enzimas: mecanismo, cinética y regulación enzimas: mecanismo
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2011 Enrique Castro 1
Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación
➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción
➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores
➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición
➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas
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Propiedades de los enzimasPropiedades de los enzimas
➢Proteínas•Ribozimas son excepción
➢Catalizadores•No alteran la posición del equilibrio (Keq, ΔG)
➢Especificidad•Una única reacción• Sin reacciones colaterales•No absoluta: varios sustratos
➢Eficacia•Aceleran enormemente la velocidad de reacción
➢Estereoselectivas•Complementariedad 3D
Papaína: inespecíficaTripsina: muy específica (R,K)Trombina: absolutamente específica (R en secuencia definida)
DHAPDihidroxiacetona-fosfato
GA3PL-gliceraldehído-3-fosfato
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Nomenclatura y clasificación de enzimasNomenclatura y clasificación de enzimas
➢Clases•
➢Subclases•
1: Oxidoreductasas• H: Deshidrogenasas• O2: Oxigenasas (mono-, di-)
2: Transferasas• P: quinasas• NH2: aminotransferasas
(transaminasas)• Ac: acetil-transferasas
D-Glucosa + ATP D-Glucosa-6-P + ADP
HexoquinasaATP:glucosa fosfotransferasaEC 2.7.1.12: Transferasa 7: Fosfotransferasa 1: grupo aceptor -OH 1: compuesto aceptor
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Componentes adicionales: CofactoresComponentes adicionales: Cofactores
➢Cofactor•No proteico, termoestable, bajo Mrr•Unido permentemente• Ión metálico esencial para catálisis
➢Coenzima•Molécula orgánica esencial para catálisis•Unión transitoria: co-sustrato
Covalente: grupo prostético
Holo-enzima = apo-enzima + cofactor
Cofactores aportan reactividad química especial
Xantina oxidasa
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Curvas de progreso de reacciónCurvas de progreso de reacción
A Pk1
k-1
Keq
v = −d [A]dt
=d [P ]dt
= k 1⋅[A] − k−1⋅[P ]
veq = k1⋅[A ]eq − k−1⋅[ P ]eq =0 ; K eq=k1k−1
=[P ]eq[A ]eq
En el equilibrio no hay más reacción neta: v
A→P = v
P→A
➢Velocidad inicial•Elimina dependencia de [P]
v0=−d [A ]0dt
=d [P ]0dt
= k1⋅[A ]0− k−1⋅[P ]0
v0 = k1⋅[A]0
[P]0=0
Constante de velocidad
Ecuación de velocidadCurva exponencial
[A]=[A ]0⋅e−kt
v0
v0
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Velocidad y orden de reacciónVelocidad y orden de reacción➢Reacciones de orden 0
•No depende de [A]
➢Reacciones de 1er orden (orden 1) • Dependencia lineal de [A]
➢Reacciones de 2º orden (orden 2) •Reacciones bimoleculares reales
A Pk v0=d [ P ]dt
= k
v0=−d [A ]
dt=k⋅[A ]
ln [A][A]0
=−kt ; [A]=[A ]0⋅e−kt
[k] = M·s-1
A Pk
[k] = s-1
A + B Pk
2 A Pk
v0=d [P ]dt
= k⋅[A ][B ]
v0=d [P ]dt
= k⋅[A ]2
[k] = M-1·s-1
Pseudo 1er orden• [B] constante (ej. Agua)
• Etapa limitante monomolecular
v0=d [P ]dt
=k [B]⋅[ A ]=k '⋅[ A]
k '=k [B ]
A + A A + A*k
A* Pk'
k>>k'
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Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación
➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción
➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores
➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición
➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas
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Energía de activación y catálisisEnergía de activación y catálisis
G S P=G0RT ln
[P ][S ]
G 0=−RT⋅ln K eq
k =k BT
h⋅e
G ‡
RT Catalizador reduce ΔG‡
sin afectar a ΔGO
N i
N=
