintética dei 504:.

2. MATERIALES l METODOS.

2.1. Purificación de FBPasa y tiorredoxina dehojas de espinaca.

2.1.1. Purificación de FBPasa.2.1.2. Purificación de tiorredoxina.

8.2. Determinación de 1a actividad FBPasa.2.2.1. Determinación de 1a actividad fosfatasa.

2.3. Determinación de 1a actividad de. tiorre­doxinal

. Determinación de 1a actividad SBPasa.1. Activación fotoqufmica de 1a SBPasa.2. Activación quimica de 1a SBPasa.3.

2.42.4.2.42.4 Ensayo de 1a actividad de SBPasa.

2.5. Purificación de 1a NADP-GAP-deshidrogenasa.

2.6. Determinación de 1a actividad de NAD(P)-GAP­deshidrogenasa.

2.7. Cromatografía de 1a FBPasa en estado activo.

2.8. Cromatografía de 1a NADP-GAPdeshidrogenasa.

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- VII ­

2.9. Purificación de caimoduiina.2.9.1. Preparación de 1a CAPP-Sefarosa.

2.10. E1ectroforesis en ge1es de poïiacri1amida encondiciones desnaturaiizantes.

2.11. Preparación de cioropiastos.2.11.1. Preparación de membranas.

2.12. Cuïtivo de cianobacterias.2.12.1. Cosechado de 1as cianobacterias.2.12.2. Ensayo de] desprendimiento de 02 en cé1u­

1as de Nostoc muscorum.

3. RESULTADOS.

Regulación de 1a fructosa-1,6-bisfosfatasa.. Fase de modificación.

. Efecto de 10s azúcares-fosfato.1. La fructosa-1,6-bisfosfato.

.2; Otros azúcares bisfosfato.

1

1

1

]

1

1 1

1 .2. Otros metales biva1entes.1 . Efecto de 1a tiorredoxina-f reducida.1 . Efecto de] pH.

.2. Fase de catálisis.2

. .2. .1. La fructosa-1,6-bisfosfato.2 .

2

2

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. Otros azúcares bisfosfato.

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.2. Requerimiento de otros metaies.3. Efecto dei Ca2+.

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- VIII ­

3.1.2.3. Requerimientos de pH.3.1.3. Anáiisis de 1a

Ca2+ con 1a FBPasa.interacción de FBP y

3.2. Reguiación de 1a actividad sedoheptu]osa-1,7­bisfosfatasa.

.2.1. Actividad SBPasa asociada a 1a FBPasa.

.2.1.1. Fase de activación.

.2.1.2. Fase de catáiisis.

.2.2. Actividad de sedoheptuïosa-l,7-bisfosfatasa(especifica).

3.2.2.1. Fase de activación.3.2.2.2. Fase de catáiisis.

3.3. Efecto modulador de] Ca2+ sobre 1a actividadde ciertas enzimas reguiatorias.

3.3.1. Efecto de caimodulina.3.3;2. Participación de un factor moduiador en 1a

activación de 1a FBPasa por Ca2+.3.3.2.1. Locaiización y purificación.3.3.2.2. Caracterización.3.3.2.3. Efecto de] factor en 1a regulación de 1a

actividad FBPasa.3.3.2.3.1. Fase de modificación.3.3.2.3.2. Fase de catáiisis.3 3.2.4. Efecto sobre 1a oxidación dei H20.

3.4. Desactivación de 1a FBPasa.3.4.1. Efecto de oxidantes.3.4.2. Efecto de ias poiiaminas.

3.5. Reguiación de 1a glicera]dehido-3P-deshidro­genasa.

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4. DISCUSION.

4.1. Generaïídades.

Fructosa-l,6-bisfosfatasa.

Sedoheptuïosa-l,7-bisfosfatasa.

NADP-GAP-deshidrogenasa.

Cambios estructura1es de 1as enzimas por 1a1uz.

Modulación por Ca2+.

Sistema de oxidación de H20.

Integración de 1a reguïacíón metabóïica.

5. REFERENCIAS.

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RESUMEN

Las cianobacterias, las algas y las plantas superioresson capaces de captar la energia luminica para la reduc­ción fotosintética de C02 a (CH20) utilizando H20 comoreductor. Este proceso se lleva a cabo en el caso de lasplantas superiores en organelas especializadas, loscloroplastos, los cuales contienen los pigmentos queabsorben la luz distribuidos en vesículas membranosas(tilacoides).

Una vez captada, la energia luminica es covertida enenergia electroqufmica en la cadena fotosintética detransporte de elctrones. En este proceso se generan ATPyNADPH, los cuales son utilizados por las enzimas delciclo de Benson-Calvin (ciclo reductivo de las pentosasfosfato), localizadas en la porción soluble delcloroplasto (estroma), para la fijación del 602. Estasenzimas, a excepción de la fosforribuloquinasa y laribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (la proteina másabundante en la naturaleza) están distribuidasampliamente entre los organismos vivos y actúan tanto enla sintesis como en la degradación de los hidratos decarbono en animales, plantas y microorganismos. En elcaso de los organismos fotosintéticos, dichas enzimasestán involucradas en la asimilación, acumulación ydegradación de los compuestos carbonados.

A diferencia de las enzimas de organismosheterotróficos, las enzimas del estroma de cloroplasto (ycianobacterias) presentan la particularidad de ser regu­ladas por la luz: las que intervienen en la asimilacióndel C02 son activas en la luz e inactivas en la oscuri­dad, en tanto una situación opuesta se observa con lasenzimas que intervienen en la degradación de los hidratosde carbono. Los estudios in vitro han tratado de correla­

cionar 1a activación enzimática mediada por efectores conios cambios en sus concentraciones, que ocurren en eiestroma de] cioropiasto a1 producirse 1a transiciónoscuridad-iuz.

Enzimas inactivas

pH (7—>8) pH (8—>7)Tiorredoxina red. GSSG

Luz Efectores Dehidroascorbato OscuridadAumento M92+ Disminución M92+LEMreducido Componente oxidado

Enzimas activas

En esta tesis, utiiizando extractos de piantassuperiores, en.particu1ar de espinaca, se estudió 1a par­ticipación conjunta de ios diferentes mecanismos modu1a­dos por 1uz en 1a reguiación de ias enzimas ciaves de1cicio de Benson-Caivin. Este cicio inactivo en oscuridadaicanza su máxima actividad 1uego de varios minutos eniuz. Esta fase de inducción ha sido interpretada por 1aacumuiación graduai de metaboiitos generados fotoqufmica­mente, asi como también 1a conversión ienta de un estadoinactivo a uno activo durante 1a transiciónoscuridad-iuz. Este tipo de cinética enzimática fuedescripta por Frieden y se denominó a dichas enzimas"histeréticas". De acuerdo con esta caracteristica es queios ensayos de ias reacciones enzimáticas se iievan acabo en dos etapas: a) Fase de modificación 1enta (min),en 1a que 1a enzima se preincuba con ei sistema moduiadorcorrespondiente y b) Fase cataiitica rápida ( s segundo),que convierte en 1a medición de 1a actividad cataiïtica.

Los resuitados obtenidos señalan que:1 v La activación compieta de 1a FBPasa purificada a homo­

geneidad se produce por 1a acción de un meta] biva­1ente, en particuiar e1 Ca2+ y su sustrato, 1a FBP, apH y (MgZ+)presentes en e] cïoropiasto i1uminado.En e] proceso de activación, 1a tiorredoxina-f redu­cida químicamente con DTT reguia 1a concentración de1a FBP como efector, mientras que su concentracióncomo sustrato es moduiada por cambios en 1a con­centración dei Mgz+.

2) Por otra parte se determinó que 1a FBPasa activada poreste sistema de modificación desarroïia una actividadSBPasa que presenta una actividad específica de unorden de magnitud menor respecto de 1a hidrólisis de1a FBP, pero es del orden de las determinadas porotros autores para SBPasas específicas obtenidas dediferentes origenes.De] mismo modo que 1a FBPasa, 1a SBPasa es activadapor e] Ca2+ y e] sustrato, cuya concentración es modu­1ada por e] sistema de reducción.

3V

La activación de 1a NADP-GAPdeshidrogenasa depende de1a de metaboiitos (1,3PZGA, NADPH,ATP, Pi), cuya con­centración está moduiada por 1uz. La tiorredoxina-f enpresencia de DTT coopera en 1a activación concertadade 1a enzima,Dado que no se detectó cambio apreciabie en Ios pesos

moiecuiares de estas proteínas 1uego de 1a activación, sesupone que 1a modificación en 1a actividad de estas tresenzimas se debe a una transición conformaciona] 1entaentre un estado inactivo y uno activo.

Particuiar atención se prestó en nuestros estudios a1a moduiación dei Ca2+ sobre 1a actividad de 1a FBPasa ySBPasa. Este catión bivaïente participa comoactivador en

1a fase de modificación de 1a enzima, en tanto inhibe 1afase de cataïisis.

E110 condujo a postular que, de participar fisioiági—camente en 1a reguiación enzimática, deberia existir unaseparación tempora] y/o espacia] entre ambas fases dadoe] efecto dual de] Ca2+ sobre estas enzimas.

Esta suposición se sustenta en que e] Ca2* esrequerido únicamente para 1a conversión de 1a enzima a suestado activo y no para 1a estabiïidad de esta forma.

Dado que 1a c0ncentraci6n de Ca2+ requerida para 1aactivación de 1a FBPasa es mayor que 1a inhibitoria, seanaiizó si otros componentes participaban en este sistemade modificación. Las calmoduiinas provenientes dediferentes fuentes activaron a 1a FBPasa sin disminuir 1aconcentración de Ca2+ requerida como activador. Por e110se descartó su posible participación en 1a moduiación de1a FBPasa.

Por otra parte, iuego de] tratamiento de 1a FBPasa conEGTAse separa una fracción que estimula le actividadespecifica en presencia de Ca2+y FBP. Este factor dismi­nuye en un orden de magnitud 1a constante de activaciónpara e] Ca2+ en 1a fase de modificación; además 1a con­centración de Mg2+ requerida para e] desarroïlo de 1acatáiisis es menor en comparación con 1a FBPasa que hasido activada en ausencia de] factor.

Fracciones de 1as membranas ti1acoides de 1osc10rop1astos de espinaca y de membranas de cianobacterias(Nostoc muscorum) contienen una actividad simiiar.Notabiemente, su efecto es independiente dei sistema dereducción, ya que requiere soiamente 1a presencia deCa2+ y FBP en 1a fase de modificación de 1a FBPasa.

En ensayos preiiminares, ias preparaciones de estefactor activaron e] sistema de oxidación de1 H20 en

cianobacterias.A pesar de que este factor no está aún bien carac­

terizado, se pudo determinar que está formado por doscomponentes: (A) con un peso moïecular de 14.000-16.000 ysusceptible a 1a digestión por subtiïísina y (B) de pesomolecúïar 1.500-4.000, e] cua] puede ser purificado porcromatografía líquida de alta presión.

1. INTRODUCCION.

1.1. Significado general gg la fotosintesis.La energia solar que incide sobre la tierra es uti­

lizada por diferentes sistemas, entre los que seencuentran los bioenergéticos. Estos sistemas biológicosconvierten la radiación solar en fuerza motriz utilizablepara un cambio y reacción bioquímica. En la biosfera,este proceso es realizado por ciertos organismos espe­cializados como plantas superi0res, algas y bacteriasfotosintéticas (1,2).

El descubrimiento de Joseph Priestley (3) de que lavegetación es el agente reSponsable de revertir el efectode la respiración de los animales llevó a BenjaminFranklin en 1773 a este comentario: "La creación de losvegetales restaura el aire consumido por los animales, loque parece un sistema racional."

A comienzos del siglo XIX el sistema se describirfaen términos más bioquímicos. Robert Mayer sugiere en 1845que la energia radiante proveniente del sol esLder invo­lucrada en una multiplicidad de mecanismos que permitenconservar la energia luminica para su posterior uso porlos organismos vivos. Dichos mecanismos permiten el fun­cionamiento de los ciclos en la biosfera; en particularse encuentran los ciclos del carbono (C02____+.hidratosde carbono) y del agua (H20————->02)(4). Estos ciclosson relevantes por cuanto están relacionados con la agri­cultura (fotosíntesis actual) y con los combustibles (fo­tosíntesis en épocas pretéritas).

Dado que la biosfera constituye un sistema cerradopara la materia (¿3m = 0), el contenido de C02 y 02 en laatmósfera permanece casi constante a pesar de su par­ticipación en la fotosíntesis. Esto es debido al procesode respiración llevado a cabo en las mitocondrias de

todas las células animales y de las plantas; en éste loshidratos de carbono y otros componentes de los tejidosson finalmente convertidos en C02 y H20 con liberaciónsimultánea de energia.

La respiración en los organismos vivos consume10.000 ton de 02/seg. En condiciones ideales la velocidadde fotosíntesis en los vegetales es, aproximadamente,treinta veces mayor que la velocidad de respiración enlos mismos tejidos. De manera que la fotosíntesis es unproceso que regula, por oposición a la respiración, elcontenido de C02 y 02 en la atmósfera. El ciclo operativopuede representarse de la siguiente manera:

h9 (energia solar).7

Fotosfntesis en plantas, algas y bacterias

C02+H20 HdeC+02

ReSpiración en plantas <+,/////y animales

La fotosíntesis puede definirse como la reacciónglobal propuesta por Van Niel donde participan un dadorde electrones y protones y un aceptor (aqui representadopor C02) (5).

HZD + C02 >(CH20) + D

En plantas superiores, algas verdes y cianobacte­

(luz)

rias, el dador de electrones es el H20, por lo tanto y deacuerdo con la ecuación general, se genera 02 por fotóli­sis del H20. En el resto de las bacterias fotosintéticas,anaerobias estrictas o facultativas, el H20 es reempla­zada por SH2 o por sustancias orgánicas, mientras que elaceptor final sigue siendo el C02 (6).

El ciclo del carbono, que comienza por la fijación

de] C02 durante 1a fotosíntesis, es cuantitativamente e]proceso quimico más importante de 1a Tierra, 5610 supera­do por e] ciclo de] H20. Cada año participan en é] de 200a 500 biiiones de toneïadas de carbono.

En estos momentos se estima que 1a productividadagricoia terrestre es de 100 a 125 x 109 ton de materiaseca/año, mientras que 1a de ios océanos es de 44 a45 x 109 ton de materia seca/año (7).

La edad estimada de 1a Tierra es de 4.500 miilonesde años. La aparición de ios vegetaies representa e]comienzo de 1a vida sobre ésta, ta] como se concibe ennuestros dias. La mayor parte de] carbono se encuentra enrestos vegetales que existieron durante e] período car­bonffero, hace ya 250 a 350 miiïones de años (8).

Se han obtenido evidencias de compuestos orgánicos,derivados probab1emente de] resu1tado de procesos metabó­iicos de plantas y animaies en épocas pasadas, aún cuandono se encuentran restos estructuraies y normaïmenteobservabies. Estos “fósiies quimicos" han sido detectadosen rocas de más de 3.000 miilones de años (9).

En e] caso de 1as piantas superiores, aïgas y ciano­bacterias, 1a energia Iumfnica es captada y transformadaen energia quimica por e1 sistema fotosintético detransporte de eiectrones. Este, ordenado en dos foto­sistemas (I y II), puede ser visuaïizado como dos"céiuias soïares" conectadas en serie, donde cada "céïuiasolar" representa un equivaiente de diferencia de poten­cia] de aproximadamente 0.8 voïtios (10,11). La cadena detransportadores redox que conecta Ios dos fotosistemas noes un "conductor" perfecto, de manera que existe unacaida de potencia] de 0.4 voitios entre 1as dos “céïuiasso]ares.' Comoresu1tado de esto, e] potenciai operativonorma] entre ios dos fotosistemas es de 1.2 a 1.3

voïtios. La eficiencia fotosintética de] aparato en sfpuede ser estimada como 1a diferencia de potencia] entreios dos fotosistemas que absorben 1a energía de dos cuan­tos de 1uz (12).

1.2 a 1.3 eV

2 x hV

La energia de un fotón a 680 nm es de aproximadamente1.83 eV.

1.2 a 1.3 eV. . E- .: 0.33 a 0.35

2 x 1.83 eV

Anuaïmente inciden sobre 1a superficie de 1a tierraradiaciones soïares de aproximadamente 3 x 106 EJ/año,equivaïente a, aproximadamente, 75 veces 1as reservasenergéticas provistas por ios bosques f6si1es. Laradiación fotosintéticamente activa se encuentra dentrode regiones de] espectro de longitud de onda de 400 a 700nm, 10 que representa e] 43% de 1a 1uz incidente sobre 1aTierra.

La eficiencia fotosintética determinada sobre 1abase de 1a energia tota] que 11ega a 1a tierra será:

0.33 x 0.43 = 0.12De manera que 1a energia quimica 1ibre de 1.2 a

1.3 eV capturada por e] sistema de transporte de eïectro­nes fotosintéticos representa una eficiencia de] 12%en1a conversión de 1a energia totaï (12).

En términos agronómicos, 1a eficiencia fotosintéticay por 1o tanto 1a productividad de ias cosechas está con­dicionada por factores intrinsecos y extrïnsecos que

afectan a ios vegetaies. Los factores intrinsecos sonaqueiios que están determinados por 1a organizacióngenética de 1a pianta, 1a cua] incide en su eficiencia en1a utiiización de 1a energia Iumïnica. Por ejempio, en su

'evoiución, ias p1antas y ias aigas han desarroiiadosistemas que permiten una mayor eficiencia fotosintéticaa intensidades de 1uz débiies y moderadas. Los factoresextrinsecos afectan directa o indirectamente 1a veiocidadde 1a fotosíntesis como 1a de consumo de ios productosfotosintéticos. Estos factores consisten en: 1a accesibi­1idad dei H20, C02, N2, Pi y varios mineraies que contri­buyen a1 crecimiento de los vegetaies; las condicionesciimáticas; 1a ca1idad de] suelo: etc (12).

1.2. Fotosintesis en términos gg organización ce1u1ar Xmoiecuiar.La fotosíntesis es e] mecanismo ciave que ha deter­

minado 1a existencia de combustibies generados a partirde restos fósiies y en e] presente, posibiiita 1a produc­ción de aiimentos, fibra y energia. Es ei proceso por e]cua] un pequeño porcentaje de 10s cuantos de iuz prove­nientes dei 501 son captados por 1as p1antas verdes,aigas y aigunas bacterias. Estos organismos 11evan a cabo1a transformación de 1a energia 1umfnica en energíaquimica, 1a cua1 es utiiizada en 1a reducción de sustan­cias inorgánicas que se convierten en componentes ceïu­ïares.

Desde e] punto de vista de 1a organización deiaparato fotosintético se puede estudiar ios organismosciasifica'ndo'los:1) Procariotes fotosintéticos.2) Eucariotes fotosintéticos.

1) Procariotes.

a) Bacterias fotosíntéticas (13).

Clasificación Productoras de 02 No productoras de 02Cíanobacterias Bacterias verdes y

purpúreas

Compartimiento Membranas tiïacoides en e1 citoplasma

Reductor H20 SHz, H2, compuestosorgánicos

pigmentos cïorofila a bacterioc1orof11a a,ficobíïíproteïnas b, c, d, e.B-carotenos variedad de carote­zeaxantina noídes

Hidrato decarbono de gïucógenoreserva

b) Bacterias fotosíntéticas simbiontes (14).

División: proch1orofyta. Género: prochïoron.

Membranas ti1acoides empaquetadas como discos.

Pigmentos: cïorofíïa a, b, pérdida de fícobiïípro­

tefnas.

2) Eucariotes.

a) Principaïes c1ases de aigas.

División Aconta Contofora

Compartimiento C1orop1astos en e] citopïasma

Pigmentos ficobi1isomas cïorofiïa b, c,secundarios carotenoides

C1asificaci6n Rodofita Clorofita Cromofita

Hidraio de ami1opectina ami10pec- 1aminari­carbono de tina, a- na, para­reserva miïosa. miïon,

almidón, gÏUCaDOCK-l,4 giucanoB­1,3 (15)

b) P1antas superiores:La diferenciación ceïu1ar condujo a 1a formación de

diversos tejidos fotosíntéticos y no fotosintéticos oheterótrofos, especiaïizados en una función determinada.Asi, con 1a aparición de ias p1antas superiores, se

aicanzaron diferentes grados de organización: ias briofi­tas, ias pteridofitas, ias gimnospermas,ias angiosper­mas.

Los eucariotes (aigas, piantas superiores) 11evan acabo e] proceso giobai fotosintético en organeias a1ta­mente especiaïizadas denominadascioropiastos (15).

1.3. El cioropiasto.Estas organeias son remarcadamente constantes en sus

aspectos básicos de composición, enzimoïogia, y función.La observación actua] de sus deta11es u1traestruc­

turaies ha sido posibie desde e] advenimiento de 1a mi­croscopía e1ectr6nica. La interpretación de muchos aspec­tos de1 c10r0p1asto, secciones y fragmentos de éste enmicrografias ha sido confirmada más recientemente por e]desarroiïo de ias técnicas de ruptura por congeiamiento yextracción de moides (freeze-etching), aportando detaiiesadicionales, asi como su correïación con 1a función deias diferentes regiones de] cioropiasto (15).1.3.1. Estructura l función.

Las micrografias eiectrónicas muestran a 10s c10­r0p1astos como ientes con un eje longitudinaï de 5 a10 u. Los estudios morfoiógicos indican tres estructurasprincipaies: e] par de membranasexternas o "envoltura",un “estroma” amorfo y una estructura 1ame1ar a1tamenteorganizada (Fig. A). Un corte paraieio en e] piano nosmuestra como sus capas membranosas internas se diSponenen forma de discos. Esto sugiere que e] cioropiasto estácompuesto por 1ame1as membranosas, compactadas como piiasde monedas que forman 1a "grana" ciifndrica. Este tipo deestructura habia sido previamente observada con e1microscopio óptico.

Fig. A: Representación esquemática de un cioropïasto.

Estromo

Grano Tilacoide

EnvoHuros

Las pilas ti1acoides de 1a grana están dispuestas en e1cioropïasto de ta] forma que 1os pigmentos fotosintéticosse vean sometidos a una irradiación óptima y que 1as1ame1as grana1es presenten una gran superficie de con­tacto con 1a solución estromática.

Se ha podido estabïecer que determinadas funcionesde] cïoropiasto están asociadas a ïas estructuras men­cionadas (15,16).

La cadena de transporte de e1ectrones capta 1aenergia 1umfnica y 1a transforma en energía e1ectroquf­mica; ésta se encuentra asociada a1 sistema de membranasinternas de1 cïoropiasto. La asimiïacion de1 C02 mediantee] cicio de Benson-Calvin seria dependiente de proteínaspresentes en e] estroma. Por otra parte, se ha deter­minado que 1a envoïtura de] c10rop1asto representa unabarrera permeabïe que reguïa e] movimiento de] carbonofijado, e] poder reductor y 1a energía quimica, dentro yfuera de] cïoroplasto.

Envoltura:Vista con e] microscopio eiectrónico, 1a envoïtura

está formada por dos membranas separadas por un espaciotransiúcido a ios eiectrones, de aproximadamente 10 nm.Su estructura no ha sido investigada en detaïie, peropresenta pequeñas invaginaciones que podrian provenir de1a membrana interna. Pueden observarse también subunida­des giobuiares y estructuras vesicuiares hacia 1aenvoïtura. Esta asociación ramificante de vesicuiasanastomosadas se ha denominado "retfcu1o periférico".Estudios sobre e] desarroiio de ios cioroplastos indicanque las invaginaciones o vesicuias de 1a envoiturapodrian contribuir a1 desarroïlo de 1a grana. Sinembargo, 1uego de separarïas mediante tratamientoosmótico se ha estabiecido que 1a composición quimica yiipfdica de 1a envoitura difiere significativamente deias membranas de 1a grana (18).Estroma e inciusiones:

La envoitura encierra 1a matriz granuiar en la quese embebe e] sistema 1ame1ar. E1 componente más abundanteen e1 estroma es ei proteico (19). Los 11amados centrosde] estroma consisten en un ordenamiento paracristaiinode a1mid6n de 8,5 nm de diámetro y de más de 200 nm deiongitud, ordenados en paquetes hexagonaies (20). Sonparticuïas que generalmente constituyen e] fotosintato dereserva. Los más comunes son Ios granos de aimidón, deaproximadamente 2 u de Iongitud; ios piastogïobuïi, quepodrian funcionar como materia] iipfdico de reserva dep1astoquinona y tocofori1—quinonas y las partícuïas defitoferritina.

Los ribosomas se encuentran en abundancia variabïeen ios cioropiastos de 1a mayoria de ias piantassuperiores (21). Los ribosomas individuaies son de 17 nm

de diámetro, semejantes a ios bacterianos. E1 DNApre­sente puede ser distinguido dei citopiasmatico por sucomposición de bases, por su densidad de fïotación yotras caracteristicas; se puede aisïar como moïécuïascircu1ares de aproximadamente 9 x 107 da1tons.

Asimismo e1 estroma contiene las enzimas de1:cic10de Benson-CaïvinL que cataïizan 1a asimiïación fotosínte­tica de] carbono, de] nitrógeno y de] azufre, asi comotambién de aminoácidos y de pigmentos (22-26).Sistema 1ame1ar interno:

Es un sistema extremadamente compïejo, donde sepueden reconocer: paquetes cerrados, que correspondena 1a grana, que se denominan tiïacoides y una estructuramenos densa, extendida, que interconecta 1as 1ame1as de1a grana.

Este sistema interno de 1ame1as derivado de inva­ginaciones y conexiones de una capa membranosa individuaïdivide e] voiumen contenido por 1a envoltura en doscompartimientos: e] estroma propiamente dicho y e1 v01u­men intracisternas cerrado por 1as membranas de 1a granay sus conductos 1ame1ares (15).1.3.2. Origen de los cloropïastos de piantas superiores.

Una compieta exp1icaci6n de 1a fotosíntesis enp1antas superiores en terminos moiecu1ares imp1ica 1acomprensión de procesos ta1es como e] f1ujo de moiécu1asy 1a transformación de 1a energia, asf como también 105mecanismos y pasos por 105 cuaies estos procesos seencuentran bajo contro] genético en 105 cïoroplastos.Estos han evoïucionado, en adaptación a 1as condicionesterrestres, en un óptimo ordenamiento para funcionar enun amplio rango de ambientes accesibies a las especiescontemporáneas. Una de 1as modificaciones más obviasocurre en e] sistema membranoso; estas variaciones pueden

observarse en e] número de granas, asf como también en e]número de conductos que conectan cada grana indivi­duaïmente.

Las especies unice1u1ares fotosíntéticas oxigéni­cas se desarr011an principalmente en un medio acuático a1cua] están restringidos. Actuaïmente está bastante acep­tado que ias piantas superiores han evoiucionado de unantecesor común - probabïemente 1a clorofita - cuyadiversificación en 1a tierra sería a partir de una 1fneaorigina1mente única (27).

Esta hipótesis invoïucra dos alternativas y puntosde vista conf1ictivos sobre el origen y 1a evo1uci6n de10s c10rop1astos. Por un 1ado, se postuïa que Ioscïoroplastos habrían estado in sit! en 1a céiuïa de unancestro primigenio, habiéndose diferenciado de membranasinternas que origina1mente servirfan a otras funciones.La otra, más actua], es 1a que especuïa sobre una endo­simbiosis procariótica en una céïula eucariótica (14,28,29). Esta teoria debe contemp1ar 1a asimiïación de por 10menos dos simbiontes, ios cua1es originan cloropïastospor un 1ado y mitocondrias por otro (30).

1.4. Biogufmicade la fotosíntesis.La fotosíntesis ha sido definida como e] proceso

mediante e] cua] 1a energia soïar es capturada por orga­nismos autotróficos y utilizada en 1a sintesis de com­puestos orgánicos (materiaï ce1u1ar). En e1 caso deeucariotes fotosintéticos y cianobacterias, e] procesofotosintético generaïmente se ha definido sobre 1a basede 1a asimiiación de) C02 por 1a siguiente ecuación:

12 H20 + 6 C02 —————————4>(€6H205) + 6 02 + 6 H20 /1/

Sin embargo no es solamente carbono e] que es reducidosino también nitrógeno y azufre.

N03H + H20—————>NH3 + 2 02 /2/

2 SO4H2———————fl+>2SH2 + 4 02 /3/

De estas ecuaciones generaies emergen dos conceptos bio­químicos importantes:a) La fotosíntesis es un proceso reductivo.b) E1 602, e] N03- y e] 504: constituyen aceptores fina­1es de electrones en dicho proceso.1.4.1. Conversión de la energia.

Este proceso está iocaiizado en 1a membranatiia­coide de ios cioropiastos o en 1a membrana de las ciano­bacterias. Básicamente, consiste en e1 transporte dee1ectrones con 1a transformación de 1a energia iumfnicaen potencia1 electroquimico con disociación de] Hzo(fotóiisis), que concluye en 1a reducción de] NADPy 1asintesis acop1ada de ATP.1.4.1.1. Sistema transportador de e1ectrones fotosintéti­

cos.En todos Ios organismos fotosintéticos 1a ener­

gfa iumfnica es captada por ios pigmentos fotosintéticos,c1asificados en tres grupos principaies: clorofilas,carotenoides y ficobiiinas (31). Dichos componentes estánorganizados en dos sistemas pigmentarios o fotosistemas Iy II, que consisten en agregados mu1tim01ecu1ares, en ioscuales 1a energía iumfnica es capturada y 1uego trans­ferida de una manera eficiente y rápida hacia e] centrode reacción (32).

E1 fotosistema I está formado por un grupo deaproximadamente 250 a 300 moiécuias de ciorofila a (entreias que predominan 1as que absorben ias Iongitudes deonda mas 1argas), por un grupo con baja proporción deciorofiia b y por otro de carotenoides. E1 centro dereacción está constituido por un pigmento fotooxidabiedenominado P700, e] cua] probabiemente consiste en un

dfmero de ciorofiia a iocaiizada en un medio ambienteparticuiar (32,33). E1 fotosistema II contiene ciorofiiade tipo a (en 1a que predominan moiécuias que absorbenias iongitudes de onda más cortas) y por una reiati­vamente alta proporción de pigmentos denominados acce­sorios, como ciorofiia b y xantofiiinas. E1 centro dereacción 10 constituye un pigmento fotooxidabie denomi­nado P680, e] cua] estaria constituido también por undfmero de ciorofiia a (32,33).

La operación en serie de estas dos reaccionesfotoquïmicas fue observada por Emerson en 1943 (34). Estese efectuaria dei siguiente modo: 1a iuz de longitud deonda más corta proveerfa a1 fotosistema II de 1a excita­ción para que un e1ectrón sea transferido a un estado demayor nive] energético, y asi provoque 1a reducción deiaceptor correspondiente. Este compuesto reducido consti­tuye e] reductor que cede e1ectrones a1 fotosistema I, elcua] a1 absorber a Iongitudes de onda de] rojo 1ejanoreduce a1 aceptor final. Es decir, existe un flujo .nocfciico de eiectrones, desde ei H20 hasta e] NADPen e1,cuai la 1uz incidirfa sobre e] sistema redox, esquemati­zado en un modeio Z, para faciïitar 1a transferencia dee1ectrones. Los transportadores de e1ectrones identi­ficados inciuyen: ciorofilas a y b, quinonas, citocromosb y f, pïastocianina, enzimas y ferredoxina (33-38) (Fig.B). E1 funcionamiento dei esquema Z desde 1a absorción de1a 1uz puede dividirse arbitrariamente de acuerdo a suduración según Kamenen tres etapas:Etapa l: "De 1a radiación fisica" (10-15 a 10-6segundos):

Esta etapa invoiucra 1a absorción de un fotón de1a 1uz por una moiécuia de ciorofiia y pigmentos acceso­rios (carotenoides y ficobiiinas), que conducen a 1a

redistribución de 1a energia dentro de su estructuramolecu1ar. La moiécuïa adquiere asi un nuevo estado quese conoce como "estado e1ectrónico excitado" y su energiaes mayor que 1a de1 estado inicia] o "estado basaï" (39).Este proceso de excitación y su disipación pueden descri­birse por ias ecuaciones siguientes:ch1————————_—__;>ch1s* (excitación, estado singuiete)

ch1s*———————————9ch1t (desactivación a1 estado trip1ete)ch15* + ch1____;> ch]S + ch1* (transferencia de energia)ch15*——————————9ch] + hv (f1uorescencia)

ch15* + CR———-——>CR* + ch] (captura de energia por cen­tro de reacción (CR))

ch1t ———————————+>ch] + hi (fosforescencia)

Etapa g: Fotoqufmica (10'10 a 10'3 segundos):Cuando un cuanto de 1uz es absorbido por aiguna

moïócuïa de c1orofi1a de uno de los fotosistemas, migrarapidamente a través de éste hasta alcanzar a una moiócu­1a especiaïizada de ciorofiïa a, posiblemente un par deéstas, 11amada centro de reacción. En este estado sefaciïita 1a transferencia de un equivaiente de reduccióna una molécuïa aceptora de e1ectrones. Luego 1a c1orofi1aoxidada de] centro de reacción es reducida por un dadorque 1e cede e1ectrones.

Como consecuencia de este proceso e] centro dereacción retorna a su estado origina], mientras que e]dador y e] aceptar de e1ectrones quedan oxidados y redu­cidos respectivamente (40). Esta etapa de separación decargas puede expresarse según:CR*.A——>CR+.A'

D,QR+————9D+.CR

Fíg. B: Esquemade] transporte fotosíntético d_eeïectrones cfch'co ym c1c11c0e_ncloroplastos. ‘

.4,flovo-4- Ferredoxma

NADPP'prot

g” B Ci*bss3530 Plastoquinona 5

é

Citf PIP11

qustocianinaSo \ \ P700

1 o. .

F’680 z/\ M" ‘ 2 H2° - Silsrrtegaksistemq Í s2 S 02 P9 e OIOpigmentano ‘H‘

ho

ho

E1 esquema Z representa e] transporte de eïectrones desde y hacía ‘losdos centros-antena de cada fotosistema (I y II) y a1 NADP.

Etapa g: Bioquímica (10'4 a 10'2 segundos):Representa ias transformaciones que ocurren

mediante 1a participación de enzimas y transportadores deelectrones, ciaramente descripto en el esquema Z postu­1ado por Hi1] y Benda11 en 1960 (41). Este sistema pro­pone 1as dos reacciones 1uminosas en serie, activando e]transporte de eiectrones provenientes de 1a fotólisis de1H20 a 1a reducción dei NADP (Fig. B), que eventuaimentedará 1ugar a 1a reducción de] C02 a hidratos de carbono.

E1 modeïo de] transporte fotosintético de eïec­trones que se muestra en 1a figura B tiene en cuenta 1asrecientes caracterizaciones de varios de sus componentesque han podido ser aislados. Solo en a1gunos casos seestabïeció 1a función y posición que éstos presentan enen 1a cadena.

En e] caso de] fotosistema I, el e1ectrón seriaaceptado por un comp1ejo que presenta un máximo de absor­ción a 430 nm (42-44). Dicho complejo en presencia deferredoxina y ferredoxina-NADP- reductasa reducefinalmente a1 NADP+(45-47).

Por e] otro 1ado, e] aceptor primario deeïectrones de] fotosistema II seria 1a forma semiquinonade ias piastoquinonas (40). E1 espectro de absorción deéstas es idéntico a un compuesto detectado en 1a zona deiespectro de 1uz próxima a1 u1travi01eta (X320) (48).

E1 esquema Z se compieta con e] sistema dador dee1ectrones a1 fotosistema II donde se produce 1a fotóli­sis de] H20, en 1a que intervienen e] Ci', e] Mn2+, ycomponentes restantes invoiucrados en este proceso que nohan sido compïetamente identificados (49).

La interacción entre Ios dos fotosistemasestaria dada por 105 dadores de e1ectrones a1 fotosistemaI provenientes de] II, que son e] citocromo f y 1a

p1astocianina. De modo que e1 aceptor primario (Q) de]fotosistema II reduce a 1a plastoquinona, una quinona1ipoff1ica con una cadena de nueve unidades de isopreno,que reduce a1 citocromo f asociado posibiemente de] iadointerno de 1a membrana tiiacoide. E1 intermediario deeïectrones fina] que conecta a1 fotosistema I es 1ap1astocianina, una cuproproteina de bajo peso moïecu1arque se 1ocaiizarfa también de] 1ado interno de 1amembrana (50).

En condiciones fisio1ógicas se produce además deeste transporte de eiectrones no cfciico, un transportede tipo cïcïico, por e] cua] se puede obtener energia enforma de ATP sin acumu1ar NADPH (51). La ferredoxina

reducida por e] P430 reduce a lHI citocromo de tipo bdenominado bs o b553, ei cua] interactúa con 1a pïasto­quinona que drena ios eïectrones nuevamente a1 P700 através de] citocromo f y 1a p1astocianina (35,37,38,52,53).1.4.1.2. Conservaciónde la energia.1.4.1.2.1. Generación del poder reductor. _

La energia 1umfnica captada y transformada porios mecanismos antes mencionados da 1ugar a 1a generaciónde un poder reductor, como NADPH(54-56). La formaciónde] NADPHestá dado por un proceso de óxidorreducción deuna Fe-suifoprotefna, 1a ferredoxina, como paso termina]de este transporte de e1ectrones (57). La ferredoxina esconocida por su importante papel en fotosíntesis, esdador de eiectrones a1 citocromo D553 (transporte cfcii­co) (58), a] 02 (transporte seudo cfcïico) (59), comoasitambién reductor de 1a tiorredoxina (reguiación enzimáti­ca) (60). Normaimente es transportador en e] fïujo dee1ectrones no cfcïico (H20——-———>NADP).En este proceso,1a reducción de] NADP+ se produce a expensas de dos

equivaTentes de ferredoxina reducida:2 Fdred + NADP+ + H+-———————+>2Fdox + NADPH

Esta reacción está cataTizada por una fTavoproteïna, 1aferredoxina-NADP-reductasa, que se haTTa asociada a Tacara externa de Ta membrana tiTacoide, de peso moTecuTar40.000, que contiene una moTécuTa de FAD como grupoprostático (47,58). Mientras que esta enzima requiere untratamiento con queTantes de metaTes bivaTentes para serextraída de Ta membrana, 1a ferredoxina se obtiene enforma soïubTe, presentando un peso moTecuTar de 12.000(61,45).

E1 NADPH juega un pape] reTevante en Tasposteriores reacciones de asimiiación reductiva de com­puestos oxidados. Esto es, debido a su energia Tibre deoxidación (62):NADPH + 1/2 02 + H+——>NADP+ + H20 AG° = -52.6 KcaT/mo]siendo su concentración en e] cToropiasto iTuminado de120 uM.

1.4.1.2.2. Generación de AIP.A este transporte de eTectrones se haTTa

acoplada 1a síntesis de ATP, a partir de ADP y Pi,'descripta en 1954 por Frenkei en cromatóforos bacterianosy por Arnon en cToropTastos de espinaca (63-65). Asi, ene] transporte de eTectrones no cchico y cchico haysitios de trans10caci6n vectoriaT de protones que estándirectamente relacionados con e] acopTamiento energético.De manera que Ta cantidad de ATP formado por par deeTectrones transferidos desde e] HZOdependerá de] númerode protones Tiberados en e] interior de Tas vesicuiastí1acoides (H+/ATP) sin considerar e] potencia] demembrana (66-67). La evidencia presentada por Wright yco]. en 1965 mostró que Ta reTación ATP/2e' es mayor que1, To que impTica que hay dos sitios formadores de ATP en

ei esquema de transporte no cic1ico de e1ectrones.En los úïtimos años e1 cúmuio de evidencias pre­

sentadas por diferentes investigadores muestra 1aexistencia de dos sitios de conservación de energfa en e]transporte de eiectrones fotosíntético. Mediante e] usode dadores y aceptores artificiaIes de e1ectrones, asicomo inhibidores de ios transportadores de e1ectrones,permitió resoïver en gran parte 1a composición de 1acadena de transporte fotosintética (10). Asimismo, fueposibïe e] estudio de segmentos de 1a cadena en formaindependiente; midiendo 1a eficiencia de cada uno encataïizar 1a fosforiïación acop1ada se identificóaqueïïos directamente reiacionados con e] acop1eenergético (10,68).

En e] transporte no cfciico de e1ectrones seidentificaron dos sitios de Iiberación vectoria] de H+a1interior de 105 discos tiiacoides, un sitio I entre 1ap1astoquinona y e] citocromo f y un sitio II en 1a

'fotóiisis de] H20.En e1 transporte cíclico de eiectrones, soia­

mente un sitio de conservación de energía seria posibie,a niveï de] cic10 redox de 1a p1astoquinona.

Otra posibïe contribución a 1a formación de ATPproviene de 1a fotofosforiiación seudo cfcïica. Comoestemecanismo funciona como un tipo de reacción de Mehier, nohay consumo o desprendimiento neto de 02 (69).

HZOÉ 1/2 02 + 2e- + 2 H+2 H+ + 2e- + 02———————>H202

H202-—————+>H20 + 1/2 02

De manera que durante 1a fijación de C02, en que e] ATPse hace 1imitante y en condiciones de acumuïación deNADPHy baja concentración de NADPdisponible para 1areducción, e] aceptor es e] 02. Resultado de 1o cua] hay

una fosforilación adicional sin reducción de NADP(69).De las diversas hipótesis que explican la con­

servación de la energia en el flujo de electrones(70,73), es la hipótesis quimiosmótica propuesta porMitchell, la que da cuenta de la síntesis de ATPacopladaal transporte de electrones por medio de un potencialelectroqufmico de protones (¿V¿H+) a través de membranastransductoras de energía (73-74). El potencial electro­qufmico de protones es una medida termodinámica del gradoen el cual el gradiente de protones supera el nivel deequilibrio. El potencial electroqufmico generado por eltransporte de electrones es utilizado para la sfntesis deATP. De manera que las membranas transductoras de energíacontendrfan dos bombas de protones, una dirigida por latransferencia de electrones, y la otra dirigida por lasintesis de ATP con el pasaje de protones en sentidocontrario al anterior, es decir, disipando el gradientede protones. El efecto combinado de estos translocadoresde protones establece un circuito de protones a través dela membrana transductora de energía; con el formaciónneta de ATP en un sentido y la hidrólisis de ATP en elsentido inverso.Complejo gg la ATPasa.

La sintesis de ATP acoplada al transporte deelectrones fotosíntéticos es llevada a cabo en presenciade Mgz+ por una enzima conocida como complejo de laATPasa (75). Esta es una proteína oligomérica de 8 a 16unidades de acuerdo con su origen (76-79). Esta formadapor un componente de membrana, el CFO, que es unoligómero de 7 polipéptidos diferentes, de los cuales 5son comunes con el otro componente del complejo, elCF1 (53,75). Una de estas subunidades es un proteolfpidode bajo peso molecular (7.000-11.000 daltons) sintetizado

por 1a misma organeia. Este seria e] responsabie de]transporte de H+ a través de 1a ATPasa, ya que presentaactividad ionoforética cuando se 10 incorpora a 1iposo­mas (80).

E] componente hidrofiiico o factor acopiante(CF1) se observa a1 microscopio e1ectr6nico como particu­1as de 9 nm de diametro distribuidas en 1a superficie de1a membrana tiiacoide (19). Este factor solubiiizado ypurificado a homogeneidad tiene un PM de 325.000 y secompone de 1a asociación de cinco subunidades poiipépti­das denominadas 54, B, X , d , y e , cuyos PM son59.000, 56.000, 37.000, 17.500 y 13.000, respectivamente(77,81). En mitocondrias y cioropiastos 1a relación entresubunidades ha sido informada en 2:2:1:1:1-2 (82-83),mientras que en bacterias 1a reiación mas correcta seria3:3:1:1:1-3 (78,84). Las subunidades c<.y B presentan e]sitio cataiftico de 1a ATPasa; X constituiría 1a puertadei cana] de H*, ac0p1ando su fiujo a 1a actiVidad cata­

—1ftica; d’- é participarfan en 1a unión de] CFl con 1apnotefna de membrana y e actuaria como inhibidor de 1aactividad ATPasica (85).Mecanismosde la fosforiiación l acgp]e energético.

La energia requerida para 1a síntesis de unamolécula de ATP puede ser ca1cu1ada como e] potencia]fosfato, según 1a energia 1ibre estándar y ias concentra­ciones de ios sustratos y productos de 1a siguientereacción (86,87):

ADP + Pi——————————>ATP + H20

(ATP)

AG: ¿35° + 1.36 iog(ADP) (Pi)

E1 vaïor de ¿:G° varia de acuerdo con e] pH, temperatura,concentración de M92+disponibie, y fuerza iónica (88).

Para ca1cu1ar e] potencia] redox necesariopara sintetizar ATPse tiene en cuenta que ¿XG = ankE.

De acuerdo con lo propuesto por Mitchel], e]transporte de eiectrones, organizado topoiógicamente en1a membrana, provoca su energización con e] consiguientetransporte vectoria] de H+ y cationes. De esta maneraresu1ta 1a generación de un gradiente de potencia]

electroqufmico ¿>f1H+ o fuerza protón motriz a través de1a membrana. E1 proceso puede esquematizarse de lasiguiente manera:

Ared + Box'_____—‘-—>on * Bred +ÉJ1H+donde A y B son componentes de 1a cadena de transporte de

e- y eIÁy1H+ está formado por 1a suma de un componenteeiéctricoïzxy)))l el gradiente quimico de protones(¿> pH)(87).

Ají“ =A\¡/ + z ApH =AGE1¿&”H+impulsarfa 1a sintesis de ATPcataiizada por unaATPasa reversible (H+-ATPasa), mientras Ios protonesfiuyen a través de e11a disipando e] gradiente e1ec­troquimico.

Según 1a estequiometrfa propuesta por Mit­che11, e] transporte de 2H+ por 1a H+-ATPasa sería sufi­ciente para 1a formación de una moïécuia de ATP.

Una estequiometrfa H+/ATP igua] a 3 ha sidodescripta por diversos autores para 1a H+-ATPasa de c10­roplastos (89), mientras que en bacterias fotosintéticasse ha encontrado que esta re1aci6n varia entre 2 y 5 (90,91).

1.4.2. Asimilación fotosintética de Egg.La primera hipótesis acerca del papel de la luz en

la asimilación de C02 fue vertida por Jan Ingenhousz,como "la influencia del sol sobre las plantas" (92). Estaobservación condujo a que en 1796 escribiera que lasplantas verdes absorben del ácido carbónico por la luzsolar desprendiendo 02 al mismo tiempo (93). En el sigloXIX se definió químicamente al almidón como el primerproducto formado en el cloroplasto bajo la influencia dela luz (94). Esta conclusión fue revisada en favor dehidratos de carbono solubles como sacarosa y glucosa(95).

El uso de técnicas modernas permitió la iden­tificación de los primeros productos estables de lafotosíntesis. Así, en 1950, mediante el empleo de lastécnicas del (14€) (96), cromatografía en papel (97) yradioautografía (98) se identificó al ácido fosfoglicóri­co, a los pocos segundos de iluminación (99). Rápidamentese agregaron esteres fosfato de dos azúcares, ribulosa ysedoheptulosa, a la lista de productos tempranos de lafotosíntesis en células verdes (22,100).

Desde el comienzo de la investigación bioquímicade la fotosíntesis, estuvo ampliamente aceptado que éstaocurre en los clor0plastos (101,102); sin embargo, laevidencia crítica de este hecho sobrevino en 1951 por eltrabajo independiente y simultáneo de tres laboratorios(54-56). De esta manera, en 1954, la reinvestigación dela fotosíntesis en cloroplastos aislados en diferentesmétodos, demostró su capacidad de asimilación deC02 dependiente de la luz (64). De modo similar a loencontrado en la célula entera, el 14C02 se asimila en elcloroplasto iluminado en azúcares y almidón, con eldesprendimiento simultáneo de 02 (103,104). Estos experi­

mentos conciuyeron 1a capacidad de esta organeia desobre11evar todo e] proceso de fotosíntesis, sin e]requerimiento de otras organeias o sistemas enzimáticos,en presencia de 1uz como única fuente de energia.

Para 1a asimiiación de] carbono, se requiere decompuestos ricos en energia, generados en e] proceso decaptación y conversión de 1a energia iumfnica. Como seresume en 1a Fig. C, se requieren 3 moies de ATP y 2mo1es de NADPH,formados por e] transporte fotosintéticode eiectrones, para 1a conversión de C02 en hexosa fos­fato (105).

Fig. C: Representación esquemática de] requerimiento ggATPl NADPHen la asimiiación de 292.

2 PGA

coz-NTN‘Ru P 2 1,3-P2GA

" r2 NADPH

ATP"—‘* Triosas-P—e>Hexosas-Pintermediarios

¿“1/6 ATPA1mid6n

RUSP

Un mecanismo de carboxiiación debería ideaimenteaicanzar las siguientes premisas (106): a) Por 1a bajaconcentración de C02 en 1a atmósfera, 1a carboxiiacióndeberia tender a una posición de equiiibrio favorabie. Esdecir, este seria un proceso termodinámicamenteirreversibie. b) Por 1a misma causa, 1a enzima que cata­1iza 1a carboxiiación tendría a1ta afinidad para e] C02.

c) Para que este proceso sea continuo, deberia rege­nerarse el aceptor de C02 y dado que éste aparece en pro­ductos finaies ta1es como giucosa, sacarosa y aimiddn, 1aconcentración de] a1mid6n iria en aumento. De manera quesu secuencia de asimiïación seria un proceso autoca­taïitico.

Estos criterios quedan contempïados en e] cicioreductivo de 1as pentosas fosfato, determinado por Ben­son, Caivin y co]. (107-108).1.4.2.1. Cicio de Benson-Caivin.

Las respuestas a1 mecanismo de 1a fijación deC02 en compuestos orgánicos sobrevinieron por e]descubrimiento de] PGAcomo primer producto (108) y de 1aRuBP(22,109), un compuesto bisfosfato de cinco carbonos,desconocido en materiaïes bioiógicos. Se postuió que 1aRuBP fuera e] aceptor primario de C02 baSado en deter­minaciones cinéticas de] cicio de asimiiación foto­sintética de 602 (108-110).

La reacción de carboxilación fue ava1ada por Iostrabajos reaïizados simu1táneamente en 105 1aboratoriosde Caivin (111) y Horecker (112). Utiïizando extractos decéiuias fotosintéticas incubadas con RuBP (111) oRibosa-S-fosfato (112), se observó que e] 14C02 es fijadoen compuestos solubïes, que 1uego se acumuïan durante 1afotosíntesis (Fig. D) (113).

E1 principa] compuesto marcado es e] PGAy 1uegoias triosas monofosfato y azúcares mono- y bisfosfato.Cuando e] cuïtivo es privado de C02, se acumuia RuBPdisminuyendo e] PGA.

Luego por degradación de] PGA se determinó 1acantidad de 14€ en cada posición y se observó' que seha11aba igua1mente distribuido entre ios carbonos (114).

Concïusiones simiiares se obtuvieron por

Fig. D: Radioautografia d_e123 productos soiubies d_eE asimi'lacióngg ¿(135; Pg cioropiastos aisïados.

Fren‘te. Glicolnto

MalatoGlicerato

I Aluhincog ‘ Glícinn\

_E 8 . Serina Aspart‘ato'v- E .­0 m 3-FosfogllceraioL ONmu. ..

o-— . . . .3 e .. ASparngina . Dlhldroxmcetonu-P*Erltrosa -‘-Po 0°

< ' ­E 3 . QRibosaeS-PoRubulosa-S-POg .Fructosn- S-PL< Glucosa-i-P

_ U .5 y Glucosa-S-Pm O Sed°*N=PW'°S‘=--Ribulosu-l,5- Pz-PN

mono-P' Fructosa=l.6—P

QUI-[gen G|ucosa-1,s-P2 2Seddneptulosa-PZ

Eleciroforesis, .pHl.PIRIDINA/ Aca I H20

10:35355

Aproximadamente e] 90% de'l tota] de 14€ fi‘ado,. acumuiado en com­puestos soiubies, 1uego de 12 min de fotosmtems es recuperado enPGA, triosas fosfato y azúcares monoy bisfosfatos, que en su mayoriason intermediarios de] cic’lo de Benson-Caivin L .

-34­

Fig. 13;; Cicïo reductivo ¿EJE pentosas fosfato.

GGBP

GNQDS ’ 6) GPGA

6POH GÏPGA 6ATP6NADPH+H 6ADP

A citoplasma

Enzimas que participan: 1) RuBPcarboxíïasa, 2) PGA quínasa, 3) GAPdeshidrogenasa, 4) triosa fosfato isomerasa, 5) FBP a'ldo1asa, 6)FBPasa, 7) transceto'lasa, 8) FBPa1d01asa, 9) SBPasa,_10) transceto­1asa, 11) pentosa fosfato epimerasa, 12) pentosa fosfato isomerasa,13) Ru5P quínasa.

fotoasimilación de fósforo, agregado como KH232P04a uncultivo de células de Scenedesmus (115).

Esto solo es posible en una via cíclica, que esla de reducción de las pentosas fosfato, como se muestraen la Fig. E. Es la via bioquimica básica por la que el602 es convertido en azúcares fosfato durante el procesode fotosíntesis.

Este ciclo se encuentra en todas las célulaseucarióticas fotosintéticas y en cianobacterias, comoasitambién en gran variedad de bacterias fotosintéticas(116-118).Enzimasde la fijación de 992.

El proceso de reducción de C02 hasta hidratos decarbono consiste en cuatro diferentes fases.I. [gig de carboxilación: El aceptor primario de C02 esla RuBP, un azúcar de cinco carbonos (111,112), originan­dose un intermediario de seis carbonos (119) que luego deuna óxidorredución interna, se escinde en dos moléculasde PGA. Esta reacción está catalizada por la RuBP car­boxilasa (carboxidismutasa). Esta enzima de peso molecu­lar 560.000 está formada por dos tipos de subunidades:ocho grandes, que presentan el sitio catalftico, sin­tetizadas a partir del DNAcloroplástico y ocho pequeñas,provenientes del DNAnuclear, que tendria una funciónregulatoria (120). Su ensamblaje en el cloroplastodepende de la luz.

La RuBP carboxilasa representa aproximadamenteel 50% de las proteinas solubles de la hoja, por lo cualha sido fácil su aislamiento en forma cristalina pura. Elsustrato verdadero es el C02 y no el C03H' y es requeridoel Mg2+ como cofactor de la reacción con una energialibre de -10 Kcal (121,62).

C'ZHzoP

gHzoP FHZOP Hooc*-c-0H9:0 M9,.Hoocïg: ¡1,

H-C-OH + cozws c=o —-> +

H-(ZZ-OH H-(::-0H QOOHCH20P CHZOP H'CE’OH

CH20PRibulosa-1,S-bisfosfato 2-carboxi-3-ce‘to cíc ido

ribitol-1,S-bisfosfato fosfoglice’rico

II. F_as¿ ¿e reducción: E1 PGA formado es reducido aazu'cares de tres carbonos, e] GAPy 1a DHAP. Esta reac­ción se produce en dos etapas: a) La fosforiïacio'n cata­11’zada por 1a fosfog'l‘íceratoquinasa que requiere Mg2+yse consume una moïe'cuïa de ATP (122).

(¡:OOH ATP ADP (EOOP

H-(¡Z-OH —-\—2‘—>H-('Z-OHCH20P CHZOP

cícido3fosfoglice'rico ácido 1,3-bisfosfoglice'rico

b) La reducción es catalizada por 1a NADP-gïiceraïdehidodeshidrogenasa de un peso molecuïar de 600.000 donde seuti'liza e] NADPH(123,124).

(IZOOP NADPH NADP QHO

H-c-OH —\—¿—> A-c-OHCHZOP CH20P

acido-1,3-bisfosfoglicérico 3-fosfogliceroldehido

E1 GAP asi formado está en equiiibrio con su isómero,DHAP, debido a 1a presencia de 1a enzima triosa­fosfoisomerasa (125).

Si bien estas dos reacciones son energéticamentedesfavorables, es en esta fase donde ocurre 1a conser­vación de 1a energía en 1as triosas-fosfato, debido a 1aenergia 1iberada por 1a hidro'iisis de] ATP (62) '

ATP-——e>ADP + Pi ¿A G = -7.6 Kca1/m01

y por 1a oxidación de] NADPH.

NADPH + 02—————e>NADP + 2 Hzo ¿BG = -52 Kcai/moi

De manera que esta fase muestra a1 cicio como unproceso eminentemente reductivo, dado que e] 83% de 1aenergia disponibie para e] cicio comp1eto proviene de1poder reductor.III. [Ese de regeneración: E1 requerimiento a partir de1a formación de 1as triosas fosfato es 1a resfntesis de1a moiécuia aceptora de C02, de manera que posibiiite sufijación continua. Esto ocurre a expensas de una serie deisomerizaciones y rearregios que invoiucran azúcares de3, 4, 5, 6 y 7 carbonos. En su mayoria son reacciones queno utiiizan cofactores generados en 1uz (ATP, NADPH)yson aitamente reversibies. Dentro de esta fase se puedenconsiderar dos etapas como 1imitantes de] cic1o:

a) La hidróiisis de] fosfato de] carbono 1 de 1afructosa-1,6-bisfosfato y de 1a sedoheptu]osa-1,7-bisfos­fato son reacciones irreversibies en este cicio(126-127).La FBP es generada por una aïdocondensación de unamoïécuia de GAP y otra de DHAPen presencia de 1a enzimaaïdoiasa (128). La iiberación de] Pi es cataiizada por 1aFBPasa, enzima de peso moïecuiar aproximado 160.000 enpresencia de M92+.

HZIC- 0P HZC-OHl

C:0 C:O| I

HO-C -H H0 -C-H

I Mgz+ lH'C'OH ——> H'C'OH o Pil I

H- C-0H H- C 'OHI I

HzC-OP HZC-OP

Fructosa-1,6-bisfosfato Fructosa-6 -fosfato

Una moïécuia de cuatro carbonos, 1a E4P, se con­densa con una moiécuia de DHAP;en esta reacción mediada

por 1a aïdoïasa se forma 1a SBP. La hidrólisis de] Pi dalugar a 1a sedoheptuïosa-7-fosfato, en presencia de M92+­Esta reacción se produce en presencia de 1a FBPasa o deuna SBPasa especifica de 85.000 de peso moïecuïar.

H2(I3-OP st-OH

CI=0 C=0I

HO-C-H HO-C-Hl 2+ l

H'C'OH -———-—> H'C'OHl I

H-(¡ï-OH H-C-OHI

H-Cl-OH H-C-OHI

H2C-0P HZC-rOP

Sedohe ptu loso- 1,7-bisfosfoto Sedoheptulosa-7-fosfato

Estas dos reacciones tienen, en condicionesfisioïógicas, un cambio negativo de energía Iibre de 7Kca] y se trata de un punto de contro] metabóïico.b) La fosforiïación de 1a ribuïosa-S-fosfato que utilizauna moïécuïa de ATP, generado fotoqufmicamente, en pre­sencia de fosforribuïoquinasa (129).

Hzc-OH Hzc-OPC=° ATP ADP C=°

l l

H-c-OH H-c-OH

H-C-OH H-(¡S-OHHz-C-OP Hz-C-OP

Ribuloso-S-fosfoto Ribulosa-l,5-bisfosfoto

Esta reacción tiene una energía libre estimadade -4 Kcal, de manera que se encuentra entre las reac­ciones claramente reversibles (¿BG = 0 a —2 Kcal) yaquellas completamente irreversibles (¿>G = —7 a —10Kcal). Esta etapa está metabólicamente regulada (62).IV. fase gg sintesis g de utilización de productos: Asi,partiendo de la RuBPy volviendo a ella, se desarrolla unciclo en el que se suministran triosas fosfato para lasintesis de sacarosa en el citoplasma de la célula (130)y de almidón (103,104,131).1.4.2.2. Metabolismo de Q4.

Hatch y Slack _establecieron en 1966 que endeterminadas plantas el primer producto generado en laasimilación fotosintética de C02 es el ácido málico y elaspártico, siendo el aceptor primario de 602 el fosfo­enolpiruvato. Dado que el primer producto de este procesose trata de un compuesto de cuatro carbonos, estas plan­

tas se denominaron de tipo C4 (132), como diferencia a1mecanismo anteriormente comentado de tipo C3.

E1 aspecto estructura] de estas p1antas ha sidoanaiizado en deta11e en numerosas ocasiones, observándosecomo modeïo de concordancia entre estructura y funciónbioquímica con sentido eco1ógico y económico. La carac­teristica sobresa1iente es 1a disposición de] tejidoclorenquimatoso en capas concéntricas alrededor de1tejido vascuiar (anatomia tipo Krantz). Esta disposiciónde 1as céiuias asimiladoras fue descripta for Haber1andten 1904 11amánd01a “Tipo corona" (133).

Este tejido está formado por dos capasce1u1ares: ias externas, céiuIas dei mesófiïo, cuyoscioroplastos están estructurados norma1mente, y 1asinternas, c61u1as de 1a vaina, donde e] almidón es pre­ferentemente acumu1ado con c10rop1astos reiativamentegrandes que no presentan coiumnas de grana-tiiacoides.

Los tres puntos básicos de1 sindrome C4 son:'1) Anatomia tipo corona o Krantz.2) Dimorfismo de ios c10rop1astos (de 1a vaina y de]mesófiio).3) Aïta fotosíntesis aparente.

De manera que las p1antas de] tipo C4 presentanuna compartimentación de Ios procesos fotosintéticos, en:dos tipos de cioropïastos. E110 permitió determinar e]pape] que e] transporte de metabo1itos juega en este tipode fotosíntesis como se esquematiza en 1a Fig. F.

Fig. F: Fijación de] C en piantas gi.

CloroplasÍo Cloroplostor ___________ __

PEPe-j-PEPeT- Pir<I Piri ATP+PÍ i RuBP

E : COZNi : PGA

'COZ i l NADPH ATP

: i NADPg NADPH l GBP

0AA—:—0AA—\—-—>Mal j :Mal almidón

Celulo del mesófilo Celulo de lo vaina

E1 C02 es fijado en e] fosfoenol-piruvato por 1aPEP-carboxiiasa en ias céiuias de] mesófiïo (15). Lamoiécuia de cuatro carbonos formada es transportada comomaiato y/o aspartato a las céiuias de 1a vaina donde esdecarboxiïada .; 1amoiécuia de tres carbonos vueive a 1as céiuias de]mesófiïo, mientras que e] C02 desprendido se fija eneilas a 1a Ribu]osa-1,5-bisfosfato. Esta es reducida pore] NADPHresuitante de 1a oxidación de] maiato (134).

La mayoría de] C02 fijado pasaría a azúcaresfosfato, a través de esta ruta de moiéculas de cuatrocarbonos (133).

La productividad de estas piantas es mayor res­pecto de 1as piantas C3, debido a que 1a veiocidad y efi­

ciencia fotosintéticas son mas altas a menoresconcentraciones de C02 atmosférico (135). Este tipo deplantas requieren intensidades de luz y temperaturamayores.1.4.2.3. 1132 QA!g variante del sindrome Q4.

Desde el punto de vista ecológico y del ren­dimiento, las C4 superan a las plantas C3, a través de laposibilidad de fotosíntesis efectiva con los estomascerrados en lugares pobres en H20. Tan deseable como esla reducción de las pérdidas de Hzo, es indeseable que através del cierre de los estomas se reduzca también laincorporación del C02 necesario para la fotosíntesis(136-137). Algunas plantas suculentas, como la verdolaga(Portulaca grandiflora), presentan comoadaptación a estasituación un método distinto de incorporación deC02 conocido como el ciclo diurno de los acidos tricar­boxflicos (138-139). Este proceso de asimilación estapresente en las plantas suculentas, las cuales disponende los más diversos mecanismos morfológico-anatómicospara la reducción de las pérdidas de agua. Ya en 1804 DeSaussure descubrió que en las chumberas tenia lugar una"acidificación" por la noche y durante el dfa una"desacidificación" del material vegetal. Luego, ésto seobservó también en muchas plantas suculentas como en losgéneros Bryophyllum, Crassula, Kalanchoe, Kleinia ySedum.

La fijación del C02 en las plantas suculentasmuestra amplia concordancia con la ruta C4 de los ácidosdicarboxflicos, pero las enzimas del ciclo diurno noestán localizadas en los cloroplastos sino en el cito­plasma (137-140).

Durante la noche predomina la respiración. ElC02 formado en ella no es cedido a la atmósfera sino que

se acumula en forma de maïato tras una fijación no depen­diente de 1a 1uz. Durante e] dia, e] aumento de tempera­tura produce pérdidas de H20 cada vez mayores por 1atranspiración a través de Ios estomas. Esta es reducidapor cierre tota] o parcia] de estos estomas, de modo que1a entrada de C02 dei exterior disminuye (141). Sin em­bargo, 1a fijación fotosintética de C02 se produce fun­damentaimente a expensas de1 C02 aimacenado durante 1anoche en forma de ma1ato, el cuai debe ser decarboxiiadopreviamente.

De manera que además de 1a separación espaciaiexistente también en 1as piantas de] tipo C4, se observauna separación tempora] entre 1a entrada de] 602 y suasimi1ación fotosintótica.1.4.3. Reguiaciónde la fotosíntesis.

Actuaïmente 1a investigación bioqufmica de iosprocesos fotosíntéticos está dirigida a di1ucidar iosmecanismos y reguïación de 1a captación y conservación de1a energia y de1 metaboiismo y flujo intraceluiar de car­bono. La eficiencia de estos procesos está directamentere1acionada con 1a productividad de ias piantas.1.4.3.1. Regulación gg_ lg¿_ procesos gg la conversión

energética.Distribución gg la excitación:

Los dos fotosistemas tienen espectros de absor­ción y acción que ios diferencian. De manera que cuai­quier Iongitud de onda e1egida favorecerfa uno u otro delos fotosistemas, y produciría variaciones en e] rendi­miento cuóntico de 1a fotosíntesis. En 1a práctica esteno es e1 caso, ya que e] rendimiento cúantico es aïto,independiente de 1a iongitud de onda (para ¡k ( 700 nm).Para expïicar el incremento por interacción de los dosfotosistemas dentro de] esquema Z, Myers propuso un meca­

nismo de tipo carburador, comodistribuidor de 1a energiade excitación entre 1os dos fotosistemas (142).

Por otro 1ado Duysens sugirió hace más de 10años que un mecanismo de este tipo deberia inv01ucrarcambios en ei estado redox de un transportador de e1ec­trones situado entre 105 dos fotosistemas (143), 10 cua1parecería ser correcto, aunque 1a identidad del transpor­tador y su significado como moduïador proviene de unenfoque de investigación diferente. La función de contro]estaria dada por fosforiïación/defosfori1ación de ciertasproteinas de membrana como una fosfoprotefna de pesomoïecuïar 25.000 componente de] comp1ejo cïorofila a/b decaptación de 1a 1uz (144). La fosforiïación se produce enun residuo treonina y está cataïizada por una protein­quinasa unida a membrana, de 1a misma manera que 1a fos­fatasa respectiva. Estas dos actividades son dependientesde 1a luz, inhibidas por DCMU(inhibidor de] transportede e1ectrones en e] fotosistema II) (145-147). Esta fos­foprotefna reguiarfa 1a distribución de 1a energía deexcitación de] fotosistema I a expensas de1 fotosistemaII (148-149).

Por ser 1a fosforiïación un proceso dependientede 1a 1uz y sensibïe a1 DCMU,surgió como posibiïidad 1aactivación de 1a quinasa mediante e] transporte nocfcïico de e1ectrones.

A11en y coïaboradores mostraron que una reduc­ción de 1a quinasa por ditionito provoca su activación enoscuridad. Por otra parte, e] oxidante Fe(CN)53- inhibe1a fosforiïación mediada por 1a 1uz. Experimentos rea1i­zados en presencia de inhibidores de1 transporte dee1ectrones y dadores de e1ectrones a sitios especificossugieren que 1a pïastoquinona seria e] componente c1aveen esta reguiación (150).

Los -componentes de] transporte de e1ectronesfotosintético no están dispuestos a1 azar en 1a membrana,sino que e1 fotosistema II se encuentra en 1a membranatiïacoide (grana), más compacta que 1a membrana inter­tiïacoide (estroma-Iameia) que contiene ios componentesde] fotosistema I (151).

Es razonabie suponer que ias proteinas quedencargadas mas negativamente por fosforiiación .y se par­ticionen hacia zonas menos compactas de 1a membrana. Asi­mismo, se determinó que 1a re1aci6n de esta proteinafosforiiada a 1a no fosforiïada es 10 veces mayor en laszonas menos compactas de 1a membrana (1ame1a de] estroma)(152-154). La fosforiïación parece causar concomitan­temente a 1a migración de pigmentos, desde 1a grana a 1alameïa del estroma, 1a transferencia de energia hacia e]fotosistema I (155).

Existen, ademas, mas de 20 poïipéptidos de]tiiacoide capaces de ser fosforiïados, su identificaciónno es precisa, asi como tampoco se ha _determinado sicumpïen aïgún ro1 en este proceso (ISS).Oxidación del Egg:

E1 desprendimiento de 02 se produce por un meca­nismo concertado de cuatro e1ectrones, en e] cua] cuatroequivaïentes de oxidación son secuenciaimente acumuiadosen un "coïector de cargas" (157). Asi, dos moïécuias deH20 son rápidamente descompuestas en 02.

Este proceso que ocurre a nive] de] fotosistemaII puede esquematizarse por 1a siguiente secuencia dereacciones:

_

ASn Sn+1V

ZP6800—-——————_-‘> ZP+6800- —"‘————‘——>Z+P6800­

ZPBBQOÏ

e‘\\\\A‘ pooï A pool

P700+ P700

hv

La energia de un fotón rojo es de aproximadamente 1.8 eVque es suficiente para oxidar ei Hzo con un potenciaí deóxido-reducción de aproximadamente +0.8V.

Aunque aún no ha sido identificado e1*c01ectorde cargas (Sn), 1a evidencia indica que e] Mn2+formaríaparte de este, ya que está invoiucrado en e] despren­dimiento de 02.

Las observaciones de Pirson indican que organis­mos fotosintéticos privados de Mn2+tienen su capacidadpara desprender 02 muy disminuida, sin afectar otrasactividades fotoquimicas. La recuperación de 1a actividadoxidante de H20 se iogra con e1 agregado de Mn2+ (en pre­sencia de 1uz). La reactivación de] sistema en céiuiastratadas con hidroxii-amina, Tris o shock de temperaturaindica que 1a iuz, en ia fotoactivación, es requeridapara 1a incorporación de Mn2+ en ei sitio correcto deoxidación de H20 (158).

Yamashita y Tomita observaron que e] desprendi­miento de 02, inactivado por e] tratamiento con Tris­acetona, es recuperado por e] 1avado con DCIP e iïuminadoen presencia de DTT, Mn2+ y Ca2+ (150,160). Recien­temente, han informado que e] sistema de oxidación de H20tiene dos sitios de unión para cationes divaïentesespecíficos para Mn2+ y Ca2+, donde 1a fotoactivacióntendria Iugar (161).Sintesis de AIR:

La formación de ATP acopïada a1 transporte dee1ectrones ocurre tanto en bacterias, como en mitocon­drias y cloropïastos (75). Los diferentes sistemas pre­sentan aspectos comunes:1) Requieren una membrana osmóticamente intacta.2) E1 transporte de electrones esta acop1ado a una fuerza

protón motriz transmembrana que dirige 1a formaciónendergónica de 1a unión fosfoanhfdrido.

3V Un transporte de protones a través de 1a enzima que

sintetiza ATP, disipando e1 gradiente electroqufmico.E1 ro] bioïógico de esta ATPasa transïocadora reversi­b1e de H+ es ei de cataiizar 1a síntesis de ATP. Porotro 1ado 1a reacción inversa, hidróiisis de ATP, tam­bién ocurre. Sin embargo esta enzima esta extrema­damente especiaiizada en 1a sintesis de ATPmientrasque 1a hidróïisis se encuentra muy disminuida.

La actividad de esta enzima depende de diferen­tes condiciones, como 105 cambios en 1a intensidad de 1a1uz durante e] cicïo día-noche (162). Los mecanismos desu reguïación son actuaïmente objeto de una intensivainvestigación.

En 1971, Roy y Moundrianakis (163) determinaron1a presencia de cinco mo1écu1as de nucïeótidos de adeninaen 1a moïécuïa de CF1 aisïada; sin embargo, 5610 una

parece ser importante en dicho mecanismo. En e]CF1 asociado a la membrana, Tas moiócuias de nucióotidoson iiberadas o intercambiadas, dependiendo de: a) Lapresencia de ADPó ATPexógeno, b) La energización de iasmembranas por 1a 1uz, c) Un cambio ácido-base, d) Uncampoeiéctrico apiicado externamente.

E110 sugirió que 1a liberación de nucieótidos esproducida por un cambio conformacionai de 1a H+-ATPasadependiente de energía, e] cua] está reiacionado con 1atransición de una forma enzimática inactiva a una activa(164). Los resuitados sugieren que en 1a fotofos­foriiación como en 1a hidróiisis de ATP, 1a ATPasa activano contiene molécuias de nucieótidos firmemente unidos.E1 CF1 purificado y tratado con caior en 1a presencia deDTT activa ia hidrólisis de ATP dependiente de oa2+, 10que indica que grupos tioies de] CF] están invoiucradosen esta activación (165).

Existen evidenCias que indican que grupos 'SHestán directamente reiacionados con 1a sintesis de ATPcomo también con su hidróiisis. Los experimentos rea]iza—dos con reactivos especificos a grupos 'SH indican asi­mismo que grupos 'SH de 1a subunidad X de CF1, que seexponen por iiuminación estan invoiucrados en 1a modula­ción de] mecanismo de sintesis e hidróiisis de ATP(166).Por otro iado 1a i1uminación de cioropiastos en presenciade agentes reductores de puentes disuifuro conduce a unaenzima capaz de hidroiizar ATP. Asimismo, 1a tiorredoxinaestá invoiucrada en 1a moduiación de 1a H+-ATPasa enc10r0p1astos intactos (167-168).

Se ha pr0puesto que e] moduiador fisioiógico de1a ATPasa es e] sistema ferredoxina-tiorredoxina. Asi­mismo se ha sugerido que e] sistema moduiador estariadébiimente unido a 1a membrana de tiiacoides y que e1

M92+actuaria estabiiizándoïo (169).Reducción del E5251:

Los equivaientes de reducción producidos porfot61isis de] H20 son transportados por 1a cadena deeïectrones no cicïica hasta reducir a1 NADP+,reaccióncataiizada por 1a ferredoxina-NADP+ reductasa (45-47). Yaen 1975 se encontraron diferentes estados conformaciona­1es entre 1a reductasa soïuble y 1a unida a membrana(170).

Los estudios realizados hasta e] presenteindican que 1a 1uz induce cambios conformacionaies en 1areductasa unida a membrana, a1 provocar 1a formación deun gradiente de protones a través de e11a (171). Estamodificación se observó también en una reducción de IosKm para e1 NADP+y 1a ferredoxina, mientras que 1a a1ca­Iinización dei estroma durante 1a transición oscuridad­qu provoca una aumento de 1a veiocidad máxima (172).1.4.3.2. Reguïación ide 13_ asimiïación fotosintética ide

Q2­Por mucho tiempo e] requerimiento de 1a 1uz en

fotosíntesis se restringió a 1a formación de ATPy NADPHnecesarios para 1a asimiiación de C02. De manera que 1aconversión de C02 a hidratos de carbono o en otros pro­ductos seria cata1izada por reacciones enzimáticas quepueden tener iugar en 1a oscuridad, cuando a1 sistema se1e provee de ATP y NADPH.La evidencia obtenida hasta e]presente indica que 1ejos de ser independiente de 1a luz,la asimiiación fotosintética de 602 requiere la activa­ción por 1uz de varias enzimas especificas que son inac­tivas en 1a oscuridad. E1 requerimiento de 1a 1uz para eidesarroïlo de 1a actividad enzimática no se 1imita a 1asenzimas invoiucradas en e] cicio reductivo de las pen­tosas fosfato sino que inciuye procesos de] metaboiismo

secundario de ias piantas, 1a asimiïación de 5042- yN03- y 1a reducción de ácidos dicarboxfiicos (173). Másaún, se ha observado que un camino metabdiico que esimportante para 1as céiuias fotosintéticas en 1a oscuri­dad, como es el cicio oxidativo de 1a pentosa fosfato,está inhibido en 1uz.

La primera evidencia provino de] 1aboratorio deios Ziegler, quienes observaron que 1a actividad de NADP­GAP-deshidrogenasa ensayada en hojas preiiuminadas eramayor que en hojas mantenidas en 1a oscuridad (174).Siguiendo este esquema experimenta]. otros 1aboratoriosdescribieron efectos simiiares en varias 'enzimas (126,175). En esa misma época, experimentos desarroïiados porBassham y coiaboradores, cuantificando durante 1a tran­sición oscuridad-iuz en un alga verde (chioreiïa) e1 con­tenido de intermediarios fotosintéticos, observaroncambios en 1a concentración de éstos como resuitado de1incremento en 1a actividad de ciertas enzimas (176,177).Estos experimentos desarroïlados in .1112 fueron coin­cidentes con 10s rea1izados sobre cioropiastos intactosque mostraron que enzimas claves de 1a fotosíntesis tam­bién son activadas por luz en este sistema.

Por otro 1ado 1a iïuminación intensa de hojasverdes 1uego de un periodo proiongado en oscuridad provo­ca una aceieración de] proceso fotosintético; e] despren­dimiento de 02 y 1a fijación de C02 liegan a su máximaveiocidad 1uego de varios minutos. Esta inducción tambiénfue observada en cïoropiastos ais1ados, 1a cua] fueexpiicada en términos de activación enzimática y for­mación de intermediarios de] cicio (178-180).

Las primeras observaciones de un iag inicia]fueron informadas por Osterhout y Haas en 1918 y porWarburg en 1920 (181-182). Probabiemente 1as mediciones

más útiïes fueron ias realizadas por McAïister y Myers,que siguieron 1a captación de 602 en función de] tiempoen hojas de trigo por un método espectrofotográficoinfrarrojo (183)1.4.3.2.1. Activación por luz.

La ausencia de un efecto directo de 1a 1uzsobre 1as enzimas y e] hecho que e] espectro de acción de1a activación enzimática corresponda a1 de 1a fotosínte­sis indicó que 1a luz ejerce su efecto a través de]sistema fotosíntético de transporte de e1ectrones (175,184-186).

Son diversos 105 cambios que se producen en e]cioropiasto durante 1a transición oscuridad-qu. Porello, son varios Ios mecanismos propuestos como respon­sables de 1a reguïación de enzimas claves de] ciclo(184-191).Mecanismos mediados por reducción:

Es e] mÍS'actual de 10s mecanismos propuestos;numerosos laboratorios han informado que proteinas regu­Iatorias son capaces de ser reducidas por mecanismosmediados por 1a 1uz. Estas proteinas funcionarfan reïa­cionando enzimas reguiatorias c1aves con reductores de]cïoroplasto generados fotoquimicamente. Las bases de estemecanismo surgieron hace 15 años de ios trabajos desa­rrollados por Buchanany coiaboradores (174,192).

Se observó en Ios experimentos de modulaciónde 1a fructosa-l,6-bisfosfatasa, que su activación por1uz depende de 1a reducción de 1a ferredoxina por elsistema de transporte de eiectrones fotosintétíco. Laferredoxina reducida no interactúa directamente con 1aenzima sino que 10 hace a través de un factor proteico.En presencia de un ditioi, e] DTT, ni e] sistema detransporte de e1ectrones fotosintético ni 1a ferredoxina

reducida son requeridas para dicha activación enzimática,pero si lo es el factor proteico. Con posterioridad seestableció que este factor proteico estaba conformado pordos componentes que se denominaron proteina reguladora dela asimilación a y b (ARPay ARPb) (60,193-197). Los tra­bajos de Nolosiuk y Buchanan concluyeron con la iden­tificación de estas proteinas como tiorredoxina yferredoxina-tiorredoxina reductasa. La tiorredoxina esuna proteina de bajo peso molecular (12.000 a 15.000),transportadora de hidrógenos que tiene el mismo centroactivo para todas las estudiadas hasta el momento:

s

triptofano-cisteina-glicina-prolina-cistefna-lisinael cual se reduce reversiblemente a 2 grupos 'SH libres(198-200). Esta proteina se encontró originariamente enbacterias y células eucarióticas heterótrofas, el únicomecanismo de reducción de la tiorredoxina conocido hastaese momento era mediante el NADPHvfa una flavoprotefna,la NADP-tiorredoxina-reductasa (201). La función conocidaera en la biosfntesis de deoxirribonucleótidos, activandola ribonucleótido-reductasa. De manera que la tiorredo­xina y la ferredoxina-tiorredoxina-reductasa emergieroncomo componentes de un mecanismo de regulación enzimáticoen los cloroplastos.

En la luz los electrOnes de la clorofila sontransferidos a la ferredoxína soluble por la cadenatransportadora de electrones y luego por la ferredoxina­tiorredoxina-reductasa a la tiorredoxina. La tiorredoxinareducida interactúa activando varias enzimas regulatoriasdel cloroplasto (Fig. G) (60).

Fig. G: Fotoactivación enzimática por gl sistema ferre­doxina-tiorredoxina.

Accptor

'uV.. . .­ Ferrcdoxina red Tlorredoxinaox Enzima redhciivu)

fid-Td-reduciosoïox Turredonnared‘ Enznno oxünocüva)

NADP+

Fotosisiema I

Este esquema no impiica necesariamente una asociación de1a enzima a ias 1ame1as tiïacoides, por cuanto todos ioscomponentes de] sistema pueden obtenerse en forma soiubieiuego de 1a ruptura de Ios cioroplastos.

En e] ciclo reductivo de las pentosas fosfato,1a FBPasa, 1a SBPasa, 1a NADP-GAPdeshidrogenasa, 1a Ru5Pquinasa son activadas por este mecanismo (202-205). Fuerade] cicio de Benson-Caïvin también son moduiadas 1amaiato deshidrogenasa y la feniiaianina-amonio iiasa(206-209).

Con posterioridad, se encontraron multipiesformas de tiorredoxina. En e] cioropiasto hay dos tipos

de tiorredoxinas, f y In, y otras dos en e] citopiasma(201-213). Las tiorredoxinas dei cioroplasto muestran unaespecificidad diferencia]: 1a tiorredoxina m es más efec­tiva en 1a activación de 1a NADP-maiato deshidrogenasa(206), mientras que 1a tiorredoxina f es más efectiva enotras enzimas de] cicio (FBPasa, SBPasa, NADP-GAPdeshidrogenasa, Ru5P quinasa) (196). Con respecto a 1astiorredoxinas citoplasmaticas, no se ha podido determinaraún ni su función ni e] mecanismo de reducción in ¿119.

Una bacteria purpúrea, Rhodopseudomonas sphae­roides, contiene una tiorredoxina dependiente de NADPHpara su reducción, 1a cua] está reiacionada a 1a activa­ción de 1a dïaminoievuïfnico sintetasa, una enzima c1aveen 1a biosfntesis de porfirinas; por otra parte, estaenzima es activada en 1a oscuridad por tiorredoxina redu­cida por DTT (214).

Una enzima pecu1iar de piantas C4 (215) y FAM(216), 1a piruvato fosfodiquinasa, puede ser activada en1a oscuridad por reductores como e] DTTy ascorbato. enpresencia de una fracción accesoria con propiedades pro­teicas. E1 espectro de acción y 1a sensibiïidad a1 DCMU,un herbicida que bioquea e] transporte no cíclico deeiectrones en un sitio cercano a1 aceptor primario de]fotosistema II, sugiere que 1a piruvato fosfodiquinasaestá moduiada por este transporte de e1ectrones (217).

Por otro 1ado, en 1976 Anderson y Avron formu­1aron un mecanismo aïternativo para 1a activación por1uz, de 1as enzimas de] c10rop1asto (218). De acuerdo coneste mecanismo habria grupos tioles unidos a membrana,denominados LEMSo mediadores de] efecto de 1a 1uz. Loscomponentes de] LEMson reducidos fotoquïmicamente, pore] transporte no cfciico de e1ectrones, en e] lado oxi­dante de] fotosistema I.

Estudios reaïizados con inhibidores de1 trans­porte de e1ectrones sugirieron 1a existencia de dos tiposde LEM, uno anterior y uno posterior a1 sitio de ferre-'doxina (218-219) como se muestra en e1 esquema.

fi - H

Ferredoxina

Fotosistema I A LEM II

P700 NADP

Sé ha informado que 1as enzimas moduïab1es poreste sistema serían 1a RuSP quinasa, NADP-GAPdeshidroge­nasa, ma1ato deshidrogenasa y g1ucosa-6P deshidrogenasa(LEM I) como también 1a FBPasa y SBPasa (LEM II)(219-222).

Recientemente, Ashton y Anderson han presenta­do evidencias que involucran a un factor soïubie que pro­mueve 1a activación por 1uz de 1a NADP-maiatodeshidrogenasa (223). E110 conduce a postu1ar que Iosmecanismos de activación por 1uz como e] sistema detiorredoxina/ferredoxina y 91 sistema LEMpuedan ser par­tes de un mismo sistema. Por cuanto 1a diferencia básica,que residfa en 1a no participación de factores solub1esen el mecanismo LEM, puede ser debida a razones expe­rimentales. Resuitados recientes sugieren que varias pro­

teinas se encuentran unidas a membrana o aparecensoïubi1izadas según e] método usado en 1a ruptura de Ioscioropïastos aisïados. Bajo ciertas condiciones, 1a RuSPquinasa, 1a 91ucosa-6P-deshidrogenasa, 1a maïatodeshidrogenasa y 1a FBPasa se ias encuentra asociadas aios tiiacoides (224).

Recientemente se ha informado que 1a Ribuiosa­1,5-bisfosfato carboxiiasa responde a 1a activación jg_vitro por ferredoxina. Asimismo, un tratamiento acfdico(pH = 5.4) de Ia RuBP carboxiiasa disocia una subunidadpequeña por moi de enzima. Esta subunidad puede reempïa­zar a 1a tiorredoxina-m en 1a activación de la NADPmaiato deshidrogenasa de maiz en presencia de un reductorcomo e] DTT. De manera que esta subunidad podria par­ticipar en reacciones redox (225).

E1 contenido de -SH en aigunas de estas enzi­mas se ha visto modificado por i1uminaci6n y ha sidocorreiacionado con 1a activación reductiva en 1uz. Estetema será discutido‘en deta11e en e] Capituïo 4.,Mecanismomediado por efectores:

Los principaies productos finaïes de 1a asimi­1aci6n de C02 en e] cloropïasto varian según las con­diciones experimentaies, pero usualmente incluyen a1a1mid6n, triosas fosfato y giico1ato (un intermediariode] ciclo de fotorrespiración). La formación relativa deestos productos estaria parciaïmente controïada por 1aconcentración de fosfato inorgánico externo (226).

Siendo e] cioropiasto una organeïa que con­sume Pi, 1a veiocidad de fotosíntesis es baja y no 1inea1con e1 tiempo en ausencia de Pi externo. La veiocidad defijación de C02 es incrementada por aumento de 1a con­centración de Pi en e1 medio, hasta que comienza a dec1i­nar a mayor concentración de Pi que provoca también un

aumento de] tiempo en que 1a fotosíntesis iiega a sumáxima velocidad (227). Esta inhibición por aita con­centración de Pi puede deberse a una disminución de iosmetaboiitos dei ciclo de Benson-Calvin por intercambiocon Pi exógeno mediante ei transiocador de Pi (228-229).

E1 Pi, GAP, DHAPy PGA son transportados, conaita velocidad y aita afinidad, por este transiocador.

El concepto de que un efector puede constituirun intermediario en 1a activación de enzimas por 1a 1uz,provino de ios trabajos de] grupo de Ziegier con NADP-GAPdeshidrogenasa. En un extracto crudo de preparaciones decioroplasto se observó el aumento en 1a actividad de 1aNADP-GAPdeshidrogenasa por ATP y NADPH;esta activaciónes fisiológicamente interesante, ya que 1a concentraciónde ATP y NADPHaumenta en luz (174,230-232).

La NADP-GAPdeshidrogenasa purificada mostróuna actividad asociada de reducción dei NADque no seafecta por ATP o NADPH(123,233). Dado que se encontraronvarias formas de esta enzima, se estudió ei efecto demetabolitos sobre una de estas (forma reguiatoria)(234-238). Se observó que efectores generados por 1uz(ATP y NADPH)activan 1a NADP-GAPdeshidrogenasa y que 1apresencia de Pi aumenta 1a afinidad de dichos efectores.En estas condiciones 1a enzima es activada por estosefectores a concentraciones reportadas comofisiológicas.E1 mecanismo por e] cual ei Pi actúa sinergfsticamentecon otros efectores en 1a activación de 1a NADP-GAPdes­hidrogenasa no es conocida. Los efectores mencionadosproducen una modificación estructural en 1a enzima, yaque se observó su disociación. Sin embargo, éste es uncambio más 1ento que e] comentado anteriormente porreducción (6 hs vs. 3 min) (123,238). De manera que no sesabe si 1a disociación está invoiucrada en 1a activación

de esta enzima _en e] tiempo en que podria ocurrir 1areguïación de 1a enzima in 1112.

La RuBPcarboxiiasa de piantas superiores esotra de las enzimas c1aves de] cicïo, activada por ATPyNADPH(239-242). A diferencia de 1a NADP-GAPdeshidroge­nasa, esta enzima puede activarse por intermediarios delciclo como por e] 6-fosfogluconato, un intermediario de]cicio oxidativo de las pentosas fosfato (239,243-244).Posteriormente, se determinó un evento importante en sumoduiación como lo es su activación por uno de iossustratos (C02) en concentraciones fisiológicas y en pre­sencia de su cofactor (M92+) (184,145).

No se presenta clara 1a contribución de variosefectores en ei contro] in 1112 de 1a RuBPcarboxiiasa,sin embargo, parecería que efectores generados en iuzJuntamente con cambios iónicos inducidos por luzactuarfan en 1a regulación de esta enzima en condicionesfisioiógicas (246,247):

Estudios sobre la moduiación de otra enzima

del cicio de Benson-Calvin estabiecieron que la FBPasa esactivada por su sustrato, 1a FBP (248). Esta modificaciónde 1a enzima podria deberse a cambios conformacionaies,ya que una vez activada: a) no existe modificación delpeso molecuïar y b) es menos sensible a 1a inhibición porreactivos de grupos “SHy a1 ataque por tripsina.

Otra enzima del cloropiasto involucrada en 1asintesis de aimidón, es moduïada por 1a luz a través deefectores, esto es, 1a activación de 1a ADP-glucosa piro­fosforilasa por PGAy su inhibición por Pi (249-251). Demanera que esta enzima estaria reguiada por 1a relaciónPGAzPi, ta] que cuando ésta es a1ta (1uz), 1a ADP­giucosa-pirofosforilasa es activada, favoreciendo 1asintesis de a1midón(250,252). Trabajos recientes confir­

maron estas conciusiones y aportaron evidencia que 1aactividad de esta enzima estaria estimuiada por ATPy unreductor (DTT) (253,254).Mecanismo mediado por iones:

En 1973 Heldt y coiaboradores observaron quecomo resuitado de 1a iiuminación se produce una a1ca1ini­zación de] estroma de ios cioropiastos, e] pH es de 7.3en 1a oscuridad y se incrementa a un pH mayor que 8.0 en1uz (255,256). Durante 1a i1uminaci6n de cioropiastosintactos e] transporte de eiectrones fotosintético induceel movimiento de protones de] estroma a1 espacio intrati­iacoide. Las consecuencias de este gradiente de pH através de 1a membrana tiiacoide son varias: 1) provee de1a fuerza motriz para 1a fotofosforiiación (10,257,258),2) afecta directamente 1a veiocidad de fijación deC02 por ei cicio de Benson-Caivin, 3) modifica 1a utili­zación de Pi exogeno durante 1a fijación de C02, 4) secorrelaciona con 1a moviiizacián en sentido opuesto deM92+hacia el estroma (mecanismo antiporter). Ya en 1938Biinks y Skow reaiizando registros continuos de] _des­prendimiento de 02 y cambios de pH en hojas de ricino,observaron su asociación con 1a iniciación de 1afotosíntesis. Los estudios reaiizados por Racker ySchroeder en 1958 con 1a FBPasa y por 105 grupos deHorecker y Racker con 1a RuBP carboxiiasa y 1a Ru5Pquinasa, reveiaron que un cambio minimo en 1a con­centración de M92+y en e] pH dei estroma provocan gran­des cambios en 1a actividad de estas enzimas. Estaspropiedades fueron confirmadas en trabajos posteriorescon estas enzimas puras y más recientemente con 1aSBPasa.

Portis y co]. concluyeron que e] incremento de1a concentración de M92+ en ei estroma (1 a 23 mM) es

necesario para que 1a FBPasa y 1a SBPasa desarro11en suactividad cataiftica. De manera que 1a concentración deMg2+y e] pH de] estroma están interreiacionados, ya quee] cambio de uno está ac0p1ado a1 cambio del otro, asicomo en e] efecto sobre 1a actividad enzimática. Estainterrelación se observa c1aramente en ios trabajos dePreiss y co]. en 105 cuaies incrementando ias con­centraciones de M92+ se disminuye e1 óptimo de pH re­querido en preparaciones homogéneas de FBPasa (265).Efectos simiïares fueron informados para 1a RuBP car­boxiiasa.

Estos resuitados sustentan 1a idea que ioscambios de pH y de 1a concentración de M92+producidos en1a transición oscuridad-qu juegan un ro] reguiador im­portante en 1a asimiiación fotosintética de] C02.1.4.3.2.2. Reiación cïoropiasto-citopïasma.

Aunque todo el proceso de fotosíntesis puedaocurrir en e] c10rop1asto, e] movimiento de metaboïitos yde iones hacia y desde e] citop1asma afecta e] procesogïobaï de 1a fotosíntesis. Aún cuando 1a envoitura deesta organeïa sea de muy baja permeabiiidad, existe unrápido intercambio de'moïéculas por iluminación de céiu­1as enteras (266). La envoïtura puede verse como unabarrera que contiene toda 1a maquinaria funciona], mante­niendo 105 componentes soïub1es y e1 poder asimiiado, e]cua1 es generado en 1uz y que está refiejado en unaumento de 1a re1aci6n ATP/ADP y NADPH/NADP.

Sin embargo este concepto seria simp1ificar e]probiema, ya que soïamente uno de ios productos de 1afotosíntesis, e] aimidón, es retenido y 5610 temporaria­mente. Sorprendentemente, 1a sacarosa, que es consideradacomo e] principai producto de 1a fotosíntesis, no seforma dentro de] cioropïasto.

La membrana externa de 1a envoltura aparececomo inespecffica en 1a difusión de mo1écu1as muypequeñas. La membrana interna es permeabïe se1ectivamentea] C02, NH: , K+ y C1“ (267). La envoïtura contiene unaATPasa que en 1uz bombea protones hacía el medio. Estaexcreción de protones está acompañada por un infïujo deK+ (268). Recientemente, se ha observado 1a entrada deCa2+ mediada por 1uz desde e] medio a1 interior decïoropiastos ai51ados (269). Los principaIes productosfotosintéticos que se exportan de] estroma de]cïoropïasto a1 citop1asma ce1u1ar son: 1a DHAP, e] PGAye] gïicoïato. Este proceso de transferencia no es unasimpïe difusión, sino que está controïado por e] transïo­cador de Pi presente en 1a membrana interna de 1aenvoltura (270). Este trasïocador controïa Ios niveïesinternos de Pi y de PGApor un mecanismo de contra-trans­porte entre e] Pi y los azúcares fosfato dé tres car­bonos. E1 ba1ance de fosfatos y ésteres fosfato provee a1citoso] de] carbono fijado por 1a fotosíntesis, comotam­bién de NADPHy ATP. De manera que este transïocador debetransportar también PGA, e] que parecería requerir de ungradiente de protones a través de 1a envoïtura de] cïoro­p1asto (271).

Estroma Membrana interna Citoso]de 1a envoltura

002

r>L________1RuBP PGA«:* PGA

\ ATP ATP

I ADP;> ADP

) 1,3 P2GA 1,3 chA

l NADPH NADH

l NADP<;) NADGAP gsflBP

Sacarosa

Por otra parte, en Ios dos úïtimos años se hadeterminado 1a presencia en hojas de p1antas superioresde un metabolito, 1a fructosa-2,6-bisfosfato, que pre­senta un pape] regu1atorio cïave en 1as p1antas. Esteactúa como moduiador entre e] metaboïismo de] cïoropïastoy e] de] citop1asma, ajustando adecuadamente e] procesa­miento de] carbono fijado por 1a fotosíntesis según 10scambios en 1as condiciones de] medio. La sintesis de 1afructosa-2,6-bisfosfato depende de 1a concentración de Piy de F6P, que promueven su sintesis, y de PGA y deDHAP,que 1a inhiben. Estos metaboïitos que modulan 1a síntesisde 1a fructosa-2,6-bisfosfato tienen un papeï estratégico

en e] camino metabóiico de 1a sacarosa. Este reguiadordisminuye 1a actividad FBPasa que cata1iza 1a primerareacción irreversible de 1a sintesis de 1a sacarosa,restringiénd01a o favoreciendo su degradación por activa­ción de 1a fosfofructoquinasa. De manera que cambios en1a concentración de DHAPacompañados por 1a modificaciónen 1a concentración de fructosa-2,6-bisfosfato coordinan1a sintesis de sacarosa con 1a veiocidad de fijación deC02. Este hecho es esencia] para que 1a fotosíntesispueda continuar, ya que ias triosas fosfato son utiiiza­das para regenerar e] aceptor de C02 (RuBP) o bien sefavorezca 1a sintesis de sacarosa o de aimidón de acuerdocon 1os requerimientos de 1a p1anta. Este mecanismo per­mitirfa a 1a pianta un uso más efectivo de 1a energiadisponibïe para ios procesos que tienen 1ugar tanto enlas hojas comoen tejidos distaïes (272).

Estroma Citoso]

Triosa-P <s—————-————;>Triosa-P<5——e>FBPl

I

l F2,6P2l

v ñAimidon F6P

I

WSacarosa

La envoïtura de] cloropiasto muestra tambiénun translocador especifico para e] transporte de dicar­boxiiatos: e] maïato y e] oxalacetato (273). Este fiujoestá relacionado a un sistema redox intra y extra­

cloroplastico, debido a la actividad malato deshi­drogenasa presente tanto en el estroma como en elcitosol. De esta manera se facilita el movimiento delpoder reductor, aunque el NADPy NADPHno permeen por lamembrana interna del cloroplasto. De modo que a través dela envoltura del cloroplasto existe un balance del estadoredox intra y extracloroplástico y un balance del poten­cial de fosforilación a través del translocador de Pi.Estos flujos son modulados por la transición oscuridad­luz.

Por lo visto anteriormente, son diversos lossistemas que afectan la actividad de las enzimas regula­torias de la asimilación fotosintética de C02 en elcloroplasto. Este hecho se ve reflejado en la "fase deinducción" del proceso de fijación de C02 vinculado alsu ciclo enzimática.1.4.3.2.3. Interacción de os mecanismos moduladores

mediados pg: luz.Estas enzimas, asi como el’ciclo de asimila­

ción de C02 son inactivas en la oscuridad y progresiva­mente llegan a un máximo de actividad en luz. Los estu­dios tienden a determinar en qué medida la conversión deuna enzima de un estado inactivo a uno activo coincidecon el tiempo necesario para alcanzar la velocidad máximaen la asimilación de C02 en luz. Asimismo, dilucidar losfactores o mecanismos que modulan estas enzimas regula­torias.

En este sentido. el estudio regulatorio deestas enzimas se ha llevado a cabo principalmente segúndos diseños experimentales definidos:1.- Separación de la reacción enzimática en dos etapas:

una fase de modificación y otra de catálisis. Estose debe a que estas enzimas, a diferencia de otras

enzimas reguiatorias, presentan una ve10cidad deactivación o conversión de una forma inactiva a unaactiva, más ienta que su veïocidad de catóïisis. Demodo que estas enzimas p0r preincubación con suactivador e1iminan su fase de 1atencia observada enei ensayo de actividad cataïftica. E1 nombre dadopor Frieden es e] de "enzimas histeréticas“, descri­biendo e] ro] de este tipo de respuesta como un"buffer dependiente de] tiempo", e] cua] serviríapara prevenir cambios rápidos en 1a concentración deintermediarios de] camino metabóiico (274).

2.- E1 tratamiento de 1a actividad enzimática como enzi­ma reguiatoria aïostérica clásica, e1 modu1ador seune a un sitio separado fisicamente dei invoïucradoen 1a catáïisis y de esa manera moduïa 1a catá1isismediante un aumento o disminución de 1a velocidadmáxima y/o de 1as constantes de afinidad.

Estos estudios se han lievado a. cabo en e]cloropïasto entero en extractos o con enzimas puri­ficadas. La primera evidencia experimenta], in vitro,sobre 1a interacción de mecanismos regu1adores mediadospor 1uz fue provista por Noiosiuk y c0]. Estos resultadosconcïuyeron que 1a FBPasa es activada por e] sistema re­ductor (ferredoxina-tiorredoxina), conjuntamente con 1aFBP (275). Estos ensayos se 11evaron a cabo preincubando1a enzima purificada con ei sistema activador y evitando1a catáïisis por omisión de] Mg2+requerido como cofactorenzimática. E1 incremento en 1a católisis de 1a enzimapreviamente activada es más pronunciado cuando e] ensayode actividad se 11eva a cabo a baja concentración deM92+ y pH considerados para e] c1orop1asto i1uminado.Posteriormente, Noodrowy Wa1ker informaron 1a activaciónconcertada de 1a SBPasa (parciaïmente purificada) por

DTT, SBP y MgZ+. De manera que 1a activación se observódirectamente comomodu1aci6n de 1a cataïisis (276). Para­1e1amente, Charies y Haliiweïl observaron que e] trata­miento de 1a FBPasa con DTT aumenta 1a afinidad por 1aFBP y el MgZ+, mientras que e] controï de su actividadseria ejercido por 1as variaciones en 1a concentracióniónica de] estroma (277).

Lorimer y c01., estudiando 1a activación de 1aRuBP-carboinasa estabïecieron e] mecanismo actuante; 1aenzima reaccionaria primero con e] C02 y Iuego más rápi­damente con e] M92+, formando un compïejo ternario, cuyaactividad fina1 incrementarfa con e] aumento dei pH(245). La reguïación de 1a RuSP-quinasa estaría dada, deacuerdo con lo propuesto por Preiss y Kosuge, por con­diciones reductoras y cambios energéticos; en este meca­nismo e] M92+jugarfa un importante ro] activador (126).Asimismo, Hoïosiuk y Buchanan informaron sobre 1a reguia­ción de 1a NADP-GAPdeshidrogenasa por un mecanismo dehistiéresis concertada en presencia de NADPH,ATP-y Pi;por otro lado Müiïer observó qqe 1a actividad especificade esta enzima es afectada por 1a acción de DTT y NADPH,y por ATP y M92+ (230).

1.4.3.2.2. Mecanismosde desactivación gn la oscuridad.Un aspecto importante de 1a regu1ación enzimá­

tica mediada por 1uz que aún no está acïarado es e] pro­ceso de reconversión de estas enzimas activadas a unestado menos activo o inactivo. Es sabido que 1a desacti­vación ocurre en 1a oscuridad. En e] caso de los mecanis­mos regu1atorios mediados por efectores y por iones, 1asituación es clara, ya que Ios cambios en ei estromainducidos por luz se revierten en 1a oscuridad. Comosecomentó anteriormente, estos cambios afectan particu1ar­mente a 1a FBPasa, SBPasa, NADP-GAP-deshidrogenasa,

RuBP-carboxiïasa y Ru5P quinasa que son reguïadas ademáspor estos dos mecanismos.

Hasta e] momento se ha observado que 1as enzi­mas moduiadas por reducción pueden desactivarse de dife­rentes maneras. Woïosiuk y Buchanan han propuesto que 1aFBPasa, Ru5P-quinasa y 1a feniïaïanina amonio 1iasapueden desactivarse por GSSGo dehidro-ascorbato. Amboscompuestos pueden formarse en oscuridad (60,278). Naïkery Leegood propusieron que e] sistema ferredoxina­tiorredoxina cataliza un proceso reversibie, tanto dereducción como de oxidación de 1a FBPasa. Asimismo obser­varon que 1a enzima es inactivada por aceptores de elec­trones como e] 02, N02" y oxa1acetato (279). Por otrolado, Charïes y Ha11iwe11 observaron 1a desactivación,con e1 H202, de la FBPasa reducida por e] tratamiento contioïes (280).

Una aïternativa diferente fue pubïicada porPortis y He1dt en base a trabajos reaïizados en cïoro:plastos enteros: 1a actividad FBPasa es inhibida por e]agregado de Ca2+ a1 medio, ya sea por acción directa deéste o bien por disminuir 1a concentración de M92+en e]estroma debido a1 intercambio con Ca2+ a través de 1aenvoïtura (262). Asimismo, Charïes y Haïliwelï proponenque Ia desactivación de 1a FBPasa estaria dada por unaumento en 1a concentración de H+ y Ca2+ en e1 estroma(281). Otro tipo de desactivación es 1a comunicada porWoïosiuk y Buchanan para 1a NADP-maïato deshidrogenasa;un oxidante unido a 1as membranas seria funciona] en 1adesactivación soiamente en oscuridad (206).

Las enzimas antes mencionadas sobreïïevan uncomportamiento comón de tipo histerético tanto en e] pro­ceso de activación como en e1 de desactivación.

1.4.4. Regulación de otros procesos metabólicos mediadospor 1uz.

1.4.4.1. La 1uz comodesactivador enzimática.La luz puede funcionar en 1a inhibición y desac­

tivación de ciertas enzimas (176). En experimentos reaii­zados en aigas durante 1a transición oscuridad-iuz semodifican los niveies de giucosa-GP y de 6-fosfogiucona­to. Esto está de acuerdo con 1a observación de que 1a luzafecta 1a g]ucosa-6P-deshidrogenasa, desactivándoia. Estaenzima cataiiza un paso reguiatOrio dei ciclo oxidativode ias pentosas fosfato. La evidencia directa de 1a inhi­bición de 1a g]ucosa-6P-deshidrogenasa fue provista portrabajos con cioropïastos aisïados y con hojas ilumina­das (282). Para1e1amente se demostró 1a desactivación, invitro, por reducción con DTTde 1a giucosa-GP deshidroge­nasa de cïoropiastos (283).

Además de 1a glucosa-6P-deshidrogenasa cioro­plástica, existe en hojas una forma citopiasmótica, quetambién es desactivada por luz o in vitro por reduccióncon DTT (284). En 10 que se refiere'a 1a enzima de cioro­piasto, e] responsabie de la inhibición seria e] sistemaLEMI pr0puesto por Anderson y Avron, simuiado experimen­taimente por e] DTT(218), mientras que 1a citopiasmótica10 seria por 1a carga energética dada en e] poder reduc­tor, puesto que 1a reiación NADPH-NADPaumenta por i1umi­nación (285). La 1uz actuarfa suprimiendo e1 ciciooxidativo de ias pentosas fosfato, tanto en e] cïoropïas­to como en citopiasma. La fosfofructoquinasa también esafectada por 1uz. Esta enzima está invoiucrada en 1adegradación dei almidón, como asi también 1a fosfog]uco—mutasa, fosforiiasa y giucosa-GP-isomerasa que son desac­tivados en 1uz (286-287).

1.4.4.2. Metaboiismo de QE dependiente de la uz.Transporte seudociCïico de electrones:

Durante 1a reducción fotosintética de C02 encioropiastos intactos, e] Hgoz es un producto norma]. Lacaptación de energia iuminica produce, a través de 1acadena de transporte de e1ectrones, no sóïo 1a reducciónde NADP,con aita eficiencia, sino también e] drenaje dee1ectrones hacia e] 02 a una veiocidad baja pero constan­te.

Los sitios principaïes de reducción monovaientede 02 se 10ca1izan en e] sitio reductor de] fotosistema1, generandose e] anión superóxido (288). Este radica]1ibre puede dismutar a peróxido de hidrógeno y oxigeno.

2H*+02-+ 02-__>H202 + 02Los organismos fotosintéticos poseen a1ta con­

centración de superóxido dismutasa que remueve rápidam­ente e] 02-. En ias hojas- de piantas superiores 1aactividad superóxido dismutasa se encuentra prin­cipaïmente ïocaiizada en Ios cloropiastos (289,290).

Aunque 105 c10rop1astos no contengan cataiasa,para metaboïizar e] H202, poseen peroxidasas no especi­ficas. E1 ácido ascórbico, que reacciona tanto con02- Como con H202, se encuentra en a1ta concentracióndentro de] cioropiasto a1 igua] que 1a ascorbato­peroxidasa. De modo que e] cioropïasto estaria compieta­mente adaptado a funcionar en presencia de 02 tai quepueda 11evar a cabo 1a utiïización iiimitada de H20 comodador de e1ectrones y evitar e] efecto de ias especiesreactivas surgidas de 1a reducción de1 02 (291).

Fotorrespiración:Este proceso ocurre como inverso a1 de 1a

fotosíntesis, consumiendo 02 y desprendiendo C02. Lafotorrespiración es debida a 1a incorporación de 02 y 1aformación dei ácido giicóiico en ios cioropiastos(292-294). Se han propuesto dos mecanismos posibies queexplican e] origen dei giicoiato en ei cioropiasto porfotorrespiración: a) Actividad oxigenasa de 1a RuBP­carboxiiasa y b) Actividad transcetoiasa.a) La RuBPcarboxiiasa es una enzima bifunciona], ya quecataiiza 1a oxidación de 1a RuBP por una moiécuia de02 en presencia de M92+z

H2?'0P

1 9:0 02 FHzOP €00­H-CIZ-OH ..4_. COOH + H’Q'OHHÏC-OP CHZOP

Ribuloso-1,5-bisfosfoto ácidofosfoglioolíco dcidQ-3-iosfoglicérico

E1 602 y ei 02 son inhibidores competitivos de 1a activi­dad oxigenasa y carboxiiasa respectivamente. De maneraque 1a reacción estará favorecida en uno u otro sentido,dependiendo de 1a reiación C02/02 (295).b) La otra via posibie de formación de] giicoiato estariadada por 1a transcetoiasa, que cataiiza 1a transferenciade un residuo de dos carbonos entre azúcares fosfatodurante e] funcionamiento de] cicio de Benson-Caivin(296). Estos se unen a1 cofactor, 1a tiamina pirofosfato

(TPP), formando dihidroxieti] TPP. Este podría ser oxi­dado no enzimáticamente a glicoïato y TPP mediante e]H202 formado por e] transporte seudocíclico de e1ectro­nes (297). Sin embargo, otros investigadores suponen quee1 mecanismo de 1a transcetoiasa no operaría a una veïo­cidad significativa in viva, por 10 que parecería que 1amayor parte de] glicoïato se generaría a partir de 1aactividad oxigenasa de 1a RuBP-carboxilasa (298-300). Sinembargo, se propone que 1a actividad transcetoiasacontribuye en 1a formación de giicoiato (301) y que éstadependería de los niveïes de 02- en e] estroma de]cioropïasto (296).

E1 cicio de 1a fotorrespiración tendría imp1i­cancias secundarias para 1a energética de 1a fotosínte­sis, ya que requieren ATP y NADPH adiciona] para

reconvertir e] PGAoriginado por fotorrespiración a RuBPaceptor de] C02. Otra consecuencia de 1a fotorrespira­ción, para 105 procesos energéticos de 1a fotosíntesis,es 1a. protección dei aparato fotoquímico contra 1afotoinhibición por aita concentración de 02. De modo que1a fotorrespiración preservaría e] sistema transductor deenergía fotosintética (301-302).1.4.4.3. Asimiiación de E93;.

E1 desprendimiento de 02 en 1a 1uz con 1a con­comitante reducción de N03- fue determinado en 1920 porNarburg y Negeiein, sobre céiulas de Chlore11a suspen­didas en un medio que contiene N03- en ausencia deC02 (303).

En ios últimos años, ei sistema reductor de N03­ha sido investigado intensivamente y se ha establecidoque consiste en dos metaïoproteínas: 1) nitrato reductasay 2) nitrito reductasa, 10s cuaies usan ferredoxina yNADPHcomo dador de e1ectrones, para cata1izar 1a reduc­

ción de N03-, con e] siguiente esquema:no3- 2e' 4ï7N05 6e' ;;NH4+

1) Hay dos tipos principales de enzimas reductoras deN03-: a) La N03- reductasa dependiente de NADPHque estápresente en céiuias eucarióticas, tanto fotosintéticascomo heterótrofas (304) y b) 1a N03- reductasa depen­diente de ferredoxina que se encuentra presente en aïgasazui-verdosas y otras bacterias fotosintéticas (305).a) La NADPH-nitrato reductasa es un compiejo enzimáticode aïto peso moiecuiar. En 1a transferencia de electronesde] NADPHa1 N03- participan secuencialmente dos activi­dades enzimáticas que pueden estudiarse separadamente,ta1 como se observa en e] esquema, una es una diaforasa oNADPH-deshidrogenasa dependiente de FADque puede utili­zar diversos compuestos como aceptores de eiectrones(citocromo C, Fe(CN)55, vitamina K) y 1a N03--reductasatermina], una moïibdoprotefna que puede utiiizar flavfnnucleótidos como dador y N03- como aceptor de eiectronesrespectivamente. De acuerdo con evidencias más recientes,se puede suponer que 1a cadena de transporte de e1ectro­nes hacia e] N03- seria: '

NADPH ; FAD >cyt. b -557—————;>Mo}————e>N03­b) La N03- reductasa de procariotes cataiiza 1a reducciónde N03- a N02- por ferredoxina reducida de acuerdo a 1asiguiente ecuación:N03r + 2 fd(red) + 2H+-—-———————e>N02-+ 2 fd(ox) + Hzo

¿SG'0, pH 7 = -38.6 Kcai/moi.2) La N02--reductasa fotosintética tanto de procariotescomo de eucariotes ha sido ciasificada como dependientede ferredoxina como dador de eiectrones. Esta enzimacataïiza 1a siguiente reacción exergónica:NOZ- + 6 fd(red) + 8H+ ———————-<>NH4+ + 6 fd(ox) + 2H20

AG'O, pH 7 = —103.5 ¡(cai/moi.

La N02--reductasa es una ferroproteina que posee un grupoprostático hemo y un centro sulfo-hierro. Evidencias

.recientes hacen suponer que la cadena de transporte deelectrones en esta enzima sería:

fd(red)————€>(Fez-Sz)————e>Fe Hemo———__;>N02'Las enzimas del sistema reductor de N03' se

encuentran locahzadas en las hojas de plantas C3 y C4. EJ

cianobacterias, se las ha encontrado asociadas aparticulas que contienen clorofila (306-307).Regulación de la reducción de EQ3;:

La velocidad en la captación de N03- parece ser unimportante factor en la regulación de la asimilación deN03-. Por otro lado se ha propuesto que la reducción deN03- ejercerfa un efecto regulatorio en la captación deN03-. Beevers y Hagemann han considerado que el pasolimitante, en la reducción de N03-, es el catalizado porla N03--reductasa. Tanto N03- como NH4+parecen ser anta­gonistas eficientes en el control de este proceso. ElNH4+ no es sólo un represor nutricional de las enzimasdel sistema reductor de N03-, sino que actuarïa sobre laN03--reductasa promoviendo la conversión de la forma oxi­dada activa en su forma reducida inactiva (308-309).1.4.4.4. Asimilación fotosintética del 594:.

La asimilación del SO4= es un proceso reguladopor la luz, en todos los organismos autotróficos (310).Los cloroplastos son capaces de llevar a cabo la reduc­ción de SO4= en forma completa, siendo los productos dela reducción: 503:, S: y cisteïna. Dado que estos produc­tos no se encuentran libres en el cloroplasto sino unidosa otros componentes, se propuso la siguiente secuencia dereacciones:

SO4=-—m9APS——e>PAPS——e>P(2)-—é>X-S:SO3=——;>X-S:S=

El primer paso en la metabolización del 504= ocurre a

expensas de] ATPde acuerdo con e] siguiente equiïibrio:504: + ATP-—————e>APS+ PPi

-Esta reacción es cataiizada por 1a ATP:SO4=adeni] trans­ferasa o suïfuriiasa que requiere M92+y Ca2+ para obte­ner su maxima veiocidad. Esta reacción es seguida porotra irreversible, cata1izada por 1a adenosina-5'-su1fatofosfoquinasa:

APS + ATP ———— _;>PAPS + ADP

E1 504= activado, APSo PAPS, sería transferido a un tio]endógeno cataïizado por una suifo-transferasa de acuerdocon 1a siguiente reacción:

||

adenosina——.P————0:503 + xs- ——e>X-S:SO3- + adenosina—Pl

E] paso reductivo que consume 6 e1ectrones está cataliza­do por 1a tiosuïfonato-reductasa, en e] cua1 1a uniónsu1fito se reduce a suifuro de acuerdo con 1a siguienteecuación:

6 H+ + X-S:SO3- + 6 e' ————e>X-S:S- + 3 HzoSchmidt observó que esta enzima trabaja con ferredoxinacomoe] reductor fisioiógico (311).

Más recientemente se encontró una tiosuïfato­reductasa unida a 1a membrana tilacoide de 105 c10rop1as­tos, con capacidad de reducir e1 503- unido dec10rop1astos, e] SO3=1ibre y e] 5205: (312).

E1 paso termina] de este proceso es 1a formaciónde cistefna de acuerdo con 1a siguiente reacción catali­zada por 1a acetii L-serina sulfidriiasa:

—e>L-cistefna + acetatoSchmidt pr0puso un mecanismo en e] cua] se formaría un

st + 0-aceti1 L-serina

compïejo intermediario enzima-producto, e] que seriaciivado requiriendo dos eiectrones.

X-S:SH+ 0-aceti1 L-serina + 2 eï____;>L-cisteina +acetato + X-S'

Ha sido propuesto por Hiiz y co]. que 1a uniónS-S seria escindida por una tioiisis intramoiecuiar conun grupo -SH adyacente (312).Reguiación de la asimiiación de 594:.

Dado que e] SO4= es metaboiizado a suifoami­noácidos, éstos controiarfan 1a entrada de SO4= a1cioropiasto a través de su envoitura. Ademasde] contro]ejercido a nivei de 1a disponibiiidad del SO4=, se hainformado sobre 1a reguiación de dos enzimas invoiucradasen su utilización. La PAPS-suïfotransferasa y 1a APS­suifotransferasa son activadas por tiorredoxina en pre­sencia de un ditioi, ei ditioeritro]. En Synechococcus sehan encontrado dos ciases de tiorredoxinas con diferentespuntos isoeiéctricos y pesos molecuiares. La tiorredoxinaB, de pI = 4.6 y 11.800 de peso- moiecuiar activa pre­

.ferenciaimente a 1a APS-suifotransferasa aproximadamente20 veces. Por otro iado, 1a tiorredoxina-A, de pI - 4.1 y12.000 de peso moiecuiar, es inactiva cuando se 1a ensayasobre 1a actividad APS-suifotransferasa, mientras qué 1aPAPS-suifotransferasa es activada por ambas formas detiorredoxina (309,313).

Los e1ementos biogenésicos primordiaies que en formainorgánica absorben ias piantas de su medio ambiente parasintetizar su propia materia se encuentran en su maximoestado de oxidación: e1 carbono, como C02, e1 nitrógeno,como N03- y e] azufre, como SO4=. Por tanto ios vegetaiescioroffiicos tienen que reducirios a un nivei asimilabie,uti1izando para eiio e1 único reductor disponibie, e]H20, y vaïiéndose de 1a única fuente de energia que tam­bién disponen, 1a luz soiar.

Dado que éstos no son 10s únicos procesos metabóïicosque una céluïa fotosintética puede 11evar a cabo sino queocurren basicamente todos los que se producen en unacéïula heterótrofa, es dabïe considerar ta] acúmuïo demecanismos de reguïación enzimática en 1a transiciónoscuridad-ïuz.

2. MATERIALES l METODOS.

2.1. Purificación de FBPasa x tiorredoxina de hojas ggespinaca.La pUrificación de FBPasa y tiorredoxina se reaiizó

de acuerdo con ios métodos descriptos (202,212,193). Separtió generaimente de 4 Kg de espinaca provenientes deimercado 10ca1. Las hojas se iavaron y se guardaron a-20°C; ias hojas congeladas se desmenuzaron y se c010­caron en un vaso de licuadora con buffer Tris-CiH 30 mM,pH 7.9 y EDTA 0.1 mM en una proporción de 1 1/500 g dehojas.

E1 homogenato se fiïtró a través de dos capas demuseiina y e] filtrado se ajustó a pH 4.5 con ácido fór­mico. Se centrifugó a 6.000 x g durante 10 min. E1 preci­pitado contenía 1a actividad FBPasa y e] sobrenadante, 1aactividad tiorredoxina.2.1.1. Purificación de FBPasa.

E1 precipitado que contenía 1a actividad FBPasa seresu5pendió en buffer Tris-AcH 30 mM, pH 7.5 y EDTA0.1 mM(1/5 de] voiumen de] homogenato) y se ajustó e] pHa 6.5 con NH40H 1 M. La suspensión se conge1ó y en esteestado se mantuvo hasta 6 meses.

Luego de descongelada 1a suspensión se centrifugóa 6.000 x g durante 20 min, se descartó e] precipitadoverde y e1 sobrenadante se sometió a un fraccionamientocon SO4(NH4)2sóiido hasta alcanzar un 50% de saturación;iuego de una centrifugación a 6.000 x g, e] sobrenadantese 11evó a 90% de saturación con SO4(NH4)2.

La actividad FBPasa presente en ei precipitado seresuspendió en un buffer AcH/Ac‘ 50 mM(en 1/10 de] voïu­men del sobrenadante de 1a fracción descongeiada) pH 5.5

y iuego se diaiizó contra este buffer. Se ciarificó 1asuspensión por centrifugación (100.000 x g, 30 min). Sedescartó e} precipitado y 91 sobrenadante se cromatogra­fió en una coiumna de DEAE-ceiuiosa (2.5 x 15 cm)equiïibrada de antemano con buffer AcH/Ac' 50 mM, pH 5.5y CiNa 0.15 M. Luego de 1avar 1a coiumna con e] buffer deequiiibración (2-3 veces e] voiumen de 1a coiumna) 1ae1ución de 1a enzima se inició mediante un gradiente deCiNa de 0.15 M hasta 0.4 M (10-20 veces ei voiumen de 1acoiumna).

Las fracciones con actividad de FBPasa, ias cuaieseiuyeron aproximadamente con 0.3 M C1Na, se juntaron yconcentraron por ultrafi1tración con membranaDiafio-PM­30 (a 1/20 de su voiumen originai).

E1 concentrado se c1arificó por centrifugación a100.000 x g durante 30 min y se sembró (2-5% dei voiumentotai de 1a coiumna) en una columna de Sefadex G-100(3 x 90 cm), equiiibrada con buffer ACH/AC' 50 mM, pH5.5. Las fracciones eiuidas de 1a coiumna con actividadFBPasa se juntaron y concentraron por uitrafiitración conmembrana Diafïo-PM-30 y se guardaron a -20°C.2.1.2. Purificación de ¿logredoxina.

E1 sobrenadante se sometió a una precipitación conun voiumen equivaïente de EtOH a -15°C y C120a 0.5 mM, sedejó reposar 1a suspensión a -15°C durante 2 h y se 1acentrifugó a 6.000 x g durante 10 min. E1 sobrenadante sedescartó y e] precipitado se resuspendió en buffer Tris­CIH 30 mM, pH 7.9 (1/10 de] voiumen originai), e] que sediaiizó 20 h contra e] mismo buffer.

Luego de una centrifugación a 30.000 x g durante10 min, se cromatografió e] sobrenadante resuitante enuna coiumna de DEAE-ce1uiosa (2.5 x 15 cm) equi1ibradacon buffer Tris-C1H 30 mM, pH 7.9; 1uego de 1avada con e]

buffer de equiïibrio (2 veces e] voiumen tota] de 1acoiumna) se ap1icó un gradiente de C1Na hasta a1canzaruna concentración de 0.3 M. Las fracciones eïufdas conactividad de tiorredoxina, ias cuaies eiuyeron aproxima­damente en 0.15 M C1Na, se juntaron y concentraron poruïtrafiitración con una membranaDiaf1o-UM-2.

E1 concentrado (7 m1) se sembró en una co1umna deSefadex G-100 (3 x 90 cm) y se eiuyó con buffer Tris-CIH30 mM, pH 7.9. Las fracciones con actividad de tiorre­doxina se juntaron y 1uego de concentradas se sembraronen una coïumna de TEAE-ceiuiosa (2.5 x 15 cm) equi1ibradacon buffer Tris-CIH 30 mM, pH 7.9; 1uego de] 1avado seeiuyó con un gradiente de C1Na hasta 0.3 M. La tiorre­doxina eluyó en 0.15 M C1Na. Esta fracción se concentrópor u1trafi1tración con membrana Diafio-UM-Z y se guardóa -20°C.

2.2. Determinación de la actividad FBPasa.La actividad FBPasa se determinó mediante el ensayo

en dos etapas (202).La FBPasa (0.5 ug) se preincubó a 23°C durante 10

min en una soïución que contenía: buffer Tris-CIH pH 7.9(10 umoies), tiorredoxina-f (2.5 ug), DTT(0.25 umoies),C126a (0.01 umoï) y FBP (0.04 umoies) en un volumen fina]de 0.1 m1. Luego 1a mezcia se inyectó en una soïución quecontenía G1u-6-P deshidrogenasa de levadura (2 U), fos­fogiucoisomerasa de levadura (5 U), buffer Tris-CIH pH7.9 (50 umo1es), SO4Mg (1 umoï), FBP (0.36 umoies), EGTA(0.02 umoies) y NADP(1 umo1), en un voïumen de 0.9 m1.

La reacción enzimática fue seguida por e] cambio deabsorbancia a 340 nm en un espectrofotómetro Giïford2000.

La actividad de FBPasa se determinó mediante un

ensayo en una etapa para su medición en ias fraccioneseiuídas de ias cromatografías en columna.

La FBPasa (30-50 u1) se incubó a 23°C durante 20 minen una solución que contenía: buffer Tris-CIH pH 7.9(50 umoïes), SO4Mg (10 umoies), FBP (3 umoies) y EGTA(0.02 umoies) en un voiumen fina] de 1 m1.

La reacción enzimática fue seguida p0r 1a 1iberaciónde] Pi 3/ su reacción de coior con e] reactivo de Chen(314).2.2.1. Eglgfminaciónde la actividad fosfatasa.

La actividad de 1a FBPasa se determinó sobresustratos a1ternativos de acuerdo con ei ensayo en dosetapas.

La FBPasa (0.5 ug) se preincubó a 23°C durante10 min en una so]ución de 0.1 m1 que contenía: bufferTris-CIH pH 8.3 (10 umoles), tiorredoxina-f (2.5 ug),CIZCa (0.02 umoïes) y e] correspondiente azúcar bisfos­fato (0.2 umoles). Luego 1a mezcia se inyectó en 0.4 m1de una solución que contenía buffer Tris-CIH pH 8.3 (50umoies), SO4Mg (5 umoïes), EGTA (0.1 umo1), y e] azúcarbisfosfato indicado (0.5 umo1es).

La reacción se 11evó' a cabo durante 5 min y sedeterminó e] Pi 1iberado por e] método descripto por Cheny co]. (314) o por e] método de Fiske-Subbarow modificado(315).

2.3. Determinaciónde la actividad de tiorredoxina.La tiorredoxina se ensayó por su efecto activador

sobre 1a FBPasa independiente de otros efectores.La FBPasa (3 ug) se preincubó a 23°C durante 30 min

en una so1ución que contenía: buffer Tris-CIH pH 7.9 (10umoies), DTT(0.5 umoies), en presencia de 1a correspon­diente fracción (30 u1) en un voiumen fina] de 0.1 m1.

Luego la mezcia se inyectó en 0.9 mi de una soiución quecontenía: buffer Tris-CiH pH 7.9 (50 umoies), SO4Mg(1umoi), FBP (3 umoies) y EGTA(0.02 umoies).

La reacción enzimática se 11evó a cabo durante 5 miny e] Pi liberado se determinó por ios métodos descriptos(314,315).

2.4. Determinación de la actividad gggaía.La actividad SBPasa se determinó por un ensayo en

dos etapas (202).La SBPasa preincubada con Ca2+, SBPy tiorredoxina-f

reducida fotoquímicamente o químicamente cataliza 1ahidróiisis de 1a SBP. Su actividad se midió por 1aliberación de Pi, e] que se determinó por e] métododescripto por Chen y co]. (314) o por ei método de Fiske­Subbarow modificado (315).2.4.1. Activación fotoquímica de la SBPasa.

La reacción se iievó a cabo a 20°C en vasos deNarburg-Krippahi que contenían en e] brazo 1atera1:SBPasa (30 ug), y en e] compartimiento centrai: ferre­doxina (10 ug), tiorredoxina-f (60 ug), ferredoxina­tiorredoxina reductasa (7 ug), membranas de cioropiastoiavadas equivaientes a 20 ug de ciorofiia, buffer Tris­C1H pH 8.4 (40 umoies), C12Ca (0.08 umoies), SBP (0.2umoies), en un voiumen finai de 0.42 u].

Los vasos se equiiibraron en atmósfera deN2 durante 6 min y iuego se i1uminaron durante 5 min. Laenzima agregada en e] brazo 1atera1 se activó por ilumi­nación durante 20 min. La intensidad de 1a iuz fue de20.000 1ux (60).

Luego de 1a activación, una aiícuota (0.05 m1) de1a mezcia de preincubación se inyectó en 1a de reacciónpara e] ensayo de 1a actividad SBPasa.

2.4.2. Activación quimica de la SBPasa.Se preincubó SBPasa (6 ug) durante 20 min a 23°C

en un voiumen de 0.1 mi que contenía: buffer Tris-CIH pH8.4 (10 umoies), DTT (0.25 umoies), SBP (0.05 umoies),C12Ca (0.02 umoies) y tiorredoxina-f (8 ug).

Luego de 1a preincubación, 1a mezcia se inyectó en1a muestra de reacción para e] ensayo de 1a actividad.2.4.3. Ensayo de la actividad de SBPasa.

La actividad SBPasa se ensayó a 23°C en una soiu­ción que contenía: Tris-CIH pH 8.4 (100 umoies), SO4Mg(10 umoies), SBP (1 umoi), EGTA(0.1 umoi), en un voiumenfina] de 2 m1.

Luego de 4 min 1a reacción se detuvo por e] agre­gado de] reactivo usado para 1a determinación de Pi.

2.5. Purificación de la NADP-GAP-deshidrogenasa.La purificación se reaiizó de acuerdo con ei método

descripto por Noiosiuk y Buchanan (238). Las hojas deespinaca (500 di se lavaron y se mantuvieron durante 1 ha 0°C. Se cortaron y se coiocaron en un vaso de iicuadoraque contenía 1 1 de buffer Tris-CiH 50 mM pH 7.9, EDTA10 mMy B-met 0.1%. Se homogeneizó durante 3 min a 0°C y1a suspensión se fiitró a través de dos capas de muse­1ina. Se descartó e] residuo y ei filtrado se centrifugóa 11.000 x g durante 20 min. E1 precipitado se descartó ya1 sobrenadante se ie agregó SO4(NH4)2 sólido (0.24g/mi); 1a suspensión se mantuvo durante 15 min en agita­ción y se centrifugó a 11.000 x g durante 20 min. E1 pre­cipitado se descartó y se agregó ai sobrenadanteSO4(NH4)2sólido (0.135 g/mi), se agitó durante 20 min yse centrifugó a 11.000 x g durante 20 min.

E1 sobrenadante de esta segunda precipitación sedescartó y e] precipitado se resuSpendió en 120 m1 de

-34­

buffer Tris-CIH 0.1 M pH 7.9, EDTA10 mMy B-met 0.01%.

A] resuspendido se ie agregó un voiumen equivaientede acetona a -15°C y se centrifugó a -15°C a 37.000 x gdurante 5 min.

Se descartó e] sobrenadante y el precipitado seresuspendió en 100 m1 de buffer Tris-C1H 50 mM pH 7.9,EDTA 1 mMy B-met 0.1%, se mantuvo en agitación durante15 min y se centrifugó a 37.000 x g durante 10 min. Sedescartó e] precipitado y ei sobrenadante (90 m1) sesembró en una coiumna de DEAE-ceiuiosa (2 x 10 cm)equiiibrada con e1 buffer anterior. Se coiectaron iostubos de máxima concentración de proteinas eïufdos con e]lavado de 1a columna y se ies agregó SO4(NH4)2 sóiido(0.5 g/mi). Se agitó durante 15 min .y se centrifugó a30.000 x g durante 15 min. Se descartó e1 sobrenadante ye] precipitado se resuspendió en 3-5 m1 de buffer Tris­C1H 50 mM pH 7.9, EDIA 10 mM y B-met 0.01%, y se centri­

fugó a 100.000 x g durante 30 min.E1 sobrenadante ciarificado (1.5 m1) se sembró en

una coiumna de Bio Gei A 1.5 m (2 x 70 cm) y se eiuyó cone] buffer anterior.

Las fracciones con actividad NAD(P)-GAP—deshidroge­nasa se juntaron y concentraron por u1trafi1tración conuna membrana Diafio-PM-30. La fracción resuitante quecontenía 1a forma inactiva de 1a NAD(P)-GAP-deshidrogena­sa se guardó a 4°C antes de usar.

La actividad dependiente de NADPque no está origi­nariamente presente en esta fracción se pone de mani­fiesto a1 preincubarse con efectores especificos.

2.6. Determinación de la actividad de NAD(P)-GAP-deshi­drogenasa.La actividad se ensayo en dos etapas de acuerdo con

ei método previamente descripto (202).La enzima se preincubó a 23°C durante 10 min en un

volumen finai de 0.1 m1 de una soiución que contenía 10umoies de buffer Tris-CIH pH 7.9, en presencia o enausencia de ios moduiadores cuyo efecto se deseó deter­minar. Luego 1a mezcia se inyectó en una soiución quecontenía PGA-quinasa (5 U), buffer Tris-CIH pH 7.9 (50umoïes), SO4Mg (10 umoies), PGA (5 umoies), ATP (5umoïes), NAD(P)H (0.12 umoies) en un voiumen de 0.9 m1.La reacción enzimática fue seguida por ei cambio deabsorbancia a 340 nm en un espectrofotómetroGi1ford-2000.

2.7. Cromatografía de la FBPasaen estado activo.La FBPasa (Ó.2 mg/mi) se preincubó a 23°C en una

solución que contenía buffer Tris-CIH pH 7.9 (50 mM), DTT(2.5 mM), FBP (0.53 mM), Cïzca (0.2 mM)y tiorredoxina-f(30 ug/mï). Luego de una preincubación de 10 min, 1amezcia (0.25 m1) se sembró en una coiumna de Sefadex6-100 6 de Ultrogei LKB AcA 34 (1 x 28 cm), equilibradacon buffer Tris-CIH pH 7.9 (50 mM) que contenía DTT(2.5 mM). E1 flujo de 1a coïumna se mantuvo en 15 m1/h.Las fracciones se colectaron con un voiumen de 0.5 m1, alas que se ies ensayo 1a actividad FBPasa, de acuerdo con10 descripto en 2.2.

2.8. Cromatografía de la NADP-GAPdeshidrogenasa.La enzima (0.1 mg/m1) se preincubó a 23°C en una

soiución que contenía buffer Tris-C1H pH 7.9 (50 mM), DTT(2.5 mM), NADPH(0.5 mM)y tiorredoxina-f (12.5 ug/m1).Luego de 10 min de preincubación, se sembró (0.35 m1) enuna coiumna de Biogeï A 1.5 m (1 x 36 cm), equiiibradacon buffer Tris-CIH pH 7.9 (50 mM) y DTT (2.5 mM). E1

eïuido se coiectó en fracciones de 0.5 m1, a las que seies ensayo 1a actividad NADP-GAPdeshidrogenasa.

2.9. Purificación gg calmoduiina.La purificación de 1a ca1modu1ina de hojas de espi­

naca se reaiizó en base a1 método descripto (316). Lashojas de espinaca (500 g). 1avadas y guardadas a —20°Cdurante 18 hs, se cortaron y se coiocaron en un vaso deIicuadora que contenía 500 m1 de un buffer Tris-CIH pH7.9 (0.1 M), EGTA(2 mM). Se homogeneizó durante 3 min yse fi1tr6 a través de dos capas de muse1ina. E1 fi1tradose ajustó a pH'4.5 con ácido fórmico y se centrifugó a6.000 x g, durante 20 min. A1 sobrenadante se 1e agregó 4voïúmenes de EtOH a —20°C y AcNa (0.15 mM, pH 4.5), sedejó 1 h a —20°Cy se centrifugó a 6.000 x g durante 10min. E1 sobrenadante se descartó y e] precipitado seresuspendió en 150 m1 de buffer Tris-CIH pH 7.9 (50 mM).E1 resuspendido se dia1izó durante 18 h contra estebuffer. Luego de una centrifugación a 30.000 x g durante15 min se ie agregó a 1a muestra C12Ca hasta aïcanzar unaconcentración de 1 mMy B-met hasta 1 mM.

La suspensión se sembró en una coiumna de afinidadde CAPP-Sefarosa (0.5 x 4 cm) equiiibrada con bufferTris-CIH pH 7.9 (20 mM), C12Ca (1 mM) y B-met (1 mM). Lacolumna se eiuyó con 10 m1 de buffer Tris-CIH pH 7.9 (20

mM), C12Ca (1 mM), B-met (1 mM) y C1Na (200 mM) y 1uego

con 10 m1 de un buffer similar, pero a1 que se 1ereempiazó e] Cïzca por EGTA(10 mM).

Las fracciones de máximaconcentración de proteinas,e1uidas con e] buffer que contenía EGTA, se juntaron(2 m1) y se diaiizaron exhaustivamente contra un bufferTris-CIH pH 7.9 (30 mM). E1 dia1izado se concentró enboïsa de diáiisis coïocada sobre Fic011-400 só1ido. Unavez reducida 1a muestra (a 1/5 de su voiumen originai) sesembró en una coïumna de Sefadex G-75 (1 x 15 cm),equiïibrada con buffer Tris-C1H pH 7.9 (30 mM). Las frac­ciones ensayadas por su efecto activador sobre 1a FBPasase juntaron y se conservaron a 0°C en tubos de plástico.2.9.1. Preparación de la CAPP-Sefarosa.

La CAPP-Sefarosa que se usó en uno de Ios pasos depurificación de 1a caïmoduïina de hojas de espinaca sepreparó de acuerdo con el método ya descripto (317).

La Sefarosa 4B (12 g), previamente 1avada con Hzobidesti1ada, fue resuspendida en 10 m1 de H20. A dichasuspensión se.1a sometió a agitación magnética en baño dehie1o y se 1e agregó 10 m1 de una soïución de BrCN(0.2 g/ml), manteniéndose e] pH = 11 por e] agregado deHONa 4 N. A ios 10 min, una vez estabilizado e1 pH, 1aresina se fi1tró con vacio en un embudo Büchner y se 1avósucesivamente con 100 m1 de H20 bidesti1ada y 100 m1 deNaC03H (0.1 M), ambos a 4°C. La resina asi activada seresuspendió en 10 m1 de NaC03H pH 10 (0.4 M), que con­tenía 25 mg de CAPPdisueïto. La suspensión se dejó agi­tando a 4°C durante 20 h. Posteriormente, 1a resina fue1avada en 10 pasos sucesivos con 100 m1 de C1K (1 M). Lapresencia de CAPP en 10s 1avados se determinó porfïuorescencia (7kexcitaci6n = 350 nm; jm emisión = 455nm).

Finaimente, 1a resina fue fiïtrada y 1avadaexhaustivamente con H20bidestiïada.

2.10. E1ectroforesis en geles de pgïiacriïamida en con­diciones desnaturaïizantes.Se realizaron ge1es p1anos po1imerizados en una

ce1da marca Bio Rad modeïo 220 (318). 'E1 ge] de corrida fue discontinuo, formado por: a)

un ge] concentrador de 2 cm de aïto x 1.5 mm de espesorque contenía acriïamida 5% (P/V), bisacri1amida 0.13%(P/V), SDS 0.1% (P/V) en buffer Tris-CIH pH 6.8 (0.125M), que fue po1imerizado por e] agregado de TEMED0.05%

(V/V) y PSA 0.1% (P/V) y b) un ge] separador de 8 cm dea1to x 1.5 mm de espesor formado por acriïamida 10, 12 615% (P/V), bisacriIamida 0.27, 0.31 6 0.39% (P/V), SDS0.1% (P/V) en buffer Tris-ClH pH 8.8 y poïimerizado pore] agregado de TEMED0.025% (V/V) y PSA 0.033% (P/V).

Las muestras antes de ser sometidas a e1ectrofore­sis fueron diaïizadas durante 16 h contra e1—buffer deresuspensión de éstas, Iibre de sa1es, a 4°C. A un voïu­men no mayor de 50 u1 que contenía de 30 a 50 ug de pro­teina se 1e agregó 50 u] de una mezc1a desnaturaïizantecompuesta por: SDS 2% (P/V), B-met 5% (V/V), gïiceroï 20%(V/V) en un buffer Tris-Cïfl pH 6.8 (0.06 M) y azuï debromofeno] 0.002% (P/V). Las muestras fueron ca1entadasdurante 3 min en baño de agua a 100°C. E1 buffer decorrida fue Tris-Gïi pH 8.0 (50 mM) y SDS 0.1% (P/V).Luego de apiicar 1as muestras en e1 cana] correspondientede] ge], 1a e1ectroforesis se reaïizó a una intensidad decorriente variabïe y voitaje constante de 50 V durante1 h y 1uego se ajustó e1 voitaje en 100 V durante 4 a5 h, manteniendo 1a temperatura a 15°C.

Las proteinas uti1izadas como marcadoras de peso

moiecuiar fueron: fosforiiasa b (müscuio de conejo),94.000; aibúmina (suero bovino). 67.000; ovaibúmina(clara de huevo), 43.000; anhidrasa carbónica (eritrocitobovino), 30.000; inhibidor de tripsina (hoja). 20.000;fi-lactoaibúmina (ieche de vaca), 14.400.

A1 término de 1a corrida electroforética, Ios geiesfueron fijados y teñidos a1 mismo tiempo durante 16 h enuna soiución acuosa que contenfa metanoi 25% (V/V), ácidoacético 8% (V/V) y azui de Coomassie R250 0.2% (P/V). E1desteñido se hizo con 1a misma soiución, pero sin e]coiorante.

2.11. Preparación gg cïoropiastos.La preparación de ios cloropiastos se reaïizó de

acuerdo con el método anteriormente descripto (319).Siete hojas de espinacas frescas se cortaron y coiocaronen un vaso de iicuadora para su homogeneización durante15 s, en una soiución isotónica para c1orop1astos__quecontenía buffer Tris-CIH pH 7.9 (30 mM), sacarosa (0.33M), ácido ascórbico (2 mM). E1 homogenato se fiitró através de dos capas de gasa y e] fiïtrado se centrifugd a5.000 x g. E1 peïïet correspondiente a ios cioropiastosse resuspendió en un voiumen mínimo de 1a soiuciónisotónica.2.11.1. Preparación gg membranas.

Los cloropiastos obtenidos en 1a preparaciónanterior fueron resuspendidos nuevamente en 1a soluciónisotónica para su 1avado y se centrifugaron a 5.000 x gdurante 1 min. E1 peliet se resuspendió en so1uci6nhipotónica que contenía buffer Tris-CIH pH 7.9 (30 mM),B-met (0.1%) y CiNa (20 mM) en un voiumen tai que 1a con­centración de ciorofíia fue de aproximadamente l mg/m].E1 fraccionamiento de ias membranas de] cioropiasto pro­

ducidas por shock hipotónico se realizó de acuerdo con e1método ya descripto (320). La suspensión de c10rop1astosrotos (5.5 m1) se sembró en 1a superficie de un gradientediscontinuo de sacarosa y se centrifugó a 20.000 rpm(centrífuga BeckmanL5-50, rotor SN 25-2) durante 90 min.E1 gradiente se preparó por e] agregado sucesivo deaïfcuotas de 5 m1 de una soïución de sacarosa de con­centración creciente hacia e] fondo de] tubo (0.6, 0.9,1.2 y 1.5 M). Luego de 1a centrifugación, se obtuvo 1aseparación en tres bandas presentes en 1a interfase deIas capas de sacarosa. La fracción más Iiviana correspon­dió a 1a envoItura del cloroplasto. una fracción inter­media compuesta por 1a 1ame1a deï estroma y 1a fracciónmas pesada constituida por membranas tiïacoides. Estafracción se di1uy6 cinco veces con buffer Tris-CIH pH 7.9(5 mM) y C12Mg (2 mM), y se centrifugó a 105 x g durante30 min. E1 sobrenadante se descartó y el precipitado seresuspendió en buffer Tris-CIH pH 7.9 (50 mM) hastaaïcanzar una concentración de 1 mg de cïorofiIa/ml (321).Esta fracción constituye lo que se denomina "membranasti1acoides de] cïoroplasto'.

2.12. Cu1tivo gg cianobacterias.Cé1u1as de Nostoc muscorum (cepa 71 19) fueron

cuïtivadas fototróficamente en e1 medio ya descripto(322). E1 medio de cuitivo estaba compuesto por 10 m1/1de cada una de 1as siguientes soiuciones: C1Na (11.79/1), SOqu.7 H20 (12.4 g/I), C12Ca.2 H20 (1.5 g/I),K2P04H.3 H20 (45.7 9/1); por 20 m1/1 de una soiución deN03K (1 M); por 5 m1/1 de NaC03H (0.1 M) y por 1 m1/1 deuna so1uci6n de SO4Fe.7 H20 (5.5 g/1), EDTA(8.8 g/1 11a­vado a pH = 3) y de una soïución de micronutrientes quecontenía en 1 1: BO3H3 (2.86 g), CïzMn.4 H20 (1.81 g),

SO4Zn.7 H20 (0;222 g), 504Cu.5 H20 (0.079 g), MoO4Na2.2H20 (1.26 g), V03Na (0.239 g) y C12Co.6 H20 (0.0403 g).Se inocu16 un medio de 250 m1 a partir de cianobacteriascrecidas en medio sóïido formado por e] mismo medio decuïtivo, pero en agar (1%). Luego se 11ev6 a un medio decuïtivo de 1 1, e] que se dejó creciendo posteriormenteen otro medio de cuitivo de 10 1. Las cianobacterias sedejaron creciendo de una a dos semanas en e} medio decu1tivo permanentemente iiuminado con dos tubosf1uorescentes de 20 H cada uno.2.12.1. Cosechagg las cianobacterias.

Las céluias se cosecharon en 1a fase estacionariade crecimiento de] cuitivo por centrifugación a30.000 x g durante 20 min a 4°C. Las c€1u1as se 1avaron yresuspendieron en buffer Tris-CÏH pH 7.9 (50 mM). E1peïiet de cianobacterias _se conservó a -70°C hasta suuso.2.12.2. Ensayo del desprendimiento de 92 en céiuias de

Nostoc muscorum. _Un cuitivo de cianobacterias se cosechó y e]

peiiet se guardó a -70°C durante un mes. Una punta deeSpátuïa de dicho pe11et se resuspendió en 40 m1 de unbuffer MES-NaOH pH 6.5 (50 mM) que contenía sacarosa(0.36 M), Fic011-400 (0.4%) y C12Ca (25 mM). La suspen­sión se centrifugó a 3.000 x g durante 10 min yfina1mente se resuspendió en 2 m1 dei mismo buffer.

Para 1a determinación de] desprendimiento de02 se agregaron 0.6 m1 de 1a muestra de cianobacterias enuna cámara de poiarógrafo con un e1ectrodo de Ciarkdesarroïiado por Deïieu y Naiker (323), en agitacióncontinua. La suspensión se dejó estabiiizar registrándosee] consumo de 02 y se prendió 1a qu (actfnica, 2.000Tux), midiéndose 1a Iiberación de 02, que fue seguida por

un registrador (X-T) acopïado a1 poïarógrafo, a una velo­cidad de 1.25 cm/min y 1a escaïa expandida utíïizada fuede 1 mV.

3. RESULTADOS.

3.1. Reguiaciónde la fructosa-1,6-bisfosfatasa.La FBPasa de cioroplastos puede ser activada in

vitro tanto por e] sistema reductor, ferredoxina­tiorredoxina (60) y, en forma independiente, por susustrato, 1a FBP (248). Más aún, se observó una interac­ción de ambos sistemas a concentraciones que por sf soiosno son modificatorios, 10s cuaies producen 1a activaciónconcertada de 1a FBPasa (275). Sin embargo, ias aitasconcentraciones de sustrato (3 mM), requeridas para e]desarroiïo de 1a actividad, indicaban 1a carencia de uncomponente en e] sistema de regulación enzimático. Laincorporación de] Caz+ a1 sistema modificador produjo 1aactivación de 1a FBPasa, in vitro, obteniéndose una a1taactividad especifica a concentraciones de FBP con­sideradas fisioiógicas (0.4 mM).

En estas condiciones, 1a actividad cataiftica,ensayada a bajas concentraciones de Mg2+(1 mM), cofactorrequerido por 1a enzima para 1a catáiisis, es inhibidapor e] Ca2+ proveniente de] sistema de modificaciónenzimática. Por eiio 1a actividad cataiitica es compieta­mente desarroliada por e] agregado de EGTAen 1a mezc1ade reacción, como se muestra en la Fig. 1, antes odespués de 1a inyección de 1a enzima activada. E1 EGTAesun queiante de metaies bivaientes con mayor afinidad paraei Ca2+ (Kd: 10-11 M) respecto dei Mg2+ (Kd: 10-4 M)(324).

La FBPasa, asi como otras enzimas reguiatorias de1cicio de asimiiación fotosintética de C02, presentan e]fenómeno de histiéresis enzimática, e] cua] se reveia enuna veiocidad de activación más 1enta que 1a de catáii­sis (274). De acuerdo con esta caracteristica, e1 ensayose 11eva a cabo en dos etapas, donde se separan 1a acti­

Fig. 1: Requerimiento de EGTApara 1a máxima expresión de 1a catáH­_s_is

OS l i I 1

EC _

C3x1".mC, 0.3 ­

.9U _CC3'.Q5 01m . ..

‘.Q<E

l l | l l

Tiempo (min)

La FBPasa fue activada por preincubac'ón con DTT (2.5 mM), tiorre­doxina (25 ug/mi), FBP (G.4 mM) y Ca + (0.1 mM); 1uego de 10 min,0.1 m1 de 1a muestra se inyectaron en una mezcïa de reacción en pre­sencia y en ausencia de EGTA (20 uM). Cuando e'l EGTA fue omitido a1principio de ia reacción, se 10 agregó 'Iuego de 1 min. La actividad sedeterminó siguiendo 1a formación de F-6-P espectrofotométricamente porun sistema enzimático acopiado a ia reducción de NADPde acuerdo conp10 descripto en Materiales y Metodos.

vación de 1a catálisis (202),3.1.1. Eg¿g_ gg modificación: En 1a cua] 1a enzima espreincubada, por minutos, con ios efectores que provocan1a conversión de 1a enzima de un estado inactivo a unoactivo.3.1.2. [ase de catáiisis: En 1a que se determina 1a acti­vidad de hidr61isis de 1a enzima modificada.

Ei Vm *»Ea

Vm f Vc.Sustrato Producto

Vc

La actividad de 1a FBPasa ensayada a FBP (0.4 mM)yM92+ (1 mM) es dependiente de 1a preincubación de 1aenzima con DTT, tiorredoxina, FBP y Ca?+. La ausencia deuno de estos modificadores en 1a mezc1a de preincubaciónimpide e1 pasaje de 1a enzima a1 estado activo.

Debido a que ei sistema de modificación enzimáticaestá formado por tres efectores y se requiere una prein­cubación 1arga para producir 1a activación enzimática, sepensó en 1a posibilidad que soïo uno de estos modifica­dores fuera ïimitante en 1a veïocidad de activación.

De manera que preincubando por cierto tiempo 1aenzima en presencia de uno de 105 modificadores, e] agre­gado de 1os restantes podria provocar 1a activación inme­diata de 1a FBPasa. En 1a Fig. 2 se observa que 1aadición secuencia] de ios modificadores a 1a FBPasa pro­duce su transformación a1 estado activo 5010 cuando lostres componentes están presentes. Esto es asi, indepen­diente deï orden de adición de ios diferentes modifica­dores. La actividad FBPasa se incrementa progresivamentehasta a1canzar un máximo de veiocidad de catáiisis a Ios

Fig. 2: Dependencia dg_lg_activaci6n gg_lg_FBPasa gg_c10rop1astos deÜTT, tiorredoxina, P-y a__s

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l 5'Tliorredoxinc-fc02'r1 ‘0-:> I'wlj 1 a nll Illll0281012141618

Tiempo (min)

La FBPasa se preincubó secuencia1mente con cada uno de 1os componentesde 1a fase de nndificación. Las conc ntraciones de éktos fueron: DTT(2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mi), Ca + (0.1 mM), FBP (0.4 mM), agre­gados a ios tiempos indicados. La soiución que contenía 1a enzima seinyectó en 1a nezcia de "edición de 1a actividad y se determinó 1aformación de F-6-P espectrofotométricamente mediante un sistemaenzimático acopiado a 1a reducción dei NADP, de acuerdo con 10descripto en Materiaies y Métodos.

10 min de preincubación.Como 1a reacción de 1a FBPasa consiste en dos etapas

sucesivas, se esperaría que ios modificadores que actúanen ambas fases tengan dos constantes cinéticas diferen­tes. E1 sistema experimenta] uti1izado permite caracteri­zar estos aspectos cinéticos de modo que pueden determi­narse ias constantes de activación, variando ias concen­traciones de FBPy Ca2+ en 1a fase de modificación; mien­tras que en 1a fase cataiftica estas concentraciones semantienen constantes. Para obtener información sobre lasconstantes cinéticas en 1a fase cataiftica, 1a enzima sepreincuba con 1a tiorredoxina reducida, FBPy Ca2+, man­teniendo 1as concentraciones de éstos constantes; mien­tras que se varian en catáiisis. Asimismo 1a determina­ción de ias diferentes constantes, tanto de activacióncomo de catáiisis, se ensayan a diferentes con­centraciones de M92+en 1a fase cataiftica.

3.1.1. fase de modificación.Se ha estudiado e1 efecto de cada uno de 10s com­

ponentes de1 sistema de modificación de 1a FBPasa enforma particuiar, considerando su interreïación en 1atransformación de 1a FBPasa entre dos estados diferentes(activo e inactivo).

Es de hacer notar que en esta etapa no hayhidróiisis de] sustrato, FBP, por cuanto se omite e]MgZ+,cofactor requerido para 1a catá1isis.

Los requerimientos de 1a activación de 1a FBPasata] como se muestran en 1a Tabïa I son 1a tiorredoxinareducida químicamente por ei DTT, 1a FBP (0.4 mM), y unmeta] bivaïente como e] Ca2+ (Otl mM) 6 e] Mn2+ (10 uM);por 1a ausencia de uno soïo de estos modificadores 1aenzima permanece inactiva.

Tabïa I: Requerimiento de DTT-tiorredoxinarf, F P y CaÉi_Eara la_acti­vac1on gg_1g_FBPasadel clotgglasïo. ”’—'

Actividad FBPasaCondiciones de preincubacióh

umo] F-6-P . min"1 . mg prot-1

Tiorredoxina-f 0

FBP 0

Ca2+ 0

Tiorredoxina-f + FBP 3.8

Tiorredoxina-f + Ca2+ 0

FBP + Ca2+ o

Tiorredoxina-f + FBP + Ca2+ 73.2

La FBPasa se greincubó con DTT 2.5 mM, tiorredoxina 30 ug/m], FBP0.4 mMy Ca2+ .1 mM, según se indica en 1a tabia. Luego de 10 min semidió 1a actividad por formación de F-6-P espectrofotométricamente deacuerdo con 10 descripto en Materiaïes y Métodos por un sistemaenzimático acopïado a 1a reducción de NADP.

3.1.1.1. Efecto de 105 azúcares-fosfato.3.1.1.1.1. La fructosa-1,6-bisfosfato.

E1 sustrato enzimática actúa como activador.La Fig. 3 muestra que 1a enzima se hace progresivamentemás activa a medida que se incrementa 1a concentracion deFBP en 1a preincubación.

Diferentes concentraciones de M92+ ensayadasen 1a cataïisis no modifican e] Ao_5 para FBP, que semantiene en 0.3 mMen todos ïos casos, mientras que sfmodifica 1a veïocidad máxima, que es de 80umo1es.min'1.mg prot'1 ensayada a 1 mM Mg2+ y de 160umo]es.min'1.mg prot'1 a 3 y 5 mMM92+.

Cuando se omite 1a tiorredoxina en 1a prein­cubación, 1a enzima presenta una baja actividadcataïïtica. En este caso 1a FBP es también un activadorsiempre que e] Ca2+ esté presente en 1a preincubación ysu concentración se aumente 10 veces (1 mM) con respectoa 1a utiïizada en presencia de 1a tiorredoxina reducida.De modo que FBP (0.4 mM) y Ca2+ (1 mM) producen 1a acti­vación de 1a enzima, pero en estas condiciones desarroïïamenor actividad. Asimismo en 1a Fig. 4 se observa que eneste caso 1a enzima requiere un mayor tiempo de prein­cubación (25 min) para alcanzar 1a veïocidad máxima.3.1.1.1.2. Otros azúcares bisfosfato.

Como se señaïó anteriormente, 1a FBPasa puedeser modificada por cada uno de 105 modificadores indivi­duaïmente cuando éstos se ensayan en aïtas concentracio­nes. En este caso se observó que e] único azúcarbisfosfato capaz de transformar a 1a FBPasa a su estadoactivo es su sustrato, 1a FBP (248). Mientras que en 1asactua1es condiciones en que 1os tres componentes par­ticipan simuïtáneamente a concentraciones muyinferiores,se observa en 1a Tabia II un incremento mayor de 10 veces

-100­

Fio. 9- Efecto de 1a concentración de FBP en ia activación de 1aWEciïrW——-_————

Ï I 1 - l

Mgz*(mM) ‘_—h

O CD

I

oo Ol l

CD Ol I

b OÏ

N Ol

pmolFru-B-Pformado.min'1omgprot'1 OO

l J

100 200 300 ¿.00 500

FBP (/uM)

La FBPasa se preincubó con Ca2+ (0.1 mM), DTT (2.5 mM) y con­centraciones variabies de FBPen presencia (O,A,I) o ausencia (CAD)de tiorredoxina (25 ug/m1). Luego de 10 min, 1a muqístr‘a se inyectó ene] medio de medición que contenía 1, 3 6 5 mMde Mg +. La actividad sesiguio' por formación de F-6-P espectrofotométricamente con un sistemaenzima'tico ac0p1ado a 1a reduccion de NADP, de acuerdo con 10descripto en Materiaies y Métodos.

Fig. 4: Efecto dei tiempo en 1a activación de 1a FBPasa demgamm @“_—__"

-1.EE 10ó'DDE

32%256-5esZ

2g o . . 41 o 1o _ 20 -. 3o

Tiempo l (min)

La FBPasa se preincubó con FBP (0.4 mM)y (la2+ ('1 mM)y a diferentestiempos 1a muestra se inyectó en 1a mezcia de medicio'n de 'Iacata'iisis. La actividad se siguió por formación de F-6-P espectrofo­tométricamente con un sistema enzimático acopiado a 1a reducción deNADPsegu'n se indica en Materiaies y Métodos.

Tabia II: Efecto _d_e_Es comgonentes d_e 1_a fase _dg modificación sobre1_aFBPasade c'lorogiastos.

Actividad FBPasaPreincubacio’n S min (umo‘les F-6-P

fonnado.min'1.mg prot‘l)

Contro'l .2

DTT (5 rnM)tiorredoxina (80 ug) 1.6 (ref. 275)

FBP (12 InM) .7 (ref. 2L8)

DTT (5 mM)-+ tiorredo­xina (20 ug) + FBP 2.2 (ref. 275)

DTT (2,5 HM) + tiorre­

doxina (2,5 ug) + FBP(0.4 mM) + Ca + (0.1 mM) 40.0

La FBPasa se preincubó segu'n se indica en presencia de DTT, tiorre­doxina, FBP y/o Ca +. Luego de 5 min, 1a muestra se inyectó en e]medio de reacción _y 1a actividad se determino' de acuerdo con 10descripto en Materiaïes y Me'todos. ’

en 1a veïocidad máxima, asi como 1a disminución de iasconcentraciones de dichos efectores requeridos para pro­ducir 1a modificación de 1a enzima.

De modo que 1as modificaciones producidas enla activación de 1a FBPasa por 1a incorporación de]Ca2+ en ei medio de preincubación observadas en 1a Tab1aII podrian redundar además en un cambio en 1a especifici­dad de1 azúcar bisfosfato requerido para su activación.

La Tabla III muestra que otros azúcares bisfos­fato como SBP, GIuBP, y RuBP reemp1azan a 1a FBP en 1aactivación de 1a enzima en presencia de tiorredoxinareducida y Ca2+. Mientras que Ios azúcares monofosfato yotros intermediarios de] ciclo de Benson-Caivin (DHAP,GAP, PGA, ATP, ADP, Pi) carecen de efecto activador.3.1.1.2. Efecto de los metaïes bivaïentes.3.1.1.2.1. Efecto¿gain

Lo anterior muestra que 1a FBPasa desarroïiauna alta actividad enzimática a bajas concentraciones deFBP (0.4 mM) y de M92+ (1 mM). soio si ésta ha sido pre­viamente incubada con DTT, tiorredoxina, FBP y Ca2+. Demodo que e] pape1 de] Ca2+ en e] sistema de modificaciónha sido e] de disminuir 1as concentraciones de 10s otrosefectores requeridos para 1a activación, comoasi tambiénposibiïitar mayoresactividades enzimáticas.

E1 Ca2+ fue considerado por mucho tiempo comoun inhibidor de 1a FBPasa (269,325-329).

En nuestro sistema experimental, 1a reacciónde 1a FBPasa se separa en dos fases. 1a de modificación y1a de catáïisis; en esta úitima se mantiene una con­centración de EGTAta] que compieje el Ca2+ remanente de1a preincubación. De esta manera, e] efecto que seobserva es aque] que ejerce e] Ca2+ como activador.

La actividad de FBPasa es muy baja en ausencia

-104­

Tab1aIII: Efecto de Ios azu’cares fosfato a ji activación g 1_aFBPasaggfcloroplasfo.

Actividad FBPasaAzútar fosfato

(umoï F-6-P . min-1 . mg prot.)

Fructosa-1,6-bisfosfato 104

Sedoheptuïosa-1,7-bisfosfato 92

Glucosa-1,6-bisfosfato 65

Ribuïosa-1,5-bisfosfato 31

Fructosa-l-fosfato 5

Fructosa-G-fosfato

G1ucosa-1-fosfato

Gïucosa-G-fosfato

“Nh-k0Ribosa-S-fosfato

La FBPasa se preincubó con e1 azútar fosfato (0.5 mM)indicado en pre­sencia de DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/ml), Ca2+ (0.1 mM), y1uego 1a actividad se ensayó de acuerdo con 10 descripto en Materia1esy Métodos.

de C82+ (2 umoïes.min'1.mg prot'l); a medida que seincrementa su concentración en e1 medio de preincubación,aumenta 1a actividad enzimática, siguiendo una curvasigmoide, hasta 11egar a un máximo que es dependiente de1a concentración de M92+ utilizada en e] ensayo decatáïisis. La variación en 1a velocidad máxima es, comose observa en 1a Fig. 5, de 60 umo]es.min'1.mg prot'1 a 1mMM92+ y de 120 umoïes.min'1.mg prot’l a 3 6 5 mM MgZ+;mientras que e] A0.5 para Ca2+ se mantiene constante (55uM) a cuaiquier concentración de Mg2+ensayada. En ausen­cia de tiorredoxina reducida, 1a FBPasa puede ser acti­vada por FBP y Ca2+, aunque 1a veiocidad de catálisismedida es un 20% de 1a obtenida cuando 1a enzima es

preincubada con e] sistema completo.En 1a Tabia IV se muestra que 1a enzima prein­

cubada durante 10 min con tiorredoxina reducida, FBP yCa2+ en presencia de EGTAy iuego inyectada en 1a mezciade reacción no desarroïia actividad. De manera quee e1agregado de EGTAqueiante de1 Ca2+ en ei sistema de modi­ficación previene e] cambio de 1a enzima a su estadoactivo. Si 1uego de 10 min de preincubación con eisistema comp1eto de modificación, donde se produce 1amáxima activación enzimática, 1a FBPasa es preincubadadurante 10 min adicionales con EGTA, 1a actividad de 1aenzima no disminuye. De modo que e] Ca2+ es requeridosoiamente en los 10 min de modificación de 1a FBPasa deun estado inactivo a uno activo.3.1.1.2.2. Otros metaies bivaientes.

Si bien ei Ca2+ ensayado en e1 sistema demodificación es e] metal bivaiente que mayor actividad leconfiere a 1a FBPasa en su pasaje a un estado activo,puede ser reempiazado por Mn2+y Sr2+.

En 1a Tabla V se observa que e] Mn2+ y e] Sr2+

-106­

Fig. 5: Efecto de] Cazi gn lg activación gg la FBPasa ficioropiaíï-o. _

120 - 1 ' ' ' ngzï(mM)I/'5l 13

100 " ­

80 - - '

_ > 1 _

50 '—' '­

¿x O

N C)

,umolFru-G-Pformado¿emin“1omgprot'1

lnr- ‘1 l l0' 1.0 80 120

CCIClz (pM)

l

160

La FBPasa fue preincubada con FBP (0.4 mM), DTT (2.5 ITM) y con­centraciones variabies de Ca + en presencia (O, l ,I ) o en ausencia(O , A ,D ) de tiorredoxina (25 ug/mïg. Luego de 10 min, 1a actividadfue ensayada a 3 concentraciones de Mg+ 1 mM(0,0 ), 3 mM(A,A ), y5 rnM(I , Ü) de acuerdo con 10 descripto en Materia1es y Métodos.

Tabia IV: Efecto de] EGTAen 1a activación gg_FBPasa gg_c10ropïastoEgr_932Í, EEE_X_DTT-tiorredoxina-f.

Actividad FBPasaCondiciones de preincubación

(umoï F-6-P formado . min'1 .mgprot'l)

Compieto, 10 min 44

Comp'leto + EGTA, 10 min 0

Comp1eto, 10 mín + EGTA, 10 min 41.5

Se incubó FBPasa (2.5 ug) a 23°C in 0.1 m1 de una soiución que con­teni'a 3 ug de tiorredoxina-f y adema’s de (expresado en umoi) bufferTris-CIH pH 7.9, 10; DTT, 0.25; FBP, 0.04; CaC12, 0.01 y, como seindicara anteriormente, EGTA,0.02. Luego de 1a preincubación, seinyectó 1a enzima en 1a nezcïa de] ensayo y 1a formación de F-6-P sesiguió espectrofotométricamente, ta] comose describe en Materiaïes yMétodos.

- 108 ­

Tabia V: Efecto de Ios meta1es bivalentes en 1a activacióh de 1aFBPasad'_e—clorop|asïos. _ — _ _

Actividad FBPasa

Componente (umoï F-6-P formado . min“1 .mgprot'l)

Ca2+ 88

Mn2+ 38

Sr2+ 10

La FBPasa se preincubó en un medio que contenía DTT (2.5 mM), tiorre­doxina (25 ug/ml) FBP (0.4 mM) y segúh se indica Ca2+ (0.1 mM),Mn2+ (10 uM) 6 Sr2+ (0.1 mM). Luego de 10 min, 1a muestra se inyectóen 1a mezcla de reacción y 1a actividad se detenminó en presencia deEGTA(20 uM), segúh 10 descripto en Materiaïes y Métodos.

reemplazan a1 Ca2+ en 1a activación de 1a FBPasa que enestas condiciones desarr011a 1a mitad 6 10%, respectiva­mente, de 1a veïocidad observada por preincubación conCa2+.

La concentración de Mn2+requerida para a1can­zar 1a mitad de 1a ve1ocidad máxima, como se muestra en1a Fig. 6, es de 7 uM, concentración ésta muy inferior a1a requerida para e1 Ca2+. Otros cationes biva1entes(Cu2+, Co2+, H92+, 2n2+, Fe2+, Pb2+, Cd2+, Ba2+)ensayados a 0.1 mMno tuvieron un efecto apreciab1e.3.1.1.3. Efecto de la tiorredoxina-f reducida.

La tiorredoxina-f, reduCida fotoqufmicamente por1a ferredoxina via 1a ferredoxina-tiorredoxina reductasaen presencia de membranas, o bien químicamente por unditio], e1 DTT, reduce a 1a FBPasa produciendo por sf

so1a un cambio de 1a FBPasa a su estado activo. Sinembargo, en presencia de FBP y Ca2+ su activación se pro­duce a menores concentraciones de tiorredoxina-f redu­cida.

Asimismo, 1a activación de 1a. FBPasa porDTT/tiorredoxina-f no seria independiente de1 meta] biva­1ente y e] azúcar bisfosfato, ya que a1 inyectar 1aenzima preincubada con DTT/tiorredoxina-f en e] medio dereacción se observa un lag hasta que 1a cinética de 1areacción es linea]. Sobre 1a base de 105 resuïtadosanteriores, 1a FBP (6 mM)estaría infïuyendo en 1a acti­vación de 1a FBPasa; 1a preincubación 1arga conDTT/tiorredoxina-f provocaría una modificación de 1aFBPasa y 1a a1ta concentración de FBP presente en e]medio de reacción 1a activarfa rápidamente. Esto esposib1e, ya que e] tiempo requerido para a1canzar 1amitad de] máximo nive] de activación informado, con con­centraciones saturantes de tiorredoxina-f y FBP, es de 12

-110­

Fig. 6: Efecto de1'Mn_2.Ï sobre_ 1_a activación gg la FBPasa de¿Loro-[flafi5._

100 - _

°/odeActividad

1434 * e

o 1o 25 ' ¡4o 60

MnClz

La FBPasa se preincubo' en presencia de DTT (2.5 mM), Éiorredoxina(30 ug/m‘l), FBP (0.4 mM)y concentraciones variables de Mn +. Luego de10 min, 1a muestra se inyectó en ei medio de medición, en presencia deMg2+ (1 mM) y 1a actividad se determinó por 1a formación de NADPHsegún se indica en Materiaïes y Métodos.E] 100% de 1a actividad corresponde a 38 umoïes de F-6-P formadomin"1 . mg prot'l.

min y 30 seg respectivamente.E1 efecto que 1a tiorredoxina-f tiene en 1a

activación concertada de 1a FBPasa en reiación con a) FBPy b) Ca2+ es e] siguiente:a) Con respecto a1 FBP, se muestra en 1a Fig. 7 que 1atiorredoxina-f reducida, además de aumentar 1evemente 1aveiocidad maxima de 1a FBPasa modificada, produce 1adisminución de 1a concentración de FBP requerida paraobtener 1a mitad de 1a máxima activación; asi, e] A0,5 esde 2 mMy 0.3 mMen ausencia y presencia de tiorredoxina­f, respectivamente.b) En tanto que, respecto de] Ca2+, 1a tiorredoxina-f nomodifica ei A0.5 para éste. En 1a Fig. 8 se observaademás una gran infiuencia en 1a veiocidad maxima de 1aFBPasa de 80 umoies.min'1.mg prot'1 y 155 umoies.min'1.mgprot'1 en ausencia y presencia de tiorredoxina-f, respec­tivamente. En ausencia compieta' de reductor (DTT), seobserva activacion enzimática a aitas concentraciones deCa2+ (> 1 mM), aunque e] tiempo requerido de prein­

cubación es mayor que con e] sistema completo, como fuecomentado anteriormente (Fig. 4).3.1.1.4. Efecto del RH.

En 1a Fig. 9 se muestra que 1a enzima a1canza sumáxima activación entre pH 8.2-8.5. A pesar que 1a acti­vidad a pH 7.9 es de aproximadamente un 70% de] máximo,ios ensayos se realizaron a este pH, ya que representa e]limite inferior de pH informado para e] estroma ilumi­nado. E1 pH infiuiria en e] tiempo necesario para aican­zar e] máximo grado de activación, como se observa en 1aFig. 10, a pH 8.5. E1 tiempo a1 cua] se 1ogra dicha acti­vación es 1a mitad dei requerido a pH 7.9 para 1a FBPasa.

- 112 ­

Fig. 7: Efecto de 1a FBP en 1a activación de FBPasa gg_c10rop1astosgg_pres€Ícï3íg auáEícïa'gg_tíorredoíïña.

tiorredoxinn-(á .DTTy Caz‘

A O CD

,-1

,umolFru-S-PformadOomlnomgprof1

U'1 Ol

9?

1 . 2 3 q

log FBP (/uM)

La FBPasa se preincubó con Ca2+ (0.1 mM), DTT (2.5 mM)y concentracio­nes variabïes de FBP, en presencia (O) o ausencia (I) de tiorredoxi­na-f (25 ug/m1). Luego de lO'min, 1a muestra se ínyectó en e] medio demedición, cuya concentración de FBP para 1a catáïísís era 0.4 mM. Laactividad se ensayó de acuerdo con 1o descripto en Materiaïes y Méto­dos.

- 113 ­

Fig. 8: Efecto ¿131932.15le activación de 1a FBPasa_d¿c10rop1astosen presencia g ausencia _aetiorreaíxïïa.

a1

¡umolFru-B-Pformadoomin-1.mgprot'

1/ 'T” 7 I v l

tiorredoxina-í. DÏÏ y

__ . FBPa

l 1/] I I

(Jl! 1 2 3

log ICoZ‘HpM)

La FBPasa se preincubo’ con FBP (0.4 mM), concentraciones variabïes deCa2+, en presencia (0,.) o ausencia (A) de DTT(2.5 mM)y en pre­sencia (o) o ausencia (I,A) de tiorredoxina-f (25 ug/m1). Luegode10 min, 1a muestra se inyectó en e] medio de medición y 1a actividadse determinó por formación de NADPHsegún 10 descripto en Materiales yMétodos.

- 114 ­

Fig. 9: Efecto ggl_pfi_gg_la_activaci6n gg_la_FBPasagg_c1orop1astos.

_.so O I

._s 3‘(JO°/oActividadFBPoso

La FBPasa se preincubó con DTT (2.5 mM), FBP (0.4 mM), Ca2+ (0.1 mM)en presencia (A) o ausencia (A) de tiorredoxina-f (25 ug/m1),variando e1 pH de] medio de activación con Tris-C1H (0.1 M). Luego10 min, 1a muestra se inyectó en e] nedio de reacción a pH 7.9 y 1aactividad se ensayó según se indica en Materiaies y Métodos, siguiendo1a formación de NADPH. ­E1 100% de 1a actividad especifica corresponde a 180 umoies de F-6-Pformado . min’1 . mg prot' .

-115—

Fig. 10: Preincubacio’n d_eLa_FBPasade cloropiastos 3 pH 8.5.

1ÏÏT ll l 1——‘ CDO

ActividadFBPasa

S 14.3

1252.23 é 1'0142 15.Tiempo (min)

La FBPasa se Breincubo' en un medio que contïm’a: buffer Tris-CIH pH8.5 (0.1 M), TT (2.5 mM), FBP (0.4 mM), Ca + (0.1 mM) en presencia(O) o ausencia (0) de tiorredoxina-f (25 ug/m‘l). A cada tiempo indi­cado, 1a muestra se inyectó en e] medio de medicio'n y 1a actividad sedeterminó de acuerdo con 10 descripto en Materiaïes y Me'todos.E1 100% de ma'xima actividad corresponde a 186 umo'les de F-6-P formado. min'1 . mg prot'l.

3.1.2. fase de catáiisis.Esta es 1a etapa rápida de 1a reacción de 1a

FBPasa en 1a cua] se produce 1a hidrdiisis del FBP con 1a1iberaci6n de Pi y de F6P en presencia de M92+ comocofactor.

FBn—M92—+—> F6P + Pi

La enzima no activada previamente puede hidroiizar1a FBP a concentraciones de Mg2+ muy a1tas (10 mM); enestas condiciones 1a actividad enzimática no es linea],ya que 1a generación de F6P presenta una fase 1ag. Encambio, si 1a FBPasa es preincubada con tiorredoxina-f,FBP (0.4 mM) y Ca2+ (0.1 mM), presenta una cinética dehidráiisis de FBP iineai en un medio que contiene ademásMg2+ (1 mM) y EGTA (quelante de] Ca2+ remanente de 1apreincubación). De esta manera es posibie estudiar endeta11e e] efecto especifico que presenta cada uno deestos y otros componentes sobre 1a catáiisis sin inter­venir en 1a fase de modificación de 1a enzima.

3.1.2.1. Efecto de los azúcares bisfosfato.3.1.2.1.1. La fructosa-1,6-bisfosfato.

Las constantes cinéticas para 1a FBP sondiferentes en catáiisis a ias observadas en activación.Contrariamente a 10 que sucede en 1a fase de modifica­ción, ios resuitados que se muestran en 1a Fig. 11 indi­can que 1a constante cinética para e] sustrato varía deacuerdo con 1a concentración de M92+ensayada. Asimismo,se incrementa 1a veïocidad máxima y 1a sigmoidicidad de1a curva disminuye por e] incremento de M92+ensayado en1a catáiisis. E1 50.5 aparente y e] n son 0.16 mMy 3.1,respectivamente, en tanto 1a veiocidad máxima es de 45umo]es.min'1.mg pr-ot'1 cuando 1a catáiisis se 11eva acabo con una concentración de M92+ de 1 mM. A con­centraciones de Mg2+mayores de 3 mM, e] 50.5 aparente y

-117­

Fig. 11: Efecto gg 1a EÉE_ en la_ catáïisís gg la FBPasa ggc1orop1astos.

1 l n l I l l l r120i­M92+(mM)

- A A A 3’5 ­

—¡l C) O

Oo OI

0') Ol

b Ol

N OI

J ll I

o 100 200 300

FBPtpM)

l l IOpmolF-S-Pformado.mirïhmgprot-1 ¿.00

La FBPasa se preincubó con DTT (2.5 mM), tíorredoxina (25 ug/m1), FBP(0.4 mM)y Ca2+ (0.1 mM). Luego de 10 min, 1a enzima así activada seinyectó en 1a mezc1a de medición que con enfa concentracionesvariables de FBP y concentraciones fijas de Mg+ de 1 mM(O), 3 y5 ¡IM(A I).

- 118 ­

el n son 0.06 mMy 2, respectivamente, alcanzóndose unavelocidad máximade 100 umoles.min'1.mg prot'l.3.1.2.1.2. Otros azúcares bisfosfato.

El hallazgo de que otros azúcares bisfosfatopueden activar a la FBPasa hizo necesario determinar siéstos se comportan como análogos de sustrato. Para ellola FBPasa se preincubó con tiorredoxina reducida,Ca2+ (0.2 mM) y FBP u otro azúcar bisfosfato (2 mM). Laenzima, asi modificada, no hidroliza ni la GluBP ni laRuBP, aún cuando la concentración de estos azúcares bis­fosfato se incrementó a 1.4 mMy la de M92+ a 10 mM, comose muestra en la Tabla VI. Más aún, tampoco se unirfan alsitio catalftico, ya que no modifican la hidrólisis deFBP (Fig. 12), a concentraciones de M92+suficientementealtas. A concentraciones de M92+menores que 5 mMse ob­serva una disminución en la hidrólisis de FBP en presen­cia de GluBP o RuBP (5 mM), debida probablemente a queparte del Mg2+es complejado por estos azúcares bisfos­fato.

Por otro lado, en la misma tabla se observaque la FBPasa, preincubada con tiorredoxina-f reducida,Ca2+ y FBP ó SBP (0.5 mM) presenta una baja actividadpara la hidrólisis de SBP(14 umol Pi.min'1.mg prot'l).3.1.2.2. Efecto de los metales bivalentes.3.1.2.2.1. Requerimientosge nazi.

La Fig. 13 muestra que la FBPasa activada,ensayada en presencia de EGTA (20 uM) presenta mayoractividad a cualquiera de las concentraciones de Mg2+quela actividad medida en ausencia de EGTA.El requerimientode M92+ para la enzima activada es menor cuando lacatálisis se realiza en presencia de EGTA(K005 = 0.7 mMvs. K0_5 = 2 mM). De acuerdo con esto, como se mostró enla Fig. 1, la actividad catalitica ensayada a 1 mM

Tabia VI: Efecto de ios azúcares bisfosfato en 1a actividad de 1aFBPasa¿Eïtï3?bp1a5t0s.

Actividad FBPasaComponente

(umoi Pi iiberado . min-1 .mgprot'l)

FBP 200

SBP 14

GïuBP 0

RuBP 2.7

La FBPasa se preincubó con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/ml),Ca2+ (0.2 mM), y según se indique, con e] correspondiente azúcar bis­fosfato (0.5 o 2 mM). La muestra se inyectó en 1a mezcla de reacción y1a actividad se determinó en un nedio que contenía e1 azúcar bisfos­fato correspondiente (0.5 mM), Mg2+ (10 mM)y EGTA(50 uM), según 10descripto en Materiaies y Métodos.

-120­

Fig. 12: Efecto de] M2+ en ja inhibición de la actividad FBPasa porg. a'ï'u'car b'lS osFí’Eomi HidrolizabTeÍ

I l

._ FBPO,2mM100L 3 4 _3 FBP 0,2mM

¡E Glu P2 SmMmLL

8E 50 Ï>.5o _o0

°\ GluPZSmM

O I

.3 5 2* 1oMg (mM)

La FBPasa se reincubo’ con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mï), FBP(0.4 mM)y Ca + (0.1 mM). Luego de 10 min, 1a actividad se ensayó enpresencia de FBP 0.2 mM (O), FBP 0.2 mMy GIuBP 5 mM (O) o” de GiuBP5 "M ([3) a concentraciones crecientes de M92+.La actividad se deter­minó por 1a formación de F-6-P según 10 descripto en Materiaïes yMétodos.

-121­

'Fig. 13: Efecto ¿el M32+en 1a actividad EEE FBPasa_d_gcloropïastosen presencia _o_auseñïía _q_e_ÉGIA.

120

.1.100

/W con‘trol__

80

60 -­

40

20

pmolFru-6-Paformadoomin.1emgprof¡llulll¿5578910

CJ —h N_ w­

Mng (mM)

La FBPasa se activo’ con DTT (2.5 mM), tíorredoxína (25 ug/mï), FBP

(0.4 mM)y Ca + (0.1 mM). Luego de 10 mín, 'la muestra se inyecto' fn 1amezc'la de reacción que contenía concentraciones variabïes de Mg+ enpresencia (O) 6 ausencia (A) de EGTA (20 uM). La veïocidadcatah’tica se siguió por 1a formación de NADPHsegún se indica enMateriales ‘y Métodos.

M92+ se encuentra inhibida por 1a presencia de]Ca2+ proveniente de 1a fase de modificación. De maneraque e] agregado de EGTAqueiando preferencialmente a1Ca2+ permitiría que ei Mg2+ actúe como cofactor de 1aFBPasa en 1a hidróiisis de 1a FBP.

3.1.2.2.2. Requerimiento de otros metaies.Asi como e] an+ reempiaza a1 Ca2+ en 1a acti­

vación de 1a enzima, puede reemplazar a1 M92+como cofac­tor de catáiisis. En 1a Fig. 14 se observa que 1aactividad cataiitica se expresa en presencia de Mn2+yésta es menor que 1a desarroiiada con Mg2+ (vmax = 38umol F6P.min'1.mg prot'1 a una concentración de 0.1 mM),con un K0_5 para Mn2+ de 0.1 mM. Asimismo ei Fe, enestado reducido por DTTo bajo condiciones anaeróbicas,reempiaza a1 Mg2+en 1a catálisis (Pereimuter, M. y No10­siuk, R.A., datos no pubiicados). Otros cationes bivalen­tes tienen, en genera], un efecto inhibitorio de 1aactividad enzimática y/o no reempiazan a1 Mg2+ comocofactor enzimático.3.1.2.2.3. Efecto d_e¿ C_az_+.

E1 sistema de modificación incïuye 'a1Ca2+ como requerimiento para maximizar 1a activación de1a FBPasa; sin embargo, este catión bivaiente presenta unefecto inhibitorio cuando se ensaya en 1a catíïisis.

La actividad de 1a FBPasa activada disminuye amedida que 1a concentración de Ca2+ va aumentando (Fig.15). La inhibición de 1a actividad FBPasa por Ca2+ esdependiente de 1a concentración de M92+utiiizada durante1a medición de 1a catáiisis; e] 10.5 aparente paraCa2+ es de 7 uM, 26 uM, 4o uM cuando 1a actividad seensaya a 1 mM, 3 mMy 5 mMM92+ respectivamente.

En particuiar, en este experimento se omitióe] agregado de EGTAa1 medio de medición de 1a catáïisis,

--123 —

Fig. 14: Efecto de] M531 gn la activación gg la FBPasa ggcloroplasïos.

ActividadFBPasa

°/.

0 20 ¿0 60 ‘80 100'an' (pM)

La FBPasa se Ereincubó con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mï), FBP(0.4 mM)y Ca + (0.1 mM). Luego de 10 min, 1a enzima se inyectó en 1amezcïa de reacción en ausencia de EGTAy con concentraciones variabïesde Mn2+Q La actividad se determinó" de acuerdo con 1o descripto enMateriaïes y Métodos.

'1247

Fig. 15: Efecto gi LazignLa actividad ¿1313 FBPasad_ecioropiastos.

...\ O‘o

80

0‘! O

¿N o

N O

,umolFru-G-Pformadoomiñ1omgpro‘í1

0 J IÜ 10 20 30 1.0 50 50 70

COCl2 _(pM)

La FBPasa se preincubo' con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mi), FBP(0.4 mM), y Ca + (0.1 mM). Luego de 10 min, 1a muestra se inyecto' en1a mezcia de medicio'n en presencia de M92+ 1 mM(O), 3 mM(A)y 5 mM(I) que contenía concentraciones variabies de Ca +.La actividad máxima se determinó en presencia de EGTA (20 uM). E1ensayo de actividad se reaiizo' segu'n 1o descripto en Materia'les yMétodos.

125 ­

excepto en los puntos de máxima actividad, donde el EGTAagregado compiejó e] Ca2+ residual proveniente de 1aactivación de 1a FBPasa. Estos resuïtados indican que 1ainhibición de 1a catálisis producida por e] Ca2+ es máspronunciada a bajas concentraciones de MgZ+.

Por otro 1ado, el efecto inhibitorio de] Ca2+sobre 1a catáïisis de 1a FBPasa ensayada en presencia deMn2+ como cofactor es menos marcado con respecto a 1aensayada con M92+. En 1a Fig. 16 se observa com­parativamente e] efecto de Ca2+ sobre la actividadcataïftica de la FBPasa activada, ensayada en presenciade an+ o MgZ+. E1 Ca2+ es un potente inhibidor de laactividad FBPasa ensayada con M92+ (1 mM), mientras quese requieren mayores concentraciones de Ca2+ para inhibir1a actividad en presencia de Mn2+. Cuando se agrega EGTA'a1 medio de reacción, se obtiene 1a máxima actividad (noinhibida) en presencia de "92*, mientras que en e] ensayode actividad con Mn2+ se parte de 1a concentración deCa2+ remanente de 1a preincubación, ya que al ser lasconstantes de formación de] compïejo EGTA-Cay EQTA-Hn,muy simiïares (10‘11 H y 10-12 M, respectivamente), no seobtendría e] efecto buscado de queïar preferencialmentea1 Ca2+.

3.1.2.3. Requerimientos de EH.La FBPasa desarroïla su máxima actividad a un pH

entre 8.2 y 8.5, de] mismo modo que ocurre en su activa­ción. Ïambién en la catáïisis el pH usualmente ensayadoes de 7.9 por ser e] limite inferior de pH en el estromadei cloropïasto iluminado.

La actividad FBPasa ensayada en presencia de"92+ disminuye cuando e] pH es superior a 8.5 (Fig. 17),mientras que utiïizando Mn2+ en e] desarroïlo de la

-126­

Fig. 16: Efecto comparatli_v_g del _C__a_2_ÏQ _1_aactividad d_e 1_a FBPasa d_eC'OY‘OEIaS OS.

I l l | ¡ l l ¡ l I

120 r _

100 5 _

“c2: MÍWOJmM) _

E eo _

í} ­60 _

“oU _

‘ÏE’.2 40 ­3< ..

,20 _

- Mgz’umm

O «L J I l j I l l

- Ü 20 40 60 80 100

CG C12 (pM)

La FBPasa se activo‘ en presencia de DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25ug/mï), FBP (0.4 mM')y Ca2+ (0.1 mM). Luego de 10 min, 1a muestra sein ecto' en 'la mezcia de incubación con concentraciones deCa + ensayada con Mn2+ 0.1 mM (0) 0' M92+ 1 mM (A). La actividad sedeterminó por la formación de F-6-P segun io descripto en Materiales yMétodos.

—127­

Fig. 17: Efecto _d_elpinLa actividad FBPasa_dgcloropiastos.

...¡ OO|

_sP

4(A)

I°/oActividadFBPde

7.5 7.9 81.2 8'5 8'7 ió

pH

La FBPasa se activo' en presencia de DTT (2.5 mM), FBP (0.4 mM) and(3a2+ (0.1 mM), manteniendo constante e] pH en 7.9, en presencia (O) oausencia (O) de tiorredoxina (25 ug/mi). Luego de 10 min, 1a activi­dad FBPasa se determinó segu'n ‘Io descripto en Materiaies _yMétodos adiferentes pH.Ei 100% de 'Ia actividad corresponde a una actividad especifica de185 umoies de F-6-P formado . min’ . mg prot‘ .

catáiisis, ésta decae a un pH mayor que 9.Por otro iado, 1a actividad de FBPasa deter­

minada con Mg2+y Mn2+ como cofactor comienza a ser apre­ciabie recién a partir de un pH 7.6, mientras quereempïazando cuaiquiera de estos cofactores por Fe2+, e1óptimo de 1a actividad cataiftica se desarrolia a pH =7.6.3.1.3. Anáiisis gg la interacción de [gg l g_21 ¿El l_

FBPasa.De acuerdo con ios resuitados comentados

anteriormente. e] aumento de 1a actividad FBPasa estariadado por 1a acción concertada de 1a FBP y e] Ca2+, 1acua} causaría 1a interconversión de una forma inactiva aotra activa. Esta modificación en presencia de la tiorre­doxina reducida permite el desarroilo de una a1ta activi­dad a bajas concentraciones de] sustrato y de MgZ+. Eneste contexto surgen dos interrogantes interreiacionadossobre 1a acción de Ios modificadores sobre 1a FBPasa: a)¿La interacción de ambos efectores se produce direc­tamente con 1a enzima? b) ¿Son éstos requeridos para man—_tenér a 1a enzima estabie en su estado activo?a) Interacción de ios efectores con 1a FBPasa: Para re­

soiver este aspecto, se utiiizó 1a técnica de unión deequiiibrio para Ca2+ y FBP. Ei diseño experimenta]consiste en 1a cromatografía de 1a FBPasa en unacoiumna de Sefadex G-25 equilibrada previamente conbuffer que contenía (45Ca) (330,331) o (u-14C)FBP. Enia Fig. 18 se observa un incremento en 1a concentra­ción de (45Ca) sobre su nive] basa], e] cua] eiuye ene] voiumen de exciusión de esta coiumnag a1 igua] que1a actividad de FBPasa. Esto indica que ei Ca2+ se unereversiblemente a 1a enzima, en una relación de 16moles de Ca2+ por moi de enzima. La incorporación de

- 129 —

Fig. 18: Unión ggl_CaÉi.g_1a FBPasagg_c10ropiastos.

cpmx10.3/0,25ml

10 30 50

Fracción (n°)

La FBPasa se sembró en una coiumna de Sefadex 6-25 (1 x 15 cm),equiiibrada con buffer Tris-C1H pH 7.9 (0.1 M) y 45Ca, de acuerdo con10 descripto en Materiales y Métodos. La actividad FBPasa y 1aradioactividad se determinaron segúh se indica en Materia1es y Méto­dos.

FBP a1 buffer de eiución no modifica este vaior deunión para e] Ca2+. Por otra parte, ios experimentosen ios cuaies 1a (U-14C)FBP reempiazó a1 (45Ca) en e]buffer de e1ución permitieron determinar que se unen6-7 moies de FBP por mo] de enzima.Otro enfoque experimentai para determinar 1a interac­ción de] Ca2+ con 1a enzima fue utiiizando un meta] detransición como e] Tb3+. E1 radio iónico de] Ca2+ essimiiar a1 de los iantánidos, por 10 que se ios hauti1izado en reemplazos isomórficos (332-334). En 1aTabla VII se observa un aumento de 1a emisión relativade fluorescencia a 560 nm por excitación de 1a FBPasaa 280 nm en presencia de Tb3+. 1a cua] disminuye poragregado de Ca2*. indicando una competencia de amboscationes por 1a enzima. En estos experimentos no puededescartarse 1a formación de agregados de 1a enzima por1a presencia dei Tb3+, ya que variando 1a iongitud deonda de excitación también se modifica 1a longitud deonda de emisión (7kexc = 270 nm: ¡Nem = 540 nm).Asimismo e] efecto de] Tb3+ se ensayó sobre 1a activi­dad catalitica de 1a FBPasa. En 1a Fig. 19 se observaque e] Tb3+ provoca una fuerte inhibición a muy bajaconcentración (1 uM), 1a cua1 no es revertida por e]posterior agregado de EGTA. La inhibición provocadapor este lantánido puede ser prevenida solamente si seencuentra compiejado a1 EGTA, previo a1 agregado de 1aFBPasa. De manera que cuando e] Tb3+ se agrega soio,1a enzima se une a éste con gran afinidad.

E + Tb——————+>E-Tb

Mientras que si se compieja con EGTA, previo a 1ainyección de 1a enzima, se encontraría unido y nointeractuaria con 1a FBPasa.

EGTA + Tb-—-———9EGTA-Tb

131 ­

Tabia VII: Emisión 1uminica gg_192i.unído g_lg_FBPasa ggl_cïor0p1asto.

Tratamiento Luminiscencia(unidades reiativas)

Enzima 34

TbC13 34

CaC12 34

TbC13 + CaC12 34

Enzima + CaC12 41

Enzima + TbC13 165

Enzima + TbC13 + CaC12 125

La emisión lumfnica de 1a FBPasensayo en presencia de Tb3+

a a 560 nm,(7 uM) y/o Ca2+ (0.8 mM)

excitando a 280 nm,en

SEun

espectrofiuorómetro SLM400 según 10 descripto en Materia1es y Méto­dos.

—1324­

Fíg. 19: Efecto ggl_IÉÉi.gg_lg_actívídad gg_lngBPasa gg_c1orop1a5tos.

0,5 I! I 1 i _

.o.o_oNh)b

OL.

Ábsorbanciaa31.0nm

Tb3‘ l EGTA

0 1 2 3 - 4

Tiempo (min)

La FBPasa se activó con DTT (2.5 mM), tíorredoxína (25 ug/mï), FBP(0.4 mM)y Ca + (0.1 mM). Luego de 10 mín, 1a muestra se inyectó en 1a

'mezcïa de reacción, a 1a que se 1e agregó, segúh se indica, Tb + y/oEGTA. La actividad se determinó segun 1o descripto en Materíaïes yMétodos.

b) Estabilidad de la forma activa de la FBPasa: Paradeterminar si el Ca2+ y/o la FBP son requeridos paramantener la forma activa de la FBPasa, se diseñarondos tipos de experimentos.La FBPasa se preincubó por 10 min con DTT,tiorredoxina-f, FBP y Ca2+ en presencia de (U-14C)FBPó 45Ca y luego se sembró en una columna de SefadexG-100. La elución de la enzima, en el volumen deexclusión de la columna, muestra un pico de radioac­tividad leve (20%del basal).Por otro lado, en la Fig. 20, se observa que la enzimaasi activada y sometida a una cromatografía en columnade Sefadex G-100 eluye en el volumen de exclusión enforma activa solo si el buffer de elución contiene elreductor DTT. Cuando la actividad de la FBPasa de

estas fracciones se ensayó en presencia de EGTA,lacatálisis se incrementa solo en un 10%. Esto indicanuevamente que el Ca2+, separado de la enzima por fil­tración, no es necesario para la estabilidad de suforma activa. De la misma manera, la enzima que eluyeen forma activa va lentamente perdiendo actividad;asi, a los 5 dias a -15°C, la actividad se reduce a lamitad; la recuperación de ésta se obtiene por prein­cubación con el sistema completo (DTT, tiorredoxina-f,FBP, Ca2+). Más aún, ni la tiorredoxina-f, ni FBP sonrequeridos para mantener esta forma enzimática, ya queprivando el buffer de elución de FBP y/o Ca2+ laFBPasa eluye en su forma activa. Asimismo, en la Fig.20 se observa que la FBPasa privada de tiorredoxina-freducida, FBP o Ca2+ en la fase de preincubación,eluye en forma inactiva como se vio previamante. LaFBPasa inactiva presente en estas fracciones no es

-134­

Fig. 20: Requerimiento de efectores ara _e_1_mantenimiento ggi_a formaactiva _d_e__1_aFB'P'asa de ciorop astos. _

J-tl- ¡AAA—fi-‘l-I-Ifi-lm'llU 5 10 15 20 25 30 35

Fracción (n°)

O

l- l l 1 I I .l _o .U

‘E

5150- _UU'U

w100- _, _Um.U

CL‘m

“- 50- _'13

U'UE"6<

La FBPasa activada en presencia de DTT (2.5 rrM), tiorredoxina-f (25ug/m1), FBP (0.4 mM)y (laz+ (0.1 mM) se cromatografio' en una coiumnade Sefadex (3-100 y se eiuyo' en forma activa en un buffer que conteníaDTT 2.5 mM(O). La FBPasa preincubada en un medio en e] que se omitióFBP se sembró en una coiumna de Sefadex (5-100. La actividad se ensayo’sin preincubacicïn (A) o activa'ndoia con e‘l sistema compieto deacuerdo con 'lo descripto en Materiaies y Métodos.

-135­

activabïe por preincubación con el soio agregado de]efector omitido sino con e] sistema compïeto de modi­ficación.

Se ha informado que 1a FBPasa de cioroplastos y 3;pa1ustris puede disociarse 1entamente a pH a1ca1ino(335). De modo que se estudió 1a posibiïidad de queocurriera un cambio en e] peso moiecuïar debido a 1aactivación enzimática; para e110 1a FBPasa se cromatogra­fió en una coïumna de filtración por ge] LKB AcA 34,observándose que no hay diferencias en e] voiumen de e1u­ción de 1a forma inactiva y activa de 1a FBPasa. La acti­vación de 1a FBPasa no produce una diferencia apreciabieen e] peso moïecuiar.

3.2. Regulación de la actividad sedoheptu]osa-1,7-bisfos­fatasa.La SBPasa en e] cioropïasto, asi como 1a FBPasa, regu­

1an 1a regeneración de] aceptor de C02, 1a RuBP. La acti­vidad de SBPasa, 31 igua] que otras enzimas regulatoriasde] ciclo de Benson-Caïvin, se incrementa en 1uz y dismi­nuye en 1a oscuridad; 1a enzima una vez activada cataliza1a siguiente reacción:

SBP—M92+—> S-7-P + PiEsta actividad enzimática es modulada, in vitro, por

tiorredoxina-f reducida fotoquimicamente via ferredoxinay ferredoxina-tiorredoxina reductasa en presencia demembranas de c10rop1astos o bien químicamente por un di­tio], e] DTT.3.2.1. Actividad SBPasa asociada a 1a FBPasa.

La FBPasa aisïada de cïoroplastos de espinaca esun tetrámero de peso molecuiar 170.000, e] cua] se diso­cia a pH 8.8. En estas condiciones comienza a disminuir1a actividad FBPasa y e] dfmero producto de 1a diso­

- 136 ­

ciación a dicho pH desarroiia actividad de SBPasa depen­diente de 1a activación por tiorredoxina-f reducida. Comoya fuera comentado, 1a FBPasa modificada por prein­cubación con tiorredoxina-f reducida, FBP o SBP yCa2+ modifica en cierto grado 1a especificidad por e]sustrato. La enzima asi activada desarr011a actividad deSBPasa (Tab1a VIII).3.2.1.1. [ase de activación.

La actividad de SBPasa se desarroïïa por prein­cubación con e] sistema de tiorredoxina-f reducida porDTT, SBP y Ca2+; omitiendo uno de estos componentes seobtiene una SBPasa re1ativamente inactiva (Tab1a IX). Laactividad de SBPasa incrementa a medida que se aumenta 1aconcentración de Ca2+ en 1a fase de modificación. Comoseobserva en 1a Fig. 21, e] Ao.5 para Ca2+ es de 50 uM. E1pH = 8.4 e1egido para 1a reacción de 1a SBPasa seencuentra en e1 rango de máxima actividad enzimática sin11egar a1 pH en e] cua] se produce 1a disociación de 1aFBPasa de cioropïastos. Es de destacar que a) 1a FBPasade c10rop1astos se ha11a homogeneamente pura, como semuestra en 1a Fig. 22; una única banda de 44.000 de pesomo1ecu1ar aparece en ias preparaciones de FBPasa decioropïastos, en una corrida por electroforesis en con­diciones desnaturaïizantes; b) 1a FBPasa modificada pore] sistema comp1eto de activación, que desarrolia unaactividad de SBPasa, no presenta modificación apreciabïeen su peso moiecuïar, de acuerdo con su perfi] de e1uci6n1uego de una cromatografía en coïumna de filtración porge]. Estos resuitados indican que no es producto deaiguna contaminación o 1a existencia de una enzimadiferente en su peso m01ecu1ar.

Estudios reaiizados por otros investigadoresmuestran que 1a activación de 1a SBPasa se produce 1uego

- 137 ­

Tabla VIII: Actividad SBPasaasociada ¿la FBPasagi c‘loropiastos.

Actividad SBPasaSustrato (nmoles Pi . min“ )

SBP 380

GiuBP 0

RuBP 0

ATP 2

La FBPasa (20 ug) se preincubo’ con DTT (2.5 uN), tiorredoxina (25ug/ml). SBP (0.5 uN) y Ca2+ (0.2 ITM). Luego de 10 min, 'la nuestra seinyecto’ en 1a mezcla de reaccio'n que contem'a Mg + (5 uN), EGTA(50uM)y e] azu’car bisfosfato indicado (0.5 uN). Luego de l min, 1a reac­cio'n se freno' y 1a actividad se determinó Por ‘Ia ‘Iiberacicïn de Pi, deacuerdo con 'lo descripto en Materiales y Metodos.

Fig. 21: Efecto de] Laíïïla activación d_e1_a_SBPasade cioropiastosmin-ña.

l I l ¡ n

'cE 80 ­O

OU 60 _D

a“)

:9 40 ..

0.:— 200- controlE

' C

o I I |

o. 160 zóoCGClz

La FBPasa se preincubó en presencia de DT; (2.5 mM), tiorredoxina (25ug/ml), concentraciones variables de Ca + en presencia (O) o enausencia (A) de SBP (0.4 mM). Luego de 20 min, 1a muestra se inyecto'en 1a mezcia de incubación y 1a actividad se determinó por 1a for­mación de Pi según 10 descripto en Materiaies y Métodos.

-139­

Fig. 22: Eïectroforesis en ge] de poh’acrflamida en condiciones desna­furahzanïes _de“E SBPasa_deCloroplastos.

1 2 Peso Molecular

94.00067.000

_--.

30.000

20.100

—--- 43.000

14.1.00

La FBPasa tratada con un buffer que contenía B-met y SDS, ca1entado a100°C durante 3 min, se sembró en e] cana] 1. Los marcadores de pesomoïecu1ar se sembraron en e] cana] 2. E1 ge] estaba formado por dospartes: un ge] compactador de po'liacrflamída (5%) y un ge] separadorde poïíacrí'lamída (12%).La corrida fue de 6 h a un voïtaje constante de 50 V durante 1a pri­mera hora y 1uego se aumento' a 100 V (ver Materiaïes y Métodos).

-14o­

que todos ios c0mponentes de cat51isis se haïïan presen­tes (276). Los resuïtados aqui expuestos consideran e1requerimiento de] Ca2+ para 1a activación de 1a SBPasa,de] mismo modo que ocurre con 1a FBPasa. De manera que 1aactividad especifica de ambas enzimas es máxima por 1aacción concertada de e] Ca2+, 1a tiorredoxina y e]sustrato de 1a reacción. Luego de la modificación, e]componente restante (M92+) participa directamente en 1acatáïisis enzimática.3.2.1.2. [352 de catáiisis.

Tanto 1a SBP como el Ca2+, además de participaren 1a fase de modificación, ejercen su efecto en 1acatáïisis, 1a SBPcomo sustrato enzimático y e] Ca2+ comoinhibidor de 1a catálisis. De manera que e1 Ca2+ presentaun efecto dua] en 1a reacción de 1a SBPasa, a1 igua] queen 1a reacción de 1a FBPasa. E1 efecto de] Ca2+ sobre 1afase catalftica de 1a SBPasa se muestra en 1a Fig. 23; 1amáxima actividad de SBPasa es inhibida progresivamente amedida que aumenta 1a concentración de Ca2+ en e] mediode medición. De manera simi1ar a 1o comentado respecto de1a actividad FBPasa, e] 10:5 para Ca2+ se modifica con 1aconcentración de M92+ uti1izada en 1a cata1isis; E110.5 es de 100 y 150 uM en presencia de 5 y 10 mMM92+respectivamente.

Para1e1amente se observó que e] sistema compïetofunciona tanto en 1a activación de 1a FBPasa de c10ro­

p1astos de espinaca (p1anta de1 tipo C3) como en 1a ais­1ada de c1or0p1astos de maiz, p1anta de] tipo C4. LaFBPasa purificada de hojas de maiz desarro11a una a1taactividad de hidróiisis de FBPcuando se activa por pre­incubación con tiorredoxina-f reducida, FBP y Ca2+, pre­sentando también una actividad de SBPasa cuando se prein­cuba con tiorredoxina-f reducida, SBP y Ca2+, como se

- 141 ­

Fig. 23: Efecto dei 9331. sobre la_ actividad SBPasa asociada a 1FBPasagg_c10rop1asfos gg_esp1naca. "' ’­

F l l l l l I l .­

C ‘ iE son- a° _ ¿So _‘g 40_ Mgz’(mM) _

g - ’ 10 ­

E. 20 -' 5 ­.6 _ e

É; (J 1 l J I1do zóo 360 1460

CGClz (HM)

O

La FBPasa se reincubó con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/m1), SBP(0.4 mM)y Ca + (0.2 mM). Luego de 20 min, 1a muestra se inyectó en unmedio de medición que contenía Mg + 5 mM (O) 6 10 mM(A). La ma'ximaactividad se determinó en presencia de EGTA(20 uM), 1uego 1a activi­da se ensayó en ausencia de EGTAe incrementando 1a concentración deCa +. La actividad SBPasa se determinó coïorimetricamente por 1a for­mación de Pi, segu'n se indica en Materiaies _yMétodos.

-142­

Tabia IX: Reguerimientos de 1a activacióh gg_ SBPasa asociada a 1aasa _g_c orofiTEszE gg_esp1naca. " __

Actividad SBPasa(nmoi Pi 1iberado . min-1)

Preincubación

Espinaca Mafi

Compieto 174 19

Menos DTT 32 1

Menos SBP 70 2

Menos Ca2+ 42 1o

Menos tiorredoxina-f 120 14

La FBPasa (10 ug) se preincubó segúh se indica con DTT (2.5 mM),tiorredoxina (25 ug/m'l), SBP (0.4 rnM)y Ca2+ (0.2 mM). Luego de-ZOmin, 1a muestra se inyectó en 1a nezcia de reaccióh para 1a medida de1a actividad determinada por formación de. Pi coiorimétricamente deacuerdo con lo expuesto en Materiales y Métodos.

muestra en 1a Tabia IX.La actividad de SBPasa desarroiiada por 1a

FBPasa de c10rop1astos modificada por este sistema esmayor que 1as actividades informadas hasta ei presente.Sin embargo, queda sin resoïver si esta actividad deSBPasa asociada a 1a FBPasa es funciona] en e] cic10 deBenson-Caivin, ya que: 1) 1a actividad SBPasa es menorque 1a actividad FBPasa desarroiïada por esta enzima, y2) existe una enzima en e] cioropiasto que hidroiizaespecificamente e] SBP (336).3.2.2. Actividad de sedoheptu]osa-1,7-bisfosfatasa (espe­

cffica).Los c10rop1astos de hojas de espinaca fueron 1a

primera fuente donde se encontró una actividad de SBPasaespecífica. Posteriormente, esta actividad también sedeterminó en hojas de maiz donde 1a enzima fue purificadahasta homogeneidad. La SBPasa purificada de hojas de maiz(pianta dei tipo C4) presenta mayor estabiiidad que 1aenzima obtenida de espinaca, por 10 que es más utiiizadapara 10s estudios sobre su reguiacion, que su simiiar enpiantas C3 (337).

Como esta enzima presenta característicashisteréticas para e] desarroiio de su actividad, 1a reac­ción puede separarse experimentaimente en dos etapas: 1afase de activación y 1a fase de catáïisis.3.2.2.1. fase de activación.

La enzima es preincubada con Ios efectores queproducen su modificación. La activación de 1a SBPasa seproduce por 1a tiorredoxina-f reducida por DTT, SBP yCa2+. Como se observa en 1a Tab1a X, 1a omisión de uno deestos componentes disminuye 1a actividad SBPasa. Asimismo1a preincubación de 1a enzima con e1 sistema completo demodificación en presencia de EGTA, un queiante con a1ta

Tabia X: Requerimientos gg_]a_activaci6n_gg la SBPasagg_c10ropïastos_e maiz.

Condiciones de preincubación Actividad SBPasa(nmoi Pi 1iberado)

Compïeto 23

Menos DTT 3

Menos SBP 0

Menos Ca2+ 11

Menostiorredoxina-f 13

Comp] eto + EGTA 1

La SBPasa (6 ug) se preincubó según se indica con DTT (2.5 mM),tiorredoxina (80 ug/mi), SBP (0.5 mM), Ca2+ (0.2 mM) y, como seindica, EGTA(0.1 mM). Luego de 20 min, 1a muestra se inyectó en 1amezcïa de medición y se determinó 1a actividad,por formación de Pisegún 10 descripto en Materiales y Métodos.

-145­

afinidad para e] Ca2+, previene 1a conversión de laenzima a su estado activo.

E1 grado de actividad desarroiiado por 1a SBPasadepende de] tiempo de preincubación con e] sistema deactivación. En 1a Fig. 24 se muestra que 1a enzima incre­menta progresivamente su actividad hasta un máximo aican­zado a ios 20 min de preincubación con tiorredoxina-freducida, SBP y Ca2+. E1 Ca2+ puede ser reempïazado porMn2+ en 1a activación de 1a SBPasa, de] mismo modo que 10es para 1a actividad FBPasa. Como se observa en 1a Tab1aXI, el Mn2+ a una concentración de 10 uM ejerce su efectoúnicamente como activador de 1a SBPasa, ya que si seomite 1a preincubación no se observa hidrólisis de sus­trato en presencia de Mg2+ en 105 4 min en que se 11eva acabo 1a reacción.

Reempïazando e] sistema quimico de reducción pore] sistema fotoquimico de membranas; se observa en 1aTab1a XII que 1a SBbasa desarroïïa una mayor actividadcuando ésta es preincubada en 1uz con: Ca2+, SBP y e]sistema ferredoxina-tiorredoxina; este último está com:puesto por: ferredoxina, tiorredoxina y ferredoxina­tiorredoxina reductasa. La omisión de aiguno de losmodificadores muestra una enzima reïativamente inactiva.3.2.2.2. [Egggg catáïisis.

La SBPasa de maiz, asi como 1a de espinaca,requiere un catión bivaïente para 1a catáïisis; M92+, omenos efectivamente Mn2+, éstos son funciona1es en dichoaspecto. Cuando 1a SBPasa es activada por tiorredoxina-freducida y SBP, 1a concentración de M92+requerida paraobtener 1a mitad de 1a velocidad máxima es a1ta (Ko,5 = 5mM). E1 agregado de Ca2+ a1 medio de preincubación dismi­nuye significativamente e] requerimiento de MgZ+, como seobserva en 1a Fig. 25, 1a SBPasa activada por e1 sistema

—146—

D)Fig. 24: Efecto de] tiempo en _1_aactivación gg L FBPasa decIoropIastos __emaiz. _

U1

NU1

0 l l l JO 5 10 15 20

i , Tiempo de preincubocióni (min)

'nrnolP¡libercndo-miri1

La SBPasa (6 ug) se activó eg presencia de DTT (2.5 mM), tiorredoxina(80 ug/ml), SBP (0.5 mM), Ca + (0.2 mM) en presencia (A) o en ausen­cia (O) de EGTAen un buffer Tris-C1H pH 8.4 (50 mM). A cada tiempoindicado, 1a muestra se inyectó en 1a mezcïa de reacción y 'Ia activi­dad se determinó Por 1a 'Iiberacicïn de Pi de acuerdo con 1o descriptoen Materiaïes y Metodos.

Tabïa x1: Efecto de] Mn2_+.gg 1_a activación d_e i_a SBPasa d_ecloroglaítïs Emaiz.

Tiempo de preincubación Tiempo de reacción Actividad SBPasa(min) (min) (nm01 Pi Iiberado)

0 0 0

0 4 0

20 0 6

20 4 20

La SBPasa se activcï en Eresencia de DTT (2.5 mM), tiorredoxina (80ug/ml), SBP (0.5 mM)y Mn + (10 uM). Luego de 20 min de preincubacicïn,según se indica, 1a muestra se inyecto’ en e] medio de medicio'n. Lareaccio'n se dejo' desarroliar durante 4 min, segu’n se indica, y 1aactividad se determine por 1a 1iberacio'n de Pi segu'n 10 descripto enMateriaies y Me'todos. "

14s ­

Tabia XII: Requerimientos gg la activación dg_lg_SBPasa gg_c10rop1as­OS _e "1612.

Condiciones de preincubación Actividad SBPasa(nmoi Pi 1iberado)

Luz, compIeto

Luz, menos Ca2+

Luz, menos SBP

Luz, menos Ca2+, menos SBP

Oscuridad, compieto

31.2

22.8

11,6

11.8

13.2

La SBPasa (30 ug) se preincubó, según se indica, con ferredoxina (10ug), ferredoxina-tiorredoxina reductasa (7 ug), tiorredoxina (60 ug),membranas de cioropiasto equivaientes a 20 ug de ciorofiia, SBP (0.4mM); C92+ (0.2 mM) se iiumina durante 20 min. Luego 1a muestra seinyecto en una nezcïa de reacci6n_para 1a nedida de 1a actividad por1a 1iberaci6n de Pi según 10 descripto en Materiaïes y Métodos.

-149­

Fig. 25: Efecto de] M331en 1a actividad de 1a SBPasa de cioroplastosde maizÍ_ “_ fi — _ o —

(11

N U'I

l I

2 3 4 5

MgZ‘ (mM)

nrholesPiliberado-mir'i1

(:ÉZD _¡._

La SBPasa se reincubó con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (80 ug/m1),‘SBP(0.5 mM) y Ca + (0.2 mM). Luego de 20 min, se inyectó en un medio deme ición en presencia de EGTA(50 uM) y concentraciones variabïes deMg+. La actividad se determinó por liberación de Pi según 10descripto en Materia1es y Métodos.

-150­

compïeto de modificación desarroïla compïetamente suactividad a 1 mM Mg2+ (Ko.5 = 0.3 mM). De manera que laSBPasa modificada en presencia de Ca2+ disminuirïa 1aafinidad de 1a enzima por ei Mg2+durante 1a catáiisis.

En Ios trabajos sobre 1a reguïación de 1a FBPasade cïoropiastos se observó que e] Ca2+ ejerce en 1a catá­Iisis un efecto inhibitorio. De] mismo modo, en 1a Fig.26 se muestra que 1a SBPasa activada por preincubacióncon tiorredoxina-f reducida, SBPy Ca2+ es inhibida en lacatáïisis por 1a presencia de Ca2+ en e] medio de reac­ción. De manera simiïar a 10 que ocurre con 1a FBPasa,esta inhibición por Ca2+ es modificada por 1a concentra­ción de Mg2+presente durante la catalisis. E1 Io_5 paraCa2+ es de 10 uM y 60 uM, segun 1a reacción se 11eve acabo a 1 mM y 5 mM MgZ+.

Asi, 1a reguïación i! vitro de 1a actividadSBPasa presenta 1as mismas caracteristicas que 1a FBPasa.Esto indicaria que existiría un mecanismo concertado deactivación por 1uz, similar, moduiando 1a actividad deambas actividades enzimáticas.

3.3. Efecto modulador de] 233:. sobre la actividad deciertas enzimasreguïatorias.La máxima actividad desarroïlada por 1a FBPasa y la

SBPasa se observa por 1a preincubación de 1as enzimas contiorredoxina-f reducida, e] sustrato y e] Ca2+. A su vezeste último presenta un efecto inhibitorio de 1a fasecataïftica (338). E1 efecto dua] de1 Ca2+ sobre las reac­ciones de 1a FBPasa y SBPasa indicarfa que, de ejercer unpape] fisioïógico, deberia existir una separación tem­pora] y/o espacia] entre 1a activación y 1a catáïisis.Por eïlo se estudió 1a participación de otros factoresque moduïen e] efecto de Ca2+ sobre 1a FBPasa, de manera

-151­

Fig. 26: Efecto del Sagi.gn_lg_actividad de lg_SBPasa de cioropiastosfig_maiz. “’

10

nmolesPi‘liberadoomin'1

(11

qï 100 ' 3do

Cam/UM)

500

La SBPasa se preincubó con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (80 ug/mi), SBP(80 ug/mi) y Ca2+ (0.2 mM) Luego de 20 min, se inyectó en 1a mezciade medición que contenía M92+ 1 mM(A) _y 5 mM(O). La máxima activi­dad se determinó en presencia de EGTA; 1uego, en ausencia de EGTA,seincrementó 1a concentración de Ca2+. Se determinó 1a formación de Picoiorimétricamente para 1a nedida de 1a actividad según 10 descriptoen Materiaies y Métodos.

que permitan 1a activación enzimática sin inhibir Iuego1a cataiisis, ya sea a) restringiendo 1a interacción de]Ca2+ so1o a ios sitios de activación, y/o b) disminuyendo1a concentración de Ca2+ requerida para 1a activación,ta] que ei Ca2+ presente en 1a activación no interfieraen 1a catáiisis de 1a FBPasa.3.3.1. Efecto de ca1modu1ina.

En este contexto se ensayo e] efecto sobre 1aactividad enzimática de una proteina de 18.000 de pesomoiecuiar que presenta cuatro sitios de unión para Ca2*,denominada ca1modu1ina (339). Se ha informado 1a presen­cia de calmoduïina en hojas de espinaca, con un altogrado de conservación a 10 1argo de 1a evoiución (340).E1 papel fisioïógico de 1a caimoduïina en piantas aún noestá compietamente resueito (341).

Si bien 1a activación de 1a FBPasa depende direc­tamente de1 Ca2*' y 1a enzima presenta sitios de uniónpara éste, en 1a Tabia XIII se observa que 1a enzimaresponde a1 agregado de caimoduiina exógena de cerebro derata y de oocito de Xenopus leavis. Asimismo, se purificócaÍmoduiina a partir de una fracción extraída de hojas deespinaca por un método especifico, que inciuye frac­cionamiento con etano], seguido por cromatografía encoïumna de afinidad CAPP-sefarosa y Sefadex G-50. Estafracción migra como una proteina de peso moïecuiar17.000, en una eiectroforesis en ge1 de poiiacri1amida encondiciones desnaturaïizantes (Fig. 27). Esta proteinaincrementa la actividad de FBPasa; 1a Tab1a XIV muestraque 1a FBPasa responde a1 agregado de 1a ca1modu1inaexógena. Sin embargo, este hecho no resueive parte de iosinterrogantes pianteados a raiz de] efecto dua1 que e]Ca2+ ejerce sobre 1a actividad de FBPasa. La presencia deca1modu1ina en e1 medio de preincubación no disminuye 1a

Tab1a XIII: Requerimientos de 1a activacióh de 1a FBPasa de___ __ ________? __clorqplastos fig_esp1naca gg_presenc1a ÉEÉcaTñbdulina.

Actividad FBPasaRequerimientos en 1a activación (umoïes F-6-P formado . min“1

. mgprot'l)

Compïeto 38.4

" + ca1modu1ina de cerebro 52.8

+ " " oocito 76.8

ll +

- Ca2+ 0

Comp1eto +- FBP 0

Comp1eto +- tiorredoxina 16.0

La FBPasa se ¿weincubó en DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mï), FBP(0.2 mM), Ca + (50 uM) y ca1modu1ina de cerebro o de oocito (1.5ug/mï) segúh se indica. Luego de 10 min, 1a nezcla se inyectó para 1amedida de 1a actividad por formación de F-6-P con un sistemaenzimático acoplado a 1a reducción de NADP, de acuerdo con lodescripto en Materiaïes y Métodos.

- 154 ­

Fig. 27: Eiectroforesis de caimoduiina gn ¿el d_e po1iacri1amida _e_n_condi C1ones desrñ'tura | izantes .

1 2 3 l. Peso Molecular

- 94.000a ' 67.000

‘-' 43000

— i 30.000

-—- 2 0.100

CIIII ""

= -'- 14.400

Una muestra purificada de ca1modu1ina de espinaca se sembró’ en 91cana] 1. Comocontroïes se sembraron: ca1modu1ina de cerebro de rataen e1 cana] 5 y tiorredoxina-f en e] cana] 2. Los narcadores de pesomoïecu1ar (ver Materiaies y Métodos) se sembraron en e1 canai 3. Lasmuestras (aproximadamente 30 ug de proteina cada una) se trataron conun‘ buffer que contenía B-met y SDS, y fueron calentadas a 100°Cdurante 3 min.E] ge] estaba formado por dos partes: un ge] de compactación depoliacriïamida 5%y una zona de separación de poiiacri1amida 15%. Lascondiciones de corrida se reaïizaron según 10 descripto en Materia1esy Métodos .

TabIa XIV: Efecto de 1a ca1modu1ina de hojas gg_espinaca gn_1a activa­c1on ggÏIÉÏFBPasa gg_clof651asfo . '-_

Actividad FBPasaPreincubación

(umoïes F-6-P formado . min'1 .mgprot'l)

Compïeto 35

" + caimoduïina deespinaca 54.5

La FBPasa se preincubó con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mi), FBP(0.2 mM), Ca2+ (50 uM) y según se indique, caimoduïina purificada dehojas de espinaca (ver Materiaies y Métodos). Luego.de 10 min, lamuestra se inyectó en 1a nezc1a de reacción y 1a actividad se deter­minó por 1a formación de F-6-P según 10 descripto en Materiaïes yMétodos.

- 156 ­

concentración de Ca2+ requerida para Iograr 1a mitad de1a máxima activación. De manera que e] Ca2+ requeridopara producir dicha activación es suficiente para inhibir1a catáïisis.

Por otro 1ado, surgió 1a posibiïidad de que unaproteina que cocromatografia junto a 1a FBPasa por e]método de purificación habitua], sea 1a responsab1e de 1aunión de] Ca2+, mostrado anteriormente (Fig. 18). Porelïo se trató 1a FBPasa con EGTA (5 mMy 10 mM) y se 1asembró en una coïumna de Sefadex G-100, como se observaen e] perfi] de e1ución de dicha coïumna (Fig. 28), seobtiene una fracción de aproximadamente 16.000 de pesomoiecu1ar. Dado que 1a relación en 1a cantidad de pro­teina de esta fracción con respecto a 1a de FBPasa es muybaja, no se observa 1a banda correspondiente en un ge] depoiiacrilamida Iuego de 1a electroforesis de 1a FBPasa;pero esta fracción se detecta por su efecto activadorsobre 1a enzima (Tabia XV).3.3.2. Participación de gg factor moduïadoren la activa­

Mg la FBPasam c_a2_+.Los resuitados ya comentados condujeroó a 1a puri­

ficación de un factor que activara 1a FBPasa modu1ando e]requerimiento de Ca2+. Para elïo, se omitió e] DTTen Iosensayos de localización y purificación de dicho factor,de modo de prevenir una posib1e contaminación de estasfracciones con tiorredoxina.3.3.2.1. Locaiización 1 purificación.

Los estudios tendientes a su 1oca1izaciónmostraron que este factor está presente en 105cloroplastos de hojas de espinaca y cianobacterias. Dadoque la extracción de] factor se realizó a partir de hojasde espinaca enteras, se procedió a determinar su iocaïi­zación subce1u1ar. Para elio, se fraccionaron 1as hojas

-157­

Fig. 28: Filtración gngglggLa FBPasade ciorop‘lastos.

'75. l l l l l l | 1 n

3.73 e Vo Cyt c vf - 6 :3

253,31 - 3 231

.9 5 mÉ 2,90 q m

3 2.1.8 1, gm _'5 2.07 32 ‘Uj; 1,66 -3 g:QU 1,21. _ 2 3E í­;3 0,33 am 1 o

É 0,41 I 7 áE J 1' 'I 4 | l\‘L ¡III | 1 l l I l 1 l 1 l l l2 l. “6 81012141618 2022 21.26

Fracción (n°)

La FBPasa se trató con EGTA(5 mM) durante 12 h y 1uego se sembró enuna coïumna de Sefadex G-100 (0.75 x 15 cm). Se determinó proteina por'Ia emisión de fluorescencia a 340 nm, por excitación a 280 nm. Laactividad FBPasa se determinó segu'n 10 descripto en Materiaïes yMétodos.Vo = D.B. (azui de dextrano), cyt C (citocromo C), Vf = Co (cobalto).

Tabla XV:Efecto de fracciones eïufdas de Eng cromatografía en gel de13_FBPasagg_c|oroplasfo tratada son . '_' ‘­

_ Actividad FBPasaMedio de incubacion de] Pico I (nmol F-6-P

(FBPasa) formado . min-1)

Compïeto 4.o

“ + Fracción II (40 u1) 9.3

+ Fracción III (40 u1) 1.6

La FBPasa tratada con EGTA(10 mM) se incubó durante 18 h a 0°C y secromatografió en Sefadex G-100. Luego se preincubó con DTT (2.5 mM),tiorredoxina (25 ug/mï), FBP (0.2 mM)y Ca2+ (50 uM); según se indicaen presencia de 1as fracciones que eluyen en 1a misma cromatografía.La actividad se determinó espectrofotométricamente según 10 descriptoen Materiaies y Métodos.

- 159 ­

de espinaca por ruptura y posterior centrifugacióndiferencia]. Debido a que se encontró actividad de] fac­tor en 1a fracción cioropióstica, se procedió a su frac­cionamiento por un método ya determinado para 1aseparación de 1as diferentes estructuras que componene]cioropiasto. Esto es, mediante su ruptura en un mediohipotónico y posterior fraccionamiento por uïtracentrifu­gación en gradiente de sacarosa. Asi se determinó que e]factor se encuentra presente en ias membranas ti1acoidesde los cioropiastos.

En io que respecta a 1a distribución de estefactor en cianobacterias, 1uego de su ruptura y posteriorcentrifugación diferencia] se determinó que se encuentrapreferenciaimente en la fracción de membranas. Dicho fac­tor es extrafbie de éstas con baja fuerza iónica y es nodializabie. Las membranas o este factor estimuian 1aFBPasa como se muestra en 1a Tabia XVI, en presencia deFBP y en ausencia de] sistema reductor. E1 factor asiextraido y sin otro-paso de purificación no requiere de]agregado de Ca2+ para 1a estimuiación de 1a FBPasa. Suincubación en presencia de EGTA (0.5 mM) disminuye 1aactividad enzimática a su basa].

En 1a purificación ias hojas de eSpinaca sonhomogeneizadas en buffer Tris-CIH pH = 7.9 (30 mM) yB-met (0,1%); ei homogenato es sometido a 80°C durante3 min. Luego de centrifugar 1a suspensión a 30.000 x gdurante 10 min, e] sobrenadante se siembra en DEAE­celulosa e1uyendo a baja fuerza iónica de dicha coiumna(buffer Tris-C1H pH = 7.9, 50 mM). La presencia de] fac­tor en estas fracciones, cuyo perfi] de e1ución semuestra en 1a Fig. 29; se ensaya por activación de 1aFBPasa en presencia de FBP (1 mM) y Ca2+ (50 uM).

Las fracciones que contienen 1a actividad del

Tabla XVI: Presencia gn_ cïoroBIastos y cianobacterias de ¿H1factorïunc1onal gg_la_act1vac1on dE_FBPasagg_cioropT3sto.

Actividad Fructosa-1,6-bisfosfatasaCondiciones (umoï Pi iiberado . min- . mg prot)

de preincubaciónTilacoides Cianobacteria

Compieto 31.0 25.0

- Membranaso factor 7.0 7.0

- FBP 3.0 3.0

- Ca2+ 27.0 25.0

- Ca2+ + EGTA 2.o 3.o

- FBPasa 2.0 3.0

Compieto + 1uz r 49.6 38.2

Compieto + ciorpromazina 18.0 15.0

La FBPasa se preincubó con FBP (1 mM)y Ca2+ (50 uM) en presencia demembranas según se indica. Se agrega EGTA(0.2 mM) 6 ciorpromazina(0.1 mM). Luego de 25 min, 1a nezcïa se inyectó en ei nedio de nadi­ción. La actividad se determinó por Iiberación de Pi según 10descripto en Materiales y Métodos.

-161­

Fig. 29: Cromatografía en coiumna de DEAE-ce'lu'losade] factor acti­vador ggLa FBPaÉa.d_eclortïflastos. —

A l I 1E "‘ Buffer A

E Í‘2 V . ’

8 m Groïienieco ..d 0,3 ­Eo _ 1,0U)oo.E 0.2 r - 0.a

A U

g a- 0.5a

.8. o

E 0.1- -0.4 í.D8 yo —0,2

TS.23 .Lu l l

Ou 1o 20 3o o

Fracción (n°)

Perfi'l de e1uci6n de una cromatografía en DEAE-ce'lu’losa (2 x 15 cm)correspondiente a un extracto parcia1mente purificado de factor, pro­veniente de hojas de espinaca.Se determinó 'Ia presencia de1 factor en 1as fracciones por su efectoactivador sobre 1a FBPasa (O) (ver Materia1es y Métodos) y 1a con­centración de proteína (A) por 1a medición de 1a DOde 'Ias fraccionesa 280 nm.

102 ­

factor se someten a sucesivos pasos de purificación.Luego de su concentración por rotaevaporación a 50°C y decïarificar la suspensión por centrifugación (30.000 x gdurante 10 min), se siembra en una coiumna de adsorciónde hidroxiapatita, de 1a cua1 e1uye en e] 1avado de 1acoïumna y minoritariamente en e] gradiente de SO4(NH4)2auna concentración de 0.15 M (Fig. 30). Luego de juntarestas fracciones y diaïizarïas, se siembran en unacoiumna de TEAE-ceïuiosa equilibrada con buffer Tris-CIHpH 7.5 (30 mM)y 1a actividad eiuye con un gradiente deClNa a una concentración de 0.1 M, como se indica en 1aFig. 31.

Por otro lado e] factor e1ufdo de 1a croma­tografía en DEAE-ceïuïosa, concentrado por u1trafi1tra­ción con membrana UM-2, se siembra en una coïumna deSefadex G-50 a temperatura ambiente y eïuye, como seobserva en 1a Fig. 32, con un peso moïecular aproximadode 16.000.

E1 factor así purificado ‘no activa 1a fos­fodiesterasa de cerebro de rata dependiente de Ca2+, por10 que se descarta 1a presencia de caimoduiina. Sedescarta también 1a presencia de tiorredoxina, ya que noactiva a 1a FBPasa por preincubación con ei reductor,DTT, en ausencia de 1a FBP y dei Ca2+.

Comose comentó anteriormente, este factor acti­vador de 1a FBPasa de cïoroplastos, independiente de1sistema de reducción, está presente además en cianobac­terias. Para su purificación se partió generaïmente de5 1 de un cuitivo de cianobacterias, crecidas durante 5dias en 1a 1uz, 1as que se precipitan por centrifugacióna 3.000 x g durante 10 min y se 1avaron dos veces con 20m1 de buffer Tris-CIH pH 7.9 (50 mM) y C1Na (20 mM).Luego se resuspendieron en 15 m1 de buffer Tris-CIH pH

-16;S—

Fig. 30: Cromatografía en coiumna d_e hidroxiapatita _de_1factor acti­vador dela FBPïsa d_ecToropiastos.

I l l l I l

Buffer Gradienfe DAMKP.

¿e l

? 100 - . a 2,1.9. g 2

‘T >C g ._ O

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0° ZQQ' ‘ p Oo 5 . '_. ’I ' ‘ Os .o 9 .0o 50‘.É ‘ AÁ“ :

A ‘AAAo 1 fui J J y l o

Ü 20 40 60

Fracción (n°)

Perfi] de e1uci6n de una cromatografía en hidroxiapatita (3 x 5 cm)correspondiente a un concentrado dei factor eiuido de 1a DEAE­ceiuiosa. Se determinó 1a presencia de] factor en ias fracciones porsu efecto activador sobre 1a FBPasa (O) (ver Materiaies y Métodos) y1a concentración de proteina (A) por 1a medición de 1a DO de 'lasfracciones a 280 nm.

—164—

Fig. 31: Cromatografía en coiumna de TEAE-ce1u1osa de] factor acti­vador ¿1313 FBPa_sa. ’— _

3 | I I l l l

á 450 - lo“ _.09'Ïg " \°\

E ,' ‘\’ .' ‘ No 300 - A. ; b —0,6 co8 o

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p A 4‘0 ó ‘Á“ ¡E “4‘¿54m¡5“C 0 l l I l | o

0 10 20 30 40 50 60

Froccio'n (n°)­

Perfi] de eïucio'n de una cromatografía en TEAE-ceiuiosa (1 x 10 cm)correspondiente a un concentrado de] factor eiuïdo de 1a HTP.Se determinó 1a presencia de] factor por su efecto activador sobre 1aFBPasa (O) (ver Materiaies y Métodos), y 1a concentración de proteina(A) por 1a D0 de ‘Ias fracciones medidas a 280 nm.

- 165 ­

Fig. 32: Cromatografía en coiumnad_eSefadex G-SOdi factor activadore a asa. "" ’—

a v c ' cI o yic oog' 300- i o l _ 2ts ¡"x

E I' \\x II ‘\ - >o I | N

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É 000000 -oo-o" Ó0000‘C l I I l O

C0 10 20 30 40

A Fracción (nf)

Perfil de eiucio'n de una cromatografía en Sefadex G-SO (1 x 20 cm)correspondiente a un concentrado de] factor eïufdo de 1a TEAE­ceiuiosa. Se determinó 1a presencia de'l factor en 1as fracciones porsu efecto activador sobre 1a FBPasa (O) (ver Materiaies y Métodos) y1a concentración de proteina (A) por 1a medicio'n de 1a DO de iasfracciones a 280 nm.Vo = D.B. (azui de dextrano), cyt C (citocromo C), Co (cobaito).

- 160 ­

7.9 (50 mM) y se rompieron por Bio-X-Press a -25°C; e]congelado de 1a ruptura de ias cianobacterias se diiuyó 4veces con H20 bidestilada y se centrifugó a 105 x gdurante 30 min.

E1 sobrenadante se siembra en DE-52 ce1u1osa

(Fig. 33), equiïibrada con buffer Tris-CIH pH 7.6 (50mM); ias fracciones con actividad de factor que e1uyen ene] 1avado de 1a coiumna se juntan con aqueiias que cocro­matograffan con 1a actividad de FBPasa, 1uego de sercaïentado a 80°C durante 3 min, y se dia1izan toda 1anoche contra buffer Tris-C1H pH 7.6 (50 mM), previa con­centración por UM-lO. E1 concentrado se siembra en unacoïumna de DEAE-ceïuiosa equiiibrada con e] mismo buffer;1as fracciones con mayor actividad de factor eiuyen en e]lavado de esta coiumna. Estas fracciones se juntan y con­centran por precipitación con C13CH:CH30H(2:1). Luego deuna centrifugación a 3.000 x g durante 5 min, se separanias fases de C13CHy 1a de CH30H;y 1a interfase o preci­pitado se deseca a 50°C bajo atmósfera de N2 y 1uego secompieta por vacio. E1 residuo se resuspende en una soiu­ción de Na2C03 (34 mM)y se diaïiza contra buffer Tris­ClH pH 7.6 (30 mMHTablaXVH) . Diez m1 de muestra sesiembran en una coiumna de Sefadex G-100, equiïibrada conbuffer Tris-CiH pH 7.6 (30 mM) a 4°C (Fig. 34). En estacromatografía se separan dos fracciones, una de pesomo1ecu1ar aparente de 14.000-16.000 (A) y otra fracciónde bajo peso moiecuiar entre 4.000 y 1.500. De manera quee] factor extraido de cianobacterias estaría compuestopor dos fracciones (A) y (B), que como se observa en 1aTabia XVIII, interactúan en 1a activación no reductiva de

¡Ia FBPasa.

— ¡67 —

Fig. 33: Cromatografía en coiumna de DE-52ceiuiosa del factor acti­vador ge_la_FBPE%a.

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‘5 8."‘ <Uv- _.U'CQ.

:3 20 10°CL ° E? 11

8 "‘00o ‘o(n E? :9 o

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<1 8

>

C l l l o10 30 50 80

Fraccion (n°)

Perfi] de e1uci6n de u a cromatografía en DE-52 ce1uïosa (2 x 20 cm)de un sobrenadante (10 x g) de cianobacterias. Se determinó 1a pre­sencia de] factor en ias fracciones caientadas a 100°C durante 3 min,por su efecto activador sobre 1a FBPasa (C)) (ver Materiaies yMétodos) y 1a actividad FBPasa de cianobacterias (¿8) en dichas frac­ciones.

Tabia XVII: Purificación y concentración de] factor Bo: partición en_;_¿_g___

Actividad FBPasa(umo'les Pi iiberado . min-1)

Fracción

Contro] Muestra

Ciorofórmica 33 50

Metanóiica 13 8

Interfase resuspendida en:

C03Na2 20 68

C13CH:CH30H:H20 7 7

E1 extracto de factor parciaimente purificado (1 voi) se particionó enC13CH2CH3OH(2:1) (3 voi). Como contro], se utiïizó 1 vo] de H20 en 3vo] de 1a nnzcia de dichos soiventes. La interfase de 1a partición de1a muestra se desecó a 50°C bajo atmósfera de N2 y 1uego vacio; éstase resuspendió en C03Na2 pH 11 (34 mM) 6 en C13CH:CH30H:H20(1:1:0.3)según se indique. La actividad de] factor se detenninó en cada frac­ción de 1a partición sobre 1a FBPasa de cloropiastos según se indicaen Materiales y Métodos.

-169 ­

Fig. 34: Cromatografía _e_nco1umna gg Sefadex (5-50 _d_e_‘¡_factor de ciano­bacter1as.

«e-1>

<-u3

0,2 - _

FBPasaporFactor

Activación

10 30 50 80

Fracción (n°)

Perfi] de eïucíón de una cromatografía en Sefadex G-SO (1 x 30 cm)correspondiente a un concentrado de] factor.La actividad deï factor se ensayo sobre 1a FBPasa en presencia deCa + (20 uM) en e] medio de preíncubación (O) o en su'ausencía (O).Vo = D.B. (azuï de dextrano), Co (coba1to). y

Tabia XVIII: Reconstitución de 1a actividad de] factor activador de 1aFBPasagg_cloropTaïtos. '_“ -_'_’

_ Actividad FBPasaCondiciones de preincubacion umoies Pi 1iberado . min'1 .

mg prot-1

Controï 7.0

“ + Componente (A) 19.8

“ + Componente (B) 17.5

" + Componente (A) + (B) 81.6

La FBPasa se preincubó con FBP (1 mM)y Ca2+ (20 uM) y según se indi­que, en presencia de uno de Ios dos componentes de] factor provenientede cianobacterias. Luego de 25 min, 1a nezcia se inyectó en e1 nediode medición y 1a actividad se detenminó por 1a 1iberaci6n de Pi según10 descripto en Materiaies y Métodos.

3.3.2.2. Caracterización.Los estudios tendientes a su caracterización

mostraron que e] factor purificado de cianobacterias,previo a 1a separación de Ios dos componentes, reaccionacon un reactivo especifico para grupos -NH2 1ibres,c1oruro de dansi1o. Este tratamiento, sin embargo, nomodifica apreciab1emente 1a actividad enzimática (Fig.35).

Por otro 1ado, e] factor se incubó durante 100min a 37°C con N-etiI-maleimida, un reactivo especificopara grupos -SH; 1uego de una diáïisis se ensayó 1a acti­vidad sobre 1a FBPasa preincubando con FBP y Ca2+. Comose muestra en 1a Tabla XIX, este tratamiento produce unadisminución parcial de] efecto activador sobre 1a FBPasa.

E1 componente (A) de] factor puede considerarseproteico por ser sensibie a1 tratamiento con subtiiisina.Como se observa en 1a Tab1a XX, luego de 100 min a 37°Cde tratamiento de1 factor con 1a proteasa, éste carece deefecto sobre 1a FBPasa.3.3.2.3. Efecto del factor en la reguïación g_ la acti­

vidad FBPasa.3.3.2.3.1. [ase gg modificación.

Este factor extraido tanto de hojas de espi­naca como de cianobacterias, activa a 1a FBPasa dec10rop1astos de espinaca en forma independiente a1sistema de reducción. Como se muestra en 1a Tabïa XXI, 1aactivación de 1a FBPasa en presencia de1 factor requierede 1a preincubación con FBP y un meta] bivaïente, ya que1a ausencia de FBP o 1a presencia de EGTA(quelante demetaïes bivaientes) en e] medio de modificación previene1a activación de 1a FBPasa.

Asimismo, este factor activador de 1a FBPasapuede actuar en forma concertada con e] sistema de acti­

-172­

Fig. 35: Tratamiento de] factor de cianobacterias con un reactivo degrupos _-__ÑH(Eïïruro _dedfim o . _' _

I ¡{DB l (¡30‘La.) C)

I l u

N Ol I N

FBPaéoporFactor1

donsiladonmol.Piliberadoemm O

I

Activocion

.A O

10 20 30 LO ”(‘Zïzá‘áru‘m’osouaosamnnopP0P!SU34UI

Fracción (n°)

E1 factor se trató con cioruro de dansi‘lo durante 18 hs a 0°C. Luegose sembró en coiumna de Sefadex G-25 (1 x 20 cm). Se determinó 1aactividad dei factor tratado (A) y no tra ado (’O) comoactivación de"la FBPasa en presencia de FBP (1 mM)y Ca + (20 uM), asi como también1a emisión de fluorescencia a 510 nm en esas fracciones.V0 = D.B. (azui de dextrano), Co (cobaito).

-17;5­

Tabla XIX: Tratamiento del factor activador de 1a FBPasa por En reac­tivo gg_grupo :__ -ef1|-male1midaïï"

Condiciones Actividad FBPasade preincubación umoies Pi liberado . min'1 . mg prot"1

Controi 9.7

+ Factor 23.6

+ Factor + NEM 11.3

rE1 factor activador proveniente de cianobacterias (0.04 mg) se incubadurante 60 min a 37°C en un voiumen de 0.2 m1 en presencia de 0.2 mMde NEM. Luego de dializario contra buffer Tris-CIH 30 mMpH 7.9, setoma una aiicuota de 0.03 m1 que se agrega a una nezcïa de prein­cubación de FBPasa en presencia de FBP (1 mM)y Ca2+ (20 uM). La acti­vidad se determinó por 1iberaci6n de Pi de acuerdo con 10 descripto enMateriaïes y Métodos.‘

Tabia XX:Tratamiento del componenteA_ggl factor por proteasa.

Condiciones de preincubación umo] Pi iiberado . min“1

Contro] 7.0

+ Componente (A) 20.4

+ Componente (A) 20.1

+ subtiïisina 58.8Componente (A)

+ subtiiisina 27.0

+ Componente (A) + 27.6subtiiisina

E1 componente A de] factor (0.02 mg) se trató durante 100 min a 37°Ccon subti1isina (28 ug). Su actividad se ensayó' sobre 1a FBPasamediante 1a preincubación en presencia de FBP (1 mM)y Ca2+ (20 uM).Luego de 25 min, se inyectó en 1a mezcia de medición y e] Pi 1iberadose determinó según 10 descripto en Materiaies y Métodos.

Tabïa XXI: Re uerimientos de la activación gg 1a FBPasa gg_c10r091astoen presenc1a deT_Tactor ¿“en ausencia'ael Sistema gg_reduc­Éïbn.

Preincubación Actividad FBPasa(nmoï Pi . min-1)

Compieto 145

" (- factor) 28

(- Ca2+) 135

(- FBP) 1.6

" (- FBP, Ca2+) o

(- FBPasa) 0

(+ EGTA) 0.8

La FBPasa (0.05 mg/mï) se preincubó segúh se indica con FBP (1 mM),ca2+ (20 mM)y e] factor extraído de hojas de espinaca. Luego de 25min, 1a actividad se determinó por 1iberaci6n de Pi segúh 10 descriptoen Materiaïes y Métodos.

-17b­

vación dependiente de reducción. Como se muestra en 1aTab1a XXII, 1a FBPasa activada a bajas concentraciones deFBP (0.4 mM)y Ca2+ requiere de 1a presencia de] factor yde 1a tiorredoxina-f reducida por DTT, para 1a expresiónde Ja máxima actividad cataïftica. La ausencia de FBPcomo 1a presencia de EGTAimpiden 1a activación de 1aenzima.

Estos resuïtados hicieron suponer que e]efecto de] factor y de 1a tiorredoxina-f podrian ejer­cerse a dos nive1es diferentes de 1a activación de 1aFBPasa. Esto se pudo dilucidar por 1as curvas de activi­dad en respuesta a diferentes concentraciones de FBPy deCa2+.

En 1a Fig. 36, se observa que 1a respuesta de1a actividad FBPasa a concentraciones crecientes de FBPse expresa en un incremento de 1a actividad específica.Sin embargo, e] A0.5 para 1a FBP no se modifica en formaapreciabïe por 1a presencia de] factor.

E1- aspecto más significativo de] efecto de1factor sobre 1a activación enzimática se muestra en 1aFig. 37; a medida que se incrementa 1a concentración deCa2+ durante 1a preincubación, aumenta 1a actividadespecífica de 1a FBPasa. La presencia de] factor (20ug/m1) en 1a fase de modificación, disminuye e] Ao_5 parae] Ca2+. La actividad de 1a FBPasa se anula comp1etamentepor e] agregado de EGTA(15-20 uM).

Asimismo, 1a interreïación de1 factor con e]meta] bivaiente (Ca2+) se observa en 1a Fig. 38. La pre­sencia de Ca2+ (20 uM) durante 1a preincubación de 1aenzima disminuye e] Ao.5 para e] factor de 18 a 4 ug/m].

Tabia XXII: Reguerimientos de la activación de 1a FBPasa dec orgp asto gn presencia del Factor y 631 Sistema '35reducción.

Actividad FBPasa (Z)

Preincubación(1) TEAE-Ceiuiosa (2) Sefadex

Compieto 100 100

" (- Factor) 40 1.7

" (- Tiorredoxina) 64 74

" (- Ca2+) 56 39

" (- Tiorredoxina 36 1.1- Ca2+)

" (- FBP) o o _

" (+ EGTA) o _ o

La FBPasa se preincubó, según se indica, con DTT (2.5 mM), tiorre­doxina (10 6 20 ug/mi), FBP (1 mM), Ca2+ (20 uM) y factor (10 ug/mi).Luego de 10 min, 1a actividad se determinó por 1iberaci6n de Pi según10 descripto en Materiales y Métodos.Actividad contro]: 80 umoles F6P fonmado . min-1 . mg prot-1corresponde a1 100% de 1a columna (1) y 47 umoies F6P fonmado . min"1mg prot'1 corresponde a1 100%de 1a coiumna (2).

Fig. 36: Efecto de] factor en 1 activación _d_gja FBPasa decloroplastos meEhada REF B'P'.

Ï l ’_—Ï’_ _o­

120 .. lo" +Factor —

0- Ill,EE OO f,

o - ' ­. 'Ü 80 Í

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-_'t

l I l

0,2 0,4 0,6FBP (mM)

OO

La FBPasa se preincubó en presencia (g) o ausencia (A) de] factorextraido de hojas de espinaca con Ca + (50 uM) y concentracionesvariab1es de FBP. Luego de 25 min, se inyectó en 1a mezcia demedición. La actividad se determinó por 'liberación de Pi según 1odestripto en Materiaïes y Métodos. A

-179­

Fig.'37: Efecto de] factor en ¿a activación de 1a FBPasa decloroplas‘tïmeaiadaïLL. _ " _

‘ï‘é l l l 1 l Ï Í 1 Í 1o. x0 —————————————————--O

m IÉ o +foctor

‘Ïs 64 - I’ ...-A­E ÍO Io ''o Ig .48 - ¡I Jl controle P "CL lluz) 32 - : _.-‘ ­3 k; .a za 15 —- 9 A _O I

g i0 l l I l 1 l 1 l l

20 0 40 80 120 160

EGTA(}JM) A Caz'buM)

La FBPasa se preincubó con DTT(2.5 th tiorredoxina (10 o' 20 ug/m1),FBPy concentraciones variabies de Ca en presencia (O) y ausencia(A) de'l factor extraido de hojas de espinaca. La prevención de Iaactivación se reaiizó con concentraciones crecientes de EGTA.Luego de10 min, 'Ia muestra se inyecto' en un medio de medición y 1a actividadse determinó por formación de fructosa-G-fosfato con un sistemaenzimático acopiado a 1a reducción de NADPsegu'n 10 descripto enMateriaïes y Métodos. »

-180*

Fig. 38: Efecto del (3.212111 activación _c_i_e_1_aFBPasa de cioropiastosvmediada¿ol-el factor. _“

'1

omin

pmolesdeFBPhidrolizodo

n l J l L

O 10 20 30 40 50

Factor (pg/ml)

La FBPasa se preincubo' con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (10 ug/mi), FBP(1 mM)’.yconcentraciones crecientes de factor extraído de hojas deespinaca, en presencia (O) o ausencia (A) de Ca2+ (20 uM). Luego de10 min, 1a muestra se inyectó en 1a mezcia de medición y se determinó1a formación de fructosa-ó-fosfato con ei sistema enzima'tico acopladoa 1a reducción de NADPsegu'n 10 descripto en Materiaies y Métodos.

3.3.2.3.2. [ase de catáiisis.Paraieiamente a estos estudios, se comprobó

que 1a FBPasa en presencia de un soivente orgánico seactiva con concentraciones menores de Ca2+ como asi tam­bién de ios restantes efectores. En este caso, 1a con­centración de Ca2+ requerida para inhibir 1a catáiisistambién disminuye..

La importancia del factor en 1a moduiación de1a FBPasa es consecuencia de 1a disminución de] A0_5 parae] Ca2+ en 1a activación. Si éste jugara un r01fisioiógico, no deberia potenciar e] efecto inhibitoriode] Ca2+ en 1a catáiisis. Por e110, 1a FBPasa fue acti­vada con e] sistema compieto en presencia o ausencia defactor. La concentración de Ca2+ para 1a fase de modifi­cación fue escogida de manera tai que ias veïocidadesiniciales fueran iguaïes cuando se ensayaron en presenciade EGTA. De esta manera, ias variaciones en 1a actividadde 1a FBPasa en ausencia de EGTAse deberian a diferentes

respuestas a 1a inhibición por Ca2+ más que a diferentesniveies de activación de 1a enzima. En 1a Fig. 39 seobserva que 1a FBPasa activada en presencia de] factorrequiere una menor concentración de MgZ+, siendo suK0.5 de 1.8 mM, mientras que 1a FBPasa modificada enausencia de] factor muestra un K0_5 para M92+ de 3.8 mM.Esto sugiere que dicho factor podria participar en 1amoduiación de 1a FBPasa, evitando ei efecto dua] que pre­senta e] Ca2+ en dicha reacción.3.3.2.4. Efecto sobre la oxidación del Egg.

E1 sistema de oxidación dei H20 en ioscloropiastos de ias piantas y de cianobacterias se ioca­iiza en 1a membrana tiiacoides. E1 desprendimiento de]02 es dependiente de] Mn2+y de 1a absorción de 1uz porei fotosistema II (342). Por otro 1ado 1a oxidación de

-182­

Fig. 39: Efecto de] Mi sobre 1a actividad ggï_a FBPasa preincubada'___. ____,_e_rlpresenCia g ausenc1a de actor.

61. _ ‘ ' 1 I r' _

7 ——- —- - - - - - ' - - -O - ­E 0’ +fa cio r FE '—' Il, v " A ..° ' Ao 9

g II ControlE IIIn- l .‘

.9 32 __ II __“r ,’ .4co5 ¡p ,A'L: l_ 15 ‘ ¡QA _oC l

é‘o 4 I I u 1 1

U 2 lo 5 8 10

Mg 2‘ (m M)

La FBPasa se Breincubo‘ con DTT (2.5 mM), tiorredoxina (10 ug/mï), FBP(0.4 mM), Ca2 (50 uM) en presencia de factor (10 ug/m1) (O) o en unmedio que contenía DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mï), FBP (0.4 mM)y Ca + (0.16 mM) en ausencia de factor extraido de espinaca (A).Luego de 10 min, 1a muestra se inyectó en ei medio de reacción quecontenía concentraciones variabies de Mg2+en ausencia de EGTA. Laactividad FBPasa[se determinó por 1a formación de F-6-P con e] sistemaenzimático acop'lado a 1a reducción de NADPsegu'n 10 descripto enMateria1es y Métodos.

- 183 ­

H20 es dependiente de Ca2+ (343). E1 tratamiento conEGTA, tanto de ias membranas tiïacoides de ioscioroplastos como de las membranas de cianobacterias,anuia compietamente e] desprendimiento de 02, e] que serestituye por ei agregado de Mn2+y Ca2+. Por eilo, seensayó 1a participación de este factor en e] sistema deoxidación de] H20. E1 desprendimiento de] 02 en membranasde cianobacterias i1uminadas, utiiizando Fe(CN)53- comoaceptor de e1ectrones, se ve incrementado por e] agregadode este factor. Más aún, en presencia de] factor no serequiere e] agregado de un aceptor exógeno de e1ectronespara observar e] desprendimiento de 02 (Fig. 40). Además,1a inhibición en e] desprendimiento de 02 provocada porel agregado de Pi es revertida por e] agregado de estefactor.

Por otra parte, a1 igual que para 1a activaciónde 1a FBPasa los componentes (A) o (B) separadamente nomodifican 1a veiocidad de desprendimiento de] 02 enmembranas de cianobacterias, mientras que agregados con­juntamente incrementan 1a veiocidad de desprendimientode] 02.

3.4. Desactivación gg la FBPasa.La captación fotosintética de] C02 es inmediatamente

suspendida en 1a oscuridad, de modo que 1as actividadesde 1as enzimas responsabies cesarfan rápidamente. Sinembargo, e11as permanecen en su estado activo por untiempo mayor a1 de 1a inhibición de 1a asimiiación deC02.

'Dado que 1a FBPasa reSponde rapidamente a cambios depH y M92+ en 1a catáiisis, 1a disminución de estos fac­tores en 1a oscuridad seria 1a responsabie de 1a inhibi­ción de] ciclo de Benson-Caivin en 1a transición

- 184 ­

Fig. 40: Efecto del factor sobre e] desprendimiento de 02 eg_cianobac­ferias. _ _ ’­

l unidadrelativa

sFc (C N)5

A [._.Ímin

A) Una aiicuota de 1a suspensión de cianobacterias se coiocó en 1acámara de] poiarógrafo y se encendió 1a 1uz (ver Materiaies yMétodos). Luego de 2-3 min, se agregó un aceptor termina] de e1ectro­nes, Fe(CN)63- (2 mM)y se determinó e] desprendimiento de 02. Otraaifcuota que contenía factor de cianobacteria se dejó estabiiizar y aios 10 min se encendió 1a 1uz. En ausencia de Fe(CN)53- se determinóe] desprendimiento de 02.B) Una aïfcuota de 1a suspensión de cianobacterias se utiïizó para 1adeterminación dei desprendimiento de 02. A ios 3 min de i1uminación se1e agregó e] componente B de] factor. A otra aïïcuota se ie determinóe] deSprendimiento de 02 en 1uz; a 1a que se 1e agregó a ios 2 min e]componente A de] factor y 1uego de 2 min se 1e agregó e] componente B.C) Una a1fcuota de 1a suspensión de cianobacterias se co1ocó en 1acámara dei poïarógrafo y se encendió 1a 1uz (ver Materiaies yMétodos). Luego de 2 min, se agregó buffer Pi pH 7.0 (0.1 mM)y a 1os3 min se 1e agregó e] factor de cianobacterias, con registro contfnuode] desprendimiento de 02. ­

- 185 ­

luz-oscuridad (344). Sin embargo, como existe una recon­versión 1enta a 1a forma inactiva, se estudió dicho pro­ceso y se observo que éste era mediado por: 1) oxidaciónde 1a forma activa de 1a FBPasa y 2) por acción de iaspoIiaminas. i3.4.1. Efecto de oxidantes.

La forma activa de 1a FBPasa es revertida a suestado inactivo por procesos de oxidación. Esto se haobservado cuando ésta es modificada in vitro por e1sistema tiorredoxina-f reducida, FBPy Ca2+. Asimismo, 1aFBPasa se desactiva por cromatografía en coiumna defi1tración por gel en un buffer privado de] reductor,DTT. De] mismo modo, oxidantes como H202 ó GSSG desac­tivarian 1a FBPasa (60,345,346).

Una vez activada, 1a enzima no revierte por 1aincubación con EGTA, mientras que si éste se agregadurante 1a modificación de 1a “FBPasa, se previene suactivación.

Cuando 1a FBPasa se activa por preincubación conFBP y Ca2+ en ausencia de] sistema de reducción, 1aeniima no es inactivada por H202, mientras que sfrevierte por e] agregado de EGTA 1uego de haber sidoactivada (Tab1a XXIIIa).

La FBPasa activada por e] sistema comp1eto en pre­sencia de] factor requiere para su desactivación deiagregado de H202 y EGTA(Tab1a XXIIIb).3.4.2. Efecto de las poiiamina .

Los c10rop1astos de piantas superiores y cianobac­terias contienen espermidina, asi como una de 1as enzimasreïacionadas a su sintesis (espermidina sintetasa)(347,348). Recientemente, se mostró que 1a incorporaciónde poïiaminas a1 cloropiasto es dependiente de 1a 1uz(349). Sin embargo, 1a información respecto de su efecto

Tabia XXIII: Efecto de] EGTA531 la_ desactivación gg__la FBPasa decIoroEIáEf-. ’­

ActividadPreincubación (nmoï Pi . min-1)

Condiciones (min)

(A)

Compïeto 20 81

+ EGTA 20 0.4

22 88

+ 20' + EGTA 2' 22 8

(B)

Compïeto 10 40

" + EGTAI' 1120

+ EGTA + H2021' 11 2

(A) La FBPasa se activó en presencia de FBP (1 mM), Ca2+ (20 uM) yfactor (20 ug/m1), según se indica, se agregó EGTAa1 comienzo de 1apreincubación o 1uego de 20 min durante 2 min. La actividad se deter­minó inyectando 1a muestra en 1a nezcia de "edición por formación dePi, como se describe en Materia1es y Métodos.

(B) La FBPasa se activo en ¿”esencia de DTT (2.5 mM), tiorredoxina(10 ug/mi), FBP (0.4 mM), Ca + (20 uM) y factor (10 ug/mï). Según seindica, se agregó EGTA(0.5 mM) durante 1 min o EGTAy H202. La acti­vidad se determinó inyectando 1a muestra en 1a mezcla de "edición porformación de Pi, como se describe en Materiaïes y Métodos.

- 187 ­

fisioïógico es escasa y Ios estudios que se han 11evado acabo ias han re1acionado a1 proceso de senescencia(350,351).

Aïgunas poïiaminas presentan un efecto inhibitoriode 1a activación de 1a FBPasa de c1orop1astos. La esper­midina y 1a espermina previenen 1a activación de 1aFBPasa de cïoropiasto por efecto concertado detiorredoxina-f reducida, FBP y Ca2+, como se muestra en1a Fig. 41; mientras que 1a putrescina carece de efecto.La concentración de espermidina y espermina que disminuye1a actividad especifica a la mitad de] va1or máximo es de3.8 mMy 0.7 mMrespectivamente. Esto indicarfa que unmayor número de cargas positivas en 1a poliamina favorecesu interacción con 1a enzima.

Estudios previos indican que estos poiicationes seunen a macromoiócuIas como consecuencia de una neutrali­zación de cargas; en e] caso de 1a unión a Ios ribosomas708 de E¿_ coli produce aiteraciones conformacionalesirreversibïes por unión a Ios ácidos nuc1eicos reempia­zando a1 MgZ+. En 1a unión a proteinas esta interacciónproduce su agregación como en e1 caso de 1aUDP-ga]actosa-4-epimerasa y 1a T4 p01inuc1eótido quinasa(352,353).

Para observar si ias poïiaminas se unen reversi­b1emente a 1a FBPasa, e] ensayo se diseñó de 1a siguientemanera: 1) preincubación de 1a FBPasa durante 20 min enpresencia de tiorredoxina-f reducida, FBP y Ca2+ conespermina 5 mM; 2) se transfiere a una soiución que con­tiene todos 105 componentes de 1a preincubación, excepto1a poiiamina, y se incuba durante 15 min; y 1uego 3) seinyecta 1a so]ución en e] medio de medición de 1a activi­dad enzimática. En 1a Tabia XXIVse observa que 1a acti­vidad FBPasa de cioropiastos se recupera cuando 1a

-188—

Fig. 41: Efecto d_e lg poiiaminas ¿en 1_a activación d_e ji FBPasa _d_e_cloroplasto.

Ï l l l I100 _

putrescina

8o ao —fl.ODLL

'b _ espermidinn_CJ

ÏE’.2 40 - ­(J<2

'o " ...°\ espermina

O l l l l IO 1 2 3 4 5

Poliamina (mM)

La FBPasa (1.5 ug) se preincubd con DTT (1.5 mM), tiorredoxina (30ug/mi), FBP (0.2 mM), Ca2+ (0.05 mM)y concentraciones variabies depoiiamina, según se indica, espermina (I), espermidina LA) yputrescina (O). Luego de 15 min, 1a actividad se midió espectrofo­tométricamente por formación de fructosa-G-fosfato según 10 descriptoen Materiaies y Métodos.E1 100% corresponde a 57 umo1es de F-6-P formado . min'1 . mg prot’l.

- 189 ­

Tabia XXIV:Reversión del efecto de espermina en la activación de laFBPasa gg_c10rop1asto.

Condiciones de Actividad FBPasapreincubación (mmoïFru-G-P formado .

min'1 . mg prot'l)

Compieto, 30 min 68

Comp1eto + espermina, 20 min 17

Compieto + espermina, 20 min y- espermina, 15 min 51

Compieto + espermina, 30 min 17

La FBPasa (18 ug) se preincubó con DTT (1.25 mM), tiorredoxina (30ug/m1), FBP (0.2 mM), Ca2+ (0.05 mM)y, segun se indique, se agregóespermina durante 20 min. Luego una alícuota (0.01 m1) se inyectó enuna solución (0.5 m1) de‘1a misma composición, que contenía (según seindique) espermina 5 mM. Luego de 15 min, 1a muestra se inyectó en 1amezcla de "edición para 1a determinación de 1a actividad, según 10descripto en Materiaïes y Métodos.

-190­

concentración de espermina disminuye en 50 veces larequerida para inhibir. Los experimentos realizados conespermidina reemplazando a la espermina mostraron tambiénque la inhibición puede ser revertida.

Como la carga positiva de las poliaminas influyeen la interacción con las proteinas y dado que al pH 7.9utilizado en estos ensayos, se hallan totalmente protona­das, se estudiaron otras sustancias. En este contexto seobservó que el NH4+, las monoaminas, los aminoácidos ylos poliaminoácidos a una concentración de 2 mMcarecende efecto. Por otro lado, dos proteinas básicas, histonay protamina inhiben completamente la actividad de FBPasa,pero contrariamente al efecto ejercido por las poliami­nas, su inhibición es irreversible.

Comolas poliaminas previenen la activación de laFBPasa, se estudió la posibilidad de revertir este efectopor alguno de los componentes de la fase de modificación.La enzima tratada con espermidina va recuperando el nivelde activación de la FBPasa no tratada, a medida que se

-incrementa la concentración de Ca2+, como se observa enla Fig. 42, mientras que la FBPasa tratada con esperminano recupera totalmente los valores del control; comotampoco lo revierten altas concentraciones de FBP o detiorredoxina-f reducida, (Fig. 43).

Como la reacción de FBPasa es regulada a dosniveles: fase de modificación y fase de catálisis, losensayos con poliaminas sobre la catálisis de la FBPasamostraron que no existe efecto alguno sobre esta fase(Fig. 44); asimismo la FBPasa inhibida por preincubaciónen presencia de poliaminas tampoco revierte a su máximaactividad especifica por el aumento de la concentraciónde Mg2+en la catálisis. Las constantes de los componen­tes requeridos para la catálisis no se modifican sustan­

-191­

Fig. 42: Efecto de] Cagiïjg activación dela FBPasa_d_ecloroplastotratada-c-fl’ïoi iamina.

-1

l Í l I 1 I

control ­

-1espermídina

“9".D.U!EO

.SE (3mM)O _

g 1‘ espermina

g 30 (0,5mM)-7énl- _.

‘P3 1o —

Cr.

_ o l l I 1 l l

g o 100 200 300l .CaClz (FM)

La FBPasa se preincubó con DTT (1.25 mM), ti rredoxina (30 ug/ml), FBP(0.2 mM)y concentraciones variabies de Ca + en presencia de esper­midina 3 mM(A) 6 espermina 0.5 mM(I) o en ausencia de po1iamina(o). Luego de 15 min, 1a muestra se inyecto’ en 1a mezc'la de mediciónde ia actividad segu'n 10 descripto en Materiaies y Métodos.

Fig. 43: Efecto de 1 concentración de FBP o de tiorredoxina en 1aa

activaci-(ïi e l FÉPasa ___c'ieÏToropiastBÉ tratada con e—sñeïïmina. _ _

—1I I l I

control W.o80AÉo.cnE

._’ 50 - " '{s ‘E - -_. _8o 40 - A " 'É 0,5mM 0,5 mM

3 — A espermind- eSPCFmÍDG 'fl- _

filo 20 “ _3

Lt _ _

—— 0 J I I l l I l l I I l

É o 200 1.00 500 1 3 5FB'P (¡JW Tiorredoxina (pg)

La FBPasa se preincubó con DTT (1.25 HM), Ca2+ (50 uM) y con­centraciones variab1es de FBP (A) o' de tiorredoxina (B), en presencia(A) o ausencia (O) de espermina (0.5 mM).Luego de 15 min, 1a muestra se inyectó en 1a mezc'la de medición para1a determinación de 1a actividad de acuerdo con 10 descripto enMateriaïes y Métodos.

-193­

Fig. 44: Efecto d_e1a espermina _e_nla_activación ¿QE actividad dela FBPasaE cloroplastos. _

T

EiUI 80' 0,5mMespcrmina _(catalisis)EO

‘Ïs ' IÉ so- _o control .

"UC

É.9 40* _0.

I

‘P - ‘ Aa _ 0,5mM.espumina —u" (activación)

EE I

'l 0 I I .¡ . .0 1 2 3 L 5

MgClz (mM)

La FBPasa (1.5 mg) se prïincubo' con DTT (1.5 mM), tiorredoxina (30ug/m'l), FBP (0.2 mM)y Ca + en presencia (A) o ausencia (O, I) deespermina 0.5 mM. Luego de 15 min, 1a muestra se inyectó en 1a mezciade medición que contenía concentraciones variables de Mg2+en presen­cia (I) o ausencia (A, O) de espermina 0.5 mM. La actividad sedeterminó de acuerdo con 1o descripto en Materia1es y Métodos.

-194­

ciaimente, e] Ko,5 para M92+ es de 1.3 mMy 0.7 mMcuando1a FBPasa se activa en presencia y ausencia de espermina(0.5 mM) respectivamente, mientras que e] 50.5 para e]FBP permanece invariabie.

Estos resu1tados indican que la baja actividadespecifica de 1a FBPasa modificada en presencia depoïiaminas se debería a una menor concentración de 1aenzima activada más que a su modificación.

3.5. Reguiación de la g]iceraïdehido-3P-deshidrogenasa.La actividad GAP-deshidrogenasa en ias p1antas supe­

riores presenta un comportamiento diferente según e]tejido que se considere. En tejidos con metaboiismo hete­rotrófico (semiiïas, raices, taiios, citopïasma dehojas), 1a enzima utiiiza soïo NADHcomo cofactor y suspropiedades son similares a 1a enzima proveniente de1evadura y múscuïo. En e1 estroma de ios cioropiastos, 1aGAP-deshidrogenasa cataïiza e1 unico paso reductivo de]cicïo de Benson-Caivin.

NADPH NADP

1,3 P2GA-—;———¿>GAP + PiUn aspecto que distingue a esta enzima de 1as prove­

nientes de tejidos heterotróficos es 1a posibiïidad deuti1izar tanto NADH como NADPHcomo cofactor. En los

organismos fotosintéticos estudiados hasta e] momento, seha comprobado que 1a actividad deshidrogenasa dependientede NADPHes modificada por 1uz. Como ocurre con otrasenzimas de1 c10rop1asto, su actividad es baja en Iostejidos mantenidos en 1a oscuridad y alta en ios iïumina­dos.

Se han observado tres formas diferentes de 1a enzimaaisiada de hojas de espinaca:

-195­

a) PM é 1.5 x 1,06; dependencia de cofactor NADPH:NADH(4:1).

b) PM = 6 x 105;

(1:8). \'c) PM 5 15x 105;

(1:1).Las formas (a) y (c) muestran cinéticas de actividad

1inea1es determinadas tanto con NADPHcomo NADH,mientrasque (b) muestra un Iag hasta que comienza a observarse e]desarr0110 de 1a catálisis cuando se ensaya con NADPH.Dicho 1ag, que representa 1a activación enzimática,disminuye por preincubación de 1a enzima con NADPH,ATP yPi, aumentando a1 mismo tiempo 1a veïocidad de cat51isis.Por e110 se postuló que 1a forma regu1atoria seria 1aenzima de PM = 6 x 105 (238,355). Asimismo se observó unainteracción entre dichos efectores, por cuanto e] agre­gado de uno de eïios en 1a fase de activación provoca 1adisminución de] A0_5 correspondiente a otro efector cuyaconcentración se está variando. De manera que 1ahistiéresis concertada seria e] mecanismo de activaciónde 1a forma reguïatoria de 1a NADP-GAP-deshidrogenasa. Laactivación concertada de 1a enzima por ATP, NADPHy Pi semuestra en 1a Tabïa XXVcomo ya fuera determinado porNoïosiuk y Buchanan '(238), 1a cua] se potencia por e1agregado a1 medio de preincubación de tiorredoxina-freducida por DTT. Confirmando resuitados anteriores, seobserva en 1a Tab1a XXVI que 1a actividad dependiente deNADno es modificada por efectores, ni por tiorredoxinareducida, asi como tampoco se observa e] efecto sinérgicoantes mencionado.

La Fig. 45 muestra 1a respuesta de 1a enzima a con­centraciones crecientes de su cofactor, e1 NADPH,agre­gado en 1a fase de modificación. La presencia de

TabTa XXV:Efecto de 10s modificadores y su interacción en 1a activa­c10n de_Ta NADP-gliceralaeñiddÏ3-Tosfafo deshïdrñgenasa ggcïorofiïasïó.

umoT de NADPHoxidado . min'1 . mg prot‘1

PreincubaciónContro] Tiorredoxina

reducida

Enzima 2.6

+ NADPH0.5 mM 10.0 38.5

+ ATP 2.5 mM 23.6 38.0

+ Pi 20 mM 0.5 9.5

+ NADPH+ ATP 32.2 50.9

+ NADPH+ Pi 28.2 48.2

+ NADPH+ ATP + Pi 32.1 53.9

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubó según se indica con NADPH(0.5mM), Pi (20 mM), y ATP (2.5 mM) en presencia o ausencia de DTT (2.5mM), y tiorredoxina (25 ug/mT). Luego de 10 min, Ta muestra se inyectóen 1a mecha de medición y Ta actividad se determinó espectrofo­tométricamente con un sistema enzimático acopTado.

Tabia XXVI:Efecto de 105 modificadores en 1a actividad 559 gg_1aÑÁDP-gliÉErETdehido-É-ïosïato ¿EÉhidïogenasa gg_ '_'clorogiasto.

Preincubación umo] de NADHoxidado .min-1 . mg prot-1

Enzima 6.1

+ tiorredoxina reducida 6.2

" + NADPH 0.5 mM 6.4

" + ATP 1 m 6.4

" + Pi 20 mM 6.1

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubó con NADPH(0.5 mM), ATP (1mM), Pi (20 mM) 6 DTT (2.5 mM), tiorredoxina (25 ug/mï). Luego de 10min se inyectó en una mezcia de medición y se determinó 1a actividadde oxidación de NADHde esta enzima, según 10 descripto en Materiaïesy Métodos.

- 198 ­

Fig. 45: Efecto de ]_a_tiorredoxina reducida en 1_a_activación de 1_aNADP-GAPdeshidrogenasa _d_ec10rop1astos mediada Bol: NADPH.

Í; 50 l l l | T ..8o. tiorredoxina

g) reducida, 1.o- _TEE

g - contr‘ol­'UU

‘ÏE’

á 20- _JE0.O<1:z 10" _'5El o. .l ' l I

0 0,2 0.4 0,6 0,8 1,0

NADPH (mM)

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubó con concentraciones variabiesde NADPHen presencia (O) o ausencia (A) de tiorredoxina (25 ug/mï)y DTT (2.5 mM). Luego de 10 min, 1a muestra se inyectó' en 1a mezc1a demedición _y 1a actividad se determinó por 'Ia oxidación de] NADPHsegúnio descripto en Materiaies y Métodos.

- 199 ­

tiorredoxina-f reducida por DTTdisminuye Ta sigmoidici­dad de 1a curva, aumentando también Ta ve10cidad maxima.E1 Ao_5 para NADPHes, respectivamente, de 0.60 mMy 0.35mMen ausencia y presencia de tiorredoxina reducida. Otrofactor que disminuye Ta sigmoidicidad de Ta curva deactividad en respuesta a 1a concentración de NADPHes e]MgZ+,en presencia o ausencia de tiorredoxina-f reducidaen e] medio de preincubación (Fig. 46). Ni e] Mn2+ (20uM) ni e] Ca2+ (0.1-4 mM) mostraron una modificaciónapreciabTe en 1a actividad NADP-GAP-deshidrogenasa.

E1 efecto de 1a tiorredoxina reducida en 1a activa­ción enzimática mediada por ATP o Pi (Figs. 47 y 48)representa una Teve disminución en Tos A0_5 respectivos.E1 A005 para ATP decrece de 1.2 a 0.7 mM, en tanto e]A0_5 para Pi To hace de 40 a 21 mM.

Es de hacer notar que a concentraciones de Pimayores de 50 mMen 1a preintubación, comienza a obser­varse una disminución de 1a actividad; ésta corresponde a1a inhibición de Ta actividad cataïitica y no de Ta acti­vación (Fig. 49).

Además se anaTizó e] efecto de] sustrato como efec­tor enzimático; Ta enzima se preincubó durante 10 min cone] sistema generador de 1,3-P26A a concentraciones deATP, PGAy Pi que por si solas no modifican Ta actividadenzimática. En 1a Fig. 50 se observa un aumento de TaveTocidad máxima por efecto de] sistema generador de1,3-PZGA, e] cual es potenciado por 1a tiorredoxina redu­cida. La dependencia de ese proceso dei 1,3-PZGA fuecorroborada por un ensayo en e] que se obvió aTguno deTos componentes dei sistema generador de 1,3-PZGA (TabTa

XXVII).Por trabajos reaTizados en otros Taboratorios se

postuTó que esta activación podria deberse a Ta conver­

-200­

Fig. 46: Efecto de 1a tiorredoxina reducida en 1a activación de 1aÑÁUPÏGAPÏdeaiiarogenasa ___aecloroplasFo-s ’ríédiada fi ÑAUPH'ÏQ'“Emi-My".

Ï l i I Iv.L.- 50 - ­0 . . 'g_, tlorredoxmua rcducn a

m tiog’edpxinare ucn aÉ 4o - "gsm

TC

E .

0 30- controH80U

control5 Mo Mgm_I

CLD<2Z 10 ..“oEl

0 10,3 0,6 0,9 1,2 1,5

NADPH (m M)

O

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubo' con concentraciones variab‘lesde NADPHen presencia (O, O ) o ausencia (A, A) de tiorredoxina (25ug/m‘l) y DTT (2.5 mM) con (O,A ) o sin (O, A) M92+ (5 mM). Luegode 10 min de preincubación, 1a muestra se inyectó en 1a mezc'la dereacción y ia actividad se determinó por 1a oxidación dei NADPHdeacuerdo con lo descripto en Materiales y Métodos.

L?" 7a,; ,7,of ,,,,,,,777 of,,7”se

- 201 ­

Fig. 47: Efecto de 1a tiorredoxina reducida en 1a activación de 1aWAWe’sïidrogenasa _decloroplastó‘s'mídiaa por_._ _

N O tiorredoxina '­reducudo

omgprof“1

3

l l l

¡umolNADPHoxidado-mm‘1

La NADP-GAPdeshidro enasa se preincubó con concentraciones variab'lesde ATPen presencia O) o ausencia (A) de tiorredoxina (25 ug/m1)yDTT (2.5 mM). Luego de 10 min, 1a muestra se inyectó en e] medio demedición de 1a actividad que se determinó por 1a oxidación de] NADPHsegún se indica en Materia'les y Métodos.

1- 202 -.

Fig. 48: Efecto de 1a tiorredoxina reducida en 1a activación _d_el_a_ÑÁDP-GAP-Üeíñ'idrogenasa_d_e_c10rop1astos mafia a 391);

tiorredoxinmreduudoN C)I

_s OControl

0 50 100

Pi (mM)¡umplNADPHoxidodo.mirï‘.’mgprot']

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubo' con concentraciones variabiesde Pi en presencia (o) o ausencia (A) de tiorredoxina (25 ug/m'l) yDTT (2.5 mM). Luego de 10 min, 1a muestra se inyectó en e] medio dereacción y 1a actividad se determinó por 1a oxidación de] NADPHsegún10 descripto en Materia‘les y Métodos.

-203­

Fig. 49: Efecto de] El gn_la_actividad gg la NADP-GAPdeshidrogenasadg_cior65Tastos.

rx) <2)

0 10 20 30

Pi (mM)pmolNADPHoxidado-miriÏ-mgprot"

8

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubó con DTT (2.5 mM), tiorredoxina(25 ug/mi) y Pi (20 mM). Luego de 10 min, 1a muestra se inyectó en 1amezcïa de reacción que contenía concentraciones variab1es de Pi. Laactividad se determinó siguiendo 1a oxidación de NADPHsegún 1odescripto en Materiaies y Métodos.

-204­

Fig. 50: Efecto de 1a tiorredoxina reducida en la activación d_e 1aÑÁ'UFÏG'AP-d'e-shidrogenasa d_e cioropiastos mediada Boi El1-3P2glí.

_ 0_ g tiorredoxind60 reducida '­

Control

1.o - —

N OI I

¡umolNADPHoxidadOomirïï-mgprot'1

I l

00 20 40

Sistema generador de1-3,PZGA(}JI)

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubó con concentraciones crecientesde] sistema enzimático de generación dei l-3PZGA en presencia (O) oausencia (A) de tiorredoxina (25 ug/mi) _y DTT (2.5 mM). Luego de 10min, 1a muestra se inyectó en 1a mezcia de reacción _y1a actividad sedeterminó por 1a oxidación de NADPHde acuerdo con 10 descripto enMateriaies _yMétodos.

Tabia XXVII: Controies de 1a activación de 1a NADP-GAPdeshidrogenasam e__|_I-31ifñfogl icerafo._ —

umo] NADPHoxidado . min'1 . mg prot-1

PreincubaciónContro] Tiorredoxina

reducida

Enzima + mezcia completa 16 30.5

- PGA 5.8 18.6

- ATP 5.8 17.6

- PGA-K 5.8 12.8

- Mg 11.2 25.7

+ PGA-K 6.4

" + EGTA 2 mM 14.5

La NADP-GAPdeshidrogenasa se preincubó, segun se indique, con 1oscomponentes de] sistema generador de PzGA, PGA (1.25 mM), ATP (1.25mM), PGA quinasa (2 unidades), Mg2+ (2.5 mM) en presencia o ausenciade tiorredoxina (25 ug/mi), DTT (2.5 mM). Luego de 10 min, 1a muestrase inyectó en 1a nnzcla de "edición y 1a actividad se determinó poroxidación de NADPHpor un sistema enzimático acopiado según 10descripto en Materiales y Métodos.

- 206 ­

sión de 1a forma reguïatoria de PM: 6 x 105 en otra formade diferente peso moiecuiar dependiente de NADPH(123,233). Por e110 se procedió a cromatografiar 1a enzimaactivada por NADPHy tiorredoxina reducida químicamentepor DTT, en una coiumna de agarosa Bioge] A 1.5 mequilibrada con buffer Tris-CIH pH 7.9 (50 mM)y DTT (2.5mM). En 1a Fig. 51 se observa que 1a enzima activadae1uye en 1a misma fracción que 1a no tratada. La depen­dencia de NADPHzNADHes de 4:1 para 1a forma activa de 1aenzima. Estos ensayos preïiminares indican que habria unainterconversión de 1a NADP-GAPdeshidrogenasa por activa­ción, 1a que aumenta su especificidad por NADPHsin modi­ficar e] peso moiecuiar.

-207­

Fig. 51: Requerimientos para 1_aestabilidad dela forma activa de 1_aNADP-GAPdeshidrogenasa de cloropiastos.

r‘ O

-1

elución 0.5

50m

pmolNAD-PHoxidadoomiri1o

Fracción (n°)

La NADP-GAPdeshidrogenasa (0.1 mg/mi) se preincubó en presencia deNADPH(0.5 mM), DTT (2.5 mM) y tiorredoxina (25 ug/mi). Luego de 10min, se sembro' en una coiumna de Bioge'l A-0.5m y se eiuyo' en un bufferque contenía DTT (2.5 mM) ( , Ü ). Por otro 1ado, se sembró en 1amisma coiumna NADP-GAPdeshidrogenasa sin preincubar ( , O ). Laactividad de ias fracciones fue ensayada siguiendo ia oxidación deNAD(,D)6deNADPH( , .

208 ­

4. DISCUSION.

4.1. Generalidades.La asimi1aci6n de C02 en tejidos fotosintéticos es

dependiente de 1a 1uz. La energia radiante transformadaen energia quimica por 1a cadena fotosintética detransporte de e1ectrones no soïo provee e] ATP y e] NADPHsino que también controia 1as reacciones enzimáticas queconforman e] cicïo de Benson-Caivin (196). Dicho controlno es un efecto directo de 1a 1uz sobre 1a enzima, sinoque está mediado por e] transporte de e1ectrones foto­sintéticos. Por eiio, en estudios in vitro, se trata deestabiecer una correïación entre 10s cambios mediados por1a luz en ei estroma con e] efecto que éstos tienen sobre1a actividad enzimática. De Ios mecanismos reguïadoresactivados por 1a luz, los más estudiados son:1) Cambios en 1a concentración de protones (H+) y de

cationes (MgZ+)como consecuencia de] transporte foto­sintético de meïectrones. Se produce e] pasaje deH+ desde e] estroma dei cïoropiasto a1 interior de losdiscos ti1acoides. Por un mecanismoantiporter se pro­duce 1a a1ca1inizaci6n de] estroma y un aumento en 1aconcentración de MgZ+. Este meta] bivaiente esrequerido como cofactor de 1a actividad de aigunasenzimas dei cicïo (256,263).

2) Aumento de 1a concentración de efectores como NADPHyATPgenerados durante e] transporte de e1ectrones comotambién de Ios intermediarios de] cicïo reductivo deias pentosas fosfato (174,226,230-232).

3) Formación de reductores enzimáticos: a) e1 sistema LEM(efectores moduiados por 1uz) presente en las membra­nas ti1acoides y b) e] sistema ferredoxina­tiorredoxina (1a tiorredoxina es reducida por 1acadena de transporte de eiectrones via 1a ferredoxina,

- 209 ­

en una reducción cataïizada por 1a ferredoxina­tiorredoxina reductasa) (60,191,218).

Estos mecanismos operarfan en 1a activación de 1asenzimas de acuerdo con e] siguiente esquema:

í————————-Enzimas inactivas

pH (7——98) pH (8——€fl)

Tiorredoxina red. GSSG lLuz Efectores Dehidroascorbato Oscuridad

Aumento Mg2+ Disminución M92+LEMreducido Componente oxidado

l

I----------¿>Enzimas activas.

La activación enzimática se debe a 1a conversión deuna forma inactiva a una activa, siendo este proceso máslento que 1a velocidad de catáïisis (202,212). Estacaracteristica 1as incïuye dentro de 1as enzimas denomi­nadas histeréticas (27fi). Por esta razón, para su estudioreguiatorio, e] ensayo de 1a reacción se separa en dosetapas:a) Fase de modificación: La enzima es preincubada con Ios

modificadores.b) Fase de catáïisis: Se ensaya 1a actividad cata1ftica.

De este modo 1a reacción enzimática ref1eja dosprocesos: 1a modificación de 1a enzima y 1a actividadcataïitica. Mediante este procedimiento experimenta] esposibïe determinar si un compuesto dado participa en unao ambas fases y cua] es e] efecto que presenta sobre 1aenzima.

- 21U ­

4.2. Fructosa-l,6-bisfosfatasa.Esta enzima cata1iza 1a hidróïisis de 1a FBP.

M92+FBP—>F-6-P + Pi

Este es uno de 105 pasos de 1a fase regenerativa de]aceptor de C02. ln vitro, su actividad se detecta a a1tasconcentraciones de FBP (6 mM)y de Mg2+ (10 mM) (260).

Varios iaboratorios mostraron 1a participación dereductores en 1a reacción de 1a FBPasa de cioropïastos.La FBPasa es activada por preincubación con DTT (20 mM)durante 24 hs (277). Asimismo se encontró que 1a incor­poración de tiorredoxina-f a] sistema de modificacióndisminuye tanto 1a concentración de DTT (5 mM) como e]tiempo de preincubación (5-20 min) (196). E1 centroactivo de 1a tiorredoxina contiene dos cistefnas, separa­das por dos aminoácidos, que forman un puente disuïfuro.Cuando se 1a reduCe fotoquimicamente o por DTT, que

-simu1a e] proceso que ocurre en 1uz, se observa 1a for­mación de dos grupos -SH provenientes de dicho puentedisuifuro (200). Sería por estos grupos -SH activos que1a tiorredoxina moduia 1a actividad de enzimas ciaves deicic10 de Benson-Caivin.

Por otra parte, 1a FBPasa de] cïoropïasto es acti­vada por efectores, como 1a FBP (sustrato enzimático), enun proceso que no requiere reductores; sin embargo, 1aconcentración necesaria de FBP para dicha activación eseievada (12 mM) (248).

Con posterioridad se demostró 1a activación de 1aFBPasa en forma conjunta por FBP y tiorredoxina-f redu­cida por DTT, 10 cua] constituye la primera evidenciaexperimentai de regulación enzimática coordinada por

-211­

efectores y e] sistema de 1a ferredoxina-tiorredoxina(275). Sin embargo, 1a concentración de FBP requeridacomo efector y sustrato era de un orden de magnitud mayorque 1a informada como fisioiógica en e] cloropiasto i1u­minado.

Los resuitados presentados muestran que 1a activa­ción dependiente de] tiempo de 1a FBPasa que se producepor preincubación con tiorredoxina-f, DTTy FBP aumentasinérgicamente en presencia de Ca2+ en e] medio de modi­ficación. Comoconsecuencia de esta activación, 1a FBPasapresenta 1a mayor actividad especifica, ensayada a bajasconcentraciones de FBP (0.4 mM)y de M92+ (1 mM).

La FBPasa asi activada 11eva a cabo 1a catáiisis aconcentraciones de FBP y’ M92+ de un orden de nmgnitudmenor respecto de] ensayo de 1a enzima en su estadoinactivo. Asimismo, ei 1ag que se observa en e] ensayo de1a actividad FBPasa es completamente suprimido por incu­bación de 1a enzima con e] sistema de modificación. De

manera que e] paso iimitante en 1a estimuiación de laactividad FBPasa es su activación concertada.

'Cuando se compara 1a capacidad de diversos com­puestos en reempiazar 1a FBP en 1a reacción de 1a FBPasa,se observa que otros azúcares bisfosfato son efectivos en1a activación concertada de 1a enzima, mientras que sola­mente 1a SBP puede reempiazar a 1a FBP como sustrato conuna menor actividad especifica.

Asimismo, por experimentos de unión de FBP, seobserva que ésta interactúa directamente con 1a enzima enuna reiación de 6-7 moies FBP/mo] FBPasa. Estos resulta­dos sugieren que Ios azúcares bisfosfato pueden interac­tuar durante 1a activación con sitios de 1a FBPasadiferentes de 10s sitios cataifticos a ios que solo seunen FBP y SBP.

212 ­

Por otra parte, ei estudio con ios metaies biva1en­tes que participan en 1a reacción de 1a FBPasa, ya sea en1a fase de modificación y/o en 1a fase cataiftica, indicaque éstos presentan efectos disimiies.

E1 Ca2+ es requerido en 1a fase de modificacióncuando 1a FBPasa es activada por bajas concentraciones deFBP y tiorredoxina reducida; en este aspecto e]Mn2+puede reempiazar a1 Ca2+ con una menor efectividad.

E1 MgZ+, a concentraciones menores que ias requeri­das para 1a catáiisis, no presenta efecto en 1a modifica­ción. Sin embargo, 1a actividad especifica observada aaitas concentraciones de FBP y M92+, en ausencia decuaïquier reductor, se deberia a una activación de 1aenzima por estos efectores, ya que luego de un 1ag seobserva 1a hidróiisis de] sustrato.

En 1a fase cataïftica, e] Mg2+actúa como cofactorenzimático. Asimismo, e] Fe2+ en presencia de DTT(Pereïmuter, M.E. y Noiosiuk, R.A., datos no pub1icados)y e] Mn2+ son funcionaies' en 1a catáIisis. E1 Ca2+,potente activador, es un potente inhibidor de 1a activi­dad de FBPasa en 1a fase cataiitica.

Estos cationes pueden interactuar directamente con1a enzima. Se han observado cambios en 1a emisión def1uorescencia de 1a FBPasa por e] agregado deMg2+ (356,357). La interacción de Ca2+ con 1a FBPasa sededuce por su unión reversibie en una reiación de 16moies/mo1 FBPasa, 1a cua] no se modifica por 1a presenciade FBP en e] ensayo. Los sitios de unión presentes en 1aenzima para metaies bivaientes se han observado por 1auti1izaci6n de] Tb3+, un meta] de transición sin efectobioiógico, que por 1a simiiitud de su radio iónico con e]de] Ca2+, puede interactuar con sus sitios de unión enuna proteina (332-334).

213 ­

E1 ensayo de] Tb3+ en 1a actividad FBPasa muestra 1ainhibición irreversibïe, 5010 prevenida si e] Tb3+ seagrega previamente compïejado con EGTAa1 medio de medi­ción de 1a actividad enzimática. Los comp1ejos formadoscon e] Tb3+ (FBPasa-Tb o EGTA-Tb) tendrian una constantede afinidad suficientemente a1ta, ya que impiden su aso­ciación con 1a especie 1ibre (EGTA6 FBPasa) dado que nose observa reversión de] efecto ya producido.

FBPasa + Tb-————e>FBPasa-Tb

EGTA + Tb-—-——+> EGTA-Tb

FBPasa + Tb + EGTA-————e>FBPasa-Tb + EGTA

FBPasa + EGTA-Tb-————e>FBPasa + EGTA-Tb

Estos experimentos demuestran que existe unainteracción directa de 105 efectores (azúcares bisfosfatoy metaïes bivaïentes) con 1a enzima. Sin embargo, estosexperimentos no exc1uyen 1a posible participación decomplejos como: azúcar bisfosfato-meta1 bivaïente, tantoen 1a activación como en 1a catáïisis de 1a enzima;

Los resuïtados de- estos estudios resumidos en 1atabïa concïuyen que 1a reacción de 1a FBPasa está modu­1ada por factores que iimitan su actividad a dos nive1es:1a activación y 1a catálisis de 1a enzima.

Componente

Efecto sobre 1a

Fase demodificación

Fasecataïitica

Tiorredoxina-f

Fructosa-1,6-bisfos­fato

Sedoheptu]osa-1,7­bisfosfato

G]ucosa-1,6-bis— —fosfato

Ribu]osa-l,5-bis­fosfato

Ca2+

Mn2+

M92+

Fe2+

activador

activador

activador

activador

activador

activador

activador

(activador)

(activador)

sin efecto

sustrato

sustrato

sin efecto

sin efecto

inhibidor

cofactor

cofactor

cofactor

¿15 ­

E1 método utiiizado para e] ensayo de 1a reacción de1a FBPasa separada en dos fases evita compiicacionesdebidas a efectos de un activador sobre 1a catáïisis yde] sustrato y cofactores sobre 1a activación. Esto hapermitido definir para cada una de ias etapas iasconstantes cinéticas (Ao.5; 50.5; Ko,5; Io_5).

De este modo, se observan dos constantes cinéticasdiferentes para un compuesto que interviene en ambasfases, 1a FBPpresenta un A0.5 como activador que difierede] 50.5 como sustrato. Asimismo, e] Mn2+ presenta unAo_5 como activador que difiere de] Ko.5 como cofactor.Por otro 1ado, e] Ca2+ presenta un A0.5 como activadordiferente a1 10,5 comoinhibidor de catáiisis.

La determinación de sitios cinéticos diferentes paraun compuesto que participa en ambas fases, asf como 1amodificación de 1a FBPasa por azúcares bisfosfato que nointervienen en 1a fase cataiftica, determina 1a existen­cia de dos sitios diferentes para activación y catáïisis.Sin embargo, Ios experimentos cinéticos no discriminan siios sitios estructuraimente diferentes eran preexistenteso fueron producidos por un rearregïo de un único sitiodebido a 1a conversión entre dos formas enzimáticas.

Asimismo, se observa una independencia de ias dosconstantes cinéticas en respuesta a concentracionesvariabies de M92+. A medida que se aumenta 1a con­centración de M92+, disminuye e] 50.5 para FBP y aumentae] 10.5 para Ca2+. Las constantes de FBP yCa2+ determinadas en 1a fase de activación no son modifi­cadas por Ios cambios en 1a concentración de M92+cuandose determina 1a actividad cataïftica; 1a veiocidad máximaes 1a que se incrementa por aumento en 1a concentraciónde MgZ+.

S0.5 6 10.5 (mM)en presencia de Mg2+ (mM)

Compuesto A0,5 (mM)o 1 3 5

FBP 0.3 0.16 0.06 0.06

Ca2+ 0.055 0.007 0.024 0.040

Los resuïtados resumidos en 1a tab1a muestran sitiosde diferente afinidad para compuestos que participan enambas fases. Asimismo, 1as _constantes cinéticas de 1afase de modificación son independientes de 1a con­centración-de M92+, en tanto ias correspondientes a 1afase cataïitica son dependientes de 1a concentración deM92+ ensayada.

En este contexto, 1a tiorredoxina-f que actúa soia­mente en 1a fase de modificación de 1a FBPasa disminuyee] Ao_5 para FBP, en tanto no cambia su 50,5. Por otraparte, 1a constante cinética de activación para Ca2+ noes afectada por 1a presencia de tiorredoxina.

4.3. Sedoheptuïosa-l,7-bisfosfatasa.La conversión de 1a FBPasa de un estado inactivo a

uno activo por preincubación con tiorredoxina-f, DTT, FBPy Ca2+ Ie confiere una actividad de SBPasa. E1 requeri­miento para e] desarroiio de 1a actividad SBPasa, de

- 217 ­

manera simi1ar a 1o discutido respecto de 1a FBPasa, es1a activación concertada de 1a enzima por su sustrato, 1aSBP, en presencia de Ca2+ y tiorredoxina-f. Asimismo,requiere Mg2+como cofactor para 1a catálisis, 1a cua] esinhibida por Ca2+. La actividad SBPasa asociada a 1aFBPasa se habia observado por disociación de 1a enzima apH 8.8 (335). Sin embargo, 1a cromatografía por fiïtra­ción de ésta en coiumnas de fiitración por ge] muestrauna actividad SBPasa en e] mismo voiumen de eiución que1a FBPasa.

En tejidos fotosintéticos se determinó 1a presenciade una enzima con actividad SBPasa, 1a cua] posee especi­ficidad de sustrato; de modo que se desconoce cua] es 1acontribución de esta actividad SBPasa asociada a 1aFBPasa en e] ciclo de reducción de ias pentosas fosfato(336). Sin embargo, como se muestra en 1a tabia, 1a acti­vidad especifica de esta SBPasa es simi1ar a otras acti­vidades previamente descriptas como especificas, siendoen estos casos comparables e] pH y 135 concentraciones deM92+ y _SBP utiJizados en e] ensayo de 1a actividadcataiftica.

Actividad SBPasaOrigen (mmoies Pi . min-1 . mg prot’l)

Asociada a 1a FBPasade cioropïastos deespinaca 8.4

Cioropiastos de trigo 0.56 (ref. 358)

Cloropiastos de maizActivación fotoquimica 2.57

Cioropiastos de maizActivación porreducción quimica 9.56

La actividad SBPasa, de] mismo modo que la FBPasa,es estimu1ada por su sustrato en presencia detiorredoxina-f reducida por DTT. En este contexto seensayó 1a reguïación de 1a SBPasa con especificidad paraSBP proveniente de c10rop1astos de maiz, una pianta detipo C4, debido a su mayor estabiiidad y a una mejorcaracterización (337).

Los experimentos presentados indican que 1a presen­cia de Ca2+ en 1a fase de modificación estimuia 1a acti­vidad SBPasa preincubada con SBP y tiorredoxina-freducida con DTT. De] mismo modo que ocurre en 1a activa­ción de 1a FBPasa, e] Mn2+ puede reempiazar a1 Ca2+ en

-219­

este proceso. Comoel sistema reductor fisiológico queactúa en 1a activación de estas enzimas es e] sistemaferredoxina/tiorredoxina, se reempïazó 1a reducciónquimica por 1a fotoqufmica. Para 1a activación por reduc­ción fotoqufmica se requiere 1a presencia de 1as membra­nas tiiacoides de] c10rop1asto, responsabïes de 1aabsorción de 1a 1uz; 1a ferredoxina, aceptor termina] dee1ectrones provenientes de] fotosistema I y 1a tiorre­doxina, que se reduce por 1a ferredoxina via 1aferredoxina-tiorredoxina reductasa. Todos estos factoresen presencia de 1a 1uz determinan 1a mayor actividadespecifica de SBPasa en presencia de Ca2+ y SBP.

La actividad cataiitica de 1a SBPasa requiere delMg2+ como cofactor, e] cua] puede ser reemplazado porMn2+. E1 requerimiento de M92+ para 1a SBPasa activadapor este sistema de modificación es significativamentemás bajo respecto de 1a SBPasa activada en ausencia deCa?+ en e] medio de preincubación. De manera que estesistema de modificación regu1a 1a activación de 1a SBPasaincrementando 1a afinidad por e1 M92+ requerido para 1acatáïisis.

E1 efecto dua] de] Ca2+ se observa nuevamente en 1areacción de 1a SBPasa; este presenta un efecto activadoren 1a fase de modificación e inhibitorio en 1a fase decatálisis. La inhibición de 1a catáiisis producida por e]Ca2+ se modifica según 1a concentración de Mg2+a 1a cua]se ensaya 1a actividad enzimática.

La reguiación por 1a 1uz de enzimas histeréticascomo FBPasa y SBPasa en 1a fotosíntesis de] tipo C3 y de]tipo C4, estaria determinada por 1a activación concertadadei sistema ferredoxina-tiorredoxina, sus sustratos y unmeta] biva1ente (Ca2+, Mn2+), Io cua] faciiitarfa 1acatáiisis a1 pH y concentración de M92+presentes en e]

- ZZU ­

cloropiasto i1uminado, de acuerdo con e] siguienteesquema:

Luz

«&—————————H+

__É;;;Z_€> Sistema

M92+ I Fd-TiïrredoxinaMe2+ (Ca2+, MgZ+) Sustrato

E(i) 1 ‘ L E(a)

S—__..___>PMg2+

Otros investigadores sugieren que en 1uz se produce1a conversión de 1a enzima dei estado oxidado a1 estadoreducido, a través de 1a tiorredoxina y ditio1es relacio­nados (358). Asimismo se ha postuiado que e] sistemareductor actuaria in 1112 regenerando nuevamente 1a formareducida de aqueiia enzima.que hubiese sido oxidada pore] H202 generado en 1uz (359). De esta manera se regu­1aria 1a veiocidad de fijación de C02 moduiando 1a can­tidad de enzima reducida, que seria 1a forma activa aconcentraciones fisioiógicas de FBP y M92+. En estosmodeios e] roi de] Ca2+ estaria restringido a un contro]inhibitorio de 1a FBPasa en 1a oscuridad (281).

Por otra parte, se propone que en condiciones deequiiibrio 1a actividad SBPasa es reguiada a dos niveles:

por 1a reiación reductor/oxidante y por 1a concentraciónde sustrato (358,360).

4.4. NADP-GAP-deshidrogenasa.La interacción de efectores soiubies y e] sistema de

reducción por tiorredoxina actúa también sobre 1a activa­ción de 1a forma reguïatoria de 1a NADP-GAPdeshidroge­nasa. Se habia informado que esta enzima es activada porATP, NADPHy Pi. Más aún, estos efectores presentes de apares en 1a preincubación de 1a NADP-GAPdeshidrogenasaejercen un efecto sinérgico en 1a activación de 1aenzima (238). Los resuitados presentados muestran que 1atiorredoxina-f reducida por DTT en presencia decua1quiera de estos efectores provocan 1a activación con­certada de esta enzima histerética. Asi, e] agregado delcofactor enzimático (NADPH)y posibiemente su sustrato(PZGA) a1 sistema de modificación presentan un efectosinérgico en 1a activación. Por otra parte, bajo lasmismas condiciones experimentaies anteriores, e1_ATP6 e]Pi, efectores no invoiucrados en 1a reacción enzimática,incrementan 1a actividad especifica de 1a deshidrogenasay 91 Ao.5 se modifica 1evemente.

A1 igua] que con 1a FBPasa, bajo estas condicionesde activación no se ha determinado un cambio apreciabieen e] peso moiecular de 1a NADP-GAPdeshidrogenasa, quees de 600.000. En este aspecto se destaca que 1avariación, en ei estado de agregación de 1a enzima, fueobservada por otros investigadores 1uego de una prein­cubación de 1a enzima con NADPHdurante 6 hs a 10°C.

Dado que 1a concentración de estos metaboiitos en e]estroma dei cloropiasto está controiada por 1a 1uz,nuestros resuïtados sugieren que 1a tiorredoxina cooperaen 1a activación concertada de 1a enzima por factores que

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se modifican en 1a transición oscuridad-iuz.

4.5. Cambiosestructurales gg ias enzimas por la 1uz.La conversión de una enzima de un estado inactivo a

uno activo se corresponde con una modificación estruc­turaï que no aitera su estructura cuaternaria.

Un factor reguiatorio, modificado en 1uz, es e] pHde] estroma de] cloropïasto que contiene a ias enzimasde] cicio de Benson-Calvin. E1 pH óptimo de 1a FBPasa,tanto en 1a fase de modificación como en 1a de catáiisis,es de 8.2 a 8.5, simiiar a1 observado en el cioropiastoi1uminado. Este cambio en e] pH seria responsabie de uncambio conformaciona] de 1a FBPasa concomitante con 1aaparición de 1a actividad. La reducción de grupos -SHconstituye otro factor que controïa e] cambio confor­maciona]. La FBPasa reducida por DTT en presencia de unmarcador fluorescente (ANS) muestra una disminución en 1aemisión de f1uorescencia (360); además se ha informadoque iuego de 1a activación de 1a FBPasa por su sustrato,1a enzima es menos sensibie a 1a inhibición por reactivosde] grupo -SH (248). Por otra parte, 1a NADP-maiatodeshidrogenasa, correspondiente a 1a via de Ios ácidosdicarboxiiicos de 1a asimiiación de C02 de] tipo C4,expone dos grupos -SH, por 1a activación contiorredoxina-m reducida por DTT (361,362). De] mismomodo, 1a modificación provocada por 1a activación de 1aNADP-GAPen presencia de efectores conduciria a 1a expo­sición de grupos -SH esenciaies para 1a actividadenzimática, ya que un reactivo de grupos -SH como e] pCMBinhibe 1a forma activada de 1a enzima, no asi su activi­dad basai (238).

Este cambio en ias propiedades estructuraies secorreiaciona con 1a modificación ienta en 1as propiedades

- 225 ­

cinéticas de enzimas c1aves de] cic1o. Esta respuesta aun cambio en 1a concentración de un 1igando contribuiriaen e] contro] de] flujo a través de una secuenciametabóIica.

4.6. Moduïación por 2331.Los resuïtados presentados muestran en deta11e 1a

moduïación ejercida por e] Ca2+ en 1as dos fases de 1areacción de 1a FBPasa y SBPasa. E1 efecto dua1 de]Ca2+ sobre estas enzimas tendria un significadofisioïógico si se considera una separación tempora] y/oespacia] entre 1a activación y 1a catóïisis enzimática.Se ha informado que 1a concentración de Ca2+ en e]c10r0p1asto es aïta, sin embargo su pape] en 1a asimila­ción fotosintética de C02 ha sido muycuestionada por:a) Bajo contenido de Ca2+ Iibre en e] estroma (329).b) Inhibición de 1a actividad de ciertas enzimas.

La inhibición de FBPasa por Ca2+ fue informada porRacker y Schróeder en 1958 (260); sin embargo, Portis yHeldt en 1976 (262) sugirieron que e] fia2+ estaria fir­memente unido para prevenir 1a inhibición de esta enzimaen luz. En 1980 Char1es y Ha11iwe11 (281) propusieron quee] Ca2+ estaria firmemente unido a 1a membrana ti1acoidede 1os c1or0p1astos, e] cua1 seria Iiberado a1 estroma en1a oscuridad, previniendo 1a actividad de 1a FBPasa enesas condiciones, de modo que se inhibirfa e] fun­cionamiento de] cicïo de Benson-Calvin. Posteriormente a1o informado por nosotros acerca de 1a activación de 1aFBPasa por Ca2+, Charles y Ha11iwe11 reformuïaron su pro­puesta sugiriendo que e] Ca2+ 1ibre dentro de]c10r0p1asto prevendria e] funcionamiento de FBPasa en 1aoscuridad y que e] Ca2+ 1ibre y/o unido faciiitarfa 1arápida activación reductiva de esta enzima en qu (338).

- ¿24 ­

Por otro iado se ha observado que:a) La concentración de Ca2+ 1ibre en un aïga verde

(Bryopsis máxima) es de aproximadamente 0.5 mM(329).b) E1 movimiento de Ca2+ en e] c10rop1asto es un proceso

dependiente de 1a 1uz, Ios c10rop1astos de espinacacomo Ios de trigo captan Ca2+ en 1uz (269).

Desde un punto de vista operaciona], se pueden con­siderar dos tipos de sitios de unión de Ca2+ en losc1orop1astos y en cianobacterias: unos, fuertemente uni­dos a 1a membrana fotosintética y otros, asociados a com­ponentes extrinsecos. En ambos casos, e] Ca2+ seriafáciïmente intercambiabie con e] medio.

La caimodu1ina, proteina que une a1 Ca2+, está pre­sente en todos los eucariotes y regula 1a actividad depor 10 menos ocho enzimas (339). En ios tejidos de pian­tas reguia a 1a NAD-quinasa (341) y e] transportador deCa2+ asociado a membrana. (363). En 1a mayoria de lasp1antas, 1a actividad de NAD-quinasa está 1oca1izada en105 c1orop1astos; en espinaca 1a actividad predominanteestá presente en e] citop1asma, 1a que es dependiente deca1modu1ina-Ca2+. Esta es de particu1ar interés, ya quereguïa ios niveïes de NADPpor cataiizar 1a conversión deNAD a NADP (364). E1 NADP asi formado actúa como aceptorterminai de e1ectrones en el fotosistema I. Asi, tambiénse ha observado que 1a inhibición de 1a función calmodu­1ina-Ca2+ previene e] desprendimiento fotosintético de02 (365).

Se ha determinado la presencia de caïmodu1ina en e]c1orop1asto de arvejas y de trigo en baja concentración,pero suficiente como para saturar 1a NAD-quinasa, 10 cua]condujo a sugerir que Ca2+-ca1modu1ina es un componentereguiatorio de 1a fotosíntesis (366-368). Sin embargo,otros iaboratorios muestran a 1a caimoduIina como pro­

teina de] citopiasma de 1a hoja y no de] cioropiasto(369).4.7. Sistema de oxidación de E29.

E1 compiejo donde se produce 1a oxidación de] H20contiene Mn2+que es requerido para 1a catá1isis. Asi­mismo se observó que otro meta] bivaiente como e]Ca2+ presenta un efecto estimuïatorio sobre 1a actividadde] fotosistema II.

Recientemente se ha observado que tres proteinas depeso mo1ecu1ar aproximado 33.000, 23.000 y 17.000estarian relacionadas con e] funcionamiento de] despren­dimiento fotosintético de 02. Se ha propuesto que 1a pro­teina de 33.000 de peso moïecuiar no unirfa directamenteMn2+g éste estaria unido a1 centro de reacción, man­teniendo ia conformación de 4 Mn2+/centro de reacción(371).

Las proteinas de 23.000 y 17.000 unidas a1 foto­sistema II serian requeridas para 1a unión de Ca2+, demanera ta] de permitir 1a estimuIación de dicha activi­dad (372). _

Los antagonistas de 1a ca1modu1ina inhibenia reac­ción de] fotosistema II, efecto que es parciaïmenterevertido por e} agregado de Ca2+. Aún no está definidoe] mecanismo por e] cua] e] Ca2+ estimuia ei despren­dimiento de 02. Por anaiogia con otros sistemas, sesugiere un ro] de tipo estructura] en e] mantenimiento de1a conformación_activa de 1os sitios de unión de Mn2+,dando mayor estabi1idad a1 sistema. Los ensayos preïimi­nares dei factor de 16.000 de peso moiecuïar, aisiado dehojas de espinaca como de cianobacterias, sobre e]sistema de desprendimiento de 02 en cianobacteriasmostraron 1a estimuïación de dicha actividad. De] mismo

modo, como ocurre para 1a actividad FBPasa¡e1 incremento

- 226 ­

de] desprendimiento de 02 requiere 1a presencia de 1osdos componentes de] factor, tanto e] proteico como el debajo peso moiecuiar.

De manera que e] factor seria una forma por 1a cua]ei Ca2+controia diferentes procesos en fotosíntesis.

4.8. Integración de la reguiación metabóiica.Hasta e] momento, ias enzimas de] cicïo de Benson­

Caivin han sido consideradas como "soiubies", ya que a1romper por shock osmótico 10s cioropïastos, éstas per­manecen en 1a fracción sobrenadante 1uego de una centri­fugación a 105 x g. De modo que 1os estudios sobrereguïación enzimática se han centrado principaimente ene] efecto de metaboïitos soïubies en e] estroma de losc10rop1astos. Recientemente se han presentado evidenciasque indican interacciones entre las membranastiiacoidesy los componentes soïubies de] estroma (373). Sinembargo, no se ha determinado cómo se integran 1as enzi­mas invoiucradas en e] cicïo de asimiiación fotosintéticade C02. <

Estudios sobre 1a interacción de estas enzimas conambientes menos po1ares mostraron modificaciones en 1aactividad enzimática en respuesta a distintos efectoresen diferentes soïventes (374). Asi, 1a FBPasa, SBPasa,NADP-GAP deshidrogenasa, Ru5P-quinasa y NADP-maiatodeshidrogenasa presentan una mayor actividad especifica amenores concentraciones de efectores, cuando se disminuye1a po1aridad de] medio por un soïvente orgánico, en 1afase de modificación enzimática. Asimismo, se ha obser­vado una corre1aci6n entre 1a concentración de so1venteorgánico requerido para 1a maxima activación y 1a hidro­fobicidad de] soïvente (374).

Esta situación de favorecer e] desarroilo de 1a

-'¿27­

actividad enzimática en un entorno menos poiar o porinteracción hidrofóbica podria indicar 1a interacción dea1gunas de estas enzimas con 1a membrana. Está demostradoque esto ocurre indirectamente por intermediarios entree] sistema de transporte de eiectrones de] fotosistema Iy ias enzimas moduiadas por luz, i.e. sistema ferredoxi­na-tiorredoxina y e1 sistema LEM.

De manera que 1a presencia de un factor estimuiadorde] sistema de oxidación de] Hzo sería un índice de 1ainteracción de éste con 1a membrana, asi como 1a disminu­ción de 1a concentración de Ca2+ para 1a activación de 1aFBPasa indicaria que esta enzima "soiubie" podría re1a­cionarse a 1a membrana no solo a través de 1a tiorre­doxina sino con 1a participación de dicho factor.

En este sentido y con respecto a 1a regulación de 1aactividad de 1a FBPasa, ésta se debe hasta e] presente ados mecanismos: I1) La tiorredoxina-f reducida disminuye 1a concentración

de uno de los efectores, 1a FBP, requerida para 1aactivación de la FBPasa. Esto contempia ei modeïo pro­puesto por Hoodrow y c01., en e] cua] ios reductoresproducidos en 1uz modifican 1a afinidad de 1a SBPasade cloropïastos por 1a SBP (375). Esta proteina estárelacionada a1 sistema de transporte de e1ectrones através de 1a ferredoxina y 1a ferredoxina-tierredoxinareductasa que 1a reducen en 1uz (196).

2¡.4 E1 factor que actúa reguïando e] efecto de] catión

bivalente sobre 1a activación de 1a FBPasa disminuye81 A0.5 para Ca2+. Resta aún estab1ecer cómo estenuevo mecanismo está reiacionado con 1a cadena detransporte de e1ectrones.

De acuerdo con lo antedicho, las caracteristicas de1a reacción de 1a FBPasa de cïoropiastos podrian esquema­

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tizasrse de 1a siguiente manera:

Luz

sistemaferredoxina-tiorredoxina

Mg2+ factor

Me2+ (M92+, Ca2+) (FBP)

(FBPasa (FBPasainactiva) activa)

M92+FBP———————-' F6P + Pi

pH = 8

De modo que en 1a transición oscuridad-iuz, 1aacción concertada de 1a tiorredoxina-f reducida y de]factor provocarian 1a activación 1enta de 1a FBPasa abajas concentraciones de ios efectores como 1a FBP y e]Ca2+. De esta manera e] nivei de FBPasa activa reguiarfa1a asimiiación fotosintética de C02.

En 1a oscuridad 1a FBPasa se reconvertirfa 1en­tamente a su estado inactivo (196). Sin embargo, se haobservado que 1a fijación de C02 se detiene inmediata­mente. E1 efecto inhibitorio rápido de 1a reacción FBPasaestá dado por 1a disminución dei pH, de los niveies deM92+ en e] estroma y quizá por efecto dei Ca2+ sobre e]sitio cataiftico (344).

Con respecto a1 estado de 1a enzima, se ha sugeridoque 1a desactivación de 1a FBPasa se produce por su oxi­dación con H202 y GSSG (60,280). La desactivación de 1a

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FBPasa por mecanismos oxidativos es bastante aceptada,esto es por e] conOCimiento de 1a peroxidación de pro­teinas .en grupos -SH, acopïada a 1a formación deH202 durante e1 fiujo de eiectrones inducido por 1a iuzen ios cloropiastos. Recientemente, se ha informado queios peróxidos disminuyen e] número de grupos -SH presen­tes en 1a FBPasa, causando inhibición de 1a fotosíntesis(376). Ensayos preïiminares aqui presentados indican que1a FBPasa activada por bajas concentraciones de FBP yCa2+ en presencia de tiorredoxina, DTT y e] factor,vue1ve a su estado inactivo por acción de] Hzoz y unquelante de meta1es bivalentes como e] EGTA.

En este sentido, y con respecto a 1a reguiación de]cicïo, se ha observado que 1a inactivación podria darsetambién en su fase reductiva, dado que 1a NADP-GAPdeshidrogenasa es inhibible por grupos oxidantes comoGSSG (377) y recientemente se determinó 1a presencia deun componente en 1a membrana de] cïoropïasto de espinacaque inhibe 1a fase de activación de 1a NADP-GAPdeshidro­genasa (L. Busconi y R.A. No1osiuk, datos no pub1icados).Asimismo, su efecto inhibitorio es revertido por e1 tra­tamiento con EDTAy ca1entamiento en presencia de DTT.

Otro mecanismo que previene 1a activación enzimáticaes e] de ias poiiaminas sobre 1a FBPasa. Esta inhibiciónestá dada por espermidina y espermina en forma especifi­ca, ya que otros po1icationes carecen de efecto. A pesarque 1a espermidina, asi como una enzima relacionada a susintesis (1a espermidina sintasa), están presente en losc1orop1astos de p1antas superiores y en cianobacterias,aún es escasa 1a información de su participación en 1afisioiogfa de] c10rop1asto (350,351).

Tanto 1a espermidina como 1a espermina afectandirectamente 1a activación de 1a FBPasa de c10rop1astos

de un modo reversibie. Recientemente se informó que 1aincorporación de las poiiaminas a1 cioropiasto es un pro­ceso dependiente de 1a 1uz (349). En este sentido, pare­ceria que 1a cantidad de enzima activa en 1a 1uz depende

de ios componentes ya discutidos, estaria controiada porotros mecanismos como 1a presencia de ias p01iaminas.

Esta reguiación a dos niveles de 1a FBPasa en suestado activo reguia a su vez e] cicio en genera], debidoa 1a disponibiïidad dei aceptor de C02, 1a RuBP, Ia quese [forma en 1a fase regenerativa de] cicio, en 1a cua]

.participa 1a FBPasa.

E1 factor fundamenta] para 1a reguiación Iumfnicaparte de 1a compiejidad dei metaboiismo hidrocarbonado,dado que en estas céiuias ocurren procesos que sontotaimente opuestos y casi todas 1as reaccionesenzimáticas se repiten en uno u otro sentido. Los datoshasta ahora disponibies permiten establecer una estrechareiación entre ei pH, 1a concentración de M92+ y 1afotorreducción de 1as enzimas, que provocan e] aumento odisminución de 1a actividad de ciertas enzimas de]estroma de] cioropiasto en 1a transición oscuridad-qu.

De e110 se deduce que cuaiquiera de estos mecanismosno podrá ser aisïadamente un e1emento reguiador. En estesentido, tampoco 10 serán e] aumento de metaboiitos comoNADPH y ATP, dado que éstos se producirán en dossituaciones opuestas por 1a actividad catabóiica enoscuridad y por 1a actividad fotosintética en 1uz.

La reguiación mas precisa de 1as enzimas c1aves deicicio de Benson-Caivin estará dada por 1a intensidadIumïnica que determinará e1 nive] de enzima activa:enzima inactiva. Esta moduiación, desde e] punto de vistade] cicïo compieto, exhibe una fase de inducción de

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varios minutos hasta alcanzar su máxima actividad, 1acua] ha sido interpretada como una transición confor­maciona] 1enta de un estado enzimática inactivo a unoactivo.

Este "buffer dependiente de] tiempo“ provee uncontroï metabólico más eficiente, ya que impide cambiosdrásticps y permite 1a reguïación simuïtánea de ‘1 s/diferentes pasos que integran este cicïo.

10.11.12.

13.14.

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"Ya sea por grupos o individualmente, 1a vida humanasiempre con11eva un diáïogo continuo entre 10 que podriaser y 10 que es, entre lo posibïe y 10 reai. Una mezciasutii de creencia, conocimiento e imaginación conformaante nuestros ojos 1a imagen siempre cambiante de 10posibie."

Francois Jacob