Rat Modelinde İskemi-Reperfüzyon Hasarı Üzerine Silastazol ve Diltiazemin Etkileri

Bekir İNANBekir İNAN, Selma SÖNMEZ ERGÜN, , Selma SÖNMEZ ERGÜN, Asiye NURTENAsiye NURTEN, , Aslı ZENGİNAslı ZENGİN Bilge BİLGİÇBilge BİLGİÇ, , Şule SEÇKİNŞule SEÇKİN

Canan KÜÇÜKGERGİNCanan KÜÇÜKGERGİN Kerem ERKALPKerem ERKALP

Açıklama :

Bu sunumda herhangi bir ticari şirket veya kurum ile çıkar ilişkisi yoktur.

Giriş 1:

İskelet kaslarında oluşan iskemi-reperfüzyon İskelet kaslarında oluşan iskemi-reperfüzyon hasarı belirgin morbiditeye ve mortaliteye neden hasarı belirgin morbiditeye ve mortaliteye neden olabilmektedir. Bu tip hasarlar akut arteryel olabilmektedir. Bu tip hasarlar akut arteryel emboli, bir çok kas ve damarsal travma ve hastalık emboli, bir çok kas ve damarsal travma ve hastalık ile ekstremitelerdeki uzun süren ameliyatlar ile ekstremitelerdeki uzun süren ameliyatlar sonucunda kaçınılmaz olarak ortaya sonucunda kaçınılmaz olarak ortaya çıkabilmektedir. çıkabilmektedir.

Giriş 2:

İskemi-reperfüzyon hasarında reoksijenasyonla birlikte, ksantin oksidaz; hipoksantini ksantine dönüştürerek serbest radikallerde aşırı derecede artışa neden olur. Serbest radikaller ve nötrofiller iskemi-reperfüzyon hasarının belirgin kaynaklarıdırlar.

Giriş 3:

Serbest oksijen radikalleri ve nötrofillerden kaynaklanan doku hasarını gidermek için çok sayıda eksojen ajan kullanılmıştır.

Giriş 4:

Bu ajanlardan biri siklik adenozin monofosfat fosfodiesteraz tip 3 inhibitörü olan silastazoldür.

Diğeri ise sarkolemmal Ca2+ kanal blokeri olan diltiazem hydroklörürdür

Giriş 5:

Silastazol etkisini:

1. Platelet aggregasyonunu ve endotele nötrofil adhezyonunu engelleyerek,

2. Endojen prostaglandin I2 ile sinerjistik davranıp düz kas hücrelerinde vazodilatasyon arttırarak,

3. Miyokardda iskemi-reperfüzyon hasarı sonrasında enfarktüs alanını azaltarak gösterir.

Giriş 6:

Diltiazem hidroklorür ise:

1.İskemi esnasında mitokondrilerin işlevlerini koruyarak,

2.Nötrofil akümülasyonunu azaltarak,3.Reperfüzyonda enfarktüs alanını azaltarak etki

göstermektedir.

Giriş 7:

Silastazol ve Diltiazem hidroklorürün iskemi-reperfüzyon hasarı sonrasında miyokard iyileşmesi üzerine olumlu etkilerinin olduğu bilinmektedir. Ama bu iki ajanın iskemi-reperfüzyon hasarı sonrasında iskelet kasları üzerindeki etkileri tam olarak bilinmemektedir.

Bu çalışmanın amacı iskemi-reperfüzyon hasarı Bu çalışmanın amacı iskemi-reperfüzyon hasarı sonrasında silastazol ile diltiazem hidroklörürün sonrasında silastazol ile diltiazem hidroklörürün iskelet kası üzerinde etkilerinin olup olmadığını iskelet kası üzerinde etkilerinin olup olmadığını göstermek ve birbirleri ile kıyaslamaktır.göstermek ve birbirleri ile kıyaslamaktır.

Amaç:

Metot 1:

Deneysel çalışma İstanbul Üniversitesi Deneysel Deneysel çalışma İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsünde (DETAE) Tıp Araştırma Enstitüsünde (DETAE) gerçekleştirildi.gerçekleştirildi.

Wistar albino ratlar üzerinde çalışıldı.Wistar albino ratlar üzerinde çalışıldı.

Metod 2:

Deney pentotal anestezisi (50 mg/kg,Deney pentotal anestezisi (50 mg/kg, intraperitoneal) altında gerçekleştiridialtında gerçekleştiridi.

Femoral artere mikrovasküler klamp (Yasargil-Femoral artere mikrovasküler klamp (Yasargil-Phynox anevrizma klempi)Phynox anevrizma klempi) yerleştirilerek 2 saatlik yerleştirilerek 2 saatlik iskemi oluşturuldu.iskemi oluşturuldu.

2 saatlik iskemiyi izleyerek 1, 2 ve 4 saatlik 2 saatlik iskemiyi izleyerek 1, 2 ve 4 saatlik reperfüzyon sağlandı. reperfüzyon sağlandı.

Metod 3:

Cerrahi öncesinde, mikrovasküler klamp Cerrahi öncesinde, mikrovasküler klamp alındıktan sonra ve alt gruplara göre değişen alındıktan sonra ve alt gruplara göre değişen reperfüzyon sürelerinin bitiminde olmak üzere 3 reperfüzyon sürelerinin bitiminde olmak üzere 3 kez kuyruk kanı alındı.kez kuyruk kanı alındı.

Metod 4:

Reperfüzyon sürelerinin bitiminde bütün ratlar sakrifiye edildi ve doku örnekleri alındı.

Histopatolojik değerlendirme için iskemik ve iskemik olmayan bacakların tibialis anterior kasları kullanıldı.

Doku malondialdehid (MDA) ve myeloperoksidaz (MPO) seviyelerinin tespiti için grasilis kasları kullanıldı.

Alınan kuyruk kanlarında serum malondialdehid (MDA) ve serum nitrik oksit (NO) düzeylerine bakıldı.

Gruplar:

Yetmiş iki adet Wistar-Albino rat rastgele olmak Yetmiş iki adet Wistar-Albino rat rastgele olmak üzere 4 ana gruba ayrıldı. üzere 4 ana gruba ayrıldı.

Gruplar: (n:72)

Grup I (kontrol grubu): Serum fizyolojik Grup I (kontrol grubu): Serum fizyolojik uygulandı,uygulandı,

Grup II: Diltiazem hidroklorür (DH) uygulandı,Grup II: Diltiazem hidroklorür (DH) uygulandı, Grup III Silastazol ve 30% dimetil sülfoksit Grup III Silastazol ve 30% dimetil sülfoksit

(CLZ+30%DMSO) uygulandı, (CLZ+30%DMSO) uygulandı,

Grup IV 30% Dimetil sülfoksit (30%DMSO) Grup IV 30% Dimetil sülfoksit (30%DMSO) uygulandı.uygulandı.

Alt gruplar:

Bu 4 ana grup, reperfüzyon süresine göre(1, 2 ve 4 Bu 4 ana grup, reperfüzyon süresine göre(1, 2 ve 4 saat) 3 alt gruba ayrıldı. saat) 3 alt gruba ayrıldı.

Değerlendirilen Parametreler :Değerlendirilen Parametreler :

Malondialdehid (lipid peroksidasyonu belirteci) Malondialdehid (lipid peroksidasyonu belirteci) ve nitrik oksit (endojen vazodilatatör) serum ve nitrik oksit (endojen vazodilatatör) serum seviyeleri, seviyeleri,

Malondialdehid ve miyeloperoksidazın (nötrofil Malondialdehid ve miyeloperoksidazın (nötrofil sekestrasyonu belirteci) doku seviyeleri,sekestrasyonu belirteci) doku seviyeleri,

Histolojik inceleme olarak sınıflandırıldı.Histolojik inceleme olarak sınıflandırıldı.

Serum MDA ve NO Seviyelerinin Değerlendirilmesi:

Kan numuneleri oda sıcaklığında 800 devirde 15 dakika Kan numuneleri oda sıcaklığında 800 devirde 15 dakika santrifüj edildi ve -80°C de analizler yapılıncaya kadar santrifüj edildi ve -80°C de analizler yapılıncaya kadar muhafaza edildi.muhafaza edildi.

Serum MDA konsantrasyonu, oksidatif stresin dolaylı Serum MDA konsantrasyonu, oksidatif stresin dolaylı belirteci olan thiobarbitürik asid reaktif ürünleri (TBARS) belirteci olan thiobarbitürik asid reaktif ürünleri (TBARS) ile spektrofotometrik olarak ölçüldü.ile spektrofotometrik olarak ölçüldü.

NO oluşumunun göstergesi olan total serum nitrit ve nitrat NO oluşumunun göstergesi olan total serum nitrit ve nitrat seviyeleri kolorimetrik kit kullanılarak (EMSNOTOT) seviyeleri kolorimetrik kit kullanılarak (EMSNOTOT) değerlendirildi. değerlendirildi.

Doku MDA ve MPO Seviyelerinin

değerlendirilmesi:

Soğuk Soğuk Phosphate Buffered SalinePhosphate Buffered Saline (PBS) (PBS) ile örnekler ile örnekler durulandı, kurulandı akabinde sıvı nitrojen ile hemen durulandı, kurulandı akabinde sıvı nitrojen ile hemen donduruldu. Biyokimyasal analize kadar –80°C de donduruldu. Biyokimyasal analize kadar –80°C de saklandı. saklandı.

MDA içeriği thiobarbituric acid ile kalorimetrik reaksiyon MDA içeriği thiobarbituric acid ile kalorimetrik reaksiyon kullanılarak (Buege ve Aust metodu) değerlendirildi. kullanılarak (Buege ve Aust metodu) değerlendirildi.

MPO aktivitesi ise MPO aktivitesi ise oo-dianisidine metoduyla -dianisidine metoduyla değerlendirildi.değerlendirildi.

Histolojik değerlendirme:

44µµm kalınlığında hazırlanan km kalınlığında hazırlanan kesitleresitler Hematoksilen-Eozin Hematoksilen-Eozin ile boyanıp, patolog tarafından körlemesine ile boyanıp, patolog tarafından körlemesine değerlendirildi.değerlendirildi. Yüksek büyütmede (x400) alan başına Yüksek büyütmede (x400) alan başına düşen nötrofiller sayılarak 0’dan 3’e kadar olan skala ile düşen nötrofiller sayılarak 0’dan 3’e kadar olan skala ile skorlandı. skorlandı.

(0,nötrofil infiltrasyonu yok; 1, <5 nötrofil; 2, 5-10 nötrofil; 3, >10 nötrofil).

Ayrıca kas fibrillerinin çizgilenmesi ve çapı, çekirdek Ayrıca kas fibrillerinin çizgilenmesi ve çapı, çekirdek santralizasyonu, segmental nekroz ve ödem histopatolojik santralizasyonu, segmental nekroz ve ödem histopatolojik olarak değerlendirildi.olarak değerlendirildi.

İstatistikte kullanılan metodlar:

Kruskal-Wallis,Kruskal-Wallis, Mann-Whitney U,Mann-Whitney U,

SONUÇ

Diğer gruplarla kıyaslandığında silastazol ile tedavi edilen grupta (Grup III) doku malondialdehid seviyelerinde anlamlı derecede düşme olduğu tespit edildi.

Tissue MDA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

non-ischemic p:0,551 ischemic p: 0,000

nm

ol/

mg control

diltiazem

cilastazol

DMSO

Kontrol grubu dışındaki tüm deney gruplarındadoku miyeloperoksidaz seviyelerinde anlamlıdüşme saptandı.

Tissue MPO

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

non-ischemic p:0,381 ischemic p: 0,000

U/m

g p

rote

in

control

diltiazem

cilastazol

DMSO

Diğer gruplarla kıyaslandığında silastazol iletedavi edilen III. grupta serum malondialdehid seviyelerinde anlamlı bir düşüş olduğu saptandı.

Serum MDA

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

p:0,224 p:0,010 p:0,000

1 2 3

nm

ol/

ml control

diltiazem

cilastazol

DMSO

Silastazol ile tedavi edilen III. grupta, diğer gruplara kıyasla, serum nitrik oksit aktivitesi istatiksel olarak anlamlı derecede yüksekti.

Serum NO

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

p:0,179 p:0,000 p:0,022

1 2 3

nm

ol/

l control

diltiazem

cilastazol

DMSO

İskemik arka bacakların histopatolojik İskemik arka bacakların histopatolojik parametreleri arasında anlamlı fark yoktu.parametreleri arasında anlamlı fark yoktu.(p=0,995)(p=0,995)

İskemik olan ve olmayan arka bacakların İskemik olan ve olmayan arka bacakların

histopatolojik parametreleri arasında anlamlı fark histopatolojik parametreleri arasında anlamlı fark mevcuttu. (p=0,033)mevcuttu. (p=0,033)

1.Diltiazem hidroklorürün iskemi-reperfüzyon 1.Diltiazem hidroklorürün iskemi-reperfüzyon hasarını gidermede yararlı etkisinin olduğu hasarını gidermede yararlı etkisinin olduğu görülmüştür.görülmüştür.

2. 2. Silastazolün iskemi-reperfüzyon hasarını Silastazolün iskemi-reperfüzyon hasarını gidermedeki yararlı etkisi diltiazem gidermedeki yararlı etkisi diltiazem hidroklörürden anlamlı derecede daha hidroklörürden anlamlı derecede daha belirgindir. belirgindir.

Teşekkür ederim