g i
Z⋅e
E i
k BT
Ecuación de Eyring
Distribución de Boltzmann
Keq, ΔGº indican dirección de la reacción
NO indican si ocurre rápidamente
ΔG‡ indica velocidad de la reacción
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Centro activoCentro activo➢Región catalítica especializada
•Hendidura 3D superficial (unión S)•Volumen reducido
➢Microentorno único•Agua excluída (salvo reactiva)•pK
a especiales
➢Multiplicidad de enlaces débiles•Energía de unión alta (15-50 kJ·mol-1) •Kd baja (10-2-10-9 M)
➢Especificidad=complementariedad•Forma 3D complementaria E-S•Enlace direccionales • Llave en cerradura / Ajuste inducido
Centro activo de Lisozima
Proteína = andamiaje para centro activo en
posición
Unión de sustratoa RNasa
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Mecanismos generales de catálisis (1)Mecanismos generales de catálisis (1)
➢Estabilización del estado de transición•Desolvatación del sustrato (sustituye por unión ES)•Distorsión del sustrato (“tensión” similar a TS) •Alineamiento de grupos catalíticos•Reducción de entropía de reactivos Estado de
transición
Energía de unión: ΔH: Múltiples enlaces débiles E-S ΔS: Alineamiento adecuado
La energía de unión ΔGB reduce
la energía de activación ΔG‡
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Catálisis: unión al estado de transiciónCatálisis: unión al estado de transición
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Efectos entrópicos: alienamiento de gruposEfectos entrópicos: alienamiento de grupos
ΔG=ΔH – TΔS
Reducción de ΔSrequiere
inversión en ΔH
ΔH:Red de enlaces débiles E-S
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Mecanismos generales de catálisis (2)Mecanismos generales de catálisis (2)➢Catálisis ácido-base general
•Aporte/secuestro de H+ o pares e-
• Ionización de grupos•Ataques nucleofílicos a >C=O
➢Catálisis redox•Cofactores redox: grupos oxidantes/reductores
Sustrato(péptido)
Estado de transición
➢Catálisis covalente• Intermediario unido al enzima•Ruta alternativa
➢Catálisis por iones metálicos•Reactividad especial de orbitales d
A—B + X: A—X + B:A—B A + BH
2O
A—X A + X:H
2O
lento
rápido
rápido
Enlaces de coordinaciónActividad redox
X: grupo del enzima
Mg:complejo de coordinación octaédrico (6 O)
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Unión ES: especificidad y estereoselectividadUnión ES: especificidad y estereoselectividad
➢Ajuste inducido•Complementario al unirse (Koshland)•Energía de unión : cambio conformacional
➢Complementariedad enzima-sustrato• Llave en cerradura (Fischer)•Estereoselectividad: unión a 3 sitios
lisozima Hexasacárido substrato
Encaje inducido en la hexoquinasa
Inactivaaa catalíticos descolocados
Activaaa catalíticos en posición
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Mecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónicaMecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónica
CO2 + HO— HCO
32—
pKa(H2O) = 14
A pH 7 [HO—]= 10-7 M[HO—]/[H2O] = 10-7/55.5 ≈ 2·10-9
pKa = 7
Estabilización por par iónico
Dramático aumentode acidez de H2O
B:
BH+
Transfiere H+
a superficie de proteína(y al medio)
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Mecanismos catalíticos: serínproteasasMecanismos catalíticos: serínproteasas
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Mecanismos catalíticos: serínproteasasMecanismos catalíticos: serínproteasas
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Coenzimas de nicotinamidaCoenzimas de nicotinamida
Nic
otin
amid
a ad
enin
a din
ucle
ótid
o, N
AD
+
AM
P
adenina
2'P en NADP
Nicotinamidaoxidada
Nicotinamidareducida
Pliege de Rossmannen la ADH de hígado
NAD+ NADH
H+
Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+
• Coenzimas difusibles• Unión transitoria al enzima• Co-sustratos
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Vitaminas B3Vitaminas B3
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Coenzimas de flavinaCoenzimas de flavina
Riboflavina vit. B2
• Coenzimas no difusibles• Unión firme al enzima• Grupo prostético (covalente)
Ac. Succínico
Ac. Fumárico
FAD
FADH2
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Actividad enzimática: Dependencia de T y pHActividad enzimática: Dependencia de T y pH➢Dependencia de T
•Energía cinética molecular•Q10
•Estabilidad de la proteína
➢Dependencia del pH•Titulación de grupos ionizables esenciales(Henderson-Hasselbalch)
•pKa aa catalíticos•Estabilidad de la proteína
20 40 60 80 100 T, ºC
Ecuación de Arrhenius
Q10 =V T10
V T
Curva bifásica asimétrica
Desnaturalizacióntérmica
Curva acampanadasimétrica
Grupodesprotonadocatalítico
Grupoprotonadocatalítico
k = A⋅eE a
RT
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Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación
➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción
➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores
➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición
➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas
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Cinética enzimática: curva hiperbólica y saturaciónCinética enzimática: curva hiperbólica y saturación
Saturación implica unión enzima-sustrato
v ≠ k⋅[A]n
v =k⋅[S ]k '[S ]
Curva de velocidadno canónica
Saturación: Vmaxv no aumenta al [S]
E + S E·S P + E
Etapa rápidacuasi-equilibrio
Etapa lentalimitante, acúmulo ES
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Cinética de MichaelisMentenCinética de MichaelisMenten
[S] << KM
Orden 1
[S] >> KM
Orden 0
E + S ES P + Ek1 k2
k-1 1ª simplificación: v0
A t=0, [P]=0 y k-2 no afectad [P ]dt
= v0 = k 2⋅[ES ]
2ª simplificación: Estado estacionario[ES] no varía (k
1>>k
2) Permite calcular [ES]
d [ES ]dt
=k 1 [E ]T−[ES ][S ] − k−1⋅[ES ] − k 2⋅[ES ]=0
[ES ]=k 1[E ]T [S ]
k 1 [S ]k 2k−1; [ES ]=
[E ]T [S ]
[S ]k 2k−1
k 1v0=k 2⋅[ES ]=
k 2[ E ]T [S ]
[S ]k 2k−1
k 1
v0=V max⋅[S ]
K M[S ]
K M=k 2k−1
k 1V max=k 2⋅[E ]T
Ecuación de Michaelis-Menten
KM: [S] a la que V=½Vmax
VMax
: V cuando [S]∞
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Parámetros cinéticos: KM, Vmax y kcatParámetros cinéticos: KM, Vmax y kcat
➢Constante de Michaelis, KM
•Afinidad E-S•Kd de ES
➢Velocidad máxima, Vmax
• Saturación.•Actividad enzimática: [E]
T
➢Constante catalítica, kcat
• k de paso limitante P•1er orden: Nº de recambio
V max=k 2⋅[E ]T
KM=k 2k−1
k1≃k−1
k1=K dSi k2<< k-1
Alta KM, baja afinidad
Baja KM, alta afinidad
Vmax
mide actividad
enzimática, [E]T
Kcat
: nº de molécula S
convertidas por segundo
k cat=V max
[E ]T
unidades• Usuales: μmol/min = UI• SI: catal = mol/s
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Límite de velocidad: Eficiencia catalíticaLímite de velocidad: Eficiencia catalítica
E + S ES P + Ek
1 k2
k-1
v0=k cat⋅[E ]T [S ]K M[S ]
v0=k cat
KM
⋅[E ]T [S ]Si [S] << KM
Velocidad máxima bimolecular:Límite de difusión (nº choques)
vdifusion
=108-109 M-1·s-1.
Constante bimolecularde 2º orden
k cat
K M
vdiffusion
kcat elevada• KM no puede ser bajo• Afinidad ES limitada
KM alta• Baja afinidad, disociación rápida• kcat
rápida
kcat baja• KM debe ser bajo• Alta afinidad ES
KM baja• alta afinidad, disociación lenta• kcat
lenta
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Gráfico de LineweaverBurkeGráfico de LineweaverBurke
v0=V max⋅[S ]
KM[S ];
1v 0=
K M[S ]
V max⋅[S ]
1v 0=
K M
V max⋅[S ]
[S ]V max⋅[S ]
1v0=
KM
V max
⋅1[S ]
1
V max
Y=K M
V max
⋅X1
V max
1/[S], mM-1
1/Vmax
1/v
0,
(μm
ol/m
in)-1
-1/KM
p=KM/V
max
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Gráfico de EadieHofsteeGráfico de EadieHofstee
v0=V max⋅[S ]
KM[S ]
v0⋅KMv0⋅[S ]=V max⋅[S ]
v0⋅KM
[S ]v 0=V max
v0=−KM⋅v0[S ]
V max
v0=−KM⋅v0[S ]
V max
Y=−K M⋅X V max
v0/[S],
(μmol/min)/mM
Vmax
v 0,
(μm
ol/m
in)
Vmax/KM
p= -KM
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Mecanismo de reacciones bisustratoMecanismo de reacciones bisustrato➢Mecanismo secuencial ordenado
•
➢Mecanismo secuencial al azar•
➢Mecanismo ping-pong•
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Cinética de reacciones bisustratoCinética de reacciones bisustrato➢Reacciones secuenciales
•Ordenadas / al azar•Complejo ternario EAB
➢Reacciones ping-pong•Ordenadas • Sin complejo ternario EAB• Intermediario enzima modificada
1/[A]
1/v
0
1/[A]
1/v
0
2011 Enrique Castro 31
Mecanismos de inhibiciónMecanismos de inhibición➢ Inhibición reversible
•Competitivos•Acompetitivos•No-competitivos: puros/mixtos
Eliminación del inhibidorrestaura actividad enzimática
➢ Inhibición irreversible•Agentes desnaturalizantes•Reactivos de centro activo• Inhibidores suicidas
Inactivación enzimática permanenteRecuperación requiere biosíntesis
Fármacos inhibidores irreversibles• Penicilina / transpeptidasa bacteriana• Aspirina / COX• Disulfiram / AlDH (alcohol)
Venenos inhibidores irreversibles• Inhibidores AchE (organofosforados)• Amanitina / RNApol Inhibidores suicidas
• Alopurinol / Xantina oxidasa• 5-Fluorouracilo / Timidilato sintasa• Deprenil / MAO
H2O +O
2
H2O2
Efectos cinéticos• V
max (k
cat o [E]
T)
• KM
K I=[E ]⋅[ I ][EI ]
=1[ I ]K I
Análogos del estado de transición• Muy baja K
M (K
I)
• Competitivos
E+I EIK
I
Inhibidor en equilbrio con E
KI: constante de
disociación de EI
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Inhibición irreversible: bloqueo aa activoInhibición irreversible: bloqueo aa activo➢Cisteín-enzimas
•Agentes S-alquilantes (iodoacetato, pCl-Hg-benzoato)
➢Serín-enzimas•Organofosfatos
Reactivación por pralidoxima
I2 antiséptico
Intoxicación por pesticidas
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Inhibición irreversible dirigidaInhibición irreversible dirigida
2011 Enrique Castro 34
Inhibición competitivaInhibición competitiva
1/[S], mM-1
1/Vmax
constante
1/v
0,
(μm
ol/m
in)-1
-1/KM
p=KM/V
max
I=0
+I
v0/[S],
(μmol/min)/mM
Vmax
constante
v 0, (
μmol
/min
)
Vmax/KM
p= -KM
I=0
+I
I se une a E: EIExcluye unión S
E+S ES P+E+I
EI
KI
v0=V max⋅[S ]
⋅K M[S ]
1v 0=⋅K M
V max
⋅1[S ]
1
V maxv0=−⋅KM⋅
v 0[S ]
V max
KMap
Vmaxap =
KMap=K M⋅1
[ I ]K I
V maxap
=V max
K I=[E ]⋅[ I ][EI ]
=1[ I ]K I
Fármacos inhibidores competitivos• Metotrexato / DHF reductasa• Ibuprofeno / COX• Sildenafilo / PDE V• Estatinas /β-HMGCoA reductasa
Inhibición superable por aumento de S
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Inhibidores enzimáticos análogos de sustratoInhibidores enzimáticos análogos de sustrato
Análogo del sustrato de la DHF reductasa humana
Análogo del sustrato de la DHPS bacteriana
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Inhibición acompetitivaInhibición acompetitiva
1/[S], mM-1
/Vmax
1/v
0,
(μm
ol/m
in)-1
-/KM
p=KM/Vmax
I=0
+I
v0/[S],
(μmol/min)/mM
Vmax
/
v 0, (
μmol
/min
)
Vmax
/KM
p= -KM/
I=0+I
I se une sólo a ES: ESI
E+S ES P+E+I
ESI
KI v0=
V max
⋅[S ]
K M
[S ]
1v 0=
KM
V max
⋅1[S ]
V maxv0=−
K M
⋅v0[S ]
V max
K I=[E ]⋅[ I ]EI
=1[ I ]K I
K Map=
K M
1[ I ]K I
V maxap =
V max
1[ I ]K I
KMap
Vmaxap
Fármacos inhibidores acompetitivos• Camptotecina / Topo I; etopósido / Topo II• Análogos 2º sustrato secuencial/ping-pong
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Inhibición no competitiva puraInhibición no competitiva pura
1/[S], mM-1
/Vmax
1/v
0,
(μm
ol/m
in)-1
-1/KM constante
p=KM/V
max
I=0
+I
v0/[S],
(μmol/min)/mM
Vmax
/
v 0,
(μm
ol/m
in)
Vmax/KM
p= -KM
constante
I=0
+I
I se une a E y ESE+S ES P+E+I
EI
KI
+I
ESI
KI
+S
v0=
V max
⋅[S ]
K M[S ]
1v 0=⋅K M
V max
⋅1[S ]
V maxv0=−K M⋅
v0[S ]
V max
K Map=K M
V maxap =
V max
1[ I ]K I
KMap =
Vmaxap
K I=[E ]⋅[ I ][EI ]
=1[ I ]K I
Fármacos inhibidores no-competitivos• Digoxina / Na+/K+-ATPasa•Tacrina / AchE• Análogos alostéricos
Inhibición insuperable por aumento de S
2011 Enrique Castro 38
Inhibición no competitiva mixtaInhibición no competitiva mixta
1/[S], mM-1
'/Vmax 1
/v0,
(μm
ol/m
in)-1
- '/KM
p=KM/V
max
I=0
+I
I se une a E y ESE+S ES P+E+I
EI
KI
+I
ESI
K'I
+S P+E
k2
k'2
v0=
V max
'⋅[S ]
K M
'[S ]1
v 0=⋅K M
V max
⋅1[S ]
'V max
K I=[E ]⋅[ I ][EI ]
=1[ I ]K I
KMap=K M⋅
1[ I ]K I
1[ I ]K ' I
V maxap
=V max
1[ I ]K ' I
K ' I=[ES ]⋅[ I ][ESI ]
'=1[ I ]K ' I
KMap
Vmaxap
Inhibición insuperable por aumento de S
2011 Enrique Castro 39
Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación
➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción
➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores
➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición
➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas
2011 Enrique Castro 40
Mecanismos genéricos de regulación enzimáticaMecanismos genéricos de regulación enzimática➢Regulación alostérica
•Modulador se une a otro sitio• Regula KM o kcat
➢Regulación de la Expresión• Inducción/represión •Ubiquitinación: degradación • Expresión diferencial de isoenzimas
[Proteína] aagenbiosíntesis degradación
Expresión es unestado estacionario
➢Regulación covalente•Mod. Reversible • Proteolisis (irreversible)
Efectos homotrópicos• Sustrato actuando en otro sitio• Usualmente ⊕
Efectos heterotrópicos• Efector <> Sustrato• Tanto ⊕⊖
Activador heterotrópico:aumenta unión de sustrato
Inhibidor heterotrópico:dificulta unión de sustratoZimógenos pancreáticos
CoagulaciónCaspasas apoptóticas
QuinasasSeñalización
2011 Enrique Castro 41
Regulación alostérica: cooperatividadRegulación alostérica: cooperatividad
2011 Enrique Castro 42
Cooperatividad cinéticaCooperatividad cinética
Cinética no michaeliana(sigmoidal)
Análisis de cooperatividad:representación de Hill
½Vmax
Vmax
K0.5
2011 Enrique Castro 43
Cinética cooperativaCinética cooperativa➢ K enzimas
• Efector modula KM
➢ V enzimas• Efector modula V
max
Cinética sigmoidal:activación/inactivación
como interruptor(switch-like)
2011 Enrique Castro 44
Modelos de cooperatividadModelos de cooperatividad
Equilibrio R-TL = T/R Stryer p. 282 fig. 10,15
➢Modelo concertado•Dos estados conformacionales• Efector cambia equilibrio T-R• Inhibidor T, activador R
➢Modelo secuencial• Subunidades cambian separadamente•Múltiples formas en equilibrio
2011 Enrique Castro 45
Reg. por modificación covalente reversibleReg. por modificación covalente reversible➢Uso regulador
•Reversible•Modula actividad
➢Uso no regulador•Activación constitutiva•Anclaje
AcilaciónFarnesilación-carboxilaciónsulfatación
Funciones específicasno reguladoras
2011 Enrique Castro 46
Fosforilación como mecanismo reguladorFosforilación como mecanismo reguladorFosforilación como mecanismo reguladorFosforilación como mecanismo regulador
Formadesfosforilada
Formafosforilada
Proteína quinasa
Proteína fosfatasaterminación de la señal
• Actividad enzimática• Capacidad de unión
•Reclutamiento•Translocación
➢Enzimas modificadoras de proteínas•Quinasas / fosfatasas•Actividad / unión
➢Dianas fosforilables•Múltiples sitios de fosforilación•Cambio estado conformacional•Actividad / unión
➢Organización en cascada•Activación secuencial•Amplificación
Fosforilación ≠ activación
A
A*
⊕B
B*
⊕C
C*
⊕10
100
1000
x10señalamplificación
MKKK
MKK
MAPK
ΔG≈-25 kJ/molΔratio P/D x104
Pi:• 2 cargas, 3 pdh, tetraédrico (capacidad enlazante, reorganización)• Reacción rápida• ATP ubicuo
2011 Enrique Castro 47
Secuencias diana de fosforilaciónSecuencias diana de fosforilación
Cada quinasa fosforila -OH en secuencias específicas
Cada proteína puede contener múltiples dianas
para varias quinasas
• S/T: quinasas efectoras• Y: transducción• H: quinasas efectoras
➢ Múltiples efectos•P constitutiva• Localización secuestro•Activación/inactivación •Magnitud variable
2011 Enrique Castro 48
PKA: ejemplo de enzima reguladoraPKA: ejemplo de enzima reguladora PKA• Heterotetrámero R
2C
2
• 4 sitios cAMP, cooperativos• S/T-quinasa• Diana RRpS/T
[cAMP]i
100%-
50%-
Act
ivid
ad q
uin
asa
≈10 µM
Activación cooperativa
sigmoidal
Umbral de activación -RRpS/T-
OH
proteína
-RRpS/T-
O-
proteína
PiATP ADPFosforilación de proteínas diana
(secuencia específica)
Subunidades CFosforilan dianas
Subunidades Rligan 4 cAMP (cooperativo)
Subunidades RInhiben a sub. C
AKAP localiza R
Centro catalítico libre, activo
Secuencia —RRGAI—pseudosustrato
2011 Enrique Castro 49
Reg. por proteolisis: zimógenos pancreáticosReg. por proteolisis: zimógenos pancreáticos
Zimógenos inactivos(Gránulos de almacenamiento)
Activación proteolítica(extracelular)
Proteolisis re-posiciona el centro activo
Activación por proteolisis
en cascadaFeedback ⊕explosivo
2011 Enrique Castro 50
Activación por proteolisis: coagulaciónActivación por proteolisis: coagulación
FibrinopéptidosA y B
Polimerización fibrina• Unión - GHR• Unión - GPR
Monómero de fibrina
Fibrinógeno
GHR
GPR
Dom.
Dom.
Proteolisis por trombinaActivación
por proteolisis en cascada
Proteasainactiva
Proteasaactiva
2011 Enrique Castro 51
Isoenzimas como mecanismo reguladorIsoenzimas como mecanismo regulador
➢Isoenzimas• Igual reacción•Diferente cinética•Diferente localización•Diferente expresión
Ajuste fino del metabolismoen cada tejido o compartimento
LDH H4• KM
Lac baja (alta afinidad)
• Inhibición alostérica Pyr
LDH M4• KM
Lac alta (baja afinidad)
• No efecto alostérico Pyr
Lac Pyr
NAD+ NADH
Pyr Lac
NADH NAD+
Adaptadoproducción aerobia Pyr
Adaptadoproducción anaerobia Lac
Recambio de isoenzimas LDHen corazón
(adaptación a aerobio)
Hexoquinasas I-III• KM
Gluc baja (0.1 mM, alta afinidad)
• Inhibición por producto
Hexoquinas IV (glucoquinasa)• KM
Gluc alta (10 mM, alta afinidad)
• SIN inhibición por producto
2011 Enrique Castro 52
Regulación de rutas metabólicasRegulación de rutas metabólicas
➢Enzimas reguladas/reguladoras•Reacciones más lentas (paso limitante)• Inicio/ramificación/fin de rutas (etapa de compromiso)
➢Retroalimentación (feedback)•Usualmente negativo •Precursores ⊕ / Productos finales ⊖
Pasolimitante
g
g' Etapa de
compromiso
retroalimentación
retroalimentación
➢Compartimentación• Separar tras membranas •Regulación independiente en zonas•Transporte regulado
•Regular actividad•Regular expresión
2011 Enrique Castro 53
Enzimas como marcadoresEnzimas como marcadores
CPK3
CPK2
➢Ensayos enzimáticos•Medida V
max (conocer K
M)
• Identificació de isoenzimas (selectividad tisular